DNA Tools and

Biotechnology

1
Amplifying DNA

2
 Copying DNA
• Polymerase Chain Reaction
• Also called PCR
• A method of making many
copies of a piece of DNA

3
 PCR Reaction
• PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1983,
kỹ thuật nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi
trong lĩnh vực Sinh học phân tử và y học ngày
nay.

• PCR được xem như là “DNA photocopier” bởi

vì nó cho phép tạo ra một số lượng bản sao
DNA cực lớn từ một lượng nhỏ phân tử DNA
ban đầu.

• PCR còn được sử dụng để phát hiện một hoặc

nhiều trình tự DNA cụ thể nào đó trong mẫu.
4
 Nguyên tắc hoạt động
• Nguyên tắc hoạt động của PCR là nếu biết trình
tự nucleotide hai đầu đoạn DNA mục tiêu thì
có thể khuyếch đại số lượng đoạn DNA đó.
Hoạt động của PCR dựa trên cơ chế sao chép
DNA tự nhiên, ứng dụng sự biến tính DNA mạch
kép và bắt cặp nucleotide (lai mạch đơn) một các
có kiểm soát.

• Trong PCR, ngoài một số yếu tố hóa-sinh học, hầu

như các bước đều được thực hiện nhờ sự thay
đổi nhiệt độ theo chu kỳ. Sự thay đổi nhiệt độ
và chu kỳ nhiệt được thiết lập trong máy luân
nhiệt (máy PCR)
5
Main Compositions for
PCR reactions
• DNA molecule containing
sequence for amplification
• DNA polymerase that can
work at high temperature
• Free nucleotides (dNTPs)
• Primers: short pieces of DNA
which are complementary to
the ends of the molecule to
be copied
7
 Thành phần trong PCR
• Phân tử DNA có mang trình tự cần sao chép.
Trình tự này đóng vai trò là khuôn (template).
• Enzyme DNA polymerase dùng trong PCR có
khả năng chịu nhiệt cao (Taq polymerase)
• Các deoxynucleotide triphosphate tự do
(dNTP).
• Cặp mồi oligonucleotide (primer) đặc hiệu, được
thiết kế và tổng hợp để có thể gắn vào hai đầu
của trình tự cần sao chép mà không gắn nhầm vào
vị trí khác trên phân tử DNA. Cặp mồi này bao
gồm một mồi “xuôi” (forward primer) và một mồi
“ngược” (reverse primer)

8
 Primer
• Một cặp mồi (primer) bao gồm một mồi “xuôi”
(forward primer) và một mồi “ngược” (reverse
primer) đóng vai trò là hai đầu của trình tự cần
sao chép.

• Mồi thường có kích thước từ 16 đến 30

nucleotides, được tính toán và thiết kế nhờ các
phần mềm chuyên dụng và được tổng hợp hóa học

• Hai yếu tố quan trọng nhất của một cặp mồi là

tính đặc hiệu và nhiệt độ nóng chảy.

9
 Thành phần trong PCR
• Dung dịch đệm (PCR buffer) cung cấp các
điều kiện hóa học tối ưu cho phản ứng PCR
như hỗ trợ việc gắn mồi, hoạt động của
enzyme,…

• Tris-HCL tạo môi trường pH 7-8

• KCL nồng độ cao giúp mồi bắt cặp tốt hơn

so với mạch khuôn

• Mg2+ là co-factor của enzyme polymerase.

Enzyme này hoạt động phụ thuộc vào Mg2+
10
 Steps in Copying DNA
3-step cycle
• The DNA is heated to separate
the two strands (denaturation)
• The tube is cooled so that
Primers bind to template
sequences (annealing)
• Change to optimal temperature
for DNA polymerase to elongate
the synthesized strands
(extension)

11
 Các bước của PCR
• Khi đặt hỗn hợp phản ứng vào máy luân nhiệt
(thermo cycler) thì quá trình sao chép DNA
sẽ được thực hiện theo một loạt chu kỳ liên
tục. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:

• Bước 1 (Denaturation): Biến tính hay tách

mạch DNA (94oC) thành hai mạch đơn
• Bước 2 (Annealing): Gắn mồi (40-72oC,
thường là 55oC). Nhiệt độ này phải thấp hơn
nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi ít nhất là 1-
2oC nhưng k quá thấp. DNA polymerase bắt
đầu có hoạt tính và kéo dài mồi ngay khi mồi
bắt vào mạch khuôn.
12
 Các bước của PCR

• Bước 3 (Extension): Kéo dài mồi

(72oC). Đây là nhiệt độ tối ưu cho
hoạt động tổng hợp mạch mới của
DNA polymerase.

• Một quá trình PCR thường có từ 25-

40 chu kỳ như vậy tùy điều kiện và
mục đích cụ thể.

13
 PCR

Denaturation

Extenstion
Annealing

Large amounts of DNA can be made

from a small starting sample
 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh
• Phân tích các gen bệnh bằng cách khuyếch đại
số lượng các đoạn DNA đặc trưng.
• PCR cũng có thể được dùng để xác định mức
độ biểu hiện gen trong những mẫu nhỏ như
mẫu mô hoặc mẫu tế bào.
• PCR được ứng dụng nhiều trong pháp y hình
sự. DNA được thu từ mẫu máu, nước bọt,
da, chân tóc và tinh dịch.
• PCR củng có thể ứng dụng trong chẩn đoán di
truyền, kiểm tra xem liệu cha mẹ có thể mang
đột biến di truyền mà có thể truyền cho con
cái hay không hoặc xác định nguy cơ mắc bệnh
ở các bệnh nhân ung thư,…
16
Real-time PCR

17
 Real-time PCR (qPCR)
• Kỹ thuật Real-time PCR (Q-PCR) còn được gọi là kỹ
thuật PCR định lượng. Được sử dụng để đo lượng sản
phẩm PCR.

• Là phương pháp được ưa thích để đo định lượng mức

độ DNA biến đổi gen.

• Q-PCR thường được sử dụng để xác định số lượng

bản sao trong mẫu. Phương pháp này có độ chính xác
cao nhất của PCR định lượng thời gian thực.

• Các thiết bị cần có:

18
 Real-time PCR

• Về nguyên lý: tương tự kỹ thuật PCR, nhưng

thành phần phản ứng có thêm chất phát huỳnh
quang và thiết bị có khả năng ghi tín hiệu khi
đoạn DNA mới được tổng hợp => đoạn DNA được
nhân lên sẽ được phát hiện tại mỗi thời điểm diễn
ra phản ứng (realtime)

• Các phương pháp QRT-PCR sử dụng thuốc

nhuộm huỳnh quang như đầu dò SYBR Green
hoặc DNA có chứa fluorophore, như TaqMan,
để đo lượng sản phẩm màu được khuếch đại
trong thời gian thực
19
 Real-time PCR

• Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản để

người làm thí nghiệm có thể quan sát trong
quá trình nhân bản DNA của các ống phản
ứng là dựa vào Biểu Đồ Khuếch Đại
(Amplification Graph/Plot)

• Biểu đồ có trục tung (Y) là cường độ huỳnh

quang phát ra từ các ống phản ứng. Còn trục
hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.

20
Biểu Đồ Khuyếch Đại (Amplification Plot)
• Cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong
những chu kỳ đầu sẽ rất thấp do số lượng bản sao
DNA còn ít – gọi là giai đoạn ủ hay giai đoạn thuần
phục.
• Cường độ huỳnh quang được hiển thị bằng một đường
nền (baseline)

• Giai đoạn lũy thừa khi số lượng bản sao DNA đạt
đến một ngưỡng nhất định vượt qua đường nền.
• Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle –CT) là chu kỳ mà
tại đó, tín hiệu huỳnh quang vượt nền và bắt đầu đi
lên. Từ thời điểm này, tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng
theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ nhiệt

21
Biểu Đồ
một đường
biểu diễn
khuếch đại
ghi nhận
cường độ
huỳnh
quang phát
ra từ ống
phản ứng
khi nhận
được ánh
sáng kích
thích vào
mỗi chu kỳ
nhiệt
Biểu Đồ Khuyếch Đại (Amplification Plot)
• Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ
tăng trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng
trưởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên do
phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq
polymerase không hoạt động hiệu quả nữa (giai
đoạn bình nguyên)

• Ct của một ống phản ứng real-time PCR là

tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban
đầu có trong ống phản ứng. Dựa vào Ct, có thể
xác định được số lượng DNA đích có trong mẫu
thử ban đầu
23
Biểu đồ khuếch
đại vẽ lên các
đường biểu diễn
khuếch đại của
các mẫu thử và
các mẫu chuẩn.
Giá trị CT càng thấp thì mẫu DNA ban đầu càng nhiều
Giá trị CT càng cao thì mẫu DNA ban đầu càng ít
 Standard Curve (Biểu Đồ Chuẩn)

• Làm sao để biết được có bao nhiêu DNA trong

chiết xuất và làm thế nào có thể biết ước tính
của tôi là chính xác?

A standard curve

• Biểu đồ chuẩn là một công cụ cho phép ước tính

nồng độ DNA của các mẫu chưa biết bằng cách
so sánh chúng với các tiêu chuẩn có nồng độ
DNA đã biết.

26
 Biểu Đồ Chuẩn

• Mục đích: để xác định chính xác số lượng bản

đích ban đầu có trong mẫu thử

• Mẫu chuẩn là mẫu pha loãng theo hệ số 10 chứa

số lượng DNA đích ban đầu

• Biểu đồ chuẩn/Đường biểu diễn chuẩn

(standard curve) được xây dựng dựa trên các
mẫu chuẩn đã biết số lượng DNA đích ban đầu
được pha loãng theo hệ số 10.

27
Đường biểu diễn vẽ lên mối
quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với
số lượng bản DNA đích ban đầu
có trong mẫu chuẩn được gọi là
đường biểu diễn chuẩn
(standard curve)

Trên biểu đồ này, trục tung (Y)

là Ct còn trục hoành (X) là số
lượng bản DNA đích ban đầu có
trong các mẫu chuẩn.
Giá trị Ct của mẫu chưa biết được đo và so sánh với đường
chuẩn để ước tính nồng độ DNA của mẫu chưa biết.

Các biểu đồ chuẩn phải cho thấy được sự đồng nhất. Sự phân
bố không đều giữa các giá trị Ct có thể là do loạt pha loãng
không được thực hiện một cách chính xác
Real-time PCR sử dụng Taqman probe
làm chất phát huỳnh quang
• Đầu dò phát huỳnh quang (Taqman probe) là những
đoạn oligonucleotides sợi đơn có trình tự có thể bắt
cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích),
trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có
gắn chất phát huỳnh quang (Reporter); đầu 3’ gắn
chất hấp thụ tương ứng (Quencher) để hấp thụ được
ánh sáng huỳnh quang phả ra từ reporter.

• Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’

exonuclease để có khả năng thủy giải để cắt bỏ probe
khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của
mồi khi enzyme kéo dài mồi khi enzyme kéo dài mồi
tổng hợp sợi bổ sung.
31
Cơ chế
hoạt động
của
Taqman
probe
trong
real-time
PCR
 Ứng dụng của Real-time PCR
• Xác định nhanh chóng định lượng axit nucleic trong
các mẫu sinh học khác nhau, với các ứng dụng đa
dạng như phân tích biểu hiện gen, phát hiện sinh vật
biến đổi gen trong thực phẩm và kiểu ung thư .

• Xác định tỷ lệ biến đổi gen (GMO) có trong mẫu

• Kết hợp với PCR phiên mã ngược (RT-PCR), các xét

nghiệm qPCR có thể được sử dụng để định lượng
chính xác những thay đổi trong biểu hiện gen, ví dụ,
tăng hoặc giảm biểu hiện để đáp ứng với các điều
kiện môi trường khác nhau hoặc điều trị bằng thuốc.
mức mRNA.
Bộ kit Real-Time (Real-Time PCR)
Reverse-Transcriptase PCR
(RT-PCR)

35
Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)

• Kỹ thuật Reverse - Transcriptase PCR (RT-PCR)

còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase
sao chép ngược (RT-PCR).

• Là kỹ thuật trong phòng thí nghiệm kết hợp giữa sao

chép ngược (phiên mã ngược) RNA thành DNA và
khuếch đại các mục tiêu DNA cụ thể bằng phản ứng
chuỗi polymerase (PCR).

• Được sử dụng để đo lượng RNA cụ thể. Phương pháp

kết hợp RT-PCR và qPCR với nhau thường được sử
dụng để phân tích biểu hiện gen và định lượng RNA
của virus trong các nghiên cứu và thực nghiệm lâm
sàng

36
Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)

• PCR sao chép ngược (RT-PCR) được sử dụng

khi nguyên liệu ban đầu là RNA.
• Trong phương pháp này, RNA lần đầu tiên
được phiên mã thành DNA bổ sung
(complementary DNA - cDNA) bằng cách
sao chép ngược từ RNA tổng hoặc RNA
thông tin (mRNA).
• cDNA sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu
cho phản ứng PCR.

• Kỹ thuật RT-PCR có thể được thực hiện

trong xét nghiệm một bước hoặc hai bước
37
Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)

• Xét nghiệm một bước kết hợp sao

chép ngược và PCR trong một ống đơn
và bộ đệm, sử dụng phiên mã ngược
cùng với DNA polymerase. RT-PCR một
bước chỉ sử dụng các đoạn mồi cụ thể
theo trình tự.

• Trong các thử nghiệm hai bước, các

bước sao chép ngược và PCR được thực
hiện trong các ống riêng biệt.

38
RT-PCR Analysis of the expression of
single genes
 Ứng dụng qPCR và RT-PCR
• Trong công nghiệp, kỹ thuật qPCR và RT-PCR được
sử dụng để định lượng các vi sinh vật có trong thức
ăn và rau hoặc để xác định các sinh vật biến đổi gen.
• Ứng dụng trong ngành nông nghiệp để xác định các
tác nhân gây bệnh ở thực vật.
• Ứng dụng trong chẩn đoán, sử dụng các kỹ thuật
PCR để định lượng - xác định kiểu gen các căn bệnh
truyền nhiễm, ung thư và các bất thường di truyền.
• Các kỹ thuật này được mở rộng như công cụ để phát
hiện các căn bệnh mới nổi lên như các chủng cúm mới
hoặc là các kiểm tra mục đích chẩn đoán.
• qPCR kết hợp RT-PCR được ứng dụng để hỗ trợ
chẩn đoán bệnh, định lượng và kiểm tra kiểu gen các
virus gây bệnh ở người.
41