1.

GIỚI THIỆU CHUNG

Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia Mỹ
(U.S.National Instituse of Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu
tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có
tên là severe combined immune deficiency SCDI, cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và
có thể bị tổn thương khi mắc phải bất kỳ mầm bệnh nào. Trẻ em mắc bệnh này
thường không chống lại được sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi
trưởng thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành
lang bảo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi
trường vô trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao.
Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra
khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào
các tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu
của bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này
đã làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể
đến trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phải là một phương
thuốc, những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một
vài tháng và quá trình này phải lặp lại.
Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả
quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp
gen được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở
người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần
được hiểu biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách
thích đáng.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực
khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự
phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực
này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong
công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những
năm 1980.
 2. LIỆU PHÁP GEN LÀ GÌ?
2.1. Định nghĩa liệu pháp gen.
Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các
rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng
khó thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian,
ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song
định nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn Quốc tế.
Định nghĩa: liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho
gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được
mục tiêu của liệu pháp.
- Biện pháp thứ nhất là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào
đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu
hiện gen đó. Cho đến nay, chưa có thành tựu đáng kể nào trong lĩnh vực này vì
người ta chưa biết cách sửa chữa gen một cách đặc hiệu. Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ
hợp đồng dạng cũng đem dến những hy vọng rất lớn và khả năng thành công là điều
hoàn toàn có thể hy vọng trong tương lai.
- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào
bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này
dẫn đến một số kết quả không lường trước được:
 Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được
biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc
hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm
chí không được biểu hiện.
 Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.
 Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn
dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.
Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm giải quyết những vấn đề này. Đặc biệt, liệu
pháp gen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc
tác động vào gen của tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từ
chối việc thay đổi gia sản di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau.
Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:
  Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.
 Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo).
Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin
di truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào
chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể xoá hay làm mất các
phần có hại của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các
virus không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu
pháp gen trên người và động vật.
 Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài
người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người
bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các
nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể.
Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn
toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào
được chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng
miễn dịch.
 Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
 Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
 Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA
của vật chủ)
 Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử
ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen
đã bị biến đổi).
2.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào
động vật theo 2 bước:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã
được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện
mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ các trình tự
cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh. Sau
đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều
nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri
potential)
Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã
tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen
ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra có thể kích
thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế
bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít
khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân.
Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm
sự phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ
sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một
người lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào
bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp
và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit
đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế
bào chất.
2.3. Ứng dụng của liệu pháp gen trong điều trị bệnh
Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới. Với 407 thử
nghiệm diễn ra ở Mỹ, đây là nước dẫn đầu trong các thử nghệm của liệu pháp gen.
Trong số 533 thử nghiệm, có 322 thử nghiệm trong điều trị bệnh ung thư, chiếm
62,28%, 37 thử nghiệm trong điều trị HIV chiếm 6,94%, ngoài ra là các thử nghiệm
với các bệnh tim mạch, u xơ, SCID (severe combined immune deficiency), chứng
máu khó đông...
3. CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT TRONG CHUYỂN GEN
“Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp
gen’
Kay, M., Glorioso, J., Naldini, L. Nature Medicine 7 (1) 2001
3.1. Các cơ sở của sinh học phân tử:
Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các
tế bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào
hay mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản
xuất của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông
tin liên quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung
cấp một giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi bốn
phân tử khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân
tử này tạo nên “ngôn ngữ” của DNA. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các
protein, là khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép hoạt hoá của các gen và
qua đó các protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang
mã và là phần quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể. Thành phần này của
của DNA vô cùng quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của
DNA trong các vùng không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện,
cho chúng ta phương pháp tìm kiếm các gen chưa biết.
Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein
đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi
là nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một
số trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố
quyết định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao.
Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình
phiên mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố
phiên mã (nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được
tiến hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế
bào. Bản sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ
được dịch mã tổng hợp thành protein.
3.2. Cơ sở của liệu pháp gen
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:
 Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự
điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy
nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện
trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện.
Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong
tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối
với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc. Những thao tác như
vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.
 Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể
tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:
 DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi
là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)
 DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus
(viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc
chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể
xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này.
 DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để
khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.
 Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có
thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi
người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong
tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi
trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.
Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương
pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:
 Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.
 Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được
hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng.
Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp
gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm
nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính
xác của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của
liệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý.
Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra
nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh
đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó
sự điều hoà gen là phức tạp hơn.
 Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vector có hoặc không có bản
chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân
phối gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus.
3.3. Vector chuyển gen có bản chất virus
3.3.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng
của nó
Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:
 Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất
di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới
các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các
điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương
tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng
đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.
 Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen
được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính
các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc
thể và DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp
bởi virus sẽ phiên mã thổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo
nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.
 Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển
gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu
quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không
giống nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô
của cơ quan này đên mô cơ quan khác.
Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược
liệu pháp gen dựa trên vector virus.
Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã
được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để
ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector
virus gây bệnh.
 Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên
cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes
Simplex.
Bảng 2: So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus

3.3.2. Vector Adenovirus:

Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có
cơ sở adenovirus. Adenovirus gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ
dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người. Kiểu
2 và 5 được sử dụng chung nhất cho các ứng dụng liệu pháp gen.

Hình 1: Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ
gen dsDNA dài xấp xỉ 36kbp. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và
base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi
mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp”
ngoài vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử.
Điểm đầu tiên trong sản xuất vector liệu pháp gen là lấy đi gen điều khiển tái
bản (sự phát triển) của virus trong mô. Sự sinh sản và phát triển của một lượng nhỏ
virus mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus.
Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu khá kỹ, chứa DNA xoắn kép gồm 50
gen, dài 36 kilobase (KB). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều
hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen
dài 8kb. Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus
giúp đỡ (helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ. Tuy nhiên, ngày
nay một dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá
dạng vector. Sự phát triển của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị
thương mại và an toàn hơn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại
được giảm bớt.
Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x1012 đoạn virus/ml
đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp
gen. Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là
nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng
và hoạt tính của các vector virus.
Thật không may, hệ thống vector adenovirus đã xuất hiện một vài bất cập. Sự
sản xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã
được chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các tác động trở
lại của vector adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ,
có nguy cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Trọng tâm nghiên cứu hiện nay
nhằm cải tiến vector adenovirus đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây
ra, mang tới thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên
trong (gutted vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus.
Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các
nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể
cho protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập
tế bào. Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống
lại protein đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vector sau đó hoà trộn với kháng
thể dung hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được
chữa trị bằng vector này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector
adenovirus đã biến đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác
nhau. Việc phân loại của các vector khác nhau này cho phép adenovirus đích tới
những mô khác nhau khi sử dụng các kháng thể.

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc của vector adenovirus hiệu năng cao (high-capacity
adenoviral) HC-Ad. Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trái và
phải của Ad5 và DNA thêm vào (stuffer DNA) thu được từ gen C346 và HPRT.
AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu,
trong AdGS85, hAAT cDNA được biểu hiện từ promoter cytomegalovirus của
người ((hCMV promoter). AdSTK129 chỉ chứa DNA thêm vào và không biểu hiện
bất cứ gen chuyển nào.
3.3.3. Vector Adeno-associated Virus (AAV):
AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người.
Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia và hoà nhập với DNA
của tế bào chủ. Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vector chống lại các
bệnh kinh niên. Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh.
Virus này nhỏ do đó chỉ có thể mang những gen có kích thước giới hạn. Nó cũng
khó sản xuất hơn các vector khác nên tính thương mại hiện nay bị hạn chế.
Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử dụng trong
các ứng dụng của liệu pháp gen. Do kích thước nhỏ, vector này chỉ mang được gen
có kích thước lớn nhất là 5 kB. Như vậy, không thể chuyển được các gen phức tạp
với kích thước lớn. Một số phương thức được đề ra để giải quyết vấn đề này.
Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vector để phân cắt một số gen hợp
nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vector phân cắt.
Một cách trung gian là sự nhân bản của các vector dung hợp sử dụng lớp vỏ của
adenovirus kết hợp với bộ gen của vector AAV. Điều không thuận lợi của phương
pháp là vector này đòi hỏi sự giứp đỡ của adenovirus để được tổng hợp. Điều này
có thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vector adenovirus (phản ứng miễn dịch).
Gần đây, 3 plasmid, hệ thống virus giúp đỡ đa năng (helper virus free system) đã
phát triển cho phép sản xuất các thể giúp đỡ đa năng của vector này.

Hình 3: cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại (wild-type) và của vectorAAV.
  (A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (reading
frames) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylation site
(pA), và inverted terminal repeats (ITR). Quá trình phiên mã của virus
mã hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới bộ gen.
Các protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điểm khởi đầu nội tại
(internal initiation sites).
 (B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap
của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và
polyadenylation site).
 (C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS) và
vùng tiêu tan cuối cùng (TRS) (terminal resolution site)
Thuận lợi chính của hệ thống vector AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của
tế bào chủ. Điều này cho phép các vector được chuyển biểu hiện một cách ổn định
và lâu hơn. Nhưng thật không may, nếu AAV kiểu hoang dại hoà nhập tại điểm đặc
hiệu trong nhiễm sắc thể 19 thì các vector tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà
nhập tuỳ tiện. Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cứu trên động vật và
người đã cho thấy rằng, sụ biểu hiện ổn định có thể đạt được với vector này.
 Hình 4: Quá trình phiên mã của vector AAV. Các bước khác nhau cần cho quá
trình phiên mã của vector AAV bao gồm: đầu tiên AAV tương tác với các receptor
đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu virion, nhân vào
trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đơn vủa vector, sự lai của bộ gen đưa vào
bổ sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiễm sắc thể trước biểu
hiện gen có thể xảy ra từ khuôn xoắn kép DNA. Cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ
gen vector bổ sung (episomal) xuất hịên như các phân tử vector RNA đã được mã
hoá.
 Hình 5: Chiến lược sản xuất rAAV. Plasmid tái tổ hợp chứa gen cần thiết, được
tách dòng cùng lúc, ITRs của AAV được chuyển với plasmid giúp đỡ tái tổ hợp có
chứa wtAAV và các gen adenovirus cần thiết cho sự giải phóng, tái bản, và đóng
gói rAAV trong 293 tế bào. Khoảng 48 đến 60 giờ sau, các tế bào bị dung giải và
phần chiết thô chứa rAAV và các protein của tế bào bị tách ra lệ thuộc vào sự tinh
chế sau này (qua ly tâm gradient mật độ và sắc kí cột). Các mẩu nhỏ rAAV sau tinh
chế được xác định chính xác và các virus đã tinh chế sau đó được sử dụng cho các
nghiên cứu in vitro và in vivo.
3.3.4. Vector Retrovirus
Retrovirus nằm trong số các vector virus được phát triển đầu tiên. Vector này
đã được sử dụng trong gần 60% dự án liệu pháp gen y học. Virus này có chứa vật
chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 kB. Khi vào tế bào, RNA virus cần
trở thành DNA trước khi nó có chức năng trên tế bào chủ. Điều này được thực hiện
bởi enzim phiên mã ngược, RT (reversse transcriptase). Retrovirus có chứa enzim
phiên mã ngược (enzim xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA
qua phiên mã ngược) và enzim hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của
retrovirus virus vào tế bào chủ.
Bộ gen của tất cả các virus này nhỏ và đã được nghiên cứu đầy đủ.
Retrovirus dễ dàng biến đổi về mặt di truyền do đó được sử dụng rộng rãi như một
vector của liệu pháp gen. Virus murina leukaemia đã biến đổi di truyền (MuLV)
được sử dụng phổ biến nhất. Các retrovirus cổ điển chỉ nhiễm vào tế bào đang phân
chia (dividing cell) và vật chất di truyền của chúng sau khi chuyển thành DNA, hoà
nhập với vật chất di truyền của tế bào chủ như một “provirus”. Điều này giúp nó
thích ứng với bệnh ung thư, bệnh mà ở đó các tế bào phân chia rất nhanh, cũng như
các bệnh cần thời gian dài để gen được ổn định vững chắc. Điều bất lợi của vector
này là nó hoà nhập tuỳ tiện với DNA của tế bào chủ. Do đó, các rủi ro khi vector
xâm nhập sẽ phá vỡ chức năng sinh lí bình thường của tế bào chủ. Các retrovirus cơ
bản cũng cần sự phân chia của tế bào chủ để làm việc. Hiện nay tồn tại những lo
ngại lớn hơn, đó là khả năng các vector retrovirus sẽ nhiễm vào tế bào mầm của
người bệnh và sản xuất tinh trùng hoặc trứng. Do vậy, tiềm tàng sự ảnh hưởng đến
sinh sản sau này. Tới nay, điều này đã được quan sát trên các động vật mẫu.
Các vector retrovirus cơ sở có thể trở thành vector được lựa chọn để thay đổi
tế bào gốc (stem sell). Khi đó, liệu pháp gen sẽ được sử dụng để sản xuất các gen
chữa bệnh. Tuy nhiên, khi ứng dụng dạng vector này để tách dòng, rủi ro do đột
biến sẽ tăng.
Một trong các phát triển thú vị gần đây là sự biến đổi của các lentivirus,
dạng thay thế (sub-type) của retrovirus, trong các ứng dụng của liệu pháp gen. Dạng
virus này gồm có HIV và SIV. Các retrovirus này hoà nhập với DNA của tế bào
chủ, do đó cung cấp sự biểu hiện gen ổn định trong một thời gian dài. Tuy nhiên,
chúng có thể vào các tế bào không phân chia, do đó mở rộng khả năng ứng dụng
của vector này.

Hình 6: Bộ gen của retrovirus (oncogenic retrovirus) gây bệnh ung thư MLV
(murine leukemia virus). DNA của axit nucleic của virus (hình thái của bộ gen virus
trong các tế bào bị nhiễm) xuất hiện. Hai virus có cùng có các gen cấu trúc gag, pol,
và env. Gav mã hoá lõi virus và pol mã hoá các enzim tái bản. Gav và pol được biểu
hiện ngay lập tức từ promoter trong LTR (long terminal repeat). Gen env được biểu
hiện từ từng chỗ nối mRNA (singly spliced mRNA), mã hoá màng glycoprotein.
Gen của HIV được biểu hiện từ mRNA xuất hiện thêm vùng đa nối. Dù các vai trò
không được biết đầy đủ song chúng quan trọng trong quá trình điều hoà biểu hiện
gen của virus và trong sự điều chỉnh lây nhiễm.

Hình 7: Chu trình tái bản của retrovirus. Sự nhiễm bắt đầu khi lớp màng
glycoprotein của virus nhận ra các vị trí thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, sau đó
màng virus và màng tế bào dung hợp giải phóng lõi virus (virus core) vào tế bào
chất. RNA của virus, được sao chép thành phân tử DNA mạch kép, và xâm nhập
vào nhân. Thời gian chính xác và cơ chế của việc này chưa được xác định rõ ràng.
DNA hoà nhập vào nhiễm sắc thể, bộ gen virus (từ bây giờ gọi là provirus) được
giữ ổn định. Sản xuất RNA của virus và sau đó là các protein và enzim của chúng.
RNA của virus cũng kết hợp với protein của virus để tạo thành các phần lõi (core)
mới. Các virion con đã trưởng thành có khả năng nhiễm vào các tế bào mới khi
chúng được giải phóng ra ngoài tế bào và được bao bởi vỏ của chúng (gồm có
màng tế bào và vỏ glycoprotein).
 Hình 8: Các yếu tố đóng vai trò trong vector retrovirus đặc trưng. Các chuỗi cần
thiết cho sự lan truyền retroviral được thể hiện. Tất cả các chuỗi protein của virus bị
xoá và thay bằng gen ngoại lai (gen cần cho các mục đích nhất định). Gen ngoại lai
có thể được biểu hiện từ promoter trong LTR của retrovirus (như được thấy trong
hình trên), hoặc từ bên trong, promoter của virus khác loại, như trường hợp xảy ra
với vector lentivirus. Vai trò của các vùng khác nhau được đánh dấu.

Hình 9: sản xuất vector retrovirus. Các gen của virus biểu hiện từ các promoter
không có bản chất retrovirus (nonretroviral) và đưa tới các tế bào, nơi chúng bảo
tồn được sự ổn định và sản xuất các protein enzim cũng như cấu trúc virus. Khi
vector retrovirus được đưa tới tế bào, vector virus RNA cần được bao gói, kết quả
từ quá trình sản xuất của các phần tử virus chứa bộ gen vector. Virus này có thể
được thu lại và sử dụng để tiêm vào các tế bào đích nhằm đưa gen ngoại lai trong
vector tới tế bào. Vì các tế bào đích này không biểu hiện các protein của virus,
vector sẽ không truyền bá xa hơn. Các gen của virus trong các tế bào bao gói không
mang cấu trúc đi xa hơn vì chúng mất chuỗi cis-acting cần thiết cho sự nhân bản.
3.3.5. Các vector có cơ sở là herpes simplex
 Vector herpes simplex là các vector có bản chất virus DNA. Chúng không hoà
nhập vào DNA chủ nhưng giữ nguyên sự ổn định như một thể bổ sung (lantency),
có khả năng cho phép các gen được chuyển ổn định trong một thời gian dài. Ngày
nay, chúng được sử dụng trong các ứng dụng đặc biệt của liệu pháp gen với các
khối u thần kinh. Herpes simplex virus (HSV) có hiệu quả cao đối với các nơron
thần kinh. Vector này đủ lớn để chuyển DNA lớn (tới 30 kB) nhưng khó thực hiện
hơn adenovirus.
Khả năng to lớn này cho phép phân phối 5 gen khác nhau được điều khiển
bằng các promoter khác nhau. Do đó, nếu quá trình trị bệnh cần đa gen, đây có thể
là vector được lựa chọn.

Hình 10: A. Sơ đồ thể hiện các thành phần chính của virion HSV. B. Bộ gen của
HSV được tổ chức thành các đoạn dài và ngắn chỉ xuất hiện một lần (U L, Us) gần
các trình tự lặp lại. 84 khung đọc mở của virus có thể được chia thành các gen cần
cho sự tái bản trong mô thích hợp.

Hiện có rất ít kinh nghiệm trị bệnh với các vector này, nhưng khả nằng sử dụng
của vector này cho việc phân phối gen trong một thời gian dài tới hệ thống thần
kinh trung ương ngày càng tăng.
3.3.6. Các vector virus khác:
 Các vector virus khác đang trên đà phát triển bao gồm virus pox, virus
Epstein-Barr, veovirus... Mỗi tiến triển mới có thể là lí tưởng cho các thử nghiệm y
học trọng tâm. Các chiến lược hiện nay là kết hợp DNA virus từ các vector đa dạng
với sự phân phối liposome không có bản chất virus. Chiến lược này cho thấy một
vài hứa hẹn trên các nghiên cứu với động vật.
3.4. Các vector không có bản chất virus
3.4.1. Giới thiệu:
Trong khi sự phát triển và sử dụng các vector virus (VV) đã đem lại nhiều hứa
hẹn, những giới hạn của nó đã thúc đẩy các nghiên cứu tìm kiếm các vector không
có bản chất virus (nonviral vector, NV) trong việc chuẩn đoán và điều trị bệnh. Có
hàng ngàn công ty, phòng nghiên cứu, trường đại học và các tổ chức chính phủ trên
thế giới cố gắng phát triển các NV cho việc chuyển gen. Thật không cần thiết và
cũng không thể đề cập đến tất cả các vấn đề trên ở đây, tôi chỉ nêu ra một số điểm
có giá trị nghiên cứu lớn.
Như VV, NV được sử dụng để gắn các vật chất di truyền, protein hay thuốc
chính xác tới tế bào ở người. Sử dụng NV trên người bệnh đã thu được nhiều thuận
lợi rõ ràng. Đáp ứng miễn dịch tăng lên chắc chắn xảy ra ở VV được bỏ qua nhờ sử
dụng NV. Như khi bất cứ virus nào vào cơ thể, các VV được xác định bởi hệ thống
miễn dịch (như một yếu tố thù địch) và đáp ứng miễn dịch tăng lên để chống lại
chúng. Các NV loại bỏ vấn đề này một cách êm thấm, về lý thuyết mà nói, làm cho
chúng mất tính độc hại, mất đáp ứng miễn dịch và đem lại hiệu quả cao hơn. Chúng
hướng tới sự đơn giản hơn trong việc thiết kế các VV do đó dễ ứng dụng hơn cho
sản xuất quy mô lớn và marketing.
Nghiên cứu và tiến triển trong phát triển NV chậm hơn so với các VV. Do đó,
hiệu quả của việc chuyển chúng hay thành công trong phân phối chúng tới các tế
bào ít được nhận thấy hơn các VV. Các VV cũng có thuận lợi trong khả năng gắn
vật chất di truyền của chúng tới các tế bào chủ, cung cấp hiệu quả liệu pháp lâu dài
hơn. Trên thực tiễn, điều này có nghĩa là các VV đòi hỏi sự chuyển vào ít hơn để
hoàn tất yêu cầu hiệu quả hơn các NV. Chỉ loại trừ đối với các nhiễm sắc thể nhân
tạo ở người (HACs). Trong khi sự lặp lại điều trị là không lý tưởng cho người bệnh,
các vector này có thể tự tồn tại trong các bệnh có cùng cách thức điều trị.
 3.4.2. Phần tử trung gian chuyển gen
Phần tử trung gian chuyển gen hay gene gun là kỹ thuật mang lại thuận lợi của
việc dễ dàng tiếp cận với da. Nó sử dụng lực cơ học để đẩy tới DNA hay protein
trong một số trường hợp tạo miễn dịch, trực tiếp tới da của người bệnh. DNA được
gắn vào bề mặt của các quả cầu vàng (đường kính ≤ 1 m). Vàng không gây ra đáp
ứng miễn dịch và là một vector tuyệt hảo để sử dụng cho kỹ thuật này. Phức hệ
chứa vàng và DNA sau đó được đẩy tới da. Bio-Rad, Inc (Hercules, CA) hiện hành
sản xuất phần tử trung gian chuyển gen Helios sử dụng heli để làm yếu tố thúc đẩy.

Hình 11: (A) Thiết bị Accell gene gun được thiết chế và chế tạo bởi Dr. D. McCabe
dưới sự giúp đỡ của Agracetus, Inc. (Middleton, WI) và được phân phối độc quyền
bởi PowderJect Vaccine, Inc. (Madison, WI). (B) Thiết bị Helios gene gun, được
phát triển từ thiết bị của Accell, hiện được sản xuất thương mại bởi Bio-Rad. (C)
Chuyển gen in vitro vào một cụm lớp tế bào đơn sử dụng Helios gene gun. (D)
Chuyển gen in vivo đến mô da lợn sử dụng Helios gene gun.
Không cần sử dụng virus hay các chất hoá học độc hại trong việc cấy phức hợp.
Không giống một số vector sinh học, nó không phụ thuộc vào sự tham gia của các
cơ quan thụ cảm bề mặt tế bào. NV dường như cũng đáng tin cậy, có ý nghĩa trong
vệc đưa các đoạn vật chất di truyền lớn. Tuy nhiên, hiệu quả của nó bị giới hạn bởi
mức độ xuyên qua mô để tới các mô đích khác nhau và sự biểu hiện trong thời gian
ngắn của sản phẩm gen mong muốn.
Liệu pháp này đã thành công trong ứng dụng điều trị ung thư da và các căn bệnh
về da với các khuyết tật di truyền đã biết. Tuy nhiên, ứng dụng hứa hẹn nhất của nó
là tạo miễn dịch chống lại các khối u ác tính. Các văcxin DNA tiến hành theo hướng
kỹ thuật “gene gun” đã được thử nghiệm trên 15 loài động vật (2 loài động vật có
vú phát triển cao nhất) và đã cho thấy hiệu quả chống lại các bệnh cúm, HIV, sốt
rét, lao…
Các nghiên cứu trung gian cũng đã có thành công ban đầu trong việc sử dụng kỹ
thuật “gene gun” để gắn DNA vào các tế bào cơ để sản xuất dystrophin (protein
thiếu hụt trong các tế bào cơ bị bệnh của người bệnh). Kỹ thuật “gene gun” là một
ví dụ của vector “cơ học” đã đem lại nhiều hứa hẹn trong phòng và trị bệnh.
3.4.3. Nhiễm sắc thể nhân tạo
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HACs) hiện vẫn chưa phát triển.
Trong khi ứng dụng y học của HACs chỉ bắt đầu trong một vài năm, khái niệm này
là một trong những lĩnh vực thú vị nhất của chuyển gen không có bản chất virus.
Trong cơ thể DNA từ một tế bào di truyền tới tế bào khác và cuối cùng từ cha mẹ
sang con, sử dụng các NST.
Các NST là vật mang đóng vai trò tổ chức DNA đến các trình tự đặc hiệu,
việc chuyển này dễ dàng. Thành công trong điều trị bệnh phụ thuộc vào khả năng
thiết kế các phân tử vật mang hay các vector của chúng ta. Do đó có thể thiết kế
NST nhân tạo ở người (HAC), hoặc NST nhỏ (minichromosome), chứa các đoạn
DNA đặc biệt sẽ vào tế bào, tạo ra kết quả mong muốn không chỉ trong tế bào mà
còn trong các tế bào sinh ra từ tế bào này.
 Hình 12: Sơ đồ của một vector HAEC (Human artificial episomal chromosome)
HACs là các NV có khả năng mang lại hiệu quả cao nhất. Chúng có thể mang
năng lượng để dễ dàng chuyển các đoạn tiền DNA lớn không quan trọng tới gắn vào
các tế bào có kích thước xác định. Chúng có thể gắn tới tế bào và cố định tại đây mà
không cần kết hợp với các NST gốc, do đó tránh được đột biến di truyền, hoặc các
biến đổi vật chất di truyền không cần thiết hay có hại với tế bào. Các NST ban đầu
dễ dàng chuyển gen tới tế bào con qua phân bào, điều này tạo nên sự duy trì biểu
hiện gen liên tục trong toàn bộ cuộc sống người bệnh. Vì HACs được tạo nên bởi
các thành phần xa lạ với cơ thể, chúng không thể hiện hiệu ứng với hệ thống miễn
dịch.
HACs vẫn trong quá trình phát triển và có thể sẽ không có giá trị thương mại
trong một vài năm. Sự sản xuất HACs chỉ trong phòng thí nghiệm, giới hạn trong
ứng dụng y học trên quy mô lớn. Khi máy tính mạnh hơn và nhỏ hơn hiện nay, sự
sản xuất HACs sẽ chắc chắn trở nên không chỉ trong phòng thí nghiệm và khả năng
sản xuất và cải tiến công nghệ sẽ tới trong vài năm nữa. Các công ty hiện nay đang
nghiên cứu HACs bào gồm clontech, geron corp. chromos molecular systems, inc,
biogenix, gentronics và Chiron.
3.4.4. Liposomes
 Liposome là vector không có bản chất virus, lợi dụng các tính chất tự nhiên
của màng tế bào để xâm nhập vào tế bào. Tất cả các vật chất sinh học có cực và
thành phần lipid cũng như tính hòa tan nước khác nhau. Thành phần và cấu trúc của
nó xác định các tính chất này.
DNA tích điện âm. Tính “béo” cao và tích điện âm của màng tế bào người
và màng nhân ngăn cản sự di chuyển tự do ra vào tế bào của DNA. Liposome mang
điện tích dương, lớp vỏ ưa lipid. Do tích điện đối dấu, DNA và liposome dễ dàng
gắn chặt với nhau, tạo nên phức hợp ưa lipid liposome-DNA. Tính hoà tan chất
lipid này cho phép vận chuyển nó qua màng tế bào và màng nhân, dễ dàng đưa
DNA vào nhân của tế bào.

Hình 13: Chuyển gen sử dụng HVJ liposome. HVJ liposome gắn với các thụ thể
axit sialic trên bề mặt tế bào và kết hợp với các lipid trong màng lipid kép gây ra sự
dung hợp tế bào. Do sự dung hợp vỏ của HVJ liposome với màng tế bào, DNA
trong HVJ liposome có thể đưa trực tiếp vào tế bào chất.
Liposome là các phân tử không độc, dễ dàng sản xuất với số lượng lớn, khiến
chúng trở thành vector rất hiệu quả trong các ứng dụng thương mại. Sự xâm nhập
của protein trong vector ngăn cản đáp ứng miễn dịch của vật chủ và chúng không bị
nguy hiểm hay bị tiêu diệt bởi các enzim (endonucleases) nội bào.
Chúng có các bất lợi y học. Mặc dù phức hệ di chuyển một cách hiệu quả
qua màng tế bào nhưng nó không thành công trong việc xuyên qua màng nhân, tính
ứng dụng của nó cũng bị giới hạn với các tế bào có tốc độ phân chia cao.
 Một trong các ứng dụng thành công nhất của chuyển gen liposome là điều trị
bệnh sơ cứng động mạch. Vào năm 1993, 10 thử nghiệm y học quan trọng đã
nghiên cứu ứng dụng của liệu pháp gen với bệnh u xơ (cystic fibrosis). Năm trong
số đó sử dụng các vector adenovirus và 5 sử dụng các vector liposome. Hiện nay có
trên 4 thử nghiệm y học quy mô lớn theo cách này. Cả vector adenovirus và vector
liposome biểu hiện hoà trộn thành công trong các nghiên cứu này. Nghiên cứu cũng
trên hướng sử dụng liposome trong điều trị các bệnh xơ cứng động mạch, ung thư
tiền liệt tuyến, u ác tính và bệnh bạch cầu.
So với tất cả các vector không có bản chất virus, chuyển gen liposome có
tiềm năng ứng dụng lớn nhất tại thời điểm hiện tại.

Hình 14: plasmid DNA được bao trong pegylated immunoliposome (PIL) 85
nm. Bề mặt của liposome được kết hợp với vài nghìn sợi polyethyleneglycol (PEG)
dài 2000 Dalton, và đỉnh của 1 đến 2% của các sợi PEG được gắn với phối tử đích,
như kháng thể đơn dòng đặc hiệu (specific mono clonal antibody) insulin receptor
(IR) (MAb). Mab kết hợp với PIL qua thụ thể trung gian đi qua hàng rào máu não
và qua màng tế bào chất của tế bào não vào trong nhân.
3.4.5. Các polymer cation
 Các polymer cation là chuỗi các phức hợp tích điện dương. Khi trộn với DNA,
chúng tạo thành phức hợp có tính chất của DNA kết tụ thành dạng mà có thể dễ
dàng vào nhân. Lĩnh vực nghiên cứu này là cuộc cách mạng nhanh chóng các phân
tử không độc có tính hiệu quả hơn và chuyển các gen tới các tế bào đúng đích hơn.

Hình 15. Sự xâm nhập vào tế bào của các polymer cation
 Hình 16: Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu sự tạo thành và tính ổn định
của phức hệ polycation-DNA.
3.4.6. Cấy trực tiếp
Sự cấy các DNA trần hay DNA tự do là một ví dụ khác của chuyển gen
không có bản chất virus. Trong kỹ thuật này, DNA trần được cấy trực tiếp tới khối u
hoặc mô. Phương pháp điều trị này có thể làm giảm trực tiếp sự sản xuất các protein
quan trọng cho liệu pháp trị bệnh (ví dụ protein khối u) hoặc có thể gây ra đáp ứng
miễn dịch giúp ngăn ngừa bệnh. Kỹ thuật này đã được ứng dụng cho cơ xương
trong điều trị các bệnh thoái hoá cơ (như bệnh loạn dưỡng cơ), ngăn cản các bệnh
gan do virus (như bệnh viêm gan), và các bệnh tim (như bệnh lỗi sung huyết tim).
Ngoài ra, các nghiên cứu trên động vật đã thành công trong điều trị ung thư như u
ác tính và u bướu. Trong khi giá thấp và tính dễ thiết kế làm nó được thu hút hơn,
cũng có một số nhược điểm. Đầu tiên, sự quản lý hệ thống của vật chất di truyền là
vấn đề và nguyên nhân gây ra sự phân huỷ bởi enzim nội bào và nhanh chóng bị
dẹp bỏ (clearance) bởi gan và thận. Hiệu quả của biểu hiện di truyền cực kỳ khó
nhận thấy. Hơn nữa, trong một số trường hợp không duy trì được biểu hiện của gen,
các DNA lạ (foreign DNA) có thể gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
3.4.7. Liệu pháp tế bào gốc
Chuyển tế bào gốc là kỹ thuật tạo ra đột biến lớn trong khoa học, chính trị và
tôn giáo. Vì vậy, việc nghiên cứu chúng là hết sức hạn chế và chỉ diễn ra trên quy
mô phòng thí nghiệm.
Các tế bào gốc là các tế bào đầu tiên trong cơ thể người. Chúng là các tế bào
hoàn toàn giống nhau và hầu như có thể phát triển thành bất cứ tế bào nào ở người.
Các tế bào này có thể tách khỏi cơ thể, tinh chế trong phòng thí nghiệm, làm
thành các dạng tế bào đặc hiệu khác nhau và sau đó các tế bào này được đưa trở lại
vật chủ.
3.4.8. Biến đổi biểu hiện gen
Sự biểu hiện gen ở người có thể bị biến đổi trực tiếp bằng cách sử dụng các công
cụ phân tử có khả năng xuyên qua tế bào, gắn tới gen đích của chúng và điều hoà
gen sản xuất protein. Có một số công cụ được dẫn ra dưới đây:
a) Oligomucleotide
Oligonucleotide là các đoạn DNA ngắn có thể được sử dụng để kìm hãm quá
trình dịch mã của gen. Mạch đối (antisense) của đoạn gen đã biết được tạo thành.
Khi mang tới tế bào, các đoạn DNA này cuộn xoắn với RNA đặc hiệu và ngăn cản
sự sản xuất protein từ RNA này. Công nghệ mạch đối đã rất hữu dụng trong nghiên
cứu nhưng các ứng dụng thương mại của nó rất không thành công. Điều này là do
thời gian sống ngắn của các oligomucleotide và sự khác nhau của phân phối đặc
hiệu. Hiện tại, có một dược phẩm oligomucleotide đã được chấp nhận là FDA, dùng
để điều trị nhiễm cytomegalovirus ở võng mạc. Dự án bộ gen người hoàn thành đã
làm sống lại mối quan tâm trong lĩnh vực này với các kỹ thuật phân phối mới làm
liệu pháp oligomucleotide có hiệu quả hơn.
b) Ribozyme
Ribozyme là các chuỗi RNA ngắn (30-50 nucleotide) được thiết kế đặc biệt,
có hoạt tính xúc tác (chúng gây ra các phản ứng hoá học). Ribozyme gắn với các
đoạn RNA đặc hiệu và tách chúng ra khỏi RNA, do đó ngăn cản quá trình sản xuất
protein. Các ribozyme này dường như có hiệu quả trong 12 đến 24 tiếng. Đây là
lĩnh vực nghiên cứu mới nhất với ứng dụng trong các bệnh ung thư và các bệnh
thoái hoá thần kinh (neuro-degenerative). Thông tin từ dự án bộ gen người có thể
đem lại các ứng dụng có giá trị cho công nghệ này một cách nhanh chóng.
c) Promoter
Promoter và enhancer là các đoạn DNA điều khiển biểu hiện gen không bị
phiên mã. Tất cả các vector liệu pháp gen hiện nay sử dụng các promoter của virus
để điều khiển sự biểu hiện của các gen được chuyển. Việc thiết kế và sử dụng đặc
hiệu mô làm các promoter trở thành lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, có thể cho
phép hoạt hoá của gen được chuyển chỉ trong các mô dự kiến. Ví dụ, một vector sử
dụng promoter cho kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến được sử dụng trong các
thử nghiệm y học chống ung thư tiền liệt tuyến. Vector này sẽ là đích của một số
lớn các tế bào, nhưng gen được chuyển chỉ được hoạt hoá trong các tế bào bình
thường sản xuất kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến.
4. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỂ VIỆC ĐIỀU TRỊ BỆNH BẰNG LIỆU
PHÁP GEN TRONG Y HỌC HIỆN NAY.
4.1. Nghiên cứu liệu pháp gene cho bệnh di truyền
Ngày 13/02/2007 các nhà khoa học ĐHTH Göttingen (CHLB Đức) đã công
bố kết quả nghiên cứu sử dụng liệu pháp gene chữa hội chứng Molybdelnum -
Cofactor - Deficiency (khiếm khuyết yếu tố kết hợp molybdenum).
Molybdenum (ký hiệu Mo) có số thứ tự 42 trong bảng tuần hoàn các nguyên tố hóa
học và có mặt trong cơ thể sinh vật từ vi khuẩn đến động, thực vật. Ở vi khuẩn, Mo
tham gia vào quá trình cố định nitơ.
Động, thực vật có một hàm lượng Mo cực kỳ nhỏ (tính bằng đơn vị ppm:
parts per million). Ở động vật và người, Mo tham gia vào cấu tạo của enzyme
xanthine oxidase (enzyme này có phân tử lượng 270.000 với hai phân tử flavin và
hai nguyên tử Mo tại ví trí hoạt động) xúc tác cho quá trình phân giải các purine và
hình thành uric acid. Nếu bổ sung một lượng nhỏ Mo vào thức ăn sẽ kích thích sinh
trưởng ở một số loài động vật.
Khiếm khuyết gene mã hóa enzyme chứa Mo (MOCO) sẽ dẫn đến rối loạn
trao đổi chất và biệt hóa của nhiều cơ quan, đặc biệt là hiện tượng phát triển không
hoàn hảo của hộp sọ. Thí nghiệm trên gà cho thấy hộp sọ của gà non mới nở không
đóng hoàn toàn. Người mắc bệnh này thường chết ở độ tuổi 7 đến 12.
Số người mắc phải bệnh này trên thế giới không nhiều (chỉ khoảng 1000
người) nhưng nghiên cứu về bệnh đặc biệt là nghiên cứu các liệu pháp điều trị có
thể ứng dụng đối với nhiều bệnh do di truyền khác.
GS J. Reiss và TS. S. Kügler cùng nhóm nghiên cứu tại khoa Y và Viện Di
truyền học người ĐHTH Göttingen (Đức) đã dùng liệu pháp gene hạn chế được sự
biểu hiện của bệnh trên chuột bị khiếm khuyết gene này.
Với thành công này, các tác giả cũng như chúng ta có quyền hy vọng hơn
vào việc ứng dụng liệu pháp gene điều trị các bệnh di truyền trong thời gian tới.
4.2. Liệu pháp gen đang được nghiên cứu trong điều trị ung thư như
thế nào?
Các nhà khoa học đang nghiên cứu dùng liệu pháp gen để điều trị ung thư
theo nhiều cách khác nhau. Một số cách nhắm tới mục tiêu là các tế bào khỏe mạnh
để tăng cường khả năng chống lại ung thư của chúng. Một số cách khác nhắm đến
mục tiêu là các tế bào ung thư để tiêu diệt và ngăn không cho chúng phát triển.
Dưới đây là một số kỹ thuật liệu pháp gen đang được nghiên cứu:
• Các nhà khoa học thay những gen bị thiếu hoặc bị thay đổi bằng những gen
khỏe mạnh. Do một số gen nếu bị thiếu hoặc thay đổi (vd như p53) có thể
 gây ung thư, bản sao thay thế đang hoạt động của những loại gen này có thể
được sử dụng để điều trị ung thư.
• Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu cách tăng cường đáp ứng miễn dịch
của bệnh nhân đối với ung thư. Ở cách này, liệu pháp gen được dùng để kích
thích khả năng tự nhiên của cơ thể chống lại các tế bào ung thư. Ở một
phương pháp đang được nghiên cứu, các nhà khoa học lấy một mẫu máu nhỏ
từ bệnh nhân và đưa vào đó những loại gen làm cho các tế bào sản xuất ra
một loại protein có tên là thụ thể tế bào T (TCR - T-cell receptor). Những
loại gen được đưa vào các tế bào bạch cầu của bệnh nhân (có tên là lympho
T) sau đó được truyền ngược trở lại vào cơ thể. Bên trong cơ thể, các bạch
cầu sản xuất ra TCR, TCR sẽ gắn với lớp mặt ngoài của các bạch cầu. Sau đó
TCR sẽ nhận ra và gắn với một số phân tử hiện diện trên bề mặt của các tế
bào u. Cuối cùng, TCR sẽ hoạt hóa bạch cầu để tấn công các tế bào u này.
• Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu cách đưa gen vào trong các tế bào
ung thư để làm chúng nhạy cảm hơn với hóa trị, xạ trị hoặc những phương
pháp điều trị khác. Trong những nghiên cứu khác, các nhà khoa học lấy
những tế bào mầm tạo máu khỏe mạnh ra khỏi cơ thể rồi đưa gen vào các tế
bào này để giúp chúng tăng khả năng kháng cự lại với các tác dụng phụ của
những loại thuốc kháng ung thư dùng ở liều cao. Sau đó, các tế bào này được
đưa trở lại cơ thể bệnh nhân.
• Ở một cách khác, các nhà khoa học đưa những loại "gen tự vẫn" vào các tế
bào ung thư của bệnh nhân. Những tiền chất của thuốc (dạng bất hoạt của
thuốc độc) được đưa vào cơ thể bệnh nhân. Những chất này sẽ hoạt hóa các
tế bào ung thư có chứa những loại "gen tự vẫn" trên dẫn đến sự hủy hoại của
chính bản thân chúng.
• Những nghiên cứu khác tập trung vào việc dùng liệu pháp gen để ngăn các tế
bào ung thư tạo thêm những mạch máu mới.
4.3. Liệu pháp gen - Vũ khí mới để điều trị HIV/AIDS
Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Đại học Pennsylvania, Mỹ,
cho thấy liệu pháp gen có thể trở thành một vũ khí mới trong việc điều trị căn bệnh
thế kỷ HIV/AIDS.
 Tuy nhiên, giới khoa học khuyến cáo cần nhiều năm nữa mới có thể áp dụng
rộng rãi biện pháp điều trị này.
Theo tiến sỹ Pablo Tebas, đồng chủ nhiệm công trình nghiên cứu này, các
loại thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay cho phép bệnh nhân sống tương đối bình
thường. Tuy nhiên, chúng lại gây ra nhiều tác dụng phụ và trong một số trường hợp,
các bệnh nhân dần trở nên kháng thuốc.
Do đó, câu hỏi đặt ra là có cách nào để điều trị hoặc kiểm soát virus
HIV/AIDS ở một mức độ mà bệnh nhân không phải sử dụng các loại thuốc phức tạp
và đắt tiền nói trên.
• Trong nghiên cứu của mình, tiến sỹ
Tebas và đồng nghiệp đã thực hiện
việc tách các tế bào miễn dịch từ
các bệnh nhân HIV/AIDS, chỉnh
sửa những tế bào này và cấy chúng
trở lại cơ thể của các người bệnh và
họ không được điều trị bằng thuốc
Bệnh nhân AIDS có hi vọng được cứu nữa.
trong tương lai nhờ các phương pháp Các nhà khoa học phát hiện thấy số
mới. (Ảnh minh họa: AFP/TTXVN) lượng virus HIV/AIDS ở những đối tượng
trên đều giảm so với dự kiến. Thậm chí, ở một người bệnh virus chết người này
biến mất hoàn toàn.
Các nhà khoa học của Đại học Pennsylvania cho hay sẽ tiếp tục nghiên cứu
biện pháp điều trị nói trên vì hiện tại họ vẫn chưa lý giải được tại sao điều này xảy
ra, cũng như chưa biết được rằng liệu pháp điều trị này có tác dụng trong bao lâu vì
các tế bào miễn dịch không tồn tại lâu dài.
Tuy nhiên, họ cho rằng đây là một phát hiện rất có ý nghĩa bởi hiện nay hàng
nghìn bệnh nhân HIV/AIDS đã hoàn toàn kháng các loại thuốc điều trị hiện có.
Trong khi đó, chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực chống lây nhiễm
HIV/AIDS Bryan William thuộc Trung tâm phân tích và mô hình hóa dịch tễ học
Nam Phi khẳng định thế giới có thể ngăn chặn được đại dịch HIV/AIDS toàn cầu
trong vòng 40 năm tới bằng cách sử dụng rộng rãi các chế phẩm chống retrovirus,
một loại dược phẩm không chỉ làm chậm lại tiến triển của bệnh mà còn giảm đáng
kể nguy cơ lây lan bệnh.
Phát biểu ngày 22/2, ông William nhấn mạnh nếu sử dụng các chế phẩm này,
trong vòng 5 năm có thể ngăn chặn sự lây lan của HIV/AIDS, sau 10 năm sẽ giảm
một nửa số bệnh nhân lao phổi liên quan tới HIV/AIDS và sau 40 năm có thể loại
trừ hoàn toàn 2 sự lây nhiễm này.
Theo chuyên gia Bryan William, khi sử dụng dược phẩm chống retrovirus,
mật độ virus HIV/AIDS trong máu giảm 10.000 lần, đủ để giảm 25 lần nguy cơ lây
nhiễm.
Theo ông William, trở ngại chính trong chiến lược này là kinh phí cho
chương trình phát thuốc miễn phí bởi bệnh nhân cần phải sử dụng thuốc hàng ngày
và suốt đời.
Tại Nam Phi, một trong những khu vực có tỉ lệ nhiễm HIV/AIDS cao nhất
thế giới, để thực hiện dự án này cần 4 tỷ USD/năm.
Tuy nhiên, ông cho rằng sự tốn kém này sẽ mang lại lợi ích tương xứng, vì
giảm số người bị nhiễm căn bệnh chết người này sẽ giúp giảm những chi phí điều
trị những căn bệnh do HIV/AIDS gây ra cũng như giảm số người mất sức lao động.
4.4. Điều trị liệu pháp gen cho người mù:
Các nhà nghiên cứu Mỹ cho biết, một năm trước đây, 3 người mù ở
độ tuổi 20 đã tình nguyện điều trị bằng liệu pháp gen. Giờ đây, thị lực họ đã
có được sự cải thiện đáng kể, thậm chí một người bệnh còn có thể đọc được
cả những con số của đồng hồ công tơ mét trên ô tô. Những thông tin liên
quan sẽ được công bố trên tạp chí “New England Journal of Medicine” vào
ngày 23/8.
Ba người tình nguyện này đều mắc phải bệnh mù lòa bẩm sinh (Leber
Congenital Amaurosis), một loại tật của võng mạc mang tính di truyền
do gen có tên gọi RPE65 (gen RPE65 tạo ra một loại Vitamin A đặc biệt cho
tế bào võng mạc) xảy ra biến dị khiến cho thị lực của người bệnh giảm dần
theo độ tuổi. Vì vậy một số người sau khi trưởng thành đã bị mù lòa, hiện tại
vẫn chưa có liệu pháp điều trị hiệu quả nào cho căn bệnh này.
 Nhóm nghiên cứu Artur V. Cideciyan thuộc trường Đại học
Pennsylvania đã tiêm DNA bình thường vào virus, sau đó lại đưa virus vào tế
bào mắt của người bệnh. Sau 3 tháng, thị lực của 3 người tình nguyện đã
được cải thiện đáng kể, có thể nhìn thấy ánh sáng bằng mắt thường, điều mà
trước đây họ không thể làm được. Hơn nữa, sau khi điều trị 1 năm, mắt và
sức khỏe của họ không hề xảy ra bất kỳ phản ứng miễn dịch nào.

Trong đó, một bệnh nhân nữ trong quá trình điều trị đã tạo ra “thị lực
thứ 2”, đại não của cô ấy học được sau khi điều trị bằng liệu pháp gen đã có
thể khôi phục tìm và thu thập thông tin ở một khu vực nào đó của võng mạc,
khiến cho cô ấy đọc được các con số trên đồng hồ công tơ mét ô tô.
Năm 1999, một thiếu nữ 18 tuổi mắc phải bệnh gan sau khi điều trị 4
ngày bằng liệu pháp gen đã qua đời, sự kiện này khiến cho liệu pháp gen gặp
phải rất nhiều sự chỉ trích và làm cho mọi người càng nghi ngờ về liệu pháp
gen.
Artur V. Cideciyan cho biết: “Liệu pháp gen RPE65 rất an toàn, thị
lực của người bệnh được sự cải thiện rõ rệt, hy vọng có thể tiếp tục tiến
hành thí nghiệm để giải quyết những vấn đề về sự an toàn và tính hiệu quả”.
 Bệnh mù lòa bẩm sinh là một loại sắc tố võng mạc biến tính, tại Mỹ
có khoảng có khoảng 2000 người mắc phải bệnh mù lòa bẩm sinh; 200 nghìn
người mắc phải sắc tố võng mạc biến tính.
4.5. Dùng liệu pháp gene chữa lành phổi bị tổn thương
Các nhà khoa học Canada đã tìm ra một phương pháp mới chữa lành
những lá phổi bị tổn thương của người hiến tạng trước khi cấy ghép.
Phương pháp này giúp tăng gấp 3 lần cơ hội thành công của các ca
cấy ghép phổi và mở ra triển vọng có thể chữa lành những bộ phận khác của
cơ thể.
Giới nghiên cứu cho biết thông thường khi một người hiến tạng qua
đời, những lá phổi của họ có thể bị sưng tấy, kéo theo những tổn thương và
điều này gây khó khăn cho các ca cấy ghép sau này vì cơ thể của người nhận
có thể phản ứng và đào thải.

Các nhà khoa học Canada sử dụng máy "Lung

Perfusion System" để phục hồi phổi bị tổn thương
của người hiến tặng (Ảnh: physorg.com).
Khoảng 20-30% số người được cấy ghép phổi đã tử vong do những
biến chứng sau này và có tới 80% số lá phổi được hiến tặng bị tổn thương
nghiêm trọng.
 Các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Y tế Phục hồi McEwen ở
Toronto và Bệnh viện Đa khoa Toronto đã thành công trong việc sử dụng
liệu pháp gene để phục hồi những lá phổi bị tổn thương.
Họ sử dụng máy "Lung Perfusion System" để "hâm nóng" hai lá phổi
bằng đúng nhiệt độ cơ thể người, sau đó bơm một dung dịch hỗn hợp gồm
ôxy, các protein và các chất dinh dưỡng vào những lá phổi bị tổn thương đó,
giúp chúng hoạt động bình thường. Trên cơ sở này, những tế bào bị tổn
thương có thể sẽ tự lành trở lại.
Những lá phổi được xử lý bằng phương pháp trên sau đó được bảo
quản lạnh trong 24 giờ trước khi cấy ghép.
Các nhà khoa học đã cấy ghép thành công ở động vật và Tiến sĩ Shaf
Keshavjee, trưởng nhóm nghiên cứu, hy vọng nhóm của ông có thể tiến hành
các thử nghiệm lâm sàng trong 2 hoặc 3 năm tới.
5. KẾT LUẬN
Từ các trình bày trên có thể thấy rằng, hiện nay có rất nhiều cách và phương
thức để chuyển gen đích tới các tế bào nhằm thu được hiệu quả của liệu pháp. Tuy
nhiên chúng ta cần nghiên cứu kỹ lưỡng các hiệu ứng phụ cũng như các tác động
của nó tới thông tin di truyền cuả người và các khía cạnh đạo đức, xã hội khác.
Song cũng cần phải nhắc lại rằng “Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả
các kỹ thuật của liệu pháp gen”, do đó cần lựa chọn một cách chính xác nhất dự
trên hiệu quả của vector đối với nhóm bệnh mà mình nghiên cứu.
MỤC LỤC