MOLEKULARNA MEEDICINA

KOLOKVIJ 1

UV LAMPA

- Bakterije plijesni kvasci protozoe i virusi

- Unisteni fizicki hemijski i bioloski
- UV mijenja samo jezgro celije sto onemogucava diobu celije i njeno umnozavanje
- 253.7 nm
- Dezinfekcija i sterilizacija
- Pola sata se kvarcaju u lamppi pa onda 15 minuta

ELEKTROFOREZA

- Agarozni gel se stavlja u kadicu za elektroforezu

- Nose se rukavice jer se koristi u procesu etidijum bromid

HEMIKALIJE

- Opasne su fenol- opekotine, akrilamid- neurotoksin, etidijum bromid- kancerogen

ODRZAVANJE- hemikalijama se sve pere sa 70% etanolom ili 10% varikinom

MIKROCENTRIFUGIRANJE

- Mora bit balansirana i mora uvijek bit jednak broj tubica jedne preko puta druge
- Vacuum speed centrifuga za ucinkovito i njezno isparavanje otapala iz uzorka
- Prilikom organske izolacije kao i izolacije isoljavanjem i tu treba da ispari sav etanol

STAKLENO I PLASTICNO POSUDJE

- Sterilno
- Pere se dtrdzentom pa destilovanom vodom
- Suhi sterilizator- vrucim zrakom i namjenjem je za sterilizaciju predmeta koji podnose
temperaturu od 200 stepeni (stavlvja se stakleno metalno masne tvari i ulja)
- Sterilizacija na 180 stepeni- 30 minuta, na 170- 60 minuta, na 140- 180 minuta
- Sterilizacija u autoklavu- vruca para pod pritiskom super je jeftina i lagana
- Gumeni predmet i plastika i puferi na 121 stepeni i pritiska 1,2 bara se sterilise 20 minuta, a na
134 stepena i 2,5 bara na 5 minuta
- Potrebno je staviti hemijske indikatore

Metode izolacije dnk

- Moze se izolirati iz krvi, tkiva, urina, kostiju, primarnih celijskih kultura, arhivskog materijala
uklopljenog u parafin
 - Protokoli a izolaciju: liziranje celija, uklanjanje celijskih proteina, rnk i drugih makromolekula,
hemijskom ekstrakcijom (fenol hloroform) ili enzimskim reakcijama (proteinaza k, rnaza),
izdvajanje dnk talozenjem, pomocu alkohola (apsolutni etanol), otapanje DNK u TE (Tris EdTa)
puferu na pH 8
- Za izolaciju se koristi :
- Qiagen sistem kitova- najpoznatiji i najjednostavniji set, kombinira princip selektivnog vezivanja
dnk molekula na silika membraanu i ispiranja sa puferima u cilju preciscavanja dnk molekula i
njihovo eluiranje u tubicu. Uspjesan u purifikaciji genomske i mitohondrijalne DNK
- Metod isoljavanja: milerov protokol, isoljavanje celijskih proteina dehidratacijom i
precipitacijom sa zasicenim rastvorom NaCl. DNK visoke molkularne tezine moze bit kvalitetno
preparirano bez toksicnih organskih rastvaraca, i DNK je dovoljno stabilna za cuvanje u frizideru
bez daljnje degradacije. Negativno je sto je analiza produzena.

Postupak prikupljanja uzorka bukalne sluznice samo proces kad protrlja stapicem po ustima

Milerov protokol za ekstrakciju DNK iz brisa bukalne sluznice

- Optimizirani protokol metodom isoljavanja po mileru

- Iz stapica se moze izolovat 5-15 mikrograma DNK
- Dovoljna je za standardne analize DNK
- Uzorci su uzeti metodom skarifikacije i stabilni su dugo u odgovarajucim uzorcima
- Uzorci ako se ne cuvaju su izlozeni procesima degradacije DNK i rasta bakterija koji
minimaliziraju provodjenje PCR nakon 4 dana
- Faze:1. Liziranje lipoproteinskog i nukleohistonskog kompleksa primjenom digestivnih pufera, 2.
isoljavanje 6m NaCL, 3. Precipitacija apsolutnim etanolom, 4. Resolubiziranje izolirane DNK u
destilovanoj vodi

Izolacija DNK iz brisa bukalne sluznice metodom po mileru

Oprema: srednjeturazna centrifuga, vorteks, pipetori 20/200/1000 mikrolitara, frizideri na minus 20

stepeni

Materijal i reagensi:

- Tubice volumena 1,5 mL 3 komada

- Pvc rukavice
- Apsolutni hladni eetanol 500 mikrolitara
- 70% etanol 200 mikrolitara
- TE pufer ili ddH20 – 50 mikrolitara
- Pufer za ekstrakciju 500 mikrolitara
- Qiagen protease k 80 mikrolitara
- 20% SDS 50 mikrolitara
Procedura:

1. Osdtrani se vatirani dio stapica

2. Prebace se uzorci u sterilne tubice
3. Doda se 500 mikrolitara Kern lysis pufera (tris, NaCl, EDTA- Na2), 50 mikrolitara 20% sds i 80
mikrolitara qiagen protease K (qiagen gmbh, hilden, germany), uzorak se vorteksira tj promijesa
4. Inkubacija na 60 stepeni
5. Dodaje se 200 mikrolitara 6M NaCl i protrese minutu do intenzivno bijele boje
6. Centrifugira se 2500 rpm 15 minuta
7. Supernatnt se prebaci u rugu tubicu i 15 sekundi vorteksira
8. Ponovo centrifugira 2500 rpm od 15 min
9. Prebaci se u novu tubicu i doda 1 ml hladnog etanola i protrese 2-3 puta
10. Centrifuga na 13000 rpm od 10 minuta
11. Dekantuje se supernatant tj etanol
12. 200 mikrolitara 70% etanola i protrese 2-3 minute i centrifugira na 13000 rpm u trajanju od 7
minuta
13. Dekantuje se etanol i osusi u speed vacuum masini
14. Doda se 50 mikrolitara destilovane vode i ostavi u sobnoj temp 15 minuta i preko noci u
frrizideru na 4 stepena

Hemikalije koje se koriste

SDS- natrij dodecilsulfat je jonski detrdzent koji unistava nativnu membransku trukturu i uzrokuje
gubitak bioloskih aktivnoti proteina. Ne denaturira dnk vec dnaze i ne utice na aktivnosst proteinaze k.
Smatra se iritansom i najopasniji je za oci i stetan ako se udisee ili apsorbira za kozu.

Proteaza k- aktivna serinska proteaza ssuptilizinskog tipa, proizvodi ga atritirachium album, odstranjuje
dnaze, nije opasna

NaCl talozi proteine i cuva tj stabilizira DNK, sto je veca koncentrcija dnk je stabilnija i 6m se koristi

Apsolutni etanol- odstranjuje hidratacijski omotac oko nukleinskih kiselina. Zaklanja negativno nabijene
fosfate secerno fosfatne okosnice koje molekulu dnk cine polianionom. Da bi se dnk istalozila mora se
stvoriti jonski parovi izmedju polianiona dnk i kationa. Hladni etanol ubrazava ovaj proces

Metode kvantificiranja DNK

Nakon izolacije da bi e utvrila kolicina i cistoca dobivenog DNK uzorka, ukljucuje digestiju DNK
restrikcijskim enzimima ili PCR amplifikacija ciljne DNK. Najcesce se korite spektrofotometar, metoda
agarozne gel elektroforeze, qrt-pcr kvantifikacija.

Agarozna gel elektroforeza za DNK kvantifikaciju

Temelji se na primjeni etidijum bromida. Agarozni gel se priprema mijesanjem i zagrijavanjem kolicine
agaroze u prahu sa elektroforetskog pufera (najcesce se koristi tri borat EDTA tbe). Paznja na
koncentracija agaroze u gelu, uslovljena je velicinom fragmenata koji se apliciraju na gel.

0.4% gel za separaciju DNK u rasponu 20000-30000 bp, 0.75% za 1000-15000 bp, 1% za 500-10000 bp,
2% za 100-2500 bp, to omogucava njihovu dobru rezoluciju.

Spektrofotometrijsko odredjivanje kolicine dnk

Fotoelektricno mjerenje zracenja koje neka supstanca apsorbira na odredjenoj valnoj duzini. Sluzi za
kvantitativno odredjivanje malih kolicina otopljenih supstanci. Kolicina aporbovanog svjetla odgovara
koncentraciji ispitivane supstance. Mjerise aporbancija na 260 i 280 nm. Potpuno cista DNK ima OD
a260/a280=1,8-2,0. Za pojedinacne DNK na 260 nm ima koncentraciju 50 mikrograma po mililitru DNK.

Koncentracija dnk u uzorku izolovane genomske DNK metodom po mileru

U kivetu se doda 1000 mikrolitara destilovane vode, u tubicu se pripremi smjesa od990 mikrolitara
destilovane vode i 10 mikrolitara uzorka DNK i promjesa se. Nakon bazdarenja iz kivete se odstrani
destilovana voda i doda rastvore vode sa uzorkom DNK.

Formula neka: DNK koncentracija (mikrogrami po mililitru) = OD(260) puta 100 (faktor razrjedjenja) puta
50 mikrograma po mikrolitru

Ako je dobijena niska koncentracija i preveliko razrjedjenje onda se dnk koncentrira precipitacijom
etanolom.