Kolokvij 2

Molekularna medicina

Vjezba 3

- Prenatalna dijagnostika- ispitivanje zdr stanja embrija il fetusa

- Utvrdjuje zdravlje, bolest, tezinia, spol, velicina, polozaj ddjeteta
- Prevencija radjanja s gen bolestima
- Neinzvazivni postupci – odredjivanje alfa fetoproteina u majcinom serumu za defekte neuralne
cijevi, trostruki test i ultrasonografsko mjerenje nuhalnog nabora fetusa za downov sindrom i
ultrasonografski pregled za str anomalije
- Specificna prenatalna dijagnostika je invazivni postupci tipa amniocenteza ili uzimanje uzoraka
horionskih resica, nosi mali rizik za spontane pobacaje
- Indikacije za prenatalnu dijagnostiku: starija dob majke, porodicna hitorija, prethodni neuspjeli
ishodi trudncoe, odstupanja u nalazu biohemijskog skrininga, odstupanje u nalazu UZ pregleda,
ostale indikacije
- Klasicna citogenetika putem kariotipizacije- br i str hromosoma (mora se primijeniti 1+ metoda)
- Ispitivanje genoma na metafaznim hromosomima i interfaznim jedrima

Metode molekularne citogenetike

In situ hibridizacija

- Detekcija hromosoma i promjena koje se mogu dogoditi n anjiima

- Temelji se na interakciji obiljezene jednolancane dnk ili rnk molekule odredjenog slijeda
muklkeotida, s komplementarnim slijedom jednolancane ciljane dnk na metafaznim
hromosomima ili u interfaznoj jezgri
- Neradioaktivne fluorescentne boje za obiljezavanje slijeda baza u dnk sondi – FISH
- Fizicki se markiraju ciljani regioni karioptipa

Analiza STR lokusa upotrebom PRC-a

- Otkriva i utvrdjuje STR markere

- Prevode se kao ponavljajuce sekvence i siroko se primjenjuju u dijagnostici aneuploidija
- Kratke repetitivne sekvence 2-7 koji se na lokusu ponavljaju odr br put
- Brza detekcija aneuploidija na zajednickom umnozavanju markera spec za hromosom i
referentnih markera na celijama plodove vode ili trofoblasta ili limfocita
- Potrebno je analizirati nekoliko str lokusa
- Produkti se analiziraju u poliakrilnom gelu u uredjaju za sekvencioniranje
- Heterozigoti za odr str lokus nose dva razlicita alela koji se pokazuju kao dva odsjecka 1:1
intenziteta
- Homozigoti pokazuju jedan odsjecak sa intenzitetom dvostruke kolicine tog alela
- Trisomija- 3 alela 1:1:1
 - Ako nosi 3 alela 2 od jednog roditelja 1 od drugog onda je 1:2
- Brzo rezultati i krace cekanje rezultata

Upotreba pcr u prenatalnoj dijagnostici

- Omogucava analizu tacno odr gena i da se u ranoj trudnoci otkrije da li plod nosi neku od
nasljednih bolesti
- Analiza mikrodelecijskih sindroma kao rezultat gubitka malih dijelova dnk a koje je nemoguce
uociti drugim metodama
- Prader-willi, angelamn, smith-mageni, wiliams sindrom i sl
- Moguca direktna analiza dnk bez prethone kultivacije celija

Polimeraza lancana reakcija PCR

- Procedura za umnozavanje odredjene sekvence dnk nakon cega se ona dodatno analizira
- Imitira sintezu dnk koja se normalno odvija i to u dnk tubici
- Moze umnoziti 1 gen ili dio gena ili dio fragmenta
- Sintetizira se lanac u 5-3 smjeru na osnovu originala iz uzorka
- Danas se koristi polimeraza iz Thermus aquaticus (jer bolje podnosi toplotu i sve) – Taq
polimeraza
- Potrebno za reakciju: taq polimeraaza, dnk kao matrica, 2 oligonukleotidna prajmera, MgCl2 za
djelovanje taqa, slobodna sva 4 dNTP nukleotida i pufer 8,3
- Princip rada: denaturise se DNK, pokidaju hidrogenke veze, sekvenca dnk molekule se obiljezi
pocetnicama na 3 krajevima, oligonukleotidi su prajmeri i stavjaju se na 3' (forward i reverse
prajmer) i komplementarni su originalu, novi lanac nastaje elongacijom prajmera u 5-3 smjeru
dnk polimerazom
- Novi lanac je original za sljedeci ciklus

Faze PCR

1. Denaturacija (1 min na 94-96 stepeni) i razmotaju se i razdvoje DNK

2. Hibridizacija (faza vezivanja prajmera) (1 min na 55-56 steoeni)
3. Faza ekstenzije i elongacije: taq katalizira vezivanje slobodnih nuklkeotidad na komplementarna
mjesta (1-2 min na 72 stepena)
- Faze se ponavljaju 30-40 puta i na kraju ciklusa se dobija 10 na 6 ili na 9 kopija
- Danas se koristi thermocycler koji sve to radi programirano

Vjezba PCR u analizi MTHFR gena

- Potrebno je: pcr pufer, mgcl2, rajmeri, dNTP, taq, dnk uzorka 50 ng, voda, mikropipete i tubice
za pcr i usitnjeni led i hemikalije
- Napravi se mastermix
- Prvo e sterilizira sve u 15% varikini
- Master mix da se izbjegnu geske prilikom velikog broja pipetiranja sastojaka u tubice
 - Treba preracunati potrebu kolicinu pojedinacnog sastojka za jednu tubicu /jednu reakciju
- Svi sastojci za pcr reakciju osim dnk i mnozimo ih sa brojem tubica +1 jer kontrola
- Ozace se sterilisane tubice i sve hemikalije drzimo na ledu
- Doda se master mix u tubicu pa onda DNK
- Ukupni pcr voluemn za svaki uzorak je 25 mikrolitara
- Svaki put se mijenja nastavak
- Negativna kontrola- reagense bez uzorka
- Pozitivna kontrola- stavi se dnk koja 100% ima mutaciju
- Stavi se sve u thermocycler

Detekcija rezultata pcr faze

- Moras e provjeriti je li umnozen segment putem gel elektrooreze

- Vide se pruge cija se mol tezina moze mjeriti upotrebom mol markera poznate velicine
- Ladder su veci br ekvenci dnk prema kojima uporedjujemo duzinu
- Vizualizacija bendova putem UV transiluminatora a na osnovu etidijum bromida koji se dodaje u
gel

4 vjezba

Mmultiplex pcr i detekcija azospermije i ikroelecija y hromozoma

- Istovremeno umnozavanje vise od jednog regiona dnk dodavanjem vise od 1 prajmera u

reakcijski miks
- Dizajnira se poseban set prajmera za svaki ciljni gen
- Simultana amplifikacija 10+ regiona dnk
- Parovi prajmera moraju biti kompatibilni jer se u protivnom moze inhibirati reakcija
- Primjena: identifikacija patogena, analiza mutacija, detekcija rnk, forenzicke studije, analize
roddoslova, kloniranje gena in vitro
- Otkriva mirkodelecije azoospermia faktor podrucja hromosoma y
- Glavni poremecaj je klinefelterov indrom
- Nalazi se u regiji yq11 i sadrzi podrucja AZFa, AZFb, AZFc
- Njcesce mikrodelecije su na AZFc (kod 6-12% muskaraca azoospermicnih)

Analiza mikrodelecije y hromosoma upotrebom multipleks PCR kita

- Mikropipete, tubice, usitnjeni led, dnk, cista voda i hemikalije: multipleks pcr kit i set prajmera
- Naprave se dvije smjese prajmera prajmermiks A i B (po 30 mikrolitara za 6 uzoraka)
- Mijenja se svaki put nastavak , Sve vrijeme u ledu
- Za svaki uzorak idu po 2 tubice jer se u svakoj posebno pravi a i B
- Za analizu 1 uzorka trebaju nam 2x4 tubice
- U multipleks A se stavlja multiplex pcr kit i prajmerix a , u b samo sa b
- Negativna kontrola 1- provjera kontaminacije, ispravnosti procesa, djelotvornosti hemikalija
- Negativna kontrola 2—dnk zenske osobe za svaki multipleks posebno
- Pozitivna kontrola u kojoj e nalazi mulatipleks a ili b i uzorak dnk sa mikrodelecijom
- Dnk
- Pcr thermocycler
- Analiza se vrsi na 2% agaroznom gelu i posmatranje pod UV lampom