Chương 2

Điện di gel

I. Nguyên lý chung
Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch các đại phân tử-đặc biệt là
các protein và các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng.
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực
dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực
hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và
vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix)
như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và
polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các
giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện
và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối.

II. Điện di agarose gel

Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong hai
thành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là
một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-
L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar,
được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó
được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thể
cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi
trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose).

Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trong
agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer.

Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm
sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Kỹ thuật này đơn
giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong
gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát
hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV).
Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau:
- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập
bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…).
- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi
thẩm tích Northern.
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý
hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình
điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.

1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel
1.1. Kích thước của phân tử
Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của
khối lượng phân tử của chúng (Hình 2.2). Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng
phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm.

Hình 2.2. Mối quan hệ giữa kích thước DNA và độ linh động điện di của nó

1.2. Nồng độ agarose

Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa
các nồng độ agarose khác nhau. Mối quan hệ tuyến tính giữa hàm logarithm của độ linh động điện di của
DNA (m) và nồng độ gel (t) được biểu diễn bằng biểu thức:

Trong đó
mo: độ linh động điện di tự do.
Kr: hệ số trì hoãn điện di (retardation), được thiết lập thông qua mối liên quan giữa các tính chất của gel với
hình dạng và kích thước của các phân tử dịch chuyển.
Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thước
khác nhau (Bảng 2.1). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng
độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn.

Bảng 2.1. Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khác
nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trong
một thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các
đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.

Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%.

1.3. Cấu hình của DNA

Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khối
lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. Nhìn chung, DNA của các plasmid
mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết
plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu
xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải.
 Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau

1.4. Thành phần base và nhiệt độ

Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base của
DNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của các
đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng từ 4oC đến 30oC. Nói chung, agarose
gel thường được chạy ở nhiệt độ phòng.

2. Phương pháp điện di agarose gel

2.1. Đệm pH
Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE),
Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 (Bảng
2.2). Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE
và TPE đều có khả năng hòa tan tốt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các
đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau
về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ
cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có
sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung
dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó.

2.2. Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tốt nhất trong thí
nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic). Nó dễ dàng chảy ra và tạo thành
một dung dịch trong suốt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ở các nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose
dễ bị bẩn bởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase
và RE. Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng
được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này.

Bảng 2.2. Các đệm sử dụng phổ biến trong điện di

2.3. Nhuộm DNA trong agarose gel
Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang
EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốc
nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiệu suất huỳnh quang không cao. Sau khi
nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
Thường EtBr (0,5 mg/mL) được đưa vào trong agarose gel để phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt
quá trình điện di. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc
nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện
di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ
nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5
mg/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng.
Chú ý
Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến mạnh. Vì thế, luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoặc dung
dịch chứa thuốc nhuộm.

2.4. Thu hồi DNA từ agarose gel

Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không có phương
pháp nào là hoàn toàn tối ưu. Có hai vấn đề chính: thứ nhất đa số các loại agarose đều bị nhiễm bẩn
bởi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tố
ức chế có hoạt tính của nhiều loại enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo
dòng tiếp theo sau; thứ hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của
nó, các đoạn DNA có chiều dài <1 kb có thể được thu hồi hoàn toàn, khi khối lượng phân tử của
DNA tăng thì hiệu suất chiết giảm, các đoạn DNA có kích thước >20 kb được thu hồi kém (khoảng
hơn 20% sản lượng). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một
vài phương pháp chính:

2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)
 Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho
vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn
toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách
chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các
nhân tố ức chế trong agarose.

2.4.2. Ly tâm
Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa
tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong
một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5
mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung
dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng
cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution)
DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể
đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.

2.4.3. Điện di vào bẫy

Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này
được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch
glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết
bằng pipette.
Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt
trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch
chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun
nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.

2.4.4. Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI (một loại chaotropic salt) ở nồng độ
khoảng 4 M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA
được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt
thủy tinh. Tiếp theo là các chu kỳ rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh
trong đệm muối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu
hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên
kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa.

3. Quy trình điện di

3.1. Chuẩn bị agarose gel
Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đệm 0,5× TAE (nếu khuôn đổ gel lớn thì tăng theo tỷ lệ trên).
Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nước
quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL. Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện di có cài sẵn
lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, có thể gỡ lược ra.

3.2. Đặt mẫu DNA vào giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoặc thấp. Chẳng
hạn theo tỷ lệ sau:
DNA (1 mg/1 mL) 1 mL
Đệm màu bromophenol (×10 loading dye) 1 mL
Nước cất 2 lần 9 mL
Tổng số 11 mL

Dùng micropipette hút 11 mL dung dịch trên cho vào giếng. Lưu ý mẫu chạy điện di phải có dung
tích £ thể tích của giếng.
Thường đặt mẫu sau khi đã đổ dịch đệm 0,5× TAE vào buồng điện di cho ngập gel, ít khi đặt mẫu
trước rồi đổ đệm sau (nạp khô). Để dễ làm việc nên dùng micropipette loại 20-200 mL và đặt buồng điện
di trên bàn có nền đen. Khi tăng điện áp của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển
nhanh hơn so với các đoạn nhỏ. Tuy nhiên, để có độ phân giải (resolution) tốt nhất đối với các đoạn DNA
có kích thước lớn hơn 2 kb thì điện áp được sử dụng phải nhỏ hơn 5 V/cm (giá trị cm được tính theo
khoảng cách giữa hai điện cực chứ không phải là chiều dài của gel). DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực
dương. Quan sát sự dịch chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di (Hình 2.5).

3.3. Nhuộm DNA bằng EtBr

Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5
mg/mL, trong thời gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr
vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr
thường pha sẵn ở dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ở 4oC trong tối.

Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel