Filozofia zdrowego stylu życia

Dla Kosmetologów
Cz.4.
2021

Ewa Luchter-Wasylewska
e-mail: mbwasyle@cyf-kr.edu.pl
 Funkcje nukleotydów
w komórce

1. Dawcy energii swobodnej dla

endoergicznych reakcji chemicznych
i procesów fizycznych
2. Koenzymy
3. Efektory enzymów allosterycznych
4. Cząsteczki sygnałowe szlaków
metabolicznych
5. Budulec kwasów nukleinowych
2
 AMP
Tetranukleotyd:
5’AUCG3’
AUCG UMP
5’pApUpCpG3’
pApUpCpG
CMP
{4 nukleotydy,
połączone
3 wiązaniami
fosfodiestrowymi}
GMP

3 3
Dwie antyrównoległe, komplementarne
nici polinukleotydowe

4 4
 Dwuniciowy polinukleotyd

oraz wiązania wodorowe stabilizujące dwie nici

5 5
Dwuniciowy DNA Jednoniciowy RNA

66
6
Podwójna helisa polinukleotydowa DNA

7 7
Chromosomy Eukariota
99
9
Od podwójnej helisy DNA do chromosomu

10 10
Od chromosomu do DNA

11
11 11
Czy można skopiować gen?

12 12
 Replikacja – synteza DNA na matrycy DNA

Transkrypcja – synteza RNA na matrycy DNA

Translacja – synteza białka na matrycy mRNA

Odwrotna transkrypcja – synteza DNA na matrycy RNA

13
13 13
Od genu do białka

Od białka do genu

14 14
 Enzymy
uczestniczące w metaboliźmie kwasów nukleinowych
A. Degradacja (hydroliza) kwasów nukleinowych

nukleaza = hydrolaza kwasów nukleinowych

• rybonukleaza
• deoksyrybonukleaza
▪ egzonukleaza
✓5’ 3’-egzonukleaza
✓3’ 5’-egzonukleaza
▪ endonukleaza
✓endonukleaza restrykcyjna = restryktaza

B. Synteza kwasów nukleinowych

(tworzenie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami)

•ligaza (syntetaza) DNA

•polimeraza DNA
•polimeraza RNA
15
15 15
 REPLIKACJA
czyli
synteza DNA na matrycy DNA
(polimeraza DNA i inne białka)

Semikonserwatywna
replikacja DNA

16 16
 Replikacja – biosynteza DNA

1. Synteza krótkiego odcinka RNA

(primer),
katalizowana działaniem „primazy”
(czyli polimerazy RNA biorącej udział
w procesie transkrypcji)

2. Polimeraza DNA III dołącza

deoksyrybonukleotydy,
dobudowując odcinek DNA
W procesie replikacji bierze udział wiele enzymów

•Topoizomeraza- wprowadza lub usuwa skręty z podwójnej nici DNA

przez przerywanie i ponowne łączenie jednej lub obu nici
•Helikazy - rozrywają wiazania wodorowe między nićmi matrycowego
DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu
•Primaza – syntetyzuje starter (primer, krótki odcinek RNA)
•Polimarazy DNA – syntetyzują DNA („polimeryzują”) zgodnie
z zasadą komplementranosci deoksyrybonukleotydow
•Egzonukleaza- usuwa startery RNA (po 1 nukleotydzie)
•Ligaza DNA – łączy odcinki DNA
•Różne enzymy pomocnicze

18 18
Replikacja – biosynteza DNA

Inhibitory polimerazy
DNA 19 19
 Replikacja – biosynteza DNA

Polimeraza DNA III

Koordynacja nici wiodącej i opóźnionej

20 20
 Kolejność działań podczas replikacji

1. Rozplatanie podwójnej helisy

2. Synteza primera (RNA):
primaza (polimeraza RNA)
3. Dobudowywanie oligonukleotydu DNA:
polimeraza DNA III
4. Usuwanie primera (RNA)
(po 1 nukleotydzie od 5’końca)
i dobudowywanie po 1 deoksyrybonukleotydzie
(na 3’końcu):
polimeraza DNA I
5. Łączenie odcinków DNA:
ligaza DNA
21 21
Ekspresja genu - Transkrypcja

Biosynteza RNA
na matrycy
jednej z nici DNA

22 22
 Transkrypcja
przepisanie informacji zawartej w DNA na RNA
przy udziale enzymu: polimeraza RNA

polimeraza RNA

Produkt transkrypcji, czyli RNA, nazywany jest (pierwotnym) transkryptem

23 23
 Transkrypcja

Etapy transkrypcji

• Inicjacja

• Elongacja

• Terminacja

• Potranskrypcyjna obróbka pierwotnego

transkryptu

Kodująca (sensowna) nić DNA

Niekodująca (antysensowna) nić DNA

Syntetyzowany RNA działaniem polimerazy RNA 24

24
24
 Inicjacja transkrypcji procaryota

Cząsteczka polimerazy RNA rozplata segment DNA o długości 17 pz,

co odpowiada 1,6 skrętowi helisy B-DNA. Stopień ujemnego
superskręcenia DNA zwiększa się
Bąbel transkrypcyjny
Łańcuch kodujący
(niematrycowy)

Łańcuch niekodujący
(matrycowy)

Kanał dla NTP

RNA (substraty)

Transkrypt powstaje w kierunku od 5’ do 3’ 25

25 25
 Typy RNA

mRNA – matryca do syntezy białek - koduje sekwencje

aminokwasów jednego (monocistronowy, Eucaryota)
lub kilku (policistronowy, Procaryota) polipeptydów

rRNA – buduje rybosomy (miejsce syntezy białka),

spełnia rolę strukturalną i katalityczną

tRNA – czyta informację zawartą w mRNA

(„tlumacz przysiegly”) i przenosi zaktywowane
aminokwasy do rosnącego łańcucha polipeptydowego
podczas biosyntezy białka

snRNA – small nuclear RNA – niskocząsteczkowy jądrowy

RNA (u Eucaryota)

vRNA – RNA wirusa

26 26
Dojrzały mRNA Eucaryota

Dojrzewanie mRNA
białka jaja kurzego
- owalbuminy

27 27
 aa
Dojrzewanie t-RNA

mRNA
28 28
Rybosomy i rRNA

29 29
Kod genetyczny

30 30
Ekspresja genu - Translacja

Biosynteza bialka
na matrycy
m RNA

31 31
 TRANSLACJA
Biosynteza białka na matrycy mRNA

58

Synteza białka
wymaga przetłumaczenia
języka kwasów nukleinowych
na język białka 32 32
33 33
Etapy translacji:

Aktywacja aminokwasu

Inicjacja translacji

Elongacja translacji

Terminacja translacji

Potranslacyjna obróbka
łańcucha polipeptydowego

34 34
 Transkrypcja i translacja
u Procaryotów (A) i Eucaryotów (B)

35
35 35
Antybiotyki – - inhibitory syntezy
białka
Streptomycyna i inne Hamuje inicjację i
aminoglikozydy powoduje błędne
odczytanie mRNA
Tetracyklina Wiąże się z podj 30 S i
hamuje wiązanie aa-
tRNA
Chloramfenikol Hamuje aktywność
transferazy peptydowej
Cykloheksimid Hamuje aktywność
transferazy peptydowej
Erytromycyna Wiążą się z podj 50S i
hamuje translokację
Puromycyna Powoduje przedczesna
terminacje syntezy
polipeptydu – analog aa-
tRNA

36 36
Odwrotna transkrypcja

37
37
 Inżynieria genetyczna

– świadoma i celowa (kontrolowana przez człowieka) ingerencja

w materiał genetyczny organizmów,
w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych

Polega ona na wprowadzaniu do komórek organizmu,

którego cechy chcemy zmienić (biorcy),
określonego odcinka DNA innego organizmu (dawcy)

38
Rekombinowane białka

39
 Białka rekombinowane

są to białka uzyskiwane z rekombinowanych genów,

czyli cząsteczek DNA złożonych

z różnych fragmentów kwasów nukleinowych

Ich zastosowanie pozwala

na wydajną produkcję tych peptydów,

które w naturalnych warunkach występują

w niewystarczających ilościach,

np. insuliny stosowanej w farmaceutyce

i podpuszczki niezbędnej do produkcji serów 40

Wiele białek, głównie enzymów
jest powszechnie wykorzystywanych w przemyśle
chemicznym
(np. przy produkcji proszków do prania)
i spożywczym
(np. renina do produkcji serów podpuszczkowych)
Dawniej wszystkie białka pozyskiwano z tkanek żywych organizmów

Jednak ze względu na nieustannie rosnące zapotrzebowanie,

tego typu metody okazały się mało wydajne

Problem niedoboru rozwiązano dzięki rozwojowi biotechnologii

Zastosowanie technik rekombinacji DNA

umożliwiło masową produkcję
prowadzoną w specjalnych systemach komórkowych,
to znaczy w bakteriach, drożdżach, roślinach i zwierzętach,
do których za pomocą odpowiednich wektorów
wprowadzono namnożony
transgen - fragment genu kodującego pożądane białko 41
 Produkcja białek rekombinowanych
Białka są związkami wielkocząsteczkowymi zbudowanymi z reszt aminokwasów.
Stanowią one największa grupą związków organicznych i pełnią wiele ważnych
funkcji życiowych w wytwarzających je organizmach
▪wchodzą w skład struktur komórkowych i płynów ustrojowych
(kolagen, keratyna, albuminy)
▪transportują i magazynują różne substancje (hemoglobina)
▪warunkują odpowiedź immunologiczną organizmu (przeciwciała)
▪regulują procesy metaboliczne (hormony, enzymy)
oraz procesy krzepnięcia krwi (fibrynogen)
Niedobór lub niewłaściwe funkcjonowanie białek
tanowi przyczynę wielu groźnych chorób
Jedynym możliwym sposobem ich leczenia jest regularne uzupełnianie
powstałych braków, np. podawanie insuliny osobom cierpiącym na cukrzycę. 42
Rekombinowane białka stosowane w medycynie

43 43
Synteza proinsuliny w bakteriach

44 44
 Klonowanie DNA

Klonować to znaczy zrobić identyczne kopie

Klonowanie
oryginalnie znaczyło procedurę izolowania jednej komórki
i pozwolenie jej reprodukować się, wytwarzając populację
identycznych komórek, potrzebnych do badań

Klonowanie DNA
wymaga oddzielenie specyficznego genu lub segmentu DNA
z dużego chromosomu, przyłączając go do cząsteczki
przenośnikowego DNA, a następnie replikacji tego
zmodyfikowanego DNA tysiące lub miliony razy, zarówno
przez wzrost ilości komórek, jak i wytworzenie wielu kopii
klonowanego DNA w każdej komórce
45
45 45
 Klonowanie DNA

1. Plazmid (wektor klonowania) jest

nacinany endonukleazą
restrykcyjną
2. Fragment DNA jest uzyskiwany
przez nacinanie
chromosomu endonukleazą
restrykcyjną
3. Fragmenty są przyłączane do
wektora (ligaza DNA)
wektor rekombinowany
4. DNA jest wprowadzany do komórki
gospodarza
(transformacja = infekcja
wirusowa bakteryjnej
komórki gospodarza)
5. Klonowanie – wytwarzanie wielu
kopii rekombinantowego DNA

46 46 46
Konstrukcja cząsteczki
rekombinantowego DNA

Manipulacje w inżynierii
genetycznej
Sekwencje palindromowe
Miejsce działania restryktaz
- Endonukleaz restrykcyjnych
47 47
Aby możliwa była ekspresja zrekombinowanych genów,
konieczne jest zastosowanie specjalnych
wektorów ekspresyjnych

Nośniki te, oprócz elementów typowych dla wektora

klonującego, zawierają również silny promotor, który umożliwia
produkcję dużej ilości białka w komórce biorcy

Wektory mogą być ponadto zaopatrzone

w sekwencje regulujące stabilność syntetyzowanych peptydów
i warunkujące sekrecję produktu docelowego,
czyli jego wydzielanie poza komórkę gospodarza

Ich obecność znacznie ułatwia izolację

i oczyszczanie pożądanej substancji

48
49
 MUTACJE

Mutacje to zmiany struktury DNA

powodujące zmiany informacji genetycznej

50 50
 MUTACJE

1. Nukleotydy i kwasy nukleinowe ulegają wielu różnym

spontanicznym przemianom struktury kowalencyjnej:
a. Dezaminacja
b. Depurynacja

2. Naświetlenie UV, X, gamma

3. Działanie związków chemicznych (mutagenów):

a. Związki dezaminujace
b. Związki alkilujace

4. Interkalacja

5. Inne

51 51
 W komórce wykorzystywane sa
różne systemy naprawcze DNA

Przyczyną licznych rodzajów nowotworów złośliwych

są niesprawnie działające
systemy naprawy DNA

52

52
Topnienia DNA działaniem temperatury

53
 Izolacja białek z tkanki

gdy jest duża zawartość białka w tkance

54
 Rozdział składników komórki
A B

C C.
2.
1.

Ultrawirowanie
W wyniku ultrawirowania I. Nadsącz 150 000 g
cytoplazmy oddziela się
roztwór białek, enzymów,
RNA oraz związków
drobnocząsteczkowych

od osadu zawierającego
cząstki i organelle II. Osad
55 55
Rozdział homogenatu tkanki za pomocą wirowania i ultrawirowania
1. Homogenizacja
2. Wirowanie
500 g

I. Osad
frakcja jądrowa
3. Ultrawirowanie
10 000 g

II. Osad
4. Ultrawirowanie frakcja
100 000 g mitochondrialna

III. Osad
frakcja
mikrosomalna
56 56
 OCZYSZCZANIE BIAŁEK
– rozdzielanie mieszaniny białek oparte na różnicach:
masy cząsteczkowej,
kształtu,
gęstości,
rozpuszczalności,
ładunku, itd
• Wysalanie
• Wirowanie i ultrawirowanie
• Chromatografia
• sączenie molekularne
• jonowymienna
• powinowactwa
• Elektroforeza
• w żelu agarozowym
• w żelu poliakrylamidowym (PAGE)
• w żelu poliakrylamidowym w środowisku detergentu
anionowego, soli sodowej siarczanu dodecylu, SDS (PAGE-SDS)

57 57
58