UNIVERSITATEA TITU MAIORESCU FACULTATEA DE MEDICINA BUCURESTI IMUNOLOGIE LUCRARI PRACTICE PENTRU STUDENTII LA FACULTATEA DE MEDICINA MANOLE COJOCARU BUCURESTI 2009CUPRINS Teste imunologice in laboratorul clinic Reacfia antigen-anticorp A. Reactii imnochimice folosite in laboratorul clinic 1, Reactia de precipitare a) Reactia de precipitare in mediul solid ~ Difuzia in gel - Imunodifuzia radiala simpla ~ Dubla difuzie in gel - Difuzia combinat& cu migrarea electroforetic& - Imunoelectroforeza - Contraimunelectroforeza - Blectroimunodifuzia - Imunofixarea b) Reactia de precipitare in mediul lichid ~ Reactia de precipitare in inel - Imunonefelometria 2, Reactia de aglutinare a) Reactia de aglutinare directa b) Reacfia de aglutinare indirect ©) Reacfia de inhibare a aglutinarii 4) Reacfia de aglutinare mediatl de anticorpi anti-imunoglobuline 3, Reactia de neutralizare 4, Reacfii ce utilizeaz complement a) Reacfia de fixare a complementului b) Testul de imunohemoliz& pasiva in prezenfa complementului ©) Determinarea imunohemolitica a complementului 5, Reacfii cu reactivi marcati a) Reactia de imunofluorescenfa ~ Reacfia de imunofluorescenfa direct - Reacfia de imunofluorescenfa indirect’ Reactia de imunofluorescenfa cu fixarea complementului radioimunologica imunoenzimatici -Tehnica ELISA 6. Tehnica Western Blot B. Metode gi tehnici de imunocitologie 1, Tehnica pentru celule lupice 2. Testul reducerii NBT 3, Chemiluminiscenta 4, Testul inhibifiei aderentei leucocitelor 5, Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei in flux 6. Testul de transformare blastici a limfocitelor 7. Reacfia de limfocitotoxicitate C. Principalele reactii antigen-anticorp si aplicatiile acestoraTeste imunologice in laboratorul clinic Imunologia clinicd foloseste numeroase tehnici pentru studiul proteinelor care mediazi imunitatea umorala, ca si pentru studiul celulelor care uau parte la imunitatea celular Analiza imunologica este considerati ca una dintre cele mai de varf tehnici din domeniul biomedical. Find foarte costisitoare, aceasta a pitruns cu dificultate in laboratoarele clinice. ‘Complexitatea gi evolutia rapid a acestor tehnici au facut necesari conturarea unui departament specializat in cadrul laboratorului clinic, care se ocup& cu metodele imunologice de diagnostic (imunodiagnostic). Domeniile mai nou dezvoltate sau in curs de dezvoltare in laboratoarele clinice cuprind: imunochimia, imunocitologia, histocompatibilitatea, radioimunoanaliza, enzimimunoanaliza. Imunitatea celulara se studiaza printr-o serie de teste de imunocitologie. Metodele de imunochimie adue informafii asupra unor proteine din sange si alte lichide biologice. De obicei se folosesc antigenul (Ag) necunoscut si reactivul, anticorpul (Ac) cunoseut. Metodele de analiza imunochimica cuprind operafiile de obfinere si purificare a Ag si Ac si de masurare a reacfiilor dintre acestea. Masurarea reacfiei Ag-Ac permite atit estimarea cantitativa a Ag cit si caracterizarea acestuia sub aspect imunochimic. Metodele cele mai utilizate in analiza imunochimica se bazeaza pe reactia Ag-Ac Reacfia dintre un Ag si un Ac presupune legarea gruparii determinante a Ag (epitop) de situsul de combinare al Ac (paratop). Legarea este dependenti de complementaritatea sterici a Ag si Ac si se realizeazi cu participarea unor fore de legitura necovalente (forfe van der Waals, forfe electrostatice, legaturi de hidrogen gi legaturi hidrofobe) care asiguri stabilitatea complexului Ag-Ac. Caracteristica general a reactiei Ag-Ac este specificitatea, adic capacitatea ac de adiscrimina Ag omolog de alt Ag. Specificitatea ag nu este absoluta. Reactia inerucisatt are loc cfind un ag reacfioneaz cu un Ac format fafa de un alt Ag. Ag care reactioneaz cu un Ac produs fafii de un alt Ag se numeste Ag cross-reactiv sau Ag cu reactivitate incrucisata. Reactia incrucisati a Ag este datorati faptului ci Ag posed in comun anumite grupiri determinante, fie ci intre grupirile determinante existi 0 asemanare chimic& ce nu poate fi decelati de Ac. Reactiile incricigate de tip I. Capacitatea a dowd Ag de a reactiona cu acelasi situs de combinare de pe aceeasi moleculi de Ac (ex. Ag proteice ce dau reacfii incrucigate din cauza diferenfei foarte mici a secvenfei de aminoacizi glicina nu poate fi deosebit& de alanina) Reacfiile incricisate de tip MH. Capacitatea unui Ag de a reactiona cu o subpopulatie de Ac dintr-un ser heterolog care confine Ac fafi de un alt Ag partial aseminiitor cu primul Reacfia Ag-Ac se desfagoari in unul sau mai multe stadii: = interacfiunea primari se datoreste legarii efective a ac cu ag si depinde de cantitatea si afinitatea Ac. Tehnicile care evidentiazi interactiunea primari ag-ac sunt tehnici curente de diagnostic (ex. nefelometria). In vivo, interacfiunile primare participa Ja protectia gazdei (neutralizarea toxinelor, inhibarea actiunii unor virusuri sau bacterii) sau la declangarea unor reacfii anafilactice~ interacfiunea secundari urmeazi celei primare (dup aprox. 30. min.) Produsul final este complexul ag-Ac insolubil. Interacjiunea secundara sti 1a baza tehnicilor imunochimice (reacfiile de precipitare aglutinare, fixare de complement, neutralizare). - interacfiunea terfiard prezinti 0 complexitate mai mare decat cea secundars., Depinde de variabilele gatdei (receptori pentru Ag, complement, mastocite). Pot determina protecjia gazdei (neutralizarea virusurilor, imobilzarea bacteriilor) sau degranularea celulelor (fenomenul Arthus, socul anafilactic) Reacfia antigen-anticorp Imunochimia disciplin’ de granif’ a imunologiei si biochimiei studiazi substanfele $i procesele chimice ce participa la reacfiile imunologice. Metodele cele mai utilizate in analiza imunochimicd se bazeazA pe reactia Ag-Ac, utilizind procedee care rezulti din imbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice, primele conferind analizei precizie si acuratefe, iar ultimele asigurnd sensibiliate gi specficitate. Datele furnizate de metodele imunochimice (calitative sau cantitative) pot conduce uneori la informafii prejioase pentru diagnostic, adesea rezultatul de laborator capaiiti valoarea informativa realli numai daca interpretarea acestuia se face in contextul clinic, 1. Reactia antigen-anticorp (Ag-Ac) are o mare putere de rezolutie. in fapt, prepararea anticorpilor prin imunizarea repetati a unui animal (epure, soarece, capri, etc...) cu un antigen dat conduce in general la obfinerea anticorpilor puternici si specifici, adic capabili si recunoasci selectiv antigenul in prezenfa numeroaselor substanfe, astfel prin reactia Ag-Ac, si detectim si si dozim selectiv in ser o protein (hormon, enzim’, etc.) prezenti la o concentrafie de cfteva picograme/ml, ceea ce reprezint& mai putin de o miliardime din confinutul proteic al serului, Aceasti caracteristica cu rezolutie crescutd fine de energia crescutl a reactiei Ag-Ac (reactie sigur non-covalent dar datorati unei adaugari de numeroase legituri unitare ca legituri electrostatice, punti de hidrogen, interacfii hidrofobe) si altor forme reduse (complementaritate intre structura epitopului Ag si aceea a situsului Ac). 2. Selectivitatea fiectrei reactii nu este absolut’. Aceasta admite o anumitt degenerescenfa: un Ac dat poate recunoaste mai multe Ag putin diferite cu preful unei diminu&ri a energici de legare. fn practici, acest fenomen fundamental este descris prin observarea reactiei “incrucigate” dintre diferite substante fafi de acelasi Ac. inaintea oricarei aplicatii a reactiei Ag-Ac trebuie sine asigurim de specificitatea funcfiei verificind cl in condifiile de utilizare, singurul Ag vizat este semnificativ recunoscut. 3, Rescfa Ag-Ac prezint un domenin de aplicare extrem de ar: detectarea antigenelor sau anticorpilor: se poate aplica la dozarea medicamentelor, hormonilor peptidici, antigenelor virale sau bacteriene gi chiar Ac cand, de exemplu, se poate explora rispunsul individului la un element patogen (serodiagnostic)- evaluarea cantitativa a Ag gi Ac: reacfia Ag-Ac este de fapt adaptabila la dozarea proteinelor plasmatice foarte reprezentate (imunoglobuline, transferina, ete), de asemenea, pentru substanje foarte rare (anumifi markeri virali, hormoni, etc.). Concentrafiile fiind intre 10 si 10"? M), 4, Reacfia Ag-Ac necesiti objinerea unui semnal secundar pentru a fi detectabil. Aceasta poate si se formeze in timpul reacfiei (ex. hemaglutinarea), fie s& fie preformata prin marcarea prealabili a Ag sau Ac prin markeri radioactivi, enzimatici sau alfii, Reactiile din prima categorie fac fn general apel la formarea unei rejele Ag-Ac de dimensiune mare, prin prezenfa de cel putin doud situsuri Ac pe imunoglobuling si de cel putin doi epitopi pe Ag. Aceasti refea se traduce prin aglutinare (eritrocitele acopera Ag) sau prin precipitarea (cazul antigenului macromolecular care formeaz o refea cu Ac). Reactiile din a doua categorie se subdivid in doua subtipuri: ~ Reactii prin competitie: 0 cantitate limitat® de unul sau doi compusi (ex: Ac) este pus in prezenfa esantionului de dozat gi o cantitate minima de element marcat (ex.. Ag radioactiv). Concentrafia de Ag din esantion va influenta negativ valoarea de legare a Ag marcat cu Ac (prin efect de competitie pentru o cantitate limitati de situsuri) Antigenul marcat find singurul decelabil (in contorul de radioactivitate), nivelul siu de legare va servi la stabilirea etalonajului reacfiei (ex.: dozarea de medicamente). - Reacfiile prin imunoextractie: reactivii (ex. Ac) sunt din contra in exces si captezi in totalitate substanfa de dozare. Cazul clasie este dozarea “in sandwich” unde antigenul de dozat este fixat prin doi Ac care servesc la insolubilizarea pe o suprafafa (peretele eprubetei) si altul aduce semnalul detectabil (Ac marcafi prin izotop sau o enzim®), in acest caz, semnalul va fi funcfionarea directa a concentratiei de Ag si acesta este Ac marcat veare permite etalonarea; Tehnicile de imunofluorescenti pe cupe sunt un alt exemplu de imunoextragere: antigenul (parazit, bacterie, virus) prezent in preparatul etalat pe lama este recunoscut de Ac marcat (produs fluorescent). Spailarea rapida permite si eliminm Ac in exces (nefixafi) apoi fixarea este relevatd la microscopul cu fluorescenfi pentru diagnosticul direct. Numeroase tehnici utilizate in imunologie sunt asemndtoare celor din stiinfele biologice (ex: metodele de izolare a antigenelor gi anticorpilor sunt asemfinatoare cu cele din biochimie utilizate pentru separarea fracfiunilor proteice). Totusi, in imunologie se utilizeaza i tehnici proprii, cum sunt reactiile Ag-Ac (ex: tehnicile de imunofluorescenta, imunodifuzie in gel, radioimunologice si imunoenzimatice). {n functie de natura Ag si de metodele aplicate pentru evidengierea reacfiei Ag- Ac, acestea se pot imparti in reactii de precipitare, aglutinare, neuralizare, reacfii care folosesc complement sau reactivi marcafi (fluorocromi, izotopi, enzime).imnochimice folosite in laboratorul clinic Reactivii imunochimici sunt produse biologice (Ac, Ag, C, hematii), ce se utilizeazi pentru determindri calitative sau/si cantitative de Ag sau Ac. Pentru a furniza informatii corecte, reactivii imunochimici trebuie folosifi conform instrucfiunilor de utilizare. Persoanele care executi tehnici imunochimice trebuie s8 verifice in permanen{a instructiunile de utilizare a produselor, inet permanenta optimizare a acestora se reflecta si in modificarea instructiunilor respective. Manipularea reactivilor imunochimici trebuie facuta finand cont de toate normele de protecfia muncii in vigoare) 1. Reacfia de precipitare in cazul reactiei de precipiatere, Ag este 0 macromolecula solubilé. Reactia de precipitare poate avea loc in mediul solid (difuzia in gel) sau in mediul lichid. Formarea precipiatului depinde de: cantitatea si concentrafia Ag, calitatea si concentrafia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul de reacfie, confinutul in lipide al antiserului, etc. Compozitia precipitatului imun, proportia de combinare a Ag cu Ac sunt variabile in funcfie de zona in care a avut loc precipitarea: exces de Ag, echivalenfa sau exces de Ac. a) Reactia de precipitare in mediul solid Difuzia in gel Difuziile in gel se grupeaza in trei categorii: difuzia simpla, difuzia dubla, difwzia combinat& cu migrarea in camp electtic. Se utilizeaza gel de agar sau agaroz in concentrafie de 0,8-1,6 g % (contimutul mare de ap permite moleculelor de Ag si Ac si migreze liber in gel). Difuzia poate fi accelerata de aplicarea unui camp electric (contraimunoelecroforeza). fn cazul dublei difuzii, are loc difuzia ambilor reactani, in acazul difuziei simple are loc difuzia unuia cAtre celalalt reactant inglobat in faza solida. intr-o zona relativ fngusti se creeaz datoriti gradientului de concentrajie conditii optime pentru imunoprecipitare. fn gelul transparent apar linii sau zone opace. Liniile se pot deplasa pana cdnd se ajunge la echilibrul sistemului ag-Ac. Nivelul liniilor corespunde numarului minim de sisteme Ag-Ac. Imunodifuzia radiala simpli Imunodifuzia radiali simpli sau imunodifuzia simpli bidimensionala a fost imaginati de Mancini, Carbonara si Heremans in 1965. Aceasti metoda presupune difuzia unui reactant (in faza lichida) intr-un gel in care este inglobat celalalt reactant. in aceast& tehnic& Ac trebuie si fie in stare pura.Dimensiunea haloului de precipitare este direct proporfional cu concentrafia Ag ce difuzeazi si invers proporfionala cu concentrafia i indljimea de gel in care sunt inglobati. Existen{a unei proporfionalititi directe intre concentratia Ag si diametrul zonei de precipitare pentru difuzia complet Mancini permite trasarea curbei etalon prin masurarea diametrelor de precipitare a cel pufin trei concentrafii ale unui Ag de refering. Pentru obfinerea unei dimensiuni convenabile a zonei de precipiatre si un contur bine delimitat, concentratia Ac inglobat in gel trebuie aleas& in funcfie de titrul antiserului sicconcentratia Ag testat. Cantitatea de Ag introdusé in godeuri nu trebuie s& depageasc capaciatea de legare a Ac inglobat. Timpul necesar difuziei complete este in funcfie de temperatura la care are loc reactia (37°C), de greutatea molecular’ si concentratia Ag. Imunodifuzia radial& simpli efectuata in condifii optime prezint& coeficientul de variafie sub 10%, iar sensibilitatea este de 2 |ig/ml. Concentrajia Ag (proteinei) se stabileste in functie de curba etalon trasaté cu trei dilufii ale serului dereferinja. Rezultatele metodei se exprima in mg/dl. Aplicafii posibile sunt determinatile cantitative pentru: imunoglobuline (IgG, IgA, IgM), complement (C3), alfa-I antitripsina, siderofilina, proteina C-reactiva (CRP), etc. Dubla difuzie Ouchterlony Dubla difuzie a fost imaginata de Ouchterlony gi Elek in 1948. Tehnica se poate efectua in mai multe variate. fn laboratorul clinic se foloseste tehnica cu 4-6 godeuri rotunde dispuse in jurul unui godeu central. Liniile de precipitare se formeazA la distanfe constante pentru fiecare sistem Ag- Ac. Se deseriu trei tipuri de reacfi: - reacfia de identitate completa in care cele dou Ag sunt complet identice: antiserul confine Ac specifici fafa de Ag; liniile de precipitare deviaz si fuzioneazit complet in zona central + reacfia de neidentitate, absenfa deviatiei liniilor. Antiserul confine Ac diferiti faffi de cele dou’ Ag neinrudite, liniile de precipiatre se intersecteaz = reacfia de identitate parfialé (fuziune parfialé a liniilor). Cele dowd Ag prezint& ‘un numar de grupiri determinante comune, dar confin si unele distinete; antiserul are Ac fafi de cele doua grupari Ag; linia de precipitare este curbata ca urmare a fuziunii parfiale acelor doua linii si prezint& un mic pinten. Aplicafii posibile sunt determinarile calitative pentru: proteinele Bence-Iones tip kappa si lambda, crioglobuline, Difuzia combinata cu migrarea electroforetic’ Mobilitatea proteinelor in gelul supus cAmpului electric se datoreste incarctrit electrice a proteinelor si curentului electroendosmotic (migrarea tamponului spre catod). La pH-ul la care se efectueaza electroforeza (EF), agarul se incarcé negativ, tamponul din porii acestuia se incarca pozitiv si la aplicarea cAmpului electric migreaza spre catod.Deplasarea tamponului este invers migcirii proteinelor, care la pH-ul neutru sau alealin migreaza spre anod (+). Daci electroendosmoza este mai mare decft viteza de deplasare a proteinelor spre anod, acestea vor fi deplasate spre catod (-), desi sunt incarcate tot negativ (ex. gamma globulinele se deplaseaza catodic la imunoeletroforeza si contraimunoelectroforeza). Viteza fluxului osmotic este direct proportional cu diferenfa de potential si concentrafia gelului gi invers proporfionala cu forfa ionica a tamponului Viteza curentului electroendosmotic este de trei ori mai sciizutt in gelul de garozi comparativ cu cel de agar, probele trebuie analizate, nu trebuie plasate la mijlocul lamei asa cum se procedeazit in cazul gelului de agar. Imaginile de electroforez se citese cu ochiul liber (intensitatea spoturilor migrarii), cdtre anod a albuminei; cdtre catod alfa, beta, gama globulinele. Imunoelectroforeza Metoda a fost imaginati de Grabar si Williams in 1953. Transformarea intr-o microvarianté executat& pe lame de microscop se datoreste lui Scheidegge in 1955. Imunoelectroforeza reprezinti asocierea electroforezei cu dubla difuzie. in prima etapa are loc electroforeza proteinelor, urmati de dubla difuzie cu un antiser corespunzitor. Reacfia Ag-Ac se vizualizeazi prin linii de precipitare corespunzaitoare sistemelor Ag-Ac din reactie. Imunoelectroforeza (IEF) oferi numai informafii calitative in diagnosticul gamapatiilor monoclonale. Metoda ilustrazi in cazul componentei monoclonale a Ig, lasa si tipul de Ig patologice. Metoda se foloseste pentru studiul puritifii unui Ag sau Ac. Imunoelectroforeza bidimensionala cantitativa a fost imaginat& de Ressler (1960), Laurell (1965), Clarke gi Freeman (1968). Metoda combina EF in gel de agaroz cu imunodifuzia. Contraimunelectroforeza Metoda a fost imaginata de Bussard (1959), CIEF reprezinti o dubla difuzie in care deplasarea Ag gi Ac este accelerata de un cémp electric. in gelul de agar sau agarozi la pH 8,2-8,6 Ac se deplaseazi spre catod (-), Ag migreaza citre anod (+). Reactia este mai sensibilA $i mai rapid& decat dubla difuzie. CIEF oferi informafii calitative i semicantitative. Electroimunodifuzia EID a fost imaginata de Laurell (1965). Se realizeaz4 prin clectroforeza Ag in strat de gel ce confine Ac monospecifici.. Preciptatul Ag-Ac apare sub forma de rachete (conuri) a clror indlfime ste direct proportionala cu concentrafia Ag gi invers proporfionalai cu cea a Ac. Reacfia are sensibilitate mai mare decat IDRS. in cazul Ig se utilizeaz ca suport agarul sau agaroza. IgG migreazi anodic in gelul de agar. IgA si IgM migreazA citre anod in gelul de agaroza,Reacfia prezint& unele dificultiti la efectuare. Imunofixarea Metoda a fiost imaginata de Alper si Johnson (1969). Cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au comun EF probei in gel, combinati cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de citre celilalt (imobilizarea Ag de citre ac cunoscut, fie invers). Precipitatele se evidentiaza dupa colorare. Metoda se utilizeazi pentru stabilirea clasei si tipului de Ig monoclonala pentru diagnosticul imunochimic al bolii lanfurilor grele si pentru diagnosticul deiferenfial al hipergamaglobulinemiilor monoclonale. b) Reactia de precipitare in mediul lichid Unmare a reacjiei Ag-Ac in mediul lichid se formeazi complexe care precipit cénd cei doi reactangi se gisesc in anumite proporfi. Inhibarea reactiei este determinati de excesul unuia dintre acestia. Reacfia este mai sensibila pentru evidenfierea Ag (Ac participa la formarea complexelor in proportie mai mare). Reactia de precipiatre in mediul lichid presupune existenfa a cel pufin doi determinangi antigenici pe molecula de Ag. Curbele de precipitare. Prin adiugarea unr concentraii crescitoare de ag la concentrafii constante de Ac, in urma izoliii si analizArii precipitatelor si supernatantelor obfinute, se pot trasa curbe de precipiatre ce releva existenfa a trei zone distincete, - zona excesului de Ac (precipitatul creste la 0 noua adiugare de Ag) - zona de echivalenfa (precipitatul rimane constant la 0 nou& adaugare de Ag) - zona excesului de Ag (precipiatul scade la 0 nouf addugare de Ag) Se cunose doua tipuri de curbe de precipiatre in mediul lichid. - curba de tip iepure. Prezint’ un maxim rotunjit, indiferent de natura chimicd a ag. Precipiatul este mai mult sau mai pufin solubil in exces de Ag, dar insolubil in exces de Ac. - curba de tip cal (curba de floculare). Curba pentru Ag proteice nu trece prin origine. Precipitatul este solubil atat in exces de Ac cat gi in exces de Ag. Reactia de precipitare in inel ‘Ag si Ac se pun in contact ineat si nu se amestece, La interfafa celor doi reactanti apare un inel de precipiare. Reacfia de precipitare in mediul lichid se efectueaza in tubul capilar. Imunonefelometria in prezen{a unei cantititi fixe de Ac sau Ag, complexele Ag-Ac precipitate intr-o suspensie, modifica intensitatea si dispersia luminii proportional cu concentrafia Ag sau Ac.Complexarea Ag cu Ac specific atinge o valoare maxima stabil in aprox. 60 sec. Deoarece formarea complexelor care disperseazi lumina este dependent de prezenta in proporfii optime a moleculelor de Ag si Ac pentru 0 cantitate constant& de Ac (respectiv Ag), gradul de complexitate creste proportional cu cantitatea de Ag (respectiv de Ac) pind la un maximum, dupa care Ag in exces determina sciderea progresiva a complexitifii; din aceasti cauzi se recomand’ ca determinarile nefelometrice si fie executate in exces moderat de Ac. Avantajele constau in rapiditatea objinerii rezultatelor (automatizarea determinarilor) Eyvaluarea se exprima in mg/l, automat in functie de curba existent in memoria nefelometrului Dezavantajele nefelometriei constau in costul ridicat al aparaturii si imposibilitatea determin&rii directe a proteinelor in probele icterice, hemolizate sau lactescente. Metoda este limitata si de deficienfe ce pot s& apard in sistemele mecanice gi electronice ale instalafici. 2, Reacfia de aglutinare Aglutinarea reprezint& agregarea de particule prin Ac. Ac reactioneaza cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafata unor particule (bacterii, hematii, latex) gi determina aglutinarea acestora. Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenfa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult ‘mai aglutinanfi decdt cei care apartin clasei IgG), densitatea determinanfilor antigenici de Ja suprafafa particulei, forfa ionicd a mediului in care are loc reactia. Aglutinarea se datoreazi scliderii forfelor de respindgere electrostatice dintre particule gi creeri unor punti de legaitura prin intermediul Ac. Reactia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decit reactia de precipitare (Ag este o particula gi nu o molecula solubila), excesul de Ag nu inhibi reacfia, concentrajiile mari de ac pot inhiba reactia si produce fenomenul de prozond, raportul intre Ag-Ac este tot in favoarea ac (ca gi la precipitare). Ac reactioneaz’ numai cu determinantul Ag specific. Alzturi de Ac aglutinanfi exist Ac neaglutinanti (blocanti sau incomplefi) si Ac care aglutineaz& numai la rece (+4°C). Reacfia de aglutinare direct Aglutinarea directa (aglutinarea simpla, clasicd) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de catre Ac specifici (ex. determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriana) Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescuta prin tratarea celulelor cu cenzime sau prin executarea reacfiei in mediul cu vascozitate crescutt. Reactia de aglutinare indirect Aglutinarea indirect (pasiva) este o reactie ce presupune particule naturale sau artificial (hematii, stafilococ protein’ A, latex) incircate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de catre Ac, respectiv Ag omolog din proba.-Se disloca usor butonul de celule gi se observa aparitia aglutinarii Reactivul anti-D Anticorpi monoclonali umani din clasa IgM, obfinufi din culturi celulare Se pistreazi la 2-8°C Conservare cu NaN3-0,1% Reactivul este pentru diagnosticul in vitro Reactivi Confine anticorpi monoctonali de origine umand din clasa IgM, obfinut din culturi celulare. Specificitatea si reproductibilitatea sunt proprietifi bine cunoscute la anticorpii monoclonal. Majoritatea reactivilor anti-D monoclonali apartin clasei de IgM. Modul de lucru 1 Testul pe lamei A, Testul rapid ‘Testul trebuie efectuat pe o suprafafai ce are temperatura cuprinsé intre 20-37°C -Se pune o picituri de reactiy Anti-D pe lama -Se adaugi o picituri mici de singe total. Se omogenizeaza bine. -Se roteste energic lama 2 min, Se observa dac& apare aglutinarea -Se citeste rezultatul dupa 2 min. (suprafata uscat& poate fi interpretati ca o reacfie fals- pozitiva. B, Testul cu incubare Se poate folosi singe total sau suspensia de celule -Se prepara o suspensie de 5-10% din celule ce trebuie testate in solutie salina izotonicd sau se foloseste singe total -Se pune cate o picitura de reactiv anti-D in cerculefele lamei, ce se vor folosi ~Se adauga o picdtura de suspensie sau o picitura mick de singe total gi se omogenizeazi bine ~Se incubeaz 30 minla 20-37°C -Se agiti ugor lama gi se observa aglutinarea II. Testul in tub -Se pregiiteste o suspensie 3-5% din celule ce trebuie testate in solute salina izotonicd -Se pune o picituri de reactiv anti-D in tubul-proba -Se adauga fn fiecare tub o picdturd din suspensia de celule si se omogenizeaza bine ~Se centrifugheaza 2 min. la 1000 rpm -Se disloca ugor butonul de celule si se observa prezenta aglutindii, Dac reacfia este negativa se incubeaza tubul 15 min, la 20°C, se centrifugheaz& 2 min la 1000 rpm, se disloc& ugor butonul de celule gi se observa aglutinarea,Anti-A Anti-B Anti-AB Grupa A + - + Grupa B + + Grupa 0 : : - Grupa AB + + + Testul pentru determinarea anticorpilor antistreptolizina O Reacfia ASLO Test calitativ si cantitativ pentru explorarea stirii de imunitate antitoxicd fata de toxinele streptococului. Testul este bazat pe reacia de aglutinare. Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecfii streptococice, ca si a celui de reumatism articular acut (RAA). Menjinerea titrului ASLO crescut chiar gi la cfteva luni dupa puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al boli Principiul metodei Reactivul folosit este o suspensie de particule latex de polistiren incdreate cu streptolizina O stabilizata, Reactivul a fost astfel preparat incit, in prezenfa unui titra ASLO normal de 200 ui/ml sau mai crescut, si dea o aglutinare vizibilA a particulelor latex, fri diluarea serului. Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de 5 ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 ml 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 plicuff pe care se efectueaza reactia Material biologic Serul de cercetat trebuie si fie clar gi proaspat. Plasma, serul lipemic ori contaminat poate determina erori in obfinerea rezultatelor. Dacd testul nu poate fi efectuat imediat, atunci serul se pistreazii la 2-8°C, maximum 72 ore. Pentru o perioad& mai indelungatt serul trebuie si fie pistrat congelat. Modul de lucru 1 Testul ASLO calitativ -Se aduc reactivii si probele la temperatura camerei inaintea folosirii cu 30 min -Se pun 2 picaturi (50 yl) de control (+) in unul din cercurile placutei de testare.-Se pun 2 picdturi (50 jl) de control (-) in al doilea cere. -Cu o pipeti se pun cate o picdturd de ser (45 il) din fiecare proba in cercurile urmitoare -Se agit usor suspensia de reactiv latex si se pune in fiecare cere folosit cate o picituri de reactiv. Pentru omogenizare se foloseste un befigor pentru fiecare test in parte. -Se roteste plicufa 2 min gi se citeste aglutinarea imediat langd o sursa de lumin8, I. Testul ASLO cantitativ -Se adue reactivii gi probele la temperatura camerei, inainte de folosire cu 30 min. Se dilueaz probele 1/2; 1/4; 1/8 1/16 in solutie salina izotonica. Se pot face dilufii si mai mari daci este necesar -Se pune 1 picituri (45 yl) din fiecare dilufie in succesiunea de cercuri ale plicufei de testare Se agit reactivul latex si se adauga o picdturdi de reactiv in fiecare cere de testare. -Se omogenizeazai cele dou’ picituri folosind un befigor pentru fiecare prob Se roteste usor placa 2 min. si se citeste rezultatul imediat in dreptul unei surse de lumina Interpretarea testului Reacfia ASLO negativa: objinerea unei suspensii liptoase, fri aglutinare, ca cea observatii la controlul negativ Reacfia ASLO pozitiva: obfinerea unei aglutinari observaté in cercul probei asemandtoare cu cea observati la controlul pozitiv. Reacfia ASLO indica starea de imunitate antitoxica fafa de streptococ. Valori normale: intre 0-200 ui Valori crescute: L >200ui La pacienfii care au avut in ultimele trei luni o angin& streptococic’ sau alte infectii streptococice I. >300ui {n infectii streptococice: glomerulonefrit® acuti streptococic®, scarlatin’, purpurd reumatoidat II. 600-2500 fn reumatismul articular acut, reactia ASLO ajuta in stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii, deoarece titrul anticorpilor antistreptolizina © se menfine crescut ip de cateva luni dupa puseul reumatismal acut. Titrul ASLO creste odata cu evolufia puseului reumatismal. Reacfia ASLO este pozitiva in stenozi mitral’, amigdaliti acuta streptococic’, endocardita streptococic’ Tent, Observafii Reactivii confin azidi de sodiu ce se poate combina cu Cu si Pb, putind asfel deveni explozibili. Controlul pozitiv si negativ a fost preparat din ser uman care a fost testat folosind metoda licenfiati FDA si s-a demonstrat ci nu reactioneazi cu anticorpii pentru AgHBs siHICV.Complexarea Ag cu Ac specific atinge o valoare maxima stabil fn aprox. 60 sec. Deoarece formarea complexelor care disperseaz lumina este dependent de prezenta in proporfii optime a moleculelor de Ag si Ac pentru o cantitate constanta de Ac (respectiv Ag), gradul de complexitate creste proportional cu cantitatea de Ag (respectiv de Ac) pana la un maximum, dupa care Ag in exces determin’ sciderea progresivi a complexititii; din aceasti cauzi se recomanda ca determinirile nefelometrice si fie executate in exces moderat de Ac. Avantajele constau in rapiditatea obfinerii rezultatelor (automatizarea determinarilor). Evaluarea se exprima in mg/l, automat in functie de curba existent in memoria nefelometrului Dezavantajele nefelometriei constau in costul ridicat al aparaturii gi imposibilitatea determinarii directe a proteinelor in probele icterice, hemolizate sau lactescente. Metoda este limitati si de deficienfe ce pot s& apari in sistemele mecanice gi electronice ale instalatie’. 2. Reacfia de aglutinare Aglutinarea reprezint& agregarea de particule prin Ac. Ac reactioneazi cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaja unor particule (bacterii, hematii, latex) gi determina aglutinarea acestora. ‘Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenfa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanfi decat cei care apartin clasei IgG), densitatea determinantilor antigenici de Ja suprafata particulei, forfa ionicd a mediului in care are loc reactia. Aglutinarea se datoreaz scdderii forfelor de respindgere electrostatice dintre particule si creeri unor punfi de legaturd prin intermediul Ac. Reactia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decat reacfia de precipitare (Ag este o particulé gi nu o molecula solubila), excesul de Ag nu inhibi reactia, concentrafiile mari de ac pot inhiba reacfia si produce fenomenul de prozonii, raportul intre Ag-Ac este tot in favoarea ac (ca gi la precipitare). Ac reactioneazi numai cu determinantul Ag specific. Alaturi de Ac aglutinanfi exist& Ac neaglutinanti (blocanfi sau incomplefi) si Ac care aglutineazi numai la rece (+4°C). Reacfia de aglutinare direct Aglutinarea directa (aglutinarea simpli, clasicd) este aglutinarea Ag naturale ale uunor particule de catre Ac specifici (ex. determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriana) Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescuta prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reacfiei in mediul cu vascozitate crescuti. Reaefia de aglutinare indirect Aglutinarea indirect (pasiva) este o reacfie ce presupune particule naturale sau artificial (hematii, stafilococ protein’ A, latex) inc&reate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de catre Ac, respectiv Ag omolog din proba,Hemagluinarea pasiva este 0 metod& deosebit de sensibili de cercetare a Ac serici, imaginat& de Gzegibes gi Sehon. ‘Ac care nu pot produce reacfii vizibile cu Ag din cauzi ci se gisesc in ser in cantitati reduse, pot fi evidentiati prin metode de aglutinare pasivad, crescdnd cantitatea de Ag prin absorbtia acstora pe un substrat inert. in acest fel, cantitati mici de Ac produc aglutinari vizibile. Reacfia de inhibare a aglutinarit Reacfia de aglutinare a particulelor inc&rcate cu Ag solubil este inhibati in cazul ‘in care Ac reacfioneazi in prealabil cu Ag omolog (ex. diagnosticul imunologic de sarcina prin inhibarea aglutinarii hematiilor sau prin inhibarea aglutiniii latexului). Diferenfa principal intre hemaglutinarea pasiva si tehnica de inhibare a hemaglutinirii este aceea ci in prima metoda (hemaglutinarea) se investigheazi prezenfa Ac, in timp ce in a doua (inhibarea) se investigheaza prezenta Ag. Reacfia de aglutinare mediata de anticorpi anti-imunoglobuline Ac anti-imunoglobuline aglutineazi particule incircate (natural sau artificia)l cu Ac (ex. decelarea FR prin reacfia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incompleti fixafi la suprafafa hematiilor prin reactia coombs). Reacfia de aglutinare poate fi calitativa de screening (ex. latex-FR, reactia coombs) sau cantitativa (ex. reactia Waaler-Rose, reactia Coombs). Reactia Latex-FR este mai sensibila, iar reactia Waaler-Rose este mai specific’. 3, Reacfia de neutralizare Antigenul este reprezentat de un imunogen cu proprietafi biologice (toxind, enzim’, virus). Ac specifici determina (in vivo sau in vitro) blocarea acestor proprietafi. Reacfia de neutralizare depinde de aviditatea Ac, adic& de viteza cu care Ac se poate combina cu Ag si de gradul de stabilitate a legiturii ag-Ac. Neutralizarea efectelor biologice ale Ag se constat& numai in cazul in care situsul (toxic sau enzimatic) responsabil de activitatea biologicd a Ag este identic cu situsul Ag, in laborator, acest tip de reactie se utilizeazi pentru determinarea Ac anti- streptolizin O prin reactia ASLO (etapa finala de vizualizare este hemoliza) si pentru identificarea unor virusuri. Testul ASLO este o reactie de neutralizare (inhibare a hemolizei). Se bazeazi pe proprietatea streptolizinei de a produce liza hematiilor de diverse specii, 4, Reactii ce utilizeazi complement in laboratorul clinic se execut& patru reactii de acest tip:Reacfia de fixare a complementului Reactia de fixare a complementului (RFC), hemoliza directa. J. Bordet a imaginat © metoda de vizualizare indirecti a unei reactii Ag-Ac, folosind complement (C) si un sistem indicator (hemolitic). Complexul Ag-Ac fixeazi C, iar hematiile sensibilizate adfugate ulterior riman intacte (absenfa hemolizei inseamna reacfie pozitiva), in lipsa complexului Ag-Ac specific (initial), C se fixeaz pe hematiile sensibilizate (sistemul indicator) producand hemoliza (hemoliza inseamna reactie negativa). Fixarea C pe complexul Ag-Ac este evidenfiati indirect prin absenta hemolizei sistemului indicator din a doua etapa a reacfiei (ser antihematii berbec-hematii berbee) Activitatea anticomplement se datoreste prezenjei_ complexelor_ Ag-Ac preformate, agregatelor de Ig gi a altor substange care pot activa calea clasicd sau calea alternativa de activare a C. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive in prezenta complementului Testul este analog testului de inhibare a hemaglutinarii, deosebirea eseniala const in desfiigurarea reactiei in prezenta C. in cazul in care in prima etapa a reactiei se formeazi complexul Ag-Ac nu mai rimén disponibili Ac care si reactioneze cu hematiile sensibilizate, astfel incit in ultima etapa, C nu este cuplat cu hematiile sensibilizate gi acestea nu sunt lizate. in acest caz rezitatul testului este considerat pozitiv. in situatia in care nu se formeazi complexul Ag-Ac, Ac liberi reacfioneazi cu hematiile sensibilizate gi are loc liza acestora, rezultatul testului este considerat negativ. fn testul de imunohemoliza pasiva, interpretarea rezultatului se face in functie de dul hemolizei obyinute, ludndu-se in considerare dimensiunile sedimentului de hematii si intensitatea culorii supernatantului. Testul de inhibare a hemolizei imune pasive in prezenta C investigheaz prezenia ‘Ag in ser, in timp ce testul clasic investigheaz prezenta Ac in ser. Testul de imunohemolizii pasivi in prezenfa complementului Ca si in cazul testului de hemaglutinare pasiva, Ag este fixat pe hematie si reacfioneazii cu Ac specific, forméndu-se in acest fel complexe Ag-Ac. Realizarea acestui complex in prezen{a C determing liza hematiilor sensibilizate cu Ag. Determinarea imunohemoliticé a complementului Se referi la reactia Ag-Ac numai in masura in care se folosefte ca indicator sistemul hemolitic (hematii de berbec sensibilizate cu ser anti-hematii berbec). Reactia masoarii activitatea hemolitic’ totala a sistemului complement. Metoda are ca punct final hemoliza 50%. Citirea se face la spectrofotometru.5) Reacfii cu reactivi marcati Detectarea, localizarea si identificarea antigenelor se poate realiza utilizind anticorpi care recunose si se leaga specific de antigenele respective. Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizata prin marcarea Ac. Marearea Ac trebuie si indeplineasci dou’ condifii: 1) s& permit detectarea unor cantita{i infime de substan{a 2) si nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunziitoare. fn aceste reacfii se utilizeazi Ag sau Ac marcati: izotiocianatul de fluoresceina (produce stralucire caracteristicd la examenul microscopic in lumina ultraviolet, Coons, 1942), izotopi radioactivi (Zalow si Berson, 1960), si enzime (au activitate asupra unui substrat-cromogen specific (Engwall si Perlman, 1972). a) Reacfia de imunofluorescenti in reacfia de imunofluorescenfa (IF) unul dintre reactanti (Ag sau Ac de cercetat) trebuie si constituie o parte dintr-o structura biologica (celula sau fesut), reactivul marcat cu fluorocrom relevand reactia Ag-Ac. Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizata prin marcarea Ac. Substanfele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina incident& de diferite lungimi de unda si emit o lumina vizibilé care este in functie de fluorocromul utilizat: albastr’, verde, galbeni, rosie sau alba. Reacfia se poate realiza direct, indirect, cu fixarea complementului Reacfia de imunofluorescenfit directa Metoda direct (Coons) permite identificarea Ag specifice in preparate cu ajutorul conjugatului fluorescent anti-Ac. Se folosesc sectiuni de fesuturi, seruri fluorescente anti- Ig si anti-c. Reactia de imunofluorescenfa indirect Reacfia de imunofluorescenf& indirecti (IFI) vizualizeaz reactia Ag-Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac. Se foloseste pentru detectarea Ac fixafi pe Ag. Serul de bolnav se pune in contact, cu un substrat celular (tisular). Urmeaza incubarea preparatului cu un ser antiglobulina uman& marcat cu izotiocianat de fluoresceiné care vizualizeaza in luming ultraviolet reacfia Ag-Ac. Testul poate fi folosit atat pentru determinarea Ag necunoscut cu ser imun cunsocut cAt gi pentru detectarea ac necunoscuti cu ag cunoscut. Reacfia de imunofluorescen{i cu fixarea complementului Complexul Ag-Ac fixeazi C. Metoda fixarii C pe sectiuni de fesut este derivatt din metoda indirect prin adiugarea C, apoi a serului marcat care va vizualiza complexul Ag-Ac-C.b) Analiza radioimunologici Analiza radioimunologica (RIA) este o tehnicd de determinare cantitativa a unui numar mare de substanje prezente in lichidele biologice in cantitate foarte mica. RIA este 0 tehnic# obiectiva, cu mare sensibilitate, partial automatizata, aparaturd costisittoare (echpament nuclear), reactivi scumpi, cu durati de utilizare scurti, personal cu calificare specialé, supusi unei legislatii speciale (radioizotopi). ©) Analiza imunoenzimatict In 1966, Avrameas si Uriel introduc in histochimie marcarea enzimaticd cu peroxidazi, iar in 1971, Van Weemen gi independent Engwall si Perlmann utilizeaz enzimele ca marker pentru reacfiile Ag-Ac. Analiza imunoenzimatics (EIA) se poate realiza in sistem omogen sau heterogen. -reacfia imunoenzimatic& in sistem omogen consti in competitia pentru Ac intre ‘Ag marcat enzimatic $i Ac de determinat (din proba). Activitatea enzimatic& este invers proportional cu concentrafia Ag din proba. -reacfia imunoenzimatic’ in sistem heterogen poate fi utilizati atat pentru determinatrea Ac cat sia Ag. Activitatea enzimaticd a conjugatului nu este influentata de reacfia Ag-Ac gi necesiti o etapii de separare. Avantajele EIA: obiectiva, poate fi automatizati, foloseste reactivi cu valabilitate convenabilé, aparatura este simpl, are sensibilitate crescuta, nu este supusi unei legislafii restrictive ca RIA, Tehnica ELISA {n cazul utilizAtii sistemelor de faz8 solida pentru separarea moleculelor libere sia celor marcate, tehnica este denumiti ELISA (enzime linked immunosorbent assay). ‘Tehnica imunoenzimatic& ELISA este bazatd pe reactia Ag-Ac. Sistemul de analiz& consti din mai multe reactii: ~ Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plaici de pastic cu godeuri) - Ag sau Ac din proba de testat se leagi specific de reactantul imobilizat - reactantul marcat enzimatic reacfioneazi cu complexul reactant imobilizat-Ag (sau Ac) din proba. Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzima este activ atat imunologic cat si enzimatic si reactioneazi att cu Ag (sau Ac) din proba imobilizat pe suportul solid cat si cu substratul corespunzaitor enzimei Vizualizarea reacfiei dintre reactantul enzimatic si complexul Ag-Ac initial se realizeazi prin adfugarea unui substrat corespunzitor enzimei utilizate. Formarea complexului este identificati prin reactia de culoare care apare la adiugarea substratului specific (p-nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalin’ si tetrametilbenzidina pentru peroxidaza). Intensitatea culorii indic& prezenta sau absenfa Ag, respectiv Ac din proba (se citeste spectrofotometric folosind un cititor de plaici ELISA).Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidentierea Ac (boliinfectioase, autoimune) sau a Ag (boli infectioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie).. 6. Tehnica Western Blot Tehnica cuprinde tei etape: separarea Ag prin electroforezi, transferul Ag, festarea probei de ser utilizind tehnica RIA sau ELISA. Numai partea a treia este efectuata in laboratoarele clinice. Tehnica WB este disponibila sub forma de truse comerciale. Metode si tehnici de imunocitologie 1. Tehnica pentru celule lupice Tehnica pentru celule lupice (LE) este 0 tehnict morfologica de decelare a Ac antinucleari - gamaglobuline cu proprietffi antinucleare (factorul Haserick) - ce apar in serul pacientilor cu lupus eritematos sistemic (LES). Acest factor serie acfioneazi asupra nucleilor de leucocite si fi transforma in corpusculi omogeni, care pierd structura cromatiniand si isi modific& colorabilitatea (corpusculi LE). Corpusculii LE sunt apoi fagocitafi de leucocite intacte si astfe! apare imaginea caractertistic& pe care o numim celuli LE. Procesul de omogenizare a nucleului si de fagocitoza are loc in vitro. Interpretarea preparatelor presupune 0 experienti temeinic’ de mlcroscopist (cunoastere exact a morfologiei celulelor LE). Celula LE este de obicei mai mare decat un polimorfonuclear. Caracteristicd este culoarea roz-violacee a corpusculilor LE care nu prezinti nici o structur’. fn jurul corpusculilor LE apare, ca o semiluna, nucleul celulei fagocitante, cu structura si culoarea obisnuite. Imaginea de rozet& este gruparea leucocitelor in jurul unui corpuscul LE. 2, Testul reducerii NBT Determinarea procentului de granulocite care produc intracelular anion superoxid datorit& activarii oxidazelor celulare. La microscopul optic se determina procentul de celule care contin depozite intracelulare albastre de formazan. 3. Chemiluminiscenta Formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) de citre granulocitul PMN este asociata cu emisia de energie luminoasi. Emisia luminoas’ poate fi intensificaté cu ajutorul luminolului sau lucigeninei si convertiti de c&tre un chemiluminometru in semnal electric. Rezultatele se exprima in mV.4, Testul inhibitiei aderenfei leucocitelor Testul inhibifiei aderenfei Ieucocitelor investigheazi rispunsul imun mediat celular in prezenta unui Ag tumoral. Rezultatele sunt exprimate sub forma de indice de deviajie a aderenfei (exprima procentual cresterea sau sciderea aderenfei fafa de proba martor). 5, Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei in flux Citometria in flux reprezinti o abordare tehnici de mare complexitate ce permite determinarea simultand a mai multor parametri fizici si chimici caractweristici unei singure celule aflate in migcare intr-un curent de lichid, Metoda permite caracterizarea pe baze morfologice si fenotipice a populafiilor celutare din singele periferic (limfocite, monocite, granulocite, ete). Prin citometria in flux se pot determina procentele seturilor si subseturilor limfocitare din singe. 6, Testul de transformare blastic a limfocitelor Daca o suspensie de limfocite prelevate de la un subiect sensibilizat se cultiva in vitro in prezenja unui Ag se constati dupa un interval de timp cresterea num@rului de celule blastice cu numeroase mitoze. ‘Transformarea blastic’ a celulelor in vitro se datoreste stimulirii metabolismului celular ca urmare a reacfiei dintre Ag si structura membranei limfocitelor. fn urma cuplirii Ag cu receptorii pe suprafafa limfocitelor sensibilizate, membrana celulara se activeaza, declangand transmiterea unui semnal spre nucleu, ceea ce determina inifierea sintezei de ADN. Ca urmare, are loc cresterea dimensiunilor celutelor, nucleul devenind mai mare cu cromatina laxi si citoplasma bazofild, 5. Reactia de limfocitotoxicitate Metoda a fost descrist de Gorer, apoi a fost aplicat la om de Terasaki Reactia const in a incuba la 37°C o suspensie de limfocite in prezenta C gi a antiserului. Dacii antiserul intalneste Ag corespunzitor pe suprafafa limfocitelor membrana celulelor este alteratd si permite trecerea colorantului in citoplasma, colorind celulele. itirea se face la microscopul optic. Testul este pozitiv cand existi un anumit procentaj de celule colorate. Testul serveste pentru determinarea Ag de histocopatibilitate (HLA).C. Principalele reacfii antigen-anticorp si aplicatiile acestora Testul pentru determinarea grupelor sanguine ABO si Rh Reactivi pentru grupele de singe ABO Reactivi Anti-A, Anti-B, Anti-AB sunt derivafi din liniile de celule hibridizate care sunt obfinute prin fuzionarea anticorpilor de soarece ce produc limfocite B cu celule de mielom. Anticorpii derivafi dintr-o singura clon (celulele aparute din celula hibrid), precum si amestecul de diferiji anticorpi derivai de la diferite clone sunt desemnafi ca monoclonali: Anti-A, Anti-B, Anti-AB. Reactivii Anti-A, Anti-B, Anti-AB au fost evaluafi in toate tipurile de teste, incluznd sisteme automate in paralel cu reactivii ABO conventionali, policlonali. Nu s-au observat reacfii fals-pozitive gi fals-negative intre serul monoclonal si cel policlonal Afinitatea serului reactiv a fost adesea mai puternicd decat a serului policlonal, in mod special fafa de celulele de nou-nascufi si subgrupele cu reactivitate slaba. Material biologie Se foloseste singe total (punctie in deget) Modul de lucru 1 Testul pe lame A.Testul rapid -Se pune o picitura de anti-A, Anti-B, Anti-AB pe o lama de sticl& -Se adaugi o pictturé mica de singe total si se omogenizeaz4 bine -Se roteste usor lama timp de 2 min. -Se observa aparitia aglutinarii, Aglutinarea apare intre 30-60 sec Rezultatele negative pot fi semnalate dupa 2 min, B.Testul cu incubare Se preparii o suspensie de celule 5-10% in solutie salina izotonic& sau se foloseste singe total Se pune o pictitura din fiecare reactiv Anti-A, Anti-B, anti-AB pe o lami Se adaugi o picttura de suspensie ori o picdturd mica de singe si se amestecd bine -Se incubeazi 15-30 min. la temperatura de 20°C -Se amestecd usor gi se observ aparifia aglutindrii Hi Testul in tub ~Se prepara o suspensie de celule de 3-5% in solutie salina izotonic& ~Se pune o picituri de Anti-A, Anti-B, Anti-AB in tubul notat corespunzitor -Se adauga in fiecare tub o picdtura din suspensia de celule si se omogenizeazi bine -Se centrifugheaz& 2. min. la 1000 rpm sau 20 sec. La 3000 rpm ori se incubeazé 20 min. Ja temperatura de 20°CAnti-A Anti-B Anti-AB Grupa A + - + Grupa B - + + Grupa 0 - 7 7 Grupa AB + + + ‘Testul pentru determinarea anticorpilor antistreptolizina O Reactia ASLO Test calitativ si cantitativ pentru explorarea starii de imunitate antitoxicd fafa de toxinele streptococului. Testul este bazat pe reacfia de aglutinare. Testul permite stabilirea diagnosticulut anginei streptococice sau de infecfii streptococice, ca gi a celui de reumatism articular acut (RAA). Mentinerea titrului ASLO crescut chiar i la cAteva luni dup& puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii. Principiul metodei Reactivul folosit este o suspensie de particule latex de polistiren incdrcate cu streptolizina O stabilizata, Reactivul a fost astfel preparat incét, in prezenta unui titra ASLO normal de 200 ui/ml sau mai crescut, si dea o aglutinare vizibil& a particulelor latex, fra diluarea serului, Reactivi 1 flacon cu reactiv latex de § ml 1 flacon cu control pozitiv de 1 mi 1 flacon cu control negativ de 1 ml 1 pliicuti pe care se efectueazi reactia Material biologic Serul de cervetat trebuie si fie clar si proaspat. Plasma, serul lipemic ori contaminat poate determina erori in obtinerea rezultatelor, Dac& testul nu poate fi efectuat imediat, atunci serul se pistreazi la 2-8°C, maximum 72 ore. Pentru o perioadi mai indelungatf serul trebuie si fie pistrat congelat, Modul de lucru 1 Testul ASLO calitativ -Se aduc reactivii si probele la temperatura camerei inaintea folositii cu 30 min -Se pun 2 picdturi (50 jul) de control (+) in unul din cercurile plicufei de testare.-Se dislocd usor butonul de celule si se observa aparifia aglutindrii Reactivul anti-D Anticorpi monoclonali umani din clasa IgM, obfinuti din culturi celulare Se pistreaza la 2-8°C Conservare cu NaN3-0,1% Reactivul este pentru diagnosticul in vitro Reactivi Confine anticorpi monoclonali de origine umand din clasa IgM, obfinut din culturi celulare. Specificitatea si reproductibilitatea sunt proprietafi bine cunoscute la anticorpii monoclonali. Majoritatea reactivilor anti-D monoclonali aparfin clasei de IgM. Modul de lucru I Testul pe lama A, Testul rapid Testul trebuie efectuat pe o suprafafi ce are temperatura cuprinsi intre 20-37°C -Se pune o pictitura de reactiv Anti-D pe lama Se adaugi o picitura mick de singe total. Se omogenizeazi bine, -Se roteste energic lama 2 min. Se observa daca apare aglutinarea Se citeste rezultatul dupa 2 min, (suprafafa uscat& poate fi interpretatd ca 0 reactie fals- pozitiva. B. Testul cu incubare Se poate folosi singe total sau suspensia de celule -Se prepara o suspensie de 5-10% din celule ce trebuie testate in solutie salind izotonica sau se foloseste singe total -Se pune cite o picitura de reactiv anti-D in cerculefele lamei, ce se vor folosi -Se adaugi o piciturt de suspensie sau o picdtur’ mici de singe total gi se omogenizeazi bine ~Se incubeaz 30 minla 20-37°C -Se agit usor lama gi se observa aglutinarea M1. Testul in tub -Se pregiiteste o suspensie 3-5% din celule ce trebuie testate in solufie salina izotonica ~Se pune o piciturk de reactiv anti-D in tubul-proba Se adauga in fiecare tub o picaturd din suspensia de celule si se omogenizeaza bine ~Se centrifugheaz 2 min. 1a 1000 rpm ~Se disloca usor butonul de celule si se observa prezenta aglutinarii, Dac reacfia este negativa se incubeazd tubul 15 min, la 20°C, se centrifugheaza 2 min la 1000 rpm, se disloc& usor butonul de celule si se observa aglutinarea.