=e ee ee © Interaccién primaria con el antigeno el 2cirujano.blogspot.com/ Intraducién, 89 Naturaleza de los epitopos de céllas 8, 90 De epitpos y deerminantes ontigénicos, 90 Identificein dels eptapns dels culos B, 90 Antigenos y anticuerpos interaction por complementariedad espacial ‘no por uniones covalentes, 92 {a varicién en lo estructura del hopeno muestra la importanca de la forma, 92 Puede demosrarse fo complementaredad espacial dl eitapo y el pardtopo, 93 as uniones antigeno-onticverpe son facimente revetsibles, 94 Las fuerzas de union del antigeno ol anticuerpo aumontan a medida que las distancias intermoleculares disminoyen, 94 La afinidad mide la fuerza de unin del antigeno y del anticverpo, 9% ‘vider del ontsuero por el antigeno; efecto de bonificacién de la rlivlencia, 98 La especifiddad del reconociniento del antigeno por el antcuerpo no s absoluta, 100 Lo que perce la célula T, 100 Loresricién de apltipo reel la necesidd def pripacén del CAH, 100 Los clas Treconocen una secenca peptic iol dl onigeno, 101 Procesamiento del antigeno intracelular para la presentacion por la, clase I del CMH, 103 Procesamiento del antigeno para la presentacion por la clase It del ‘HH Gok sigue une wa erent, 105 Naturaleza del péptido de la “ranura”, 107 ‘Union o la dase | del AH, 108 Union 0 Ja case Mi del CMH, 108, H receptor cB de la célula T forma un complejo ternario on el CMH yy el péptido antigénico, 110 Topologia del complejo terneria, 110 Gélulos T con una perspective diferente, 111 ‘as mlicls dose no csi tambien pueden presentr al entgen, 111 Algunas clulasT poseen marcodores NK, 113 ns TCR 46 poseenclunas coraderisicas de os ancvrpes, 113 Los superantigonos estimulon famiias entoras de receptores del linfocito, 113 Los toxinas bacteriangs representan un grupo importante de superontigenos ‘pra los clos , 114 Los vrs de tomores mamarios endgenos dl ran (RYT) cctian com ‘superanignes, 114 1 mictobio tmbién pueden propordonar seperantigenos par las cules 8, ns Hlreconociiento de formas diferentes del antigeno por las céulos 8 Tes ventojoso para el huésped, 115 INTRODUCCION Un hombre no puede ser un marido sin una esposa y una molécula no puede ser un antige- no sin un correspondiente antisuero 0 anticuer- po o receptor de célula T. Fl término antigeno se utiliza en dos sentidos, el primero para describir una molécula que genera una respuesta inmune (también denominado inmundgeno), y el se- gundo, una molécula que reacciona con los an- ticuerpos o las células T programadas, indepen- diente de su capacidad de generarlos. Si esta tl- tima situacién parece algo confusa, un ejemplo puede ayudar con su comprensién. Un ratén Fig. 5-1. Un hapteno por sf solo no inducird anticuer- pos. Sin embargo, reaccionaré in vitro con anticuerpos formados contra un conjugado con transportador inmu- nogénico. Resumen, 116 Lecturas odianales, 118 suagouaro be sr ANNORENCEIO " a 7 t a x concern (tpn aPTENO j | | ncn SwamiTULO 5 ee nad inoculado con sus propios glébulos rojos, de mo- do no demasiado sorprendente, no elaborara an- ticuerpos; si ahora se administran eritrocitos de rata, se forman anticuerpos contra ambos glébu- los rojos, de rata y raién, y estos tiltimos se unen a las propias células del animal in vivo, es decir, Jos globulos rojos del ratén actiian como antigeno en unién con los anticuerpos, aun cuando son in- capaces de evocar su formacién. De manera simi- lar, los haptenos, que son pequefias agrupaciones quimicas bien definidas como dinitrofenol (DNP; véase pag, 41) 0 sulfonato de m-aminobenceno, no son inmunogénicos por si solos, pero reaccio- naran con anticuerpos. preformados inducidos por la inoculacién del hapteno unido a una molé- cula transportadora que es por sf sola un inmu- négeno (fig. 5-1) 5 Tas partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antigeno se de- nominan pardtopos y la parte del antigeno que estd en contacto con el paratopo se designa epito- po. Para dar alguna idea de tamaito, si el antige- no es un péptido o hidrato de carbono lineal, el sitio de combinacién por lo comin puede acomo- dar hasta cinco o seis residuos de aminodcidos 0 unidades de hexosa. En el caso de una proteina globular, en los casos tipicos 14-21 residuos de aminoacido estén en contacto en ambos, el anti- cuerpo y el antigeno (véase fig. 5-5). NATURALEZA DE LOS EPITOPOS DE CELULAS B De epitopos y determinantes antigénicos Los anticuerpos formados como respuesta a la inmunizacién con una protefna globular nativa (a diferencia de una proteina fibrilar) tienden a no reaccionar bien con las preparaciones desnaturali- zadas, y esto es compatible con el concepto de que la mayorfa reconoce estructuras (superficie) topo- griticas (es decir epitopos), lo que depende de la conformacién de la molécula nativa, Por esta razén, los anticuerpos contra proteinas nativas por lo co- mun no reaccionan de modo tan intenso con los péptides que poseen la misma secuencia primaria (fig. 5-2). Cuando se mapean los epitopos indivi- duales mediante el uso de anticuerpos monoclona- Jes homoggneos (véase pag. 133), con frecuencia se 4 véPnbo DEL Ash REDUCIDO IDO DéL ASA NISLADO USOZMA (dad y configuraciGn tridimensional en una 2 globular, lisozima. Los anticuerpos contra la molécula entera y el peptide de asa aislado no reaccionan con el péptido después de la reducci6n de su puente disulfuro, lo que muestra que el péptida lineal redtcicio perdi la configuracién antigéni- «ea que tenia cuando mantenia el asa a pesar de que la secuencia det aminoacid se mantiene inalterada. (De Maron E, Shiowa C, Arnon R, Sela M. Biochemistry 1971; 10:763,) observa que involucran residuos de aminodcidos muy distanciados en la secuencia primaria, pero reunidos en el plegamiento de las cadenas peptidi- cas en la proteina nativa (figs. 5-3 y 5-5), En estos ca- 508 parece razonable hablar de discontinuos 0 agrupados mas que continuos o secuenciales, Si se tomara cada anticuerpo individual dentro de un antisuero elaborado contra un antigeno proteico y se trazara el centro aproximado del epitopo corres- pondiente en la superficie del antigeno, se acabaria casi con certeza con un “mapa de contorno” de ta densidad del epitopo que indica las regiones en ta superficie del antigeno de los ciimulos de epitopos dominantes (fig. 5-4a y b). Cada uno de estos cimu- los es lo mds cercano a una definicidn de determi- nante antigénico. Es importante tomar conciencia de que cada antigeno por lo comtin posee varios deter- minantes en su superficie, que pueden ser distintos entre si desde el punto de vista estructural; asi, un anticuerpo monoclonal que reacciona con un deter- minante de modo habitual no reaccionard con cual- quier otro determinante en el mismo antigeno, a me- nos que la molécula posea ejes de simetria (fig. 5-4c) identificacién de los epitopos de las células B Este es un tema de interés particular para los que deseen elaborar sustitutos de péptidos simples paraFig. 53. Residuos de epitopos en la cadena peptidica plegada de la cadena de mioglobina de esperma de ballena. Los resi- duos de aminosicidos 34, 53 y 113 ( @ ) conteibuyen con el epi- topo reconocido por un anticuerpo monoclonal homogéneo; los residuos 83, 144 y 145 ( @}, can otro. Estos son claramente epi topos discontinuos. Se postula que los aminoscides 18-22 (Q@ ) forman parte de un epitopo continuo sobre la base de Teacciones con péptidos aislados. Gran parte de la cadena de mioglobina esté en la forma g-helicoidal. EI residuo 109 (© jes «cxitico para el reconocimiento de la célula T y hasta el presente no s@ demostraron anticuerpos que reaccionen con este siti. (Basado en Benjamin DC et al. Anmual Review of Immunology 1986; 267.) antigenos proteicos complejos. En general, las pro- teinas de gran tamaiio, dado que poseen mds deter- minantes potenciales, son mejores antigenos que las pequefias. Cuanto mas extraiio es el antigeno, es de- Gir, menos similar a las configuraciones propias que inducen tolerancia, resulta mas eficaz. para provo- car una respuesta inmune. Las partes de las cadenas peptidicas que protru- yen de manera significativa de la superficie globu- lar tienden a ser sitios de alta densidad de epitopos. Los segmentos menos antigénicos de la superficie se asocian con fas regiones céncavas vecinas que contienen moléculas de agua que pueden ser mas dificiles de desplazar. Sin embargo, la prediccién de los epitopos de las células B, incluso cuando uno co- noce la estructura tridimensional de un antigeno, todavia es una tarea bastante frustrante, entre otras cosas porque cada huésped inmunizado tiene su propia manera de reconocer las diferentes regiones de un antigeno dado. De hecho, la tinica unidad de 0 so 1% FPiT0RO. ANTIGENO. { couuto oe etoro rotenone) Fig, 5-4. Un antigeno proteico globular por lo comin pose un mosaico de determinantes (cimulos de epitopos dom! nantes) en su superficie, detinido por la poblacién heterog nea de moléculas de antieuerpos en un antisuoro dado. a) Diagrama idealizado que ilustra la idea de que los anticuer- pos individuales en un antisuero policlonal con diferentes si- tios de combinacién (pardtopos) pueden reaccionar con epito- pos superpuestos y formar un determinante en la superticie det antigeno. Los ntimeros se refieren a la frecuencia relativa imaginada de cada especificidad de anticuerpo. b) Mapa del “contomo” hipotético de lo superficie que muestra la manera cen que los determinantes representan regiones de cdmulos de epitopos superpuestos, cuyas posiciones estan marcadas co- mo e! centro del area que establece contacto con el anticuer- po. El tamaito real de un epitopo aislado puede calcularse si se observa la figura 5-5. ¢) Corte transversal de un antigeno tedrico con un eje de simetria que despliega seis determinan- tes que incluyen dos pares que son idénticos. Los cximulos de anticuerpos superpuestos en cada determinate (se muestra tun representante de cada ciimulo de anticuerpos) no reaccio- nan con otros determinantes no relacionados desde el punto de vista estructural.reconocimiento que puede desplegarse para identi- ficar un epitopo es la que lo define, a saber, el anti- cuerpo que posee el pardtopo complementario, La maxima precision la proporciona sin dudas el anilisis cristalogréfico con rayos X de un complejo de un anticuerpo monoclonal (o un fragmento de 61) con el antigeno (véase fig. 5-5). Aunque se resol- vieron mas de un centenar de estas estructuras, es- te enfoque no es apto para que lo realicen todos los cientificos, ya que constituye un método dificil, in- sume tiempo y requiere alta tecnologia. Una estra- tegia alternativa, aplicable a los antigenos proteicos, es llevar a cabo una serie de mutaciones para loca- lizar los residuos que proporcionan las uniones do- minantes al anticuerpo ~titil pero con ciertas limita- ciones-. Los intentos para imitar el epitopo median- te la elaboracin de péptidos sintéticos se describi- ran mas adelante (pag. 332). Como anticipo, es una buena alternativa para los epitopos lineales y frus- trante para los discontinuos. ANTIGENOS Y ANTICUERPOS INTERACTUAN POR COMPLEMENTARIEDAD ESPACIAL Y NO POR UNIONES COVALENTES La variacién en la estructura del hapteno muestra la importancia de la forma Una ver encontrado un método para elaborar anticuerpos contra haptenos pequenos quimica- mente definidos (fig, 5-1), fue posible relacionar las variaciones en la estructura quimica de un hapteno con su capacidad de unirse a un anticuerpo dado En un experimento se probaron los anticuerpos ela- borados contra sulfonato de mi-aminobenceno por su capacidad de combinarse con los isémeros orto, Fig, 5-5, Estructura de las regiones de contacto entre un anti- cuerpo Fab monoclonal antilisozima y lisozima. a) Modelo es pacial que muestra las moléculas de Fab y de lisozima que enca- jan entre si de manera ajustada. La cadena pesada del anticuer- poes azul; la cadena liviana, amarilla; la lisozima, verde con glu tamina 121 en rojo. b) Los modelos de Fab y de lisozima separa: dos para mastrar el modo en que las protuberancias y depresio~ nes de cada uno son complementarias entre sic) Imagenes fron: tales del sitio de combinacién del anticuerpo (izquierda) y del epitopo de la lisozima (derecha) obtenidas a partir de b) por ro- facidn de 90° de cada molécula sobre un ee vertical. Los resid uos. de contacto son rojos, excepto Ginl21 que aparece de color puir- pura claro, El residuo Gin121 encaja en una cavidad de la super ficie del anticuerpo todeada por residuos V, 32, 91, 92 y 93, y te siduos V,, 101. Los dieciséis residuos de contacto en el epitope de la lisozima comprenden: ocho aminodcidos de un intervalo de 10 aminoscidos en las posiciones 18-27, siete aminoacidos de tun intervalo de nueve aminodcidos en las posiciones 116-124, junto con el residuo de aminosicido 129, es decir, ésta es una evi: dencia clara de un epitopo discontinuo. Todos los CDR hacen el contacto con el antigeno: en la cadena pesaca los residuos 30-32 (CDR1), 52-54 (CDR2) y 99-102 (CDR3), y en Jos residuos de la cadena liviana 30 y 32 (CDRI), 49 y 50 (CDR2) y 91-95 (CDR3). ‘Todos los residuos que contactan pueden no contribuir de mane- +a positiva con las fuerzas de atraccidn entre el antigeno y el an- ticuerpo; la influencia Hamativa del residuo Gln171 esta revela- da por la unin deficiente de las lisozimas provenientes de otras ‘especies en las que el residuo Glni21 es reemplazado por histi- dina. (Reproducido con autorizacién de Amit A, et al. Science 1986; 233:747, Copyright © 1986 por la AAAS.)Tt eee Cuadro 5-1. Efecto de las variaciones en Ia estructura del hapteno en la fuerza de unidn a los anticuerpos ela- borados contra el Sulfonato de m-aminobenceno. La reac- cién del anticuerpo con el hapteno original contra el que {fue elaborado se destaca en el recuadro, (De Landsteiner K, van der Scheer J. Journal of Experimental Medici- ne 1936; 63,325) MH Wi WH TO NER PARA 0 + 4 : ®) . | © 9 tetohédrico 1 ® terohédtico i ‘meta y para de haptenos y moléculas relacionadas en los que el grupo sulfonato se sustituyé por arsona- to 0 carboxilato (cuadro 5-1). El hapteno con el gru- po sulfonato en la posicién orto se combina de un modo algo peor con el anticuerpo que el isémero ‘meta original, pero el compuesto paru-sustituido (si- milar desde el punto de vista quimico al isémero orto) muestra muy escasa reactividad. La sustitu- cién de sulfonato por arsonato conduce a una com- binacién més débil con el anticuerpo; ambos grupos poseen una carga negativa y una estructura tetraé- drica, pero el grupo arsonato es mas grande en ta- maiio y pose un dtomo de H mas. Los aminoben- zoatos en los que el sulfonato est sustituido por el grupo carboxilato planar con carga negativa mues- tran incluso menos afinidad por el anticuerpo. Pa- ee rece que la configuracién global del hapteno es aun mas importante que su naturaleza qufmica, es de- cir, el hapteno se reconoce por la forma tridimensio- nal global de su nube electronica externa y no por su reactividad quimica. La produccién de anticuer- pos contra moléculas tan extrarias como el sulfona- to y el arsonato de benceno puede volverse mas comprensible si se considera que estén dirigidos contra una forma de nube de electrones particular, de hacerlo contra una estructura quimica Puede demostrarse la complementariedad espacial del epitopo y el paratopo Resulté posible, aunque con cierta dificultad, cristalizar un complejo del fragmento Fab de un an- ticuerpo monoclonal anti-lisozima con su antigeno. El andlisis con rayos X de estos cristales fue convin- cente; el antigeno y el anticuerpo encajaron de mo- do firme debido a la complementariedad en la for- ma en una amplia érea de contacto (fig. 5-5). Estu- dios similares con otros anticuerpos monoclonales que reaccionaban con el mismo antigeno confirma- ron el tipo de encaje “llave y cerradura” entre el pa- rétopo y el epitopo. Es importante no considerar el concepto “Ilave y cerradura” como entidades infle- xibles, como dos trozos de roca, ya que seria muy dificil para un animal producir un anticuerpo con, esta superficie complementaria singular. De hecho, la mayoria de los anticuerpos monoclonales anti-li- sozima estudiados de esta manera revelé cambios significativos en la columna polipeptidica de hasta 1,0 A cuando el anticuerpo forma un complejo con su antigeno (véase fig. 5-6), y si se agrega a la ecua- cidn la posibilidad de movimiento rotatorio de las cadenas lateraies del aminodcido y alteraciones en las posiciones relativas de los dominios variables de Jas cadenas livianas y pesadas (V,/V,,) en el Fab, parece més correcto pensar en un antigeno y un an- ticuerpo como superficies en alguna medida mu- tuamente deformables; es decir, més parecidas a nubes que a rocas, como lo expresé Lerner de un modo grafico. En este contexto, es pertinente dirigir Ta atenci6n a la asociacién entre las partes de un an- tigeno proteico que proporciona los epitopos domi- nantes para la unidn con el anticuerpo y la flexibili- dad de su cadena peptidica determinada por los factores de temperatura derivados de la cristalogra- fia con rayos X. Esta mutua acomodacisn de estruc turas en el antigeno y en el anticuerpo permite de manera evidente el maximo contacto, pero hay un precio que pagar y es el consumo de energia reque- 9394 Fig. 5-6. Flexbilidad estructural del anticuerpo durante la for- macién del complejo con el antigeno. a} Cambios conformacio- rales signficativos(05-1,0 A) se producen en la colurna Cade las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la feaccion Fab de un auitoanticuexpo especifico para un DNA mo: nocatenario, que forma un complejo con un fragmento de anti- geno (trimero de timicina), Ssto se muestran los domtinias Fv (Wy + V,) del anticuerpo. EI Fv sin ligando es amarillo y el ligan- do (antigeno) es rojo. En la forma de complejo, ! V, es azul y et Vy puispura, b) Movimientos en las cadenas lateraes de aminoa- cides contactantes como resultado de la unin con el antigeno. (Reproduccisn con autorizacisn de Herton JN, He XM, Ballard DW, Bhier PR, Pace PE, Bothwell ALM, Voss EW J, Edmondson AB, Proteins 1991; 11:150. Reimpreso con autorizacion de Wiley Liss, una divisién de john Wiley and Sons, Inc) rida para inducir estos cambios conformacionales. Sin embargo, en general esto serd mas que compen- sado por el cambio de energia libre intrinseca aso- ciado con la formacién de nuevos sitios de unién (fig. 5-7a y b). Esta energia recibida para producir el cambio conformacional que conduce a una unién més firme parece ser el factor responsable de Ja pre sencia frecuente de cadenas laterales hidrdfobas normalmente “ocultas” como sesiduos de contacto para el anticuerpo. En el caso de los antfgenos constituidos por pro- tefna globulares, el drea de contacto entre el epitopo y el pardtopo es bastante grande, del orden de 600- 800 A2. Las tirosinas y los triptéfanos tienden a pro: ducirse con una frecuencia mayor en el sitio de combinacién que en el resto de la molécula de anti- cuerpo, Ambos pueden formar puentes de H con solvente 0 antigeno, ademdés de tener grandes su- perficies hidréfobas, caracteristica de innegable uti lidad para los residuos expuestos al agua cuando ef anticuerpo esta libre pero oculto (es decir, excluido del contacto con el solvente) cuando interacttia de manera intima con el antigeno. Las uniones antigeno-anticuerpo son facilmente reversibles Si el eslabén entre el epitopo y el paratopo de- pende por completo de la complementariedad es- pacial y no involucra la formacidn de uniones qui- micas covalentes, no deberia ser muy dificil sepa- rarlos. Esto puede probarse con facilidad. Si se colo- ca una mezcla de hapteno con anticuerpo dentro de una bolsa de dislisis, se encontrar que ef hapteno difunde hacia el exterior, al liquido circundante, hasta que se alcanza un equilibrio en el que algo de hapteno esta unido al anticuerpo y algo esta libre; si este liquido exterior se renueva de manera conti- nua, todo el hapteno se perderd de la bolsa de did- lisis, lo que demuestra que puede disociarse por completo del anticuerpo (fig. 5-8). Con antigenos de mayor tamaiio los complejos pueden disociarse por un cambio en el pH que provoca alteraciones en la conformacién de la protefna y destruye la comple- mentariedad de los dos reactantes. Como se veré mas adelante (pag. 139), este principio puede utili- zarse para la purificacién de antigenos 0 anticuer- pos por cromatografia de afinidad, LAS FUERZAS DE UNION DEL ANTIGENO AL ANTICUERPO AUMENTAN A MEDIDA QUE LAS DISTANCIAS INTERMOLECULARES DISMINUYEN Las fuerzas involucradas en la unién del anti- cuerpo con el antigeno son no covalentes y por con siguiente reversibles; asimismo, por lo general slo son efectivas en distancias cortas. Pueden clasificar- se bajo cuatro titulos J) Electrostiticas. Atraccién entre grupos con car- gas idnicas opuestas (fig. 5-9a). Las fuerzas electros- taticas opuestas necesitan estar aproximadamente equiparadas entre si, si el anticuerpo esta unido con fuerza al antigeno.Cte ea en ny 9: ru owt -sTi6eNo (lugs de saicuereo ‘ccaibono Fig. 5-7. La flexibilidad del antigeno y del anticuerpo contribu- ye con la afinidad para la unién. En la ilustracién mostramos: a) ines tipos de reacciones que consumen energia xtqueridas para Geformar ambas moléculas, lo que por eso permite b) la interac- cisin positiva entre (os residuos del parétopo y del epitopo: 1) 10- tacidn de una umién que expone una cadena lateral hidréfoba oeutta en el interior, 2) flexion de Ia coluumna de a-carbono para aproximar los residuos que interactiian y 3) desplazamiento la- teral de an residuo cuyas mubes de electrones se superponen con las de su: par opuesto. Siempre que la energfa total de deforma- ‘én sea menor que la energia de atraccisn de las moléculas de- formadas, se favorecerd la formacién de complejos. Expresado en ténninos matematicos: Energia libre de deformacisn = (AG, + AG, + AG) = AG, 2) Puentes de hidrégeno. Un hidrdgeno se compar- te entre dos dtomos electronegativos (fig. 5-9). Los puentes de hidrégeno pueden generarse entre dto- mos como oxigeno, nitrégeno o azufre. Ademés, las moléculas de agua pueden Nenar las cavidades en la interfase, que de otro modo tendrian un efecto desestabilizante en el complejo, y estas moléculas de agua pueden formar puentes de hidrégeno para conectar el anticuerpo y el antigeno. 3) Hidréfobas. Los grupos hidréfobos pueden in- teractuar entre sf en Iugar de hacerlo con moléculas de agua (fig. 5-9c). Estas interacciones hidréfobas a menudo desempefan un papel importante en la unién antigeno-anticuerpo. 4) Vast der Waals. Son fuerzas entre moléculas que dependen de la interaccién entre las “nubes de electrones” externas (fig. 5-94). Las fuerzas de Van der Waals son responsables de una minoria -entre el 2 y el 20% del total de la energia de in- teraccién en la unién de un anticuerpo tipico con su antigeno. ESTRUCTURA DEFORIADA r donde AG, es la variacién de energia libre de Gibbs de la reac: ibn (1) y asi sucesivamente La energia de asociacién del antigeno y del anticuerpo defor- mados = la suma de las energias de unién individuales = AG, (una fuerza de atraceién brinda un AG negativo). La variacisn de la energia global para la formacién del complejo = AG gat AGyuan = RT In K, Siempre que AG jag > SGyy el antigeno y ef anticuerpo se asociaran en equilibrio con una razonable couistante de afinidad de asociacién K,, (R, constante de los gases: T, temperatura abso- luta; In, logaritmo natural.) Si el antigeno fuese completamente rigido, seria incapaz de acercarse lo sutficiente al anticuerpo para generar una energia de union importante. Una caracteristica esencial comin a los cuatro ti- pos de fuerzas es que dependen del acercamiento intimo de ambas moléculas antes de que las fuerzas adquieran una magnitud significativa, més aun si se excluyen las moléculas de agua y esto es lo prin- cipal de la combinacién del antigeno con el anti- cuerpo. Las formas de las nubes de electrones com- plementarias en el sitio de combinacién del anti- cuerpo y el determinante de superficie del antigeno permiten que las dos moléculas encajen de manera ajustada (véase fig. 5-5), de modo que la distancia intermolecular se torna muy pequefia y aumentan en grado considerable las fuerzas de interaccién no covalentes de las proteinas; cuanto mayor son Jas areas de antigeno y anticuerpo que encajan en- tre si, mayor es la fuerza de atraccidn, en particular si hay aposicién de cargas opuestas y agrupaciones hidréfobas. Por el contrario, cuando las nubes de electrones de dos moléculas se superponen de manera eficaz, se generan poderosas fuerzas de repulsion y debe96 STC a ee consumirse energia para desplazar los residuos superpuestos de sus posiciones normales de equi- librio. LA AFINIDAD MIDE LA FUERZA DE UNION DEL ANTIGENO Y DEL ANTICUERPO En los estudios con microscopio electrénico so- re la interaccién entre un conjugado de DNP di valente y un anticuerpo, cada grupo DNP encaja- ba en un sitio de combinacién del anticuerpo (figs. 3-1 y 3-2). Esto significa que los haptenos de pequeiio tama- fo en sf son monovalentes en lo que respecta a la reaccién con el anticuerpo. El experimento de la mezela del hapteno con el anticuerpo en una bolsa de dislisis (fig. 5-8) mostré que la combinacién con el anticuerpo era reversible y que el complejo asi formado podria disociarse con facilidad en funcién de la fuerza de unién, a la que denominamos afini- dad. En la situacién simplista de un brazo de unién Fab aislado a un epitopo en el antigeno, la fuerza de unién puede definirse mediante Ja constante de equilibrio (K,) de la reaccidn de asociacién: Ac + Ag = AcAg dada por la ecuacién de accién de las masas [AcAg) [Ac] [Ag] donde [Ac] es la concentracién de los sitios de com- binacién libres del anticuerpo y [Ag] es la concen- tracién del antigeno libre en equilibrio. Si el anti- cuerpo y el antigeno encajaran juntos de modo muy intimo, e] equilibrio estaria bien a la derecha de la reaccidn de asociacidn; nos referimos a estos anti- cuerpos que se unen con fuerza al antigeno como anticuerpos de alta afinidad. A cierta concentra- cién de antigeno libre [Ag,], donde la mitad de los sitios de anticuerpos estan unidos [AcAg] = [Ac] y K, = 1/1Ag] es decir, la constante de afinidad K, es igual a la re- cfproca de la concentracién del antigeno libre en el punto de equilibrio donde fa mitad de los sitios de Boise oe als | SM Fig. 5-6. Reversibilidad de Ja interaccién entre el anticuerpo (© Dy el hapteno ( @ ). Dentro de la bolsa de didliss el hapte- 'no se encuentra en parte en la forma libre y en parte unido al an- ticuerpo segtin Ia afinidad del anticuerpo. Séto el hapteno pue- de difundir a través de la membrana de didlisisy la concentra- igualard la del hapteno no unido dentro de la bol- sa, La determinacisn del hapteno total en Ja bolsa de la diatisis permite luego calcular la cantidad unida al anticuerpo. La teno- vacién constante del buffer externa dara por resultado la diso- = [Ag] [AcT uniones de anticuerpos individuales. Esto se ilustra en Ja figura 5-1. El mecanismo de este efecto pue- de interpretarse si se considera una analogia. Per- mitanos suponer una enfermedad desconocida en la que no podemos detener nuestra apertura y cie- tre continuos de las manos, Si intentamos sostener un objeto en una mano, se caer en el momento en que la abrimos. Sin embargo, si utilizamos ambas manos para sostener el objeto, siempre que abra- mos y cerremos nuestras manos en momentos dife- rentes, hay muchas menos oportunidades para la caida del objeto. La combinacién reversible del an- tigeno y del anticuerpo es como la apertura y el cie- rre de las manos; cuanto més valencias sostienen el antigeno, menos probable es que se pierda cuando se disocia el complejo en cualquier sitio de unién (fig. 5-12), ‘Las mismas consideraciones se aplican ala unién del anticuerpo a un antigeno polimérico con deter- minantes repetitivos, como la ovoalbumina susti- tuida por varios grupos DNP o la mayoria de los polisacéridos bacterianos o gldbulos rojos con de- terminantes de grupo sanguineo repetitivos. A me- dida que pasamos de un fragmento Fab univalente a.una IgG divalente a una IgM pentamérica, el efec- to de bonificacién de multivalencia produce au- mentos llamativos en la intensidad de la formacion de los complejos antigeno-anticuerpo. La avider, que es una medida de la afinidad fun- cional de un antisuero para el antigeno completo, es de relevancia evidente en la reaccién con el antige- no en el organismo. La alta avidez es superior a la 950 CAPITULO 5 Interaccion primaria con el antigeno ‘ntgena | Undeterminonte | Determinante | _ Sin sinlaridad |__iaal ina Siisr|__ este | a A i gam is EACCON RUZADA SW REX Fig. 5:13, Especificidad y reaccin cruzada, Avides de fos ant- cxtexpos sericos (= y.)—C) para Ag, > Ag, > AB> AB baja para una amplia variedad de funciones in vivo, por ejemplo, eliminacién inmune del antigeno, neu- tralizacion de virus, papel protector contra las bac- terias y asi sucesivamente. LA ESPECIFICIDAD DEL RECONOCIMIENTO DEL ANTIGENO POR EL ANTICUERPO NO ES ABSOLUTA La capacidad de los anticuerpos para discriminar entre los diferentes antigenos se ilustré bien en la variacin de la reactividad de un anti-hapteno para una serie de moléculas relacionadas desde el punto de vista estructural, como se describe en el cuadro 5-1. Dado que la intensidad de la reaccién puede cuantificarse por la afinidad o Ia avidez, relaciona- riamos la especificidad de un antisuero con su avi- dez relativa por los antigenos para los que estén siendo discriminados. Al reconocer que un antisuero puede tener una avidez relativamente mayor por un antigeno que por otro, indicamos que el antisuero despliega una especificidad relativa més que absoluta; en la prac- tica se habla de grados de reactividad cruzada. Un antisuero elaborado contra un antigeno dado puede reaccionar en forma cruzada con un antigeno par- cialmente relacionado que posee uno 0 més deter- minantes idénticos o similares. En la figura 5-13 puede verse que un antisuero contra un antigeno, (Ag,) reaccionaré de modo menos intenso con un Ag, que posee sélo un determinante idéntico, debi- do a que sélo ciertos anticuerpos en e] suero pueden unirse. E] Ag, que posee un determinante similar pero no idéntico, no encajaré tan bien con el anti- cuerpo y Ia unién es aun més débil. El Ag, que no tiene nada de similitud estructural, no reaccionard de modo significativo con el anticuerpo. Por esto, sobre la base de consideraciones estereoquimicas, podemos observar por qué la avidez del antisuero para el Ag, y Ag, es menor que para el antigeno ho- mélogo, mientras que es despreciable para el Ag,no relacionado. Seria bueno describir el antisuero co- mo muy especifico para el Ag, respecto del Ag,, pe- ro que reacciona en forma cruzada con Ag,y Ag en diferente medida. Al dirigirse contra epitopos tinicos en el antige- no, los anticuerpos monoclonales muestran con fre cuencia alta especificidad en lo que respecta a su baja reactividad cruzada con otros antigenos. Sin embargo, en ocasiones se observa una unién bas tante inesperada con antigenos con los que reaccio- nan de manera deficiente, si lo hacen, con un anti- suero especifico. Es un ejercicio instructive observar cémo es que un antisuero policlonal, que contiene una coleccin heterogénea de anticuerpos, puede ser mas especifico para discriminar entre dos anti- genos que un anticuerpo monoclonal. Las seis re- giones hipervariables de un anticuerpo abarcan un area molecular relativamente grande compuesta por cadenas laterales de aminodcidos muy diver- sos, y es evidente que una cantidad de diferentes es- tructuras epit6picas podria encajar en distintas par- tes de este “terreno” hipervariable, aunque con un espectro de afinidades de combinacién. Asi, cada anticuerpo no sdlo reaccionard con el antigeno que estimuls su produccién, sino también con algunas moléculas posiblemente muy poco re- lacionadas. La figura 5-14 explica (es lo que espera mos) cémo puede traducirse esto en una especifici- dad més alta para el suero policlonal. LO QUE PERCIBE LA CELULA T En varias ocasiones hicimos referencia que el re- ceptor de las células T ve al antigeno en la superti- cie de las células asociado con una molécula clase I o Il del CMH. Ahora es el momento de profundizar en esta relacisn. La restriccion del haplotipo revela la necesidad de la participacion del CMH Se establecis en ldpidas de piedra que las células, T que poseen receptores aff, con algunas excepcio nes (véase pag. 111), sdlo responden cuando Jas cé- lulas presentadoras de antigeno expresan el mismoFig. 514, La especificidad de un antisuero deriva de la reactivic dad comin al componente anticuerpos. El antigeno A estiraula a los linfocitos cuyes receptores polifuncionales se unen a A, pe- zo también podria unirse a otros determinantes como esté indi- cado (letras mintisculas), Todos los anticuerpos en el antisuero tendrian anti-A como especificidad comiin, pero las otras especi- ficidades serén tan diversas que ninguno de ellos alcanzaré con- haplotipo del CMH que el buésped a partir del cual derivaron las células T (hito 5-1). Esta restriccién por el haplotipo en el reconacimiento de las células T indica sin equivocaciones que las moléculas del CMH estén involucradas de manera intima y nece- saria en Ia interaccidn del antigeno con la célula que lo porta con su linfocito T especifico para el antige- no correspondiente. También aprendimos que, en términos generales, las células T citotéxicas recono- cen el antigeno en el contexto de fas moléculas cla- sel del CMH, y las células T helper que interactian con los macréfagos responden cuando el antigeno se asocia con las moléculas clase TI. Si entonces aceptamos la participacién del CMH en el reconocimiento de las eélulas T, qué ocurre con el antigeno? Durante algtin tiempo nos dejé perplejos que, en muchos sistemas, los anticuerpos originados por un antigeno nativo fallaban en blo- quear la citotoxicidad (véase fig. H5-1-1b), a pesar del éxito sistematico con los sueros anti-moléculas clase I del CMH. En el presente sabemos por qué. Las células T reconocen una secuencia peptidica lineal del antigeno En el hito 5-1, se comentaron los experimentos que involucran a las células T especificas contra las. nucleaproteinas del viriss influenza, que podrian matar las células infectadas por el virus de la in- fluenza. La muerte se produce después de que las células T citotdxicas se adhieren con firmeza con su “blanco a través del reconocimiento de moléculas es- -pecificas de superficie. Es curioso entonces que la centraciones apreciables para dar reacciones cruzadas significa- tivas con otro antigeno que posea 2, b, etc, es decir, el antisuero muestra especificidad para A, Por otro lado, un anticuerpo rmo- noclonal no puede dituir su especificidad alternativa y asf en el ejemplo mostrado con un asterisco habria reaccién cruzada mas intensa con un antigeno a no correlacionado. (Con agradleci rmiento 2 Talmage D.W. Science 1959; 129:1643.) nucleoproteina, que carece de una secuencia de se- ial o regién transmembrana y, por Jo tanto, no pue- de expresarse en la superficie celular, pueda no obs- tante funcionar como blanco para las céhulas T cito- t6xicas, en particular porque ya destacamos que los anticuerpos contra la nucleoproteina nativa no in- fluyen en la reaccién de destruccién (fig. H5-1.1b) Ademés, las células no infectadas no se convierten en blancos para las células T citotéxicas cuando se agrega nucleoproteina entera al sistema de cultivo. Sin embargo, si, en cambio, agregamos una serie de péptidos cortos con secuencias derivadas de la es- tructura primaria de la nucleoproteina, las células no infectadas pueden transformarse en susceptibles al ataque citolitico de las células T (fig. 5-15). iAsf se reveld el secreto! La realidad sorprenden- te es que las células T reconocen péptidos lineales derivados del antigeno, y ésta es la razén por la que los anticuerpos elaborados contra la nucleoproteina en su conformacién nativa tridimensional (véase fig. 5-2)no inhiben la muerte celular. Notese que s6- lo ciertos péptidos de la nucleoproteina fueron reco- nocidos por las células T policlonales en 1a pobla- cidn del donante y éstos se consideran epitopos de las células T. Cuando clones de idéntica especifici- dad derivan de estas células T, cada clon sélo reac- ciona con uno de los péptidos; en otras palabras, al igual que con los clones de células B, cada clon es especifico para un epitopo correspondiente. Se obtienen por completo resultados andlogos cuando los clones de céhulas T-helper son estimula- dos por células presentadoras de antigenos a las que se les agregaron ciertos péptidos derivados del antigeno original. De nuevo, mediante la sintesis de 101