Técnicas celulares wwwel l2cirujano.blogspot.com/ Introduccion, 143 ‘Aislamiento de subpoblociones de levcoios, 143 Tenias por grandes volimenes, 143, Selecin celular po FACS, 144 Eniquecinieno de poblaonesespecticas pre el antigen, 144 Inmunoquimica: localizacién de antigenos en células y tejidos, 144 Teves de nmunofluorscena, 144 Otros todos cen onticuerpas morcads, 150 Expresion génico, 150 Evoluacion dela actividad funcional, 150 Acividd debs ellos fogotias, 150 INTRODUCCION Las técnicas para determinar el inmunofenoti- poy la funcién de las cétulas del sistema inmune son cada vez més sofisticadas. Ademis, es posi- ble identificar la funcin de genes individuales por mutacidn y la creacién de animales transgé- nicos y “por noqueo”” AISLAMIENTO DE SUBPOBLACIONES DE LEUCOCITOS Técnicas para grandes volumenes Separacién basada en pardmetros fisicos La separacién de células sobre la base de su ve- locidad de sedimentacién diferencial, que de ma- nera aproximada se correlaciona con el tamaiio, puede llevarse a cabo por centrifugacién a través de un gradiente de densidad. Es posible aumentar la masa celular mediante la unién selectiva con parti- culas en su superficie, como gldbulos rojos; el ejem- plo més notable es la formacién de rosetas cuando los eritrocitos de carnero se unen al CD2 de células T humanas La densidad de flotacién es otro pardmetro titil La centrifugacidn de sangre entera en Ficoll- Hypa- Copacided de respuesta desk Apoptosis, 152 Frecenci del prearsor, 152 ounifcacn de los frmodoros de ontcurps, 152 Andis de lo acvidad funcional pr recnstcén cellar, 155 Exploracén de la funcin con amticuerpes, 156 Ingenieria genética de cilolas, 157 lnsercén y modtcacin de gens en as lulas de mamifero, 157 {ntroducién de nuevos gens en animales, 157 Resumen, 160 Lecturas adicionales, 162 ts, 150 que isoténico (metrizoato de sodio) de densidad 1,077 g/mL deja las células mononucleares (linfoci- tos, monocitos y células natural killer (NK) flotan- do en una banda en la interfase, mientras que los eritrocitos y leucocitos polimorfonucleares, que son, mas densos, forman un sedimento en el fondo del tubo. La adherencia a a superficie del plastico eli- mina en gran medida las células fagociticas, mien- tras que el pasaje a través de columnas de lana de naifon enriquece mucho las poblaciones linfociticas de células T a expensas de las células B. Separacién que aprovecha pardmetros biolégicos Las células fagociticas activas que captan peque- fas particulas de hierro pueden manipularse por un imén externo, Los linfocitos que se dividen co- mo respuesta a un activador policlonal (véase pag. 183) 0 a un antigeno especifico pueden eliminarse si se les permite incorporar 5 bromodesoxiuridina (BrdU); esto los torna susceptibles al efecto letal de Ia irradiacién UV. Seleccién por anticuerpos Varios métodos estén disponibles para la selec- cin de células recubierlas de manera especifica con anticuerpos, algunos de los cuales se ilustran en la figura 7-1. El agregado de complemento o conjugados de toxina anti-Ig eliminard estas pobla- ciones. Las perlas magnéticas cubiertas con anti-Ig,Coe A eo CVOTOXICIDAD, PERLAS MAGNETICAS. | Iau aaciienos cowsuenno | REcteRs ANTENG-RICNO © | CONANT conetcnerro ANG | fm pty 1 | | | | PLAGAS RECUBIERTAS CON ANTLAG ‘SEPARACION CELULAR [ACTIVADA CON ENFRENTAMIENTO EN PLACAS Fig. 7-1. Principales métodos para las separaciones de células recubiertas con un anticuerpo especifico. forman cdimulos con las células recubiertas con el anticuerpo, los que pueden separarse con facilidad de las células no recubiertas. Otra técnica de selec- cin dtil para grandes volimenes consiste en en- frentar las células recubiertas con anti-lg adsorbida a una superficie. Una variante de este tema, utiliza~ da para el aislamiento de células precursoras de la médula dsea con anti-CD34, es cubrir las células con el anticuerpo tratado con biotina y selecciona- das con una columna de avidina o perlas magnéti- cas con avidina Combinaciones de anticuerpos que recubren las perlas se utilizan en las columnas de separacién de células para la deplecién de poblaciones especificas que poseen, por ejemplo, linfocitos enriquecidos en CD4* CD45RA: 0 CD4*CD45RO- Seleccion celular por FACS 4 Las células recubiertas con anticuerpos fluores- centes se pueden separar mediante el clasificador celular activado por fluorescencia (Fluorecence-ac- tivated cell sorter - FACS), como se describe en el hito 7-1 y en la figura 7-2 (véase una discusién mas profunda bajo el titulo “Citofluorometria de flujo”, pag. 147). La expansién selectiva de células T especificas, por estimulacién repetida con antigeno y células presentadoras en cultivo, por lo comtin alternada con tratamiento con interleucina 2 (IL-2), conduce a ‘un enriquecimiento de células T heterogéneas espe cificas para los diferentes epitopos en el antigeno. Estas lineas de células T pueden distribuirse en las cubetas de las placas de microtitulacién, en una di- lucién lo suficientemente alta para que en prome- dio haya menos de una célula por cubeta; cuando las células son estimuladas a proliferar con antige- no 0 anti-CD3 produce clones de eélulas T indivi duales que pueden mantenerse con un cuidado y atencién muy obsesivo; pero, [Dios mio pueden ser un gran fastidio! Los hibridomas de células T po- tencialmente inmortales, similares en principio a los hibridomas de células B, pueden establecerse por fusi6n de lineas celulares con una linea de células T tumorales y clonacién ulterior. Los animales que poseen en esencia una pobla- cidn de células T con una tinica especificidad se pueden producir mediante la introduccién de genes oy B para el receptor de células T a partir de un clon de células T, como un transgén (véase mas ade- lante); dado que los genes ya estan reordenados, su presencia en cada célula T que se esté desarrollando cambiaré cualquiera de las otras recombinaciones del gen VB. Nadie ha tenido éxito en la clonacién de células B, excepto como hibridomas o lineas celulares transformadas por el virus de Epstein-Barr; aun- que, como ocurre con las células T, se produjeron animales transgénicos que expresan el mismo anti- cuerpo en todas sus células B. INMUNOQUIMICA: LOCALIZACION DE ANTIGENOS EN CELULAS Y TEJIDOS ‘Técnicas de inmunofluorescencia Dado que los colorantes fluorescentes, como fluoresceina y rodamina, pueden acoplarse a anti- cuerpos sin destruir su especificidad, el conjugado puede combinarse con el antigeno presente en un corte de tejido y visualizarse en el microscopio de fluorescencia. De esta manera puede demostrarse la distribucidn del antigeno en el tejido y dentro de las células. Desde otro punto de vista, el método tam- bin puede usarse para la deteccién de anticuerposHito 7-1. Clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) EI EFACS fue desarrollado por Herzenbergs y col. pa~ ra cuantificar las moléculas de superficie en las células individuales pertenecientes a la serie blanca, por su reaccién con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo, y para usar las sefiales asi formadas para separar células de fenotipo definido a partir de una mezcla heterogénea. En este elegante pero complejo aparato se hacen, una detras de la otra frente a un haz de rayos laser, La determinaci6n cuantitativa de la sefal fluorescente en un tubo fotomulplicador colocado de manera adecua- da retransmite una sefial a la célula a medida que ella fluir las células fluorescentes de manera ordenada, emerge en tna gotita individual; la cétula adquiere una carga eléctrica y puede separarse en un campo eléctrico (fig, H7-1.1). Puede introducirse una mayor sofisticacién por el empleo de rayos laser y fluorocro- mos, y una dispersién de la luz tanto anterior como a 90%. Esto se tratard en la seccién sobre citoflucrometria_| de flujo que describe cémo puede utilizarse esta técni- ca para el andlisis cuantitativo de multiples parime- | tros de poblaciones celulares individuales (véase fig. 7-6). Basta decir que estos tiltimos aparatos FACS per- miten el aislamiento de células con un fenotipo com- | plejo de una poblacién heterogénea con un alto grado de discriminacién. O FS Fig, H7-1.1. El principio del FACS para la citometria de flujo de Ta fluorescencia en las células teitidas (cfrculos con anillos de color verde) y separacién fisica de las células no tefidas. La sefial de carga puede activarse para separar las células de alta =! = 2 — Uiguivo 0€ suspension to STs & | oO ssa oe | OD) cos ruse user —( en DETECTORES DE ©) DISPERSION DE LA WZ | | sion de la luz, las de gran tamafio de las de pequefio tamaiio, | | | luorescencia de las de baja fluorescencia y, mediante la disper- y las muertas de las viables. dirigidos contra antigenos conocidos, presentes en un corte de tejido dado o en una preparacién celu- lar. Hay dos maneras generales de llevar a cabo la prueba Prueba directa con anticuerpo marcado El anticuerpo contra el antigeno tisular se conju- ga con el fluorocromo y se aplica directamente (fi- gura 7-3a). Por ejemplo, supongamos que deseamos mostrar la distribucién de un autoantigeno tiroideo que reacciona con los autoanticuerpos presentes en el suero de un paciente con la enfermedad de Has- himoto, un tipo de autoinmunidad tiroidea. Noso- tros aislariamos IgG a partir del suero del paciente, a conjugariamos con fluoresceina y la aplicariamos a una impronta de tiroides humana en un portaob- jeto. Cuando se lo observa en el microscopio de fluorescencia veriamos que el citoplasma de las cé- lulas epiteliales foliculares estarian coloreadas en forma brillante (véase fig. 19-1a). Si se utilizan dos antisueros conjugados a colo- antes que emiten fluorescencia con diferentes lon- gitudes de onda, pueden identificarse dos antige- nos diferentes de manera simultanea en la misma6 CU Poke (No SEPARADAS | SEPARADAS WE ] ‘SEPARADASPOSTTVAMENTE \ | | i] j | | Lt 7 1 | i al | 1 / * lp | eli | 2 j | ra Y | Fs] | I 3 T { I 3 Z = \ Fl {i | Z | Vii s I |_| | i ' i i | 5 i ‘| | | | | _ dan sill hd — at) fe ee eee ee i Fuaescenci lav ateCD4SRO | Fluorescence an-CD4SRO Sluoresenia ela af:CD4SRO ! AESPUESTA MTOGENIGA == D0 (uontzs/in 1 naboena ant. cons lls no esimlads “nave” CD4SRA (Gls de meri cvs C0450 } Fig. 7-2. Separacién de las células T de memoria activadas de sangre periférica (CD4SRO positivas) de las células T virgenes, {CD45RO negativas; pero positivas para la isoforma CD45RA) en el FACS despuds de tei las células vivas en Frio con un ant cuerpo monoclonal fluorescente contra CDASRO (véase pag. 221). Las células no separedas mostraron dos picos (a); las célu- Jas con intensidad de fluorescencia menor que e} umbral arbitra- rio fueron separadas de aquelias con intensidad més alta y dic- ron poblaciones (b) negativas (CD§SRA) y (c) positivas preparacién. En la figura 2-6e, la coloracién directa de células plasmaticas fijadas con una mezcla de anti-IgG marcada con rodamina y anti-IgM conju- gada con fluoresceina demuestra con claridad que estas dos clases de anticuerpos son producidas por células diferentes, A menudo se emplea la técnica de acoplamiento de biotina al antisuero y la colora- cidn final con avidina fluorescente. Prueba indirecta para anticuerpos En esta técnica en doble capa el anticuerpo no marcado se aplica directamente sobre e} sustrato re- presentado por el tefido y se visualiza mediante el tratamiento con una antiinmunoglobulina conjuga- (CD45RO}, las que fueron estudiadas en cuanto a su respuesta proliferativa para una mezcla de dos anticuerpos monoclonales anticCD2 (OKTII y GT2) en presencia de un 10% de células pre- sentadoras de antigenos (4). Después de tres dias se agregé “H- timidina y las eélulas se contaron después de U5 h, Es claro que la pobiacidn de céhulas de memoria proliferé, mientras que la po- blacién de células no estimuladas no lo hizo. (Datos proporcio- nados por gentileza de D. Wallace y R. Hicks.) da con fluorocromo (fig, 7-3b). En este caso, con el objeto de averiguar si el suero de un paciente pre- senta anticuerpos contra las células epiteliales tiroi- deas 0 no los posee, es necesario tratar primero un. corte de tejido tiroideo con el suero, lavar bien y luego aplicar suero de conejo antiinmunoglobulina humana marcada con fluoresceina; si hay anticuer- pos, las células epiteliales tiroideas aparecen tefi- das. Esta técnica posee varias ventajas. En primer lugar la fluorescencia es mas brillante que con la prueba directa, dado que diversas antiinmunoglo- bulinas fluorescentes se unen con cada una de las moléculas de anticuerpo presente en la primera ca- pa (fig. 7-3b). En segundo lugar, incluso cuando muchos sueros deben ser evaluados para anticuer- pos especificos, slo es necesario preparar (0, conted pres ts Fig. 73. Base de las prucbas de fluores: cencia con anticuerpos para Ia identifica- cin de antigenos tisulares 0 sus anticuer- pos. © = fuoresceina marcada -FLUORESCEINA més frecuencia, comprar) un tnico reactive marca- do, 0 sea la antiinmunoglobulina. Ademés, el méto- do posee gran flexibilidad. Por ejemplo, mediante el uso de conjugados de antisueros contra cadenas pesadas individuales de la inmunoglobulina puede evaluarse la distribucién de anticuerpos entre las diversas clases y subclases, por lo menos en forma semicuantitativa, También se puede determinar por fijacién de complemento sobre cortes de tejido me- diante el agregado de una mezcla del primer anti- cuerpo més una fuente de complemento, seguida por un reactivo anticomplemento fluorescente co- mo segunda capa. Otras aplicaciones de la prueba indirecta pueden observarse en el capitulo 19. Alta resolucién con microscopio confocal Las imégenes fluorescentes con gran aumento son, por lo comin, dificiles de resolver debido al brillo ligeramente fuera de foco por encima y por debajo del objeto. Todo esto ahora es cuestién del pasado, con el advenimiento de microscopios de barridos confocales, disponibles en el comercio, que centran la imagen de la fuente de un rayo laser en un plano delgado dentro de la célula y recogen Ia emisi6n de fluorescencia en un tubo fotomultipli- cador (photo-multiplier tube - PMT) con una aber- tura confocal. La fluorescencia a partir de planos ubicados por encima y por debajo del plano del ob- jeto no llega al PMT y por eso no se afecta la agude- za de la imagen. Una uinidad de barrido X-Y permi- te el estudio cuantitativo de la totalidad del plano de la muestra y, con la Gptica conveniente, pueden uti- lizarse dos fluorocromos diferentes de modo simul- téneo. El programa informético del instrumento puede computar imagenes fluorescentes tridimen- CORTE DE ‘rei aa ze #@.) ANTCUERPO ——ATICUERPO——_ayNUWOGLORULNA + NO WARCID —MARCADO COW MABCADA COM lurexcote FRSC wowed | Seem CHP sn tae Frodaindce 7 Prabesinha?—_| sionales de una serie automatica de estos barridos X-Y acumuladas en el eje Z (fig. 7-4) y rotarlas se~ gtin el gusto del operador. Citofluorometria de flujo Los antigenos de la superficie celular pueden de- tectarse y localizarse por el uso de anticuerpos mar- cados. Dado que los anticuerpos no pueden pene- trar con facilidad en las células vivas, excepto por endocitosis, el tratamiento de las células con anti- cuerpo marcado en fro (para minimizar la endoci- tosis) conduce a la coloracién sélo de los antigenos en Ja superficie (fig. 7-2). Recuérdese también un ejemplo anterior de coloracién fluorescente de la superficie de los linfocitos B con antiinmunoglobu- lina (fig. 2-6¢). Es posible teftir células individuales con diversos fluorocromos diferentes (fig. 7-5) y analizar las célu- las en gotas individuales cuando fluyen a través de Ja seccidn de un citémetro de flujo. Esta parte del equipo es en esencia una maquina de FACS sin el Gasificador de células (fig. 7-6). Estos instrumentos registran datos cuantitativos que relacionan el con- tenido de antigeno de Ja superficie y la naturaleza fisica de cada célula individual, con parémetros miiltiples que se evalian por célula para dar un andlisis fenot{pico en una tinica célula més que un promedio de la poblacién (fig. 7-7). Con la impre- sionante cantidad de anticuerpos monoclonales y los fluorocromos disponibles, en la actualidad es posible Ja realizacién del andlisis con alto geado de detalle, lo que representa una notable contribucién al diagnéstico de leucemia (véase pag. 436). También podemos investigar el interior de la cé- lula de varias maneras, La permeacién para permi- tir la penetracién de los anticuerpos fluorescentes V448 Fig. 7-4. Construccidn de una imagen {Iuorescente tridimensio- nal con el microscopio confocal. Un foliculo tiroideo esférico en tun corte grueso de tiroides de rata fijada en formalina, temtido. con un conjugado de rodamina-faloidina el cual se une a la act: na F (resultados similares a los obtenidos con et de los canjuga- dos de anticuerpos). $i bien la muestra era muy gruesa, el mi croscopio se enfoed en planas sucesivos con intervalos de 1 desde la parte superior del foliculo (imagen nro, 1) hasta mitad de camino (imagen nro, 8), el total de imagenes representa un he- imisferio! Nétese cémo la fluorescencia en un plano no interfere con la de los otros y que Ta fotografia compuesta {imagen nro. 9) (de preferencia con Fab pequefio o incluso fragmen- tos monocatenarios Fv) proporciona una lectura de citocinas y otras proteinas intracelulares, El anélisis del ciclo celular puede lograrse con un colorante unido al DNA, como yoduro de propidio, para me- dir el contenido de DNA y la deteccién de anticuer- de las imagenes 1-8 muestean la totalidad de la tincisn fluores- «ente en foco en tod la profundidad del hemiserio, Bs claro que el anticuetpo colotea las construcciones hexagonales cercanas a Ja superficie apical (interna) de las células epiteliales foliculares. Los eritrocitos se observan cerca de Ja parte superior del folicu- To, (Los negativos fueron proporeionados por gentileza de la Dra ‘Anna Smalicombe, tomados por el personal de Bio-Rad en un sistema de formacién de imégenes confocal Bio Rad MRC- 600 que utiliza material proporcionado por e} profesor V. Herzog y Fr Brix dela Universidad de Bonn.) pos por incorporacién de BrdU para visualizar 1a sintesis de DNA. Ademés, se han desarrollado son- das fluorescentes para determinar el pH intracelu- lar, la concentracidn de tiol, Ca’, Mg y Nat ‘Una herramienta analitica poderosa es la deter- minacién de la expresién intracelular de genes, in-Aid Sacha troducidos de manera artificial, que comprenden una secuencia de codificacidn o regién reguladora de interés, {usionados a otro gen por una molécu- la, como la proteina fluorescente verde (green fluorescent protein - GEP), luciferasa 0 LacZ (B- galactosidasa de Escherichia coli, detectada por la hidrdlisis del sustrato fluorogénico digalactésido de fluoresceina). De acuerdo con la construccion usada, el gen puede emplearse como un marcador para los estudios de desarrollo y migracién 0 co mo informador bajo el control de un promotor es- pecificado 0 elemento intensificador. Como un ejemplo del andlisis citofluorométrico de flujo ele- gante que puede llevarse a cabo, el reemplazo transgénico (véase pag. 159) de genes RAG-2 en dégenos con un gen de fusién RAG-2-GFP permi- tid el estudio de la expresién RAG-2 en linfocitos individuales cuyo fenotipo fue definido de mane- ra simulténea por tincién con anticuerpos mono- clonates, Peso de bond 620/20 & Investig : stig i ela visa individ $ Fig. 7-6. Sistema dptico de citometria de flujo con seis paré- metros para el andlisis de la inmunofluorescencia multicolor. La fluorescencia celular excitada por el laser azul se divide en sefales verdes (fluorescefna) y naranja (ficoeritrina), mientras In fluorescencia excitada por el laser naranja es reflejada por un espejo y se divide en sefiales casi rojas (rojo Texas) y rojas (loficocianina). En este sistema también se mide la luz azul dispessada en pequefos angulos anteriores y a 90%, Jo que pro Td Ri da wags Sy wo 50057040 Se) $80 600620 640 xtc (am) Fig. 7-5. Marcadores fluorescentes utilizados en la citometria de flujo. La onda de emisién mas larga de flvoresceina se super- pone con la det rojo Texas y es corregida por el programa infor :natico. Las ficobiliproteinas de las algas rojas y cianobacterias efectian la transferencia de energie de la luz azul a la clorofila para la fotosintesis; cada molécula posee muchos grupos fluo- rescentes que permiten un amplio espectro de excitacidn, pero se emite la fluorescencia dentro de una banda de la longitud de on da estrecha con una eficacia euantica tan alta como para obviar la necesidad de un segundo anticuerpo amplificador. Deters de uz igen porciona informacién sobre el tamaio celular y ta granulari- dad interna, respectivamente. PMT, tubo fotomultiplicador. (Basado en Hardy RR. (1998) En Delves PJ. & Roitt IM. (eds) Encyclopedia of Immunology, 2.ed, pig., 946. Academic Press, Londres.) EI uso reciente de tres rayos laser y nueve fluorocro- mos diferentes amplia incluso mis el iona 1 parémetros! 14CU cee ted Tin de fio = blosTVB6 Floreconio oni VB6 WF ie ie cy To FHureseni ont.C03. > Fig, 7-7. Anilisis citofluorométrico de TCR V6 usado por los linfocitos de sangre periférica humana. Las células tenidas con anti-TCR VB6 fiuoresceinado y conjugado de ficoeritrina anti- CD3. Cada punto representa un Tinfocito individual y los nuime~ ros se refieren al porcentaje de linfocitos que yacen dentro de los cuatro cuadrantes formados por tos dos niveles de umbrales tt lizados de modo arbitrario para separar los valores positivos de los negativos. Practicamente ningiin linfocito que porta recepto~ res de células T perteneciente a la familia VB6 carece de CD3, mientras que el 4,6% (3,5 fuera del 77,0) de las cétulas T madu- ras expresan VBS. (Datos proporcionados por gensileza de D, Morrison.) Otros métodos con anticuerpos marcados | En lugar de marcadores fluorescentes, enzimas como fosfatasa alcalina (véase fig. 18-7) o peroxida- sa pueden acoplarse a anticuerpos y luego visuali- zarse por métodos histoquimicos convencionales tanto por microscopia dptica (véase fig. 8-74) como por microscopia electrénica También se esté utilizando ampliamente el oro coloidal unido a anticuerpos como una inmuno- marcacién electrodensa para los microscopistas electrénicos. Pueden aplicarse al menos tres anti- cuerpos diferentes en el mismo corte mediante el marcado con particulas de oro de tamafios diferen- tes (véase fig. 9-13). Una nueva sonda ultrapeque- fe, constituida por fragmentos Fab’ unidos a cimu- los undecaatiticos, permite una localizacién espa- cial mAs precisa de los antigenos y su tamaiio pe- quefto le permite marcar sitios que son inaccesibles a los inmunomarcadores de mayor tamaiio. Sin em- bargo, la visualizacidn clara requiere un microsco- pio electrdnico de transmisin con barrido de alta resolucién. EXPRESION GENICA E1 RNA mensajero puede extraerse de células 0 tejidos y luego analizarse en manchas (“dot blot”), mediante Northern blot 0 PCR. El desarrollo de tecnologias de microclasificadores permite en la ac- tualidad determinar de manera simulténea la ex- presién de miles de genes en un tinico experimen- to. Los oligonuclestidos o fragmentos del CDNA son colocados por medios robéticos sobre un dis- positivo génico, a partir de los cuales se generan los cDNA; por ejemplo, el mRNA de células T es marcado e hibridado a los genes en el microclasifi- cador. Esto proporciona una comparacién cuanti- tativa de la expresién para cada gen presente en el dispositivo. Mediante la acumutlacién de estos da- tos es posible construir un cuadro completo del ti- po de genes que estén expresados en las diferentes células (fig. 7-8). Un drea en la que esta tecnologia estd desplegéndose con rapidez es el andlisis de las diferencias en la expresién del gen entre una célula tumoral y su contraparte normal, lo que en consecuencia da a luz posibles blancos para la in- tervencién terapéutica La localizacién del mRNA en células individua- Jes puede obtenerse por la hibridacién in situ de sondas de oligonucledtidos marcadas, ya sea en ex- tendidos de células 0 en cortes de tejido. EVALUACION DE LA ACTIVIDAD FUNCIONAL Actividad de las células fagociticas En el cuadro 7-1 se resumen las principales prue- bas empleadas para evaluar la funcién de los neu- wofilos, Capacidad de respuesta de'los linfocitos Cuando los linfocitos son estimulados por anti- geno 0 por activadores policlonales in vitro por lo comtin sufren mitosis (véase fig. 2-6b) y Jiberan ci- tocinas. La mitosis se evaltia de manera habitual por la incorporacién de °H-timidina o 5I-UdR (5- yododesoxiuridina) en el DNA de las células en division.ML A 1s Cuadro 7-1. Evaluacién de ta funcién de los neutréfitos Fogaiss Wide la coptain de portuas coma tex o boctrios por acoploiento 0 por Esl respiratorio. coirslumiiscencin, Muerte introcelular Wide la educcn dl ritroozu de ttrazato Puebo ontimiobiona que vtiiza Stophylococus aureus Maracén dreconah Movimiento raves defies pre graente de oncerrain del ogento ‘uimitécico como el fori Me. Leu. hen Evalvacin con fincin con antcuerpo ‘monolonal Regulain hai orb del {" 1 y C83 de suerte Las citocinas liberadas en el medio de cultivo pueden medirse por inmunoensayo o por un bicensayo que emplea una linea celular depen- diente de una citocina particular para su crecimien- to y supervivencia. Las células individuales que sintetizan citocinas pueden cuantificarse en el cité- metro de flujo mediante la permeaci6n y tincién in tracelular con anticuerpos marcados; de modo al- ternativo, puede aplicarse la técnica ELISPOT (véa- se més adelante). Como de costumbre, la biologia molecular hace un aporte valioso, si bien mas sofis- ticado, dado que las células T transfectadas con una construccién lacZ intensificadora de TL-2 acti- varé la expresién de f-galactosidasa del Iac-Z en respuesta a la citosina IL-2 (véase pag. 186); esto puede revelarse con facilidad mediante un sustrato enzimatico fluorescente 0 cromogénico. La capacidad de las células T citotéxicas para des- tmuir sus blancos celulares de modo extracelular se evaliia por lo comiin mediante un ensayo con libera~ cidn de cromo. Las eélulas blanco se marcan con "Cr y la liberacién de protefna radiactiva en el medio por encima del observado en los controles represen- ta el indice de citotoxicidad. La prueba se repite con diferentes proporciones de células efectoras y célu- Jas blanco: Una técnica similar se utiliza para deter- minar la destruccién extracelular por las células NK de células blanco recubiertas con anticuerpos 0 de células blanco no recubiertas. Es necesario hacer una advertencia en Jo que respecta a la interpretacién de Jos ensayos in vitro. Dado que es posible manipular Jas condiciones de cultivo dentro de limites amplios, es posible lograr un resultado que podria no conse- guirse in vivo. Permitanos ilustrar este punto por la referencia a Ja citotoxicidad para células murinas in- I (Evi Bde ce genial I (Glo 8 octvada (las T lo B/1 Fig. 7-8. Expresién génica durante ef desarrollo y activacién del linfocito. Los datos provienen de mas de 3,8 millones de me- diciones de expresign genica reatizadla en 3.637 genes que utili- zan 243 microclasificadores. Cada experimento representa una poblacién celular diferente. Por ejemplo, el experimento 1 utili- 26 células timicas CD$" activadas de manera policlonat, mien- tras que el experimento 2 muestra la misma poblacién antes de la estimulacidn. Los genes sobreexpresados o inducidos estén coloreados de rojo, las genes subexpresados o reprimidos de co- lor verde. Ciertas nibricas de la expresién génica se vuelven apa- rentes en poblaciones celulares diferentes, como se indice ala derecha. Por ejemplo, la ribrica de la expresién del gen de eslu- las T incluyen moléculas de sefalizacién C2, TCR, PCR y mus chos citocinas. (Reproducido con autorizacidn de los autores y editores de Alizadeh A.A. & Staudt LM. (2000) Current Opinién inv Immmunology 12,219.) fectadas por el virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMY) 0 el virus de la estomatitis vesicular (VSV). La técnica in vitro que mostré ser mds sensible es la que utiliza la liberaci6n de cromo de las oélulas blan- co después de la segunda estimulacién de los linfo- citos. Sin embargo, esto necesita 5 dias, tiempo du- rante ef cual un ntimero relativamente pequefto de precursores de células T citotéxicas CD8 de memo-52 OU Ame ee ria pueden reproducirse y superar el umbral exigido para producir un ensayo mensurable. No obstante, una prueba de citotoxicidad débil bajo estas condi- ciones no fue reflejada por ninguna de las evaluacio- nes in vivo de la funcidn antiviral, lo que implica que carecen de relevancia bioldgica. Apoptosis La muerte celular programada es frecuente en el sistema inmune en varias situaciones diferentes y pueden utilizarse una diversidad de enfoques para medir las células apoptésicas. La electroforesis en gel detectard el patrén caracteristico “en escalera” de los fragmentos de DNA generados por el clivaje internucleosémico (véase fig. 1-19). Una manera al temnativa para detectar esta fragmentacién del DNA, conocida como técnica TUNEL (del inglés TaT-me- diated dUTP (deoxyuridine triphosphate) mick end labeling, marcacién terminal del punto critico con trifosfato de desoxiuridina (dUTP), utiliza la en. ma terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) pa- ra agregar nucledtidos marcados en los extremos 3° de los fragmentos. Un acontecimiento mas tempra- no en la apoptosis es la pérdida de simetria de la membrana que produce la expresion de fosfatidilse- rina en la superficie celular, detectada con facilidad por citometria de flujo utilizando una versién mar cada, Annexin V, de su ligando. Si se dispone de me- dios sofisticados, pueden emprenderse anilisis més detallados en los que es posible determinar compo- nentes individuales de los mecanismos apoptésicos, como Bel-2, Bel-x,, Bax, PARP (polimerasa po- 1i(ADP-ribosa)) 0 procaspasas y caspasas especificas por ensayos fluorométricos o colorimétricos Frecuencia del precursor La magnitud de las respuestas de los linfocitos en cultivo se relaciona estrechamente con la cantidad de Jinfocitos especificos para el antigeno capaces de res- ponder. Debido a la clonalidad de las respuestas, es posible estimar la frecuencia de estos precursores es- pecificos de antigenos por andlisis de dilucién limi- tante. En esencia, el método se basa en que si se to- man diversas alicuotas duplicadas de una suspen- sida celular dada, que seria de esperar que en prome- dio contenga un precursor por alicusta, luego, el ané- lisis de distribucién de Poisson muestra que el 37% de las alicuota no contendré células precursoras (a través de la aleatoriedad del muestreo). Asi, silas ali- cuotas se realizan a partir de una serie de diluciones de-una suspensién celular, se incuban en condiciones que permiten la maduracién de los precursores y se reconocen mediante un esquema de amplificacién, serd posible conocer que la dilucisn en ia cutal el 37%. de las alicuotas da respuestas negativas contiene un promedio de una célula precursora por alicuota; en consecuencia, se puede calcular la frecuencia del pre~ cursor en la suspensién celular original, En la figura 7-9 se muestra un ejemplo con cierto detalle. Se arguments que el andlisis de dilucién limitan- te a menudo infravalora la verdadera frecuencia del precursor. Una medida exacta del porcentaje de lin- focitos que posee un receptor especifico para el anti- geno puede obfenerse por citometria de flujo de cé- lulas teitidas con el antigeno marcado. En el caso de células B esto es bastante cierto, dado que sus recep- tores de antigeno reconocen el antigeno nativo, Sin embargo, s6lo en los tiltimos tiempos esta sutileza técnica, en la forma de tetrdmeros peptidicos del CMH, permitié aplicar esta metodologia a las célu- las T (fig. 7-10). Este enfoque supera el problema de la afinidad intrinseca relativamente débil del TCR para el péptido-CMH, mediante la presentacin de un péptido-CMH marcado como un tetramero mul tivalente, lo que en consecuencia aprovecha el efec~ to de bonificacién de la multivalencia (véase pag, 99). Los complejos péptido-CMH se producen por pemmitir el replegado de las moléculas del CMH con el péptido sintético apropiado. Las moléculas re- combinantes del CMH son biotiniladas en una ex- tensién carboxiterminal especial, lo que asegura que Ia biotina sea incorporada en una distancia a partir del sitio en el cual se une el TCR y mezclada con es. treptavidina marcada de modo fluorescente, que no sélo se tune a la biotina con una afinidad muy alta si- no también tiene una valencia de cuatro con respec- toa la biotina, de allf a la formacion de tetrameros. Estn apareciendo numerosas adaptaciones de esta tecnologia. Por ejemplo, la incubacién a 37°C de los tetrémeros unidos a su TCR relacionado con- duce a la internalizacién; mediante su marcado con una toxina pueden eliminarse los linfocitos T indi- viduales con una tinica especificidad. Otro enfoque es utilizar FACS de células teftidas seleccionadas di- rectamente en una placa de microtitulacién ELIS- POT en fa cual,se mide la secrecién de citocina; es- to proporciona un andlisis funcional de as células. Cuantificacién de células formadoras de anticuerpos Prueba de inmunofluorescencia “sandwich” Este es un procedimiento en doble capa disehado para visualizar el anticuerpo intracelular especitico.Calcd Fig. 7-9, Andlisis de dilucién limitante de la frecuencia de pre- cursores de células T citotéxicas en células esplénicas prove- nientes de un ratén BALB/c estimulade con eslulas esplénicas irradiadas de C57BL/6 como antigeno. Lag células esplénicas aque responden de BALB/c fueron determinadas en 24 duplica- dos en cada concentracién probacla junto con antigeno y un ex- eso de factores de eétulas T helper: La citotoxicidad en cada ori ficio se buses mediante e! agregado de células lumorales marca- das con “Cr (EL-4) del haplotipo C57B1./6; la citotoxicidad se re- veld luego por la determinacidn de la liberaci6n del material in- tracolular soluble marcado con *Cr en e! medio. a) Los puntos -muestran el poreentaje de lisis especifica de Tos orificios indivi- duales. La linea punteada indica tres desvios estndares por en. Por ejemplo, si desearamos ver cudntas células en una preparacién de tejido linfoide estaban sinteti zando anticuerpos contra el polisacdrido neumocé: Fig. 7-10. Tetrdmero péptido-CMI. Un tinico complejo péptido- CMH marcado con ftuorocromo (arriba, a la derecha) sélo pre~ senta una baja afinidad para et TCR y, en consecuendia, propor ‘ona tna sonda insensible para su receptor andlogo. Sin embar- 0, por biotinilacién (@) de las molsculas del CMH y mezelin- dolas luego con estreptavidina, que tiene una valencia de euateo con respecto ala uniGn de la biatina, se forma un complejo tetra mérice que posee una afinidad funcional mucho més alta (avi- ddez) cuanclo se utiliza uma sonda para los TCR especificos en ta superficie de la eéiula T. cima del control liberado al medio y cada punto sobre esa lines se cuenta como positivo para citotoxicidad. 6) Los datos gratica- dos de nuevo en términos de porcentaje de los orificios negati- vos a cada concentracién de aélulas que responcen por encima de Jos limites en los que se titularon los datos (5 x 10°/otificio a 0,625 * 10°/orificio). La linea punteada estd dibujada en el 37% de los orificios negativos y esta corta la linen de regresisn para dar a una frecuencia de precursores (T.,) de 1 en 2.327 cé- hulas que responden. La linea de regresidn tiene un valor r? de 1,00 en este experimento. (Reproducide con autorizacién de Simpson E. & Chandler P. (1986). En Weir D.M, (ed.) Handbook of Experimental Immunology, fig. 68-2, Blackwell Scientific Pus blications, Oxford.) cico, primero deberiamos fijar las células con etanol para evitar que el anticuerpo sea arrastrado con el lavado durante la prueba y luego tratar el extendi- ie Pipi snared Ici ofc dt more ppl ‘ta vider de 153eed eee TAL Técnica de placas de Jerne para cuantificar las células formadoras de anticuerpos (modificacién de Cunningham). a) Se muestra Ta técnica directa para células que sintetizan hemo- lisina IgM, La técnica jnditecta para la visualizacién de células productoras de hemolisinas IgG requieren el agregado de anti- IgG al sistema. La diferencia entze las piacas obtenidas por los meétodos directo e indirecto dan el ntimero de placas “IgG”. El ensayo de placas frzersas cuantifica Jas cétulas que producen Ig, total por la captura de la Ig secretada en los glibulos rojos rec do con una solucién del antigeno polisacérido. Des- pués del lavado se agrega un anticuerpo contra el polisacérido marcado con fluoresceina para locali- zar las células que se habian unido de manera espe- cifica al antigeno. El nombre de Ja prueba deriva del hecho que el antigeno queda intercalado (sandwich) entre el an- ticuerpo presente en el sustrato celular y el que se agregd como segunda capa (fig. 7-3c). Técnicas de formacién de placas Las células gue secretan anticuerpos pueden cuantificarse mediante su diluci6n en un ambien- te en el cual el anticuerpo formado por cada célu- la individual produce un efecto que puede obser- varse con facilidad. En una técnica, desarrollada a partir del método original de Jerne y Nordin, las células provenientes de un animal inmunizado con eritrocitos de carnero se suspenden junto con un exceso de gldbulos rojos de carnero y comple- mento, dentro de una cémara poco profunda for- mada entre dos portaobjetos. Con la incubacién, las células formadoras de anticuerpos liberan su inmunoglobulina, que recubre los eritrocitos cir~ cundantes, El complemento causara la lisis de las células recubiertas por lo que luego puede obser as eivos eis des pre compe mento pra femal pan oa ec nto Diertos con anti-Ig. EL ensayo de placas muiltiples se puede tlevar acaba por una modificacién que utiliza placas de microtitula- ion. b) La fotografia de las placas las muestra como areas circu- lares oscuras (algunas de los cuales estén indicadas con flechas) bajo iluminacisn con fondo oscuro. Presentan tamafo variable que depende de la afinidad del anticuerpo y Ia velocidad de se- cxecién por Ta célula formadora de anticw-2r70. (Cortesia de C. Shapland, P. Hutchings y profesor D. Male.) varse una placa despejada de glébulos rojos alre- dedor de cada célula formadora de anticuerpo (fig. 7-11). Las placas directas obtenidas de este modo revelan las células productoras de IgM, ya que este anticuerpo tiene una alta eficacia hemoli- tica, Para demostrar las oélulas que sintetizan IgG es necesario incrementar la unién del complemen- to del complejo eritrocito-anticuerpo IgG median- te el agregado de suero de conejo anti-IgG; las “placas indirectas” asi desarrolladas pueden utili- zarse para cuantificar las cétulas que elaboran an- ticuerpos de diferentes subclases de inmunoglo- bulina, siempre que se disponga del adecuado an- tisuero de conejo. El método puede expandirse re- cubriendo los glébulos rojos con un antigeno co- mo polisacarido de Pneumococcus o por el acopla- miento de los grupos hapteno a la superficie del eritrocito. En la modificacién ELISPOT, la suspensién de las células formadoras de anticuerpos se incuban en Jas microcubetas de las placas de microtitulacién que contienen filtros recubiertos con antigeno. EL anticuerpo secretado es capturado localmente y se visualiza después de Ia eliminacién de las células, por el tratamiento con anti-Ig marcada con enzima y el desarrollo de la reaccién de color con el sustra- io. Los puntos macroscépicos pueden cuantificarse con facilidad (fig. 7-12)eed ea 87 Wont eee sean on] nig fost agregado de sustvato en eP agar Forma grandes 7 tl a ane Fig, 7-12. Sistema BLISPOT (de ELISA spot) para cuantificar las cétulas formadoras de anticuerpos. El cuadvo muestra puis tos formados por eélulas de hibridoma que elabora autoanti- ‘cuerpos contra tiroglobulina reveladas por la anti-, unida con fosfatasa alcalina (cortesia de P. Hutchings). Cantidades crecien- tes de céluilas de bibridoma fueron agregadas a los dos orificios superiores y a] inferior izquierdo, los que muestran aumentos correspondientes en la cantidad de “ELISPOT”. El orificio infe- or derecho es utilizado como control utitizando un hibridoma de especificidad ircelevante, [ Tae Operadin Iran Resitoién sleep "Tinea sind gar” Neds ica | + | _Tnwtoi LAS | itive { Tiowdonio | go” hills | Fig. 7-13, Maduracidn de células madre de médula ésea bajo la influencia del timo para transforar linfocitos inmunocompe- tentes capaces de reacciones inmunes mediadas por eélulas. La jeradiacisn X (X) destruye la capacidad de linfoctos de! huésped para montar una respuesta inmune celular, pero las células ma dire en la médula dsea inyectada pueden tornarse inmunocom petentes y restaurar la espucsta (1) a menos que se extirpe el tic mo (2), en cuyo caso s6lo los linfacitos ya inmunocompetentes son eficaces (3). A propésito, las céhulas made de médula dsea también restauran los niveles de otros elementos formes de l sangre (gidbulos rojos, plaquetas, neutrdtiles, monocitos) que de otra manera disminuyen de manera espectacular después de la irradiacin con rayos X, y esta terapéutica es crucial en los casos donde la exposicisn accidental 0 terapéutica de rayos de X ‘otros agentes mitéticos dafa de manera intensa las eélulas he- matopoyéticas Anilisis de la actividad funcional por reconstitucion celular Quimeras por irradiacion Las poblaciones enteras de linfocitos y poli morfonucleares pueden ser inactivadas por dosis apropiadas de irradiacién X. Los animales trata- dos de este modo pueden ser reconstituidos por la inoculacién de células multipotenciales hema- topoyéticas de médula dsea, que proporcionan las células precursoras de todos los elementos formes de la sangre (véase fig. 12-1). Estas quime- ras del huésped més las células hematopoyéticas injertadas pueden manipularse de muchas mane- ras para analizar la funcién celular, como el papel del timo en la maduracién de los linfocitos T a partir de las células multipotenciales de médula Osea (fig. 7-13), Ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) Los ratones con defectos en Jos genes que codifi- can la cadena y del receptor IL-2, el mecanismo de 15556 ot ees Fig, 7-14, Microcirugia de un cono de crecimiento neuronal re- pleto de anticuerpos anticalcineurina marcados con verde de malatuuita, El cono de crecimiento muestra la retractacisn indu- cida por el laser de las extensiones de la membrana: (a) antes, (b) durante y (¢) después de la fulguracién del laser, (Reproducido de un comentario realizado por Muller BK. & Bonhoeffer E (1995) Current Biology 11, 1255 en los experimentos de Jay D.G. y cal. (1995) Nature 376, 686, con autorizaciGn.) salvataje de las enzimas adenosina desaminasa 0 purina nucledsido fosforilasa 0 las enzimas RAG, desarrollan SCID debido a una deficiencia en la di- ferenciaci6n de las células B y T. Estos animales es- peciales pueden reconstituirse con diversos tejidos linfoides humanos y, a continuacién, analizar sus funciones y respuestas. La coimplantacién de frag- mentos continuos de higado fetal humano (células multipotenciales hematopoyéticas) y el timo permi- te la linfopoyesis T, la produccién de oélulas B y el mantenimiento de unidades formadoras de colonias del linaje mieloide y eritroide durante 6-12 meses, Las células de sangre periférica del adulto inocula- das en la cavidad peritoneal de ratones con SCID tratados con hormona del crecimiento pueden soste- ner la produccién de oélulas B humanas y anticuer- pos, y utilizarse para generar hibridomas humanos que elaboran anticuerpos monoclonales definidos. En estos animales también es posible manipular las respuesias antitumorales inmunoterapéuticas. Interacciones celulares in vitro Es obvio que los métodos mencionades antes pa- ra la deplecién, el enriquecimiento y el aislamiento de poblaciones de células individuales le permite al investigador estudiar las interacciones celulares a través de recombinaciones juiciosas. Estas interaccio- nes por lo comtin son mas efectivas cuando las célu- las operan dentro de alguna clase de red de la estro- ‘ma, con una estructura que recuerda la de los tejidos donde su funcién se expresa de manera dptima. Por ejemplo, la colonizacién de rudimentos de timo fetal murino en cullivo con precursores de células T nos permite seguir el patrén de proliferacién, madura~ Gién, reordenamiento de TCR y seleccidn, positiva y negativa, vista por lo comtin in vivo (véase pag. 254). Un sistema aun mas refinado incluye el agrega- do de poblaciones linfoides seleccionadas a células de la estroma desagregadas, derivadas de los }ébu- los timicos fetales, deplecionadas de células linfoi- des endégenas con oxiguanosina. Las células pue- den centrifugarse en un “pellet” y cocultivarse en gotas pendientes; cuando se transfieren a un cultivo de 6rgano normal después de unas horas, se reagre- gan de un modo bastante magico conformando un Iobulo intacto y tienen lugar los diversos procesos de diferenciacion y maduracién. Exploracién de la funcion con anticuerpos Los anticuerpos pueden utilizarse para confit- mat la importancia del entrecruzamiento de los componentes de superficie celular para varias fun- ciones. Un ejemplo excelente es la induccién de la liberacién de histamina de las células cebadas por el fragmento divalente F(ab’), anti-FceRI pero no por el fragmento univalente. De manera similar, el anti- FoyR divalente activa la fagocitosis en los macréfa- gos, mientras que un anticuerpo biespecifico contra CDS y CD4 retine las dos moléculas sobre la super ficie de la célula T e induce la activacidn. El dao intracelular definido desde un punto de vista espacial mediante la inactivacién con léser, asistida por croméforo, puede Mlevarse a cabo con el uso de anticuerpos. Por ejemplo, un cono de creci- miento neuronal en un embrién vivo puede per- mearse y cargarse con anticalcineurina marcada con verde de malaquita que absorbe la luz a 620 nm, donde la mayoria de los constituyentes celulares no Io hacen, Un laser que emite luz de esta longitud de onda irradiaré el conjugedo croméforo-anticuerpo, Jo que genera un pulso de radicales libres altamen- te reactivos que causan la inactivacién en una pe- quefia regién con un diémetro aproximado de 15 A. La figura 7-14 muestra que el centelleo del laser produce la retraccion de las extensiones de la mem- brana en forma de filopodios y lamelipodios. Esto a su vez influye sobre la direcci6n del movimiento de crecimiento posterior del cono, lo que demuestra la participacién de la calcineurina, una fosfatasa de- pendiente de calmodulina, en el gobierno del cono de crecimiento. Si el investigador actiia en diferen- tes fases embrionarias, puede destruir las funciones de un modo transitorio asi como restringido en el espacio. Esta técnica debiera ser una herramientamicroquirtirgica celular discriminativa de conside- rable utilidad y aplicabilidad. INGENIERIA GENETICA DE CELULAS Insercién y modificacién de genes en las células de mamifero Dado que la transferencia de genes al interior de las oélulas de mamiferos es ineficaz, se acostumbra utilizar lineas de células inmortales para estas trans- fecciones e incluir un marcador seleccionable, como la resistencia a la neomicina. Los genes pueden intro- ducirse en las células como precipitados de fosfato de calcio 0 electroporacién, en el cual un pulso eléc- trico breve crea de manera transitoria orificios en la membrana celular. Otro enfoque consiste en incorpo- rar el gen en los liposomas, el cual se fusiona con la membrana celular. También es eficaz la microinyec- én directa de DNA. La integracién del gen en el ge- noma de un virus, como el virus vacuna (vaccinia), es una forma sencilla de ingresar en la célula, aunque se abtienen transfecciones mds estables en el largo plazo con vectores retrovirales modificados. Una de las uiltimas novedades es la transfeccién por medio de la biolistica, palabra derivada de la balistica biolé- gica. E) DNA que recubre microparticulas de oro se dispara literalmente de un arma de helio a alta pre- sign y penetra las células; incluso las células vegeta- les, con sus cubiertas de celulosa, no escapan a esta tecnologia. La piel y los tejiclos expuestos por cirugia también pueden ser penetrados con facilidad. Estudiar el efecto de agregar un gen, entonces, no oftece demasiados problemas téenicos. ;Cémo se eva- hia el impacto de eliminar un gen? Una estrategia ver- satil para suprimir la funcidn del gen endégeno con- siste en ocuparse del mRNA del gen como un elemen- to distinto del gen propiamente dicho. Las secuencias de nuclestides complementarias al mRNA del gen blanco son introducidas en la célula, por lo general en una forma gue les permite replicarse, Las moléculas antisentido asi producidas aparean sus bases con el mRNA blanco y bloquean la traduccién en proteina. Introduccion de nuevos genes en animales Creacién de “ratones disefiadores” que poseen genes nuevos Los ratones hembra son inducidos a una supero- vulacién y luego se los aparea. En los huevos fertili- HUEvO Fenrt.zapo) DESARROLLO DE ENBRIONES Proce TRANSGENICA TONES TRANSGENICOS to ta tm Fig. 7-15. Produccidn de una cepa pura de ratones transgénicos, por microinyeccién del huevo fertilizado, implantacién en una madre adoptiva y endocria posterior zados se microinyecta el gen y se realiza la implan- tacién quinirgica en las hembras. Entre el 5% y el 40% de los oocitos implantados se desarrollan hasta el té&mino y, de éstos, 10% al 25% posee copias del gen inyectado integradas de manera estable en sus cromosomas, las que pueden detectarse por PCR. Estos animales transgénicos “fundadores” son apa- reados con ratones no transgénicos y por tiltimo se establecen lineas transgénicas puras (fig. 7-15) La expresion del transgén puede estar dirigida a {ejidos particulares si se incluye el promotor pertinen- te en la estructura, por ejemplo el promotor tiroglo- bulina confinaré la expresién al tiroides. Un enfoque diferente es activar y desactivar el gen a voluntad, mediante la incorporaci6n de un promotor inducible. Asi, el promotor metalotionina sélo posibilitard la ex- ptesin de su gen unido si se agrega cinc al agua de bebida de los ratones. Es necesario confirmar que s6- Jo se obtiene la expresién deseada, dado que, en algu- nas situaciones, los promotores pueden comportarsere es \ ¢ MASA CULAR ae i oF TERN | BustogsTO. | ay pe DAR aie | | Ree reat eae j (Ph ‘te te ttm Fig. 7-16, Introduccion de un transgén a través de la transfec- ign de células madre embrionarias. Las células transtectadas pueden seleccionazse, por ejemplo para recombinantes homélo- 08 “por noqueo” (“knack out”), antes de fa reimplantacisn. LIE, factor inhibitorio de la leucemia de manera errénea lo que conduce a una expresién “inoportuna’’ del gen asociado Transgenes introducidos en células multipotenciales embrionarias Las células multipotenciales (madre) embriona- rias (en inglés, embryonic stem - ES) pueden obte- nerse mediante el cuitivo de fa masa celular interna de los blastocistos del ratén. Después de la transfec~ cién del gen apropiado, pueden seleccionarse las células transfectadas y reimplantarlas después de la Teer lulares ry inyeccién en un nuevo blastocisto. Los ratones re- sultantes son quiméricos, 0 sea que algunas células portan el transgén y otras no. Lo mismo es cierto para las células germinales, y pueden producirse cepas puras engendradas por transmisién de la li nea germinal del transgén (fig. 7-16). La ventaja sobre la microinyeccidn es que las céhu- las se pueden seleccionar después de la transfeccién y esto adquiere una importancia especial si se requie- re una recombinacién homdloga con el objeto de ge- nerar “ratones noqueados” (knockout mice), que ca- recen del gen que ha sido blanco de este proceso. En este caso, una secuencia de DNA que romperd ef marco de lectura del gen endégeno se inserta en las células BS. Dado que la recombinacién homéloga es un hecho raro comparado con Ja integracién al azar, los marcadores seleccionables son incorporados en la construccién (estructura) con el objeto de transferir sélo aquellas células ES en las que el gen endégeno ha sido delecionado (fig. 7-17). Esta es una tecnologia verdaderamente poderosa y la comunidad biolégica en su totalidad se ha contagiado con la fiebre del bo- xe0, noqueando a los genes a la derecha, a la izquier~ da y al centro. En el cuadro 7-2 se mencionan sto unos pocos ejemplos de interés para los inmundlo- gos de ratones generados por noqueo. No es un hallazgo particularmente raro observar que el noqueo de un gen de modo inesperado con- duce a defectos del desarrollo. Aunque esto en si mismo puede proporcionar informacién importan- te que implica al gen en la biologfa del desarrollo del animal, puede frustrar el objetivo original del experimento. De hecho, varios ratones generados por noqueo no son viables debido a letalidad em- brionaria. No teman, una vez més la ingeniosidad triunfa, en este caso por el servicio activo de los sis- temas de recombinasas virales o de levaduras. En lugar de usar un gen no funcional para crear el ra- tén pot noqueo, la construccién blanco contiene Ja forma normal del gen pero flanqueada con las se- cuencias de reconocimiento (sitios foxP) para una enzima recombinasa denominada Cre. Estos rato- nes son apareados con ratones transgénicos que contienen el transgén Cre derivado del bacterisfago PJ unido a un promotor inducible o especifico del tejido. El gen enddgeno de interés sera delecionado s6lo en el momento y en el lugar donde se expresa Cre (fig. 7-18). El sistema Cre/loxP también puede estar organizado de modo tal que transforma la ex- presién de un gen incorporando una secuencia de detencidn flanqueada por los sitios loxP. Los ratones en los que un gen endégeno es reem- plazado adrede por un gen funcional por noqueo por insercién (“knock in mice”) versién modificada del gen original u otro completamente diferente sonTL AR od 15 ! Secuencia blanco ——--- - | aque conione ef Plismido | | gen funcional 1 | | | | | Gon end | ral en| romasome | | colas ES i \ | | Gen por noques omosome | eles ls tS « “Fig. 7-17. Desorganizacién génica por recombinacién homélo- ga con DNA de plsmidos que contiene una copia del gen de in- letés (en este ejemplo RAG-1) en el que se inserts una secuencia ‘que especifica resistencia a Ia neomicina (neo*) de modo similar al marco de lectura destcuido RAG-I entre los extremes 5! y 3° del igen. Las celulas madre embrionatias (ES) en las cuales se incor- poré la secuencia blanco en el DNA cromosémico por recombi- Fig. 7-18. Noqueo condicional. El gen endiigeno que est en’ estudio (aqui 87-2) es reemplazado de modo homélogo en las células FS por un gen idéntico, como en la figura 7-17, pero aqui flanqueado por las secuencias loxP (recuadros de color ‘eastafio) y con et gen 210" incorporado de un modo puramen- te no desorganizativo para los propdsites de scleccién. Los re- combinantes no homélogos contendran el gen tk y son elimi= nados mediante el empleo de ganciclovir, Luego se generan animales transgénicos a partir de células ES resistentes a G4l8, nacién homéloga serén resistentes al andlogo G4l8 de la neo ina, Las células madre en las que se produjo la recombinacign ro homéloga en el DNA cromosémico incorporarian ademas el igen tinvidina cinasa (ik), que podrs utilizarse para destruir estas células mediante su cultivo en presencia de ganciclovir, !o que deja solo células BS en las que se logré la recombinacisa homé- loga. Luego éstas se utilizan para crear tun ratén por noqueo. Si los transgénicos 87.2 fox? hamocigotos son cruzados con ra- tones que contienen un transgén para la recombinasa Cre bajo el control de elementos reguladores especificos, sélo aquellas células en las que el promotor es activo producirin la enzima Cre, necesaria para delecionar la secuencia fianqueada por loxP. El ejemplo mencionado representaria un experimento destinado a investigar el efecto del nogueo especttico B7.2 en las células B mientras se mantiene su expresiGn, por ejemplo, en las eélulas dendriticas.60 Cun rac Cuadro 7-2. Algunos genes “noqueados” y sus efectos (aera de (08 Aseria de lls Tconcas 59 Seize detective en os tmocts pero no eno los paises HOX TT Ausencia en el bozo ge iin dates observados! (Codena c- de FeeR) Resistente a fo onafaxiacutnea y sistemica xin dela cadena dela] Auseni de lls B Ight de membrana 6 Sin pda 6se0 condos realizo oforec- tomia (gmplicacin on lo osteoporesis?} 18 Susceptible a Leishmania moj, cambio de larespuesta Th Th? (disminuin del Ty y curmento dela produc de IL-4) Af de a moléla dase] Disminucién de as ls T 04; el OH enfermedad inflomteria inestnl Petforna Doi de Cy del funn de cls WK ‘TwPh Falta de células (DB WR Resin ol shock ndotxico, sensible a Usteria dtd rods (195) Carat iy 5, 425. denominados “ratones noqueados”. En consecuen- cia, en el ejemplo mencionado antes el noqueo por insercidn en el gen flanqueado por loxP conduce por iiltimo a un gen puesto fuera de combate en un tipo celular selecionado. Otro ejemplo de un no- queo por insercién en el gen se mencioné en la pag. 149 con el reemplazo del RAG-2 enddgeno con un gen por fusién RAG-2-GEP. Terapia génica en seres humanos. Parece que esta- mos alcanzando la ciencia ficcién y estamos en las fases tempranas de poder corregir el infortunio ge- nético mediante la introduccidn de genes “buenos”, La provisién génica eficaz atin pose problemas im- portantes si bien ha habido algunos éxitos recientes. Una forma de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) se debe a una mutacién en el gen ye, que co- difica una subunidad de los receptores citocina para la IL-2; IL-4, IL-7, IL-9 e I-15. La correccién de este defecto en los nifios se ha logrado por la transferen- cia in vitro del gen normal en las células multipoten- ciales de la médula ésea CD34* que utiliza un vector derivado de un retrovirus Moloney, una prueba con- vincente del principio para la terapia génica huma- na. También quedé demostrado que los vectores adenovirus titiles en la terapia génica en el pasado, cada vez mas estan siendo reemplazados por el vi- rus asociado con los adenovirus (AAV), que puede ser més seguro. Se logré cierto éxito con el empleo de la inyeccidn intramuscular de vectores basados en AAV para transferir el factor IX de la coagulacién sanguinea humana en los pacientes con hemofilia B. | Rislamiento de subpoblaciones de levcocitos * Las células pueden separarse sobre la base de caracteristicas fisicas como tamaiio, densidad de flotacién y adhesividad, * Las células fagociticas pueden separarse con un imén después de la captacién de particulas de hierro y las células que se dividen en respues- ta a un estimulo especitico, por ejemplo antige- no, pueden eliminarse por la luz ultravioleta después de Ia incorporacién de 5-bromodeso- xiuridina. * Las células recubiertas con anticuerpo pue- den eliminarse por citotoxicidad mediada por anticuerpos © conjugados anti-Ig-ricino; pue- den aislarse por el enfrentamiento con an en fase sdlida o por formacién de cuimulos con perlas magnéticas que poseen anti-[g en su su- perficie. * Cantidades més pequefias de células pueden Fraccionarse al cubrirlas con un anticuerpo mo- noclonal fluorescente y separarlas de las células no thuorescentes en el FACS. * Las eélulas T especificas para un antigeno pue- den ser enriquecidas como Iineas o clones me- diante la estimulacién con el antigeno; la fusidn apropiada a lineas de células T tumorales pro- duce hibridomas de células T inmortales especf- ficas para el antigeno.tea BTS Localizacién inmrunohistoguimica de ontigenos en células ytejidos * Los antigenos pueden localizarse si son tei dos con anticuerpos fluorescentes y observados con un microscopio de fluorescencia. * La microscopia confocal examina un plano muy delgado con gran aumento y proporciona datos cuantitativos en imagenes extremadamen- te nitidas de las estructuras que contienen el an- tigeno, las que también pueden examinarse en tres dimensiones. « Los anticuerpos se pueden marcar directamen- te o visuatizarse mediante un segundo anticuer- po, una anti-ig marcada. * En un citémetro de flujo se investigan células Gnicas en gotas individuales, mediante el em- pleo de uno o més haces de laser, y pueden re gistrarse los datos cuantitatives que utilizan di- ferentes marcadores fluorescentes, lo que da un andlisis fenotipico complejo de cada célula en una mezcla heterogénea. Ademas, la dispersicin de la Juz del laser define el tamafo celular y la dispersion a 90°, la granularidad celular. * También pueden utilizarse anticuerpos fluo- rescentes 0 sus fragmentos para tefiir antigenos intracelulares en las células permeabilizadas. También se dispone de sondas para pH, Ca’, ‘Mg, Na’, tioles y contenido de DNA. En la ac- tualidad también pueden estudiarse elementos reguladores génicos unidos a un gen informa- dor como GFP en el nivel de célula tinica por tometria de flujo. * Los anticuerpos pueden marcarse por enzima para la definicién histoquimica de antigenos con microscopio 6ptico y acoplados con particulas de oro coloidal de diferentes tamafios para la vi- sualizacidn ultraestructural en el microscopio electrénico. Expresion génica + La expresién del mRNA puede localizarse por hibridacién in situ mediante el empleo de una sonda de oligonuclestido complementa- ria + Un cuadro completo de la expresion génica ce- lular es ahora asequible por la hibridacién en dispositivos microclasificadores Evaluacién de lo actividad funcional + Pueden estudiarse, casi de manera sistematica, Ia quimiotaxis de neutréfilos, la fagocitosis, la idad oxidasa del NADH (nicotinamida ina dinuclestido reducido) y el poder mi- crobicida. + Las respuestas de linfocitos contra antigenos son monitoreadas por la proliferacién, por la li- beracién de citocina o por ambas. Las células in- dividuales que secretan citocinas pueden identi- ficarse por la técnica ELISPOT, en la cual el pro- ducto secretado es capturado por un anticuerpo en fase sélida y luego tefiido con un segundo an- ticuerpo marcado. La destruccidn extracelular por las células T ci- tot6xicas y células NK puede determinarse por Ia liberacién de *'Cr radiactivo a partir de las cé- lulas blanco premarcadas. La frecuencia del precursor de células T efecto- ras puede medirse por la tincién de las células con tetrémeros péptido-CMH o por andlisis de diluci6n limitante. * Las células formadoras de anticuerpos pueden cuantificarse ya sea por una prueba sandwich de inmunofluorescencia 0 por técnicas de for- macién de placas, en las que el anticuerpo secre- tado por las células causa la lisis mediada por complemento de tos gldbulos rojos adyacentes 0 es capturado por el antigeno en fase sdlida en un ensaye ELISPOT. * La actividad funcional puede evaluarse me- diante experimentos de reconstruccién celular en los que conjuntos dé leucocitos y tejido linfoi- de seleccionado pueden trasplantarse en hu pedes que no responden, como receptores irra- diados 0 ratones con SCID. Poblaciones celula- res definidas también pueden separarse y re- combinarse de manera selectiva in vitro. * Los anticuerpos pueden ittilizarse para la ex- ploracién de la funcidn celular, por entrecruza- miento de los componentes de la superficie celu- lar o por destruccién selectiva de sitios intrace- lulares particulares, por irradiaci6n con laser de anticuerpos especificos conjugados con cromé- foros que se localizan en el rea blanca por la pe- netracién de células permeabilizadas. Ingenieria genética de las células * Los genes pueden insertarse en células de ma- mifero por transfeccién, utilizando precipitados de fosfato de calcio, electroporacién, liposomas y microinyeccién. * Los genes también pueden ingresar en una c&- lula después de la incorporacién en virus vacu- na o retrovirus. 1662 Cri Rao ed * La funcién génica endégena puede ser inhibi- da por RNA antisentido 0 por recombinacién homdéloga con un gen desintegrado. * Los ratones transgénicos que portan un gen completamente nuevo introducido en un huevo fertilizado por microinyeccién de DNA pueden ser establecidos como Iineas endocriadas. * Los genes pueden ser introducidos en células multipotenciales embrionarias; estas células ma- dre modificadas son inyectadas de nuevo en un blastocisto y pueden desarrollar ratones funda- dores a partir de los cuales pueden criarse ani- males transgénicos puros. Una aplicacién muy, importante de esta técnica comprende la ruptu- ra de un gen blanco en la célula multipotencial embrionaria por recombincacién homéloga, lo que produce “ratones noqueados” (“knock cout”) que carecen de un gen especifico: Los no- queos condicionales emplean sistemas de re- combinasas como Cre/loxP, con el objeto de controlar Ia delecién ya sea temporaria o de ma- nera especifica del tejido. «Los “ratones por noqueo por insercién” (“knock in”) que poseen el gen especifico tienen un gen endégeno reemplazado ya sea por una variante de ese gen 0 por otro completamente diferente. * La terapia génica humana promete un futuro excitante. La provisién de genes por vectores, basados en retrovirus o en virus relacionados a Jos adenoviurus, se encuentran bajo intensa in- vestigacién. Véonse preguntas de opciones miltiples en el sitio webs conespondiente (www.‘oi.com| LECTURAS ADICIONALES Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore D.D., Seid- man J.G, Smith J.A. & Struhl K. 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