Variantes Mutacionales

su R.43I4 Ci4 TRADA *h9__ VARIANTES MUTACIONALES NO SELECCIONADAS DE LA FOSFA- TASA ALCALINA DE ESCHERICHIA COLI. Trabajo realizado en el Departamento de Gené- tica, Facultad de Biologia, Universidad de Sevilla, para optar al grado de Doctor en Biologia, por el licenciado FRANCISCO DEL CASTILLO ROMAN Fk Gile= Sevilla, Enero de 1982 Director y Ponente A. Leda PHlisedo Prof. Enrique Cerd4 Olmedo Director del Departamento de GenéticaEl esfuerzo del hombre por comprender el Universo es lo nico que eleva la vida humana sobre el nivel de la farsa y le confiere algo de la dig- nidad de la tragedia, Steven Weinberg, "Los tres primeros «minutos del Universo"RESUMEN Y CONCLUSIONES La polémica sobre la importancia relativa de la seleccién y de la deriva genética en el polimorfismo y la evolucién moleculares (neutralismo contra seleccionismo) se encuentra estanca- da y la solucién parece depender del desarrollo de nuevas vias experimentales, En esta Tesis se han investigado en la fosfatasa alcalina de Escherichia coli el espectro mutacional-"naciente" (conjunto de variantes mutacionales esponténeas) y el espectro “establecido" en poblaciones naturales. Mediante la comparacién de ambos espectros se pretende determinar qué proporcién de las mutaciones nuevas estan sometidas a seleccién, qué pardmetros’ enzim&ticos influyen y en qué medida, permitiendo asi un nuevo enfoque de la polémica, El estudio del espectro mutacional naciente de una enzima ha sido imposible hasta ahora por la rareza de la mutacién y la necesidad de evitar cualquier procedimiento selectivo que pudiera sesgar el conjunto de . variantes estudiadas.El empleo de la comutacién con nitro-soguanidina entre el gen estructural de la fosfatasa (phoA) y el gen proC ha permitido el estudio sistematico del espectro mutacional naciente, porque el 6% de los revertientes protétrofos obtenidos tras el tratamiento con nitrosoguanidina. de un auxétrofo proC presentan variaciones en la fosfatasa, Estas variantes no han sido sometidas a ningén proceso selectivo y, ademas, la sintesis de la enzima estuvo reprimida durante la obtencién de las estirpes a investigar. Por tanto, dichas variantes constituyen una muestra no sesgada del espectro mutacional naciente de la fosfatasa, Se han ensayado métodos rApidos, fiables y precisos para‘la deteccién de variantes de la fosfatasa atendiendo a la movilidad electrofo- rética, la termoestabilidad, la actividad, la cinética, la curva actividad/pH y la energia de activacién. La aplicacién de dichos métodos a la deteccién y caracterizacién bioquimica de variantes de la fosfatasa en estirpes naturales (espectro establecido) y estirpes mutantes (espectro naciente) ha permitido obtener las siguientes conclusiones:1. La comutacién con nitrosoguanidina incrementa unas 6000 veces la frecuencia de variantes mutacionales de una enzima respecto al nivel esponta- neo y permite la busqueda sistem4tica de variantes sin exigir a priori ninguna variacién fenoti- pica. 2. La electroforesis en condiciones 6ptimas permite detectar la gran mayoria de las sustitu-~ ciones de aminodcidos y no sélo aquélias que implican amino4cidos con distinta carga eléctri- ca. . 3. La termoestabilidad es un pardmetro muy eficaz para la deteccién de variantes enzimaticas, sobre todo en cpmbinacién con la electroforesis 4, Otros paraémetros enzimaticos, como la actividad, la cinética, la curva actividad/pH y la energia de activacién, tienen escaso poder de deteccién de variantes pero pueden ser muy tiles para la caracterizacién bioquimica de las variantes enzimaticas.5. La fosfatasa alcalina es polimérfica en la poblacién hospitalaria sevillana de Escherichia coli, habiéndose encontrado 5 alelos distintos entre 50 estirpes naturales investigadas, La seleccién purificadora puede explicar el estre- cho parecido entre las variantes naturales mas abundantes y la fosfatasa de las estirpes de laboratorio. 6. La comparacién de las variantes naturales y las obtenidas por comutacién sugiere la existencia de abundantes alelos selectivamente neu- trog de la fosfatasa.I, LA POLEMICA NEUTRALISMO-SELECCIONISMO Las investigaciones de los siglos XVIII y XIX sobre Taxonomia, Anatomia y Morfologia Comparadas, Paleontologia y Biogeografia encontraron una interpretacién convincente en la teorfa de la evolucién por seleccién natural de Dar- win y Wallace, El desarrollo posterior de esta teoria (neodarwinismo) ha demostrado su valor como explicacién racio- nal de la evolucién de los seres vivos (ver, por ejemplo, Dobzhansky, 1970 y Huxley, 1974), Segin el neodarwinismo, la evolucién tiene lugar mediante seleccién natural en funcién de las diferencias adaptativas entre individuos portadores de informaciones genéticas distintas. Asi, cuando una mutacién ventajosa aparece en un individuo, se hace cada vez mas frecuente por seleccién natural y llega a fijarse en la poblacién. Por otra parte, la teoria neodarwinista considera que la ' fijacién de mutaciones neutras (sin ventaja o desventaja adaptativa) es un hecho evolutivo muy raro e incluso se discute si exist@n tales mutaciones neutras (Mayr, 1965), El desarrollo reciente de la Biologia Molecular ha permitido un nuevo enfoque del problema de la evolucién, pero ha desembocado en una agria polémica, "neutralismo contra seleccionismo", que versa sobre la importancia relativa ide la seleccién y de los procesos aleatorios (deriva gené- tica) en la evolucién.“3 Mientras que las teorias evolucionistas clAsicas eran exclusivamente seleccionistas o "darwinianas", los estudios sobre evolucién molecular han invocado desde su co- mienzo la intervencién de procesos aleatorios o "no darwi- nianos", En este sentido son interesantes los trabajos con estirpes de Escherichia coli portadoras de mutaciones mut, que aumentan notablemente la tasa de mutacién espontdnea pero no acarrean desventaja selectiva detectable. Se ha demostrado que la composicién de bases del ADN de estas estirpes cambia durante subcultivos sucesivos al ritmo esperado si la inmensa mayoria de los cambios de bases son neutros (Cox y Yanofsky, 1967; Gibson et al., 1970). La formulacién explicita de la teoria neutralista fue realizada por Kimura (1968) y King y Jukes (1969), quienes explicaron los resultados sobre filogenia y polimorfismos moleculares mediante la fijacién aleatoria de mutaciones neutras por deriva genética. Esta hipétesis fue rebatida rapidamente por quienes aductan que 1a evolucién molecular ocurre a través de procesos selectivos deterministas como los propuestos para explicar las observaciones clasicas (Prakash et al., 1969; Clarke, 1970 y Richmond, 1970, entre otros). Ambas teorias coinciden, sin embargo, en que la mayor parte de las mutaciones nuevas son deletéreas. Las discusiones se centran actualmente en 1a compati- bilidad entre los datos empiricos, suministrados frecuente-* mente por los seleccionistas, y las predicciones cuantita- tivas de la teoria neutralista. Los mismos datos se citan a veces en apoyo de las dos teorfas contrapuestas. Como se discute m4s adelante, la cuestién dista mucho de estar solucionada siquiera parcialmente, porque es dificil demostrar si la mayoria de los alelos que segregan en las poblaciones son neutros (como pretenden los neutralistas: Kimu- ra, King, etc...) 0 por el contrario estén sometidos a la seleccién (como afirman los seleccionistas: Ayala, Clarke, etc...). La discusién de los numerosos datos disponibles ha sido exhaustiva y la solucién parece depender del desarrollo de nuevas vias de acceso al problema. A continuacién se discuten brevemente algunos aspectos de la filogenia y el polimorfismo molecular, para ilustrar los argumentos empleados por las dos tenden¢cias opuestas, Se citan, en la medida de lo posible, libros o revisiones recientes de aspectos parciales del problema, pero cuando la informacién necesaria est& excesivamente dispersa, se ofrecen s6lo los resultados globales y la referencia mas reciente, sin pretender ser exhaustivo. 1.1, La filogenia molecular La secuenciacién de proteinas se ha perfeccionado hasta llegar a la automatizacién casi total en muestras peque--5- , fiisimas (Hunkapiller y Hood, 1980), Se conoce ya la secuencia de muchas proteinas homélogas de especies distintas (Dayhoff, 1978). Un resumen reciente de la elaboracién de estos datos puede encontrarse en Petit y Zuzkerkandl (1976). El cuadro filogenético derivado de estos estudios es muy coherente con los resultados de la Anatomfa Comparada y con los del registro fésil y amplia adem4s las relacio- nes filogenéticas a grupos, como los microorganismos, en que la escasez de fésiles y las controversias taxonémicas impiden el desarrollo de una filogenia clasica. La comparacién de secuencias de prote{nas homélogas de varias especies permite apreciar una conservacién casi absoluta de los aminodcidos que ocupan posiciones criticas para la funcién de la proteina y una gran variabilidad de la mayoria de los amino&cidos restantes, La evolucién mole cular de las globinas (Ferguson, 1980) es un buen ejemplo, Miyata et al. (1979) han encontrado una correlacién negativa entre la frecuencia relativa dg cada sustitucién de aminodcidos y una estima de la diferencia de caracteristicas fisicoquimicas entre los dos aminodcidos implicados, Por otra parte, los aminodcidos de caracteristicas similares parecen intercambiarse libremente, reflejando la ac- cién de la deriva genética (Sander y Schulz, 1979). Se encuentran por tanto hechos que indican procesos selectivos y otros que indican procesos aleatorios.La comparacién de secuencias ha puesto de relieve que el ntimero de sustituciones de aminodcidos entre secuencias homélogas es proporcional al tiempo de divergencia estimado a partir del registro fésil. Asi, las sustituciones de aminoa&cidos se han empleado para definir un "reloj" molecular que ha sido utilizado para estimar tiempos de divergencia en ausencia de datos paleontolégicos. La constancia de la velocidad de evolucién molecular se interpreté inicialmente como un indicio a favor de la teor{a neutralista, fundamentalmente porque se hace dificil postular una presién ae seleccién constante durante enormes periodos de tiempo. Sin embargo, la velocidad de evolucién molecular, aunque aproximadamente constante para una proteina dada, es distinta para cada proteina, reflejando asi la existencia de restricciones funcionalés y apoyando a la teoria seleccionista, Los resultados m&s recientes ponen en duda la constancia de la velocidad de evolucién molecular incluso de una proteina individual y la situacién ac- tual es muy confusa (Gillespie y Langley, 1979). Muy recientemente se han desarrollado técnicas para la secuenciacién de dcidos. nucleicos (Maxam y Gilbert, 1977; Sanger et al,, 1977 y Maat y Smith, 1978), que hacen posible la comparacién de secuencias de ADN de genes homé- logos de distintas especies (ver Perler et al., 1980 sobre las insulinas, y Efstratiadis et al., 1980 sobre las globinas). Se encuentra una gran frecuencia de cambios siné--7- nimos que afectan a la tercera posicién de los tripletes y que deberfan ser absolutamente neutros en principio, pero también parecen éncontrarse restriceiones a nivel de ADN, debidas a exigencias de 1a estructura secundaria (Ha- segawa et al., 1979) y la maduracién de'los ARNm y, en el caso de los virus, a la existencia de genes solapados (San- der y Schulz, 1979). Los nuevos resultados analiticos han provocado’ una oleada de elaboraciones y discusiones teéri- cas (ver, por ejemplo, Miyata et al,, 1980; Kimura, 1981 y Modiano et al., 1981), I.2. El polimorfismo molecular El polimorfismo se define en general como la coexistencia de varios alelos de un mismo gen en una poblacién. El polimorfismo morfolégico de ciertas especies, como el melanismo industrial en los Lepidépteros y la pigmenta- cién de la concha de los caracoles, ha sido el material idéneo para poner de relieve la participacién de la deriva genética y de diversos mecanismos selectivos, como ventaja del heterocigoto (heterosis), seleccién sexual, seleccién dependiente de frecuencia y densidad, y otros, en algunos casos concretos (Ford, 1971).-8- El desarrollo de la Genética Molecular durante la segunda mitad del siglo XX demostré que los polimorfimos mor- folégicos tienen una: base molecular en-el polimorfismo de los genes y proteinas implicados. A continuacién se discuten algunos aspectos interesantes del polimorfismo molecular. La técnica m4s utilizada en la deteccién del polimorfismo molecular es la electroforesis. La realizacién de zimogramas (Hunter y Markert, 1957) permite identificar a las enzimas como bandas coloreadas en el gel de electroforesis después de una reaccién especifica catalizada por la enzima sobre el propio gel o tifiendo directamente las proteinas. Esta técnica permite la deteccién de difereh- cias de movilidad electroforética (polimorfismo electro- forético) en enzimas y proteinas solubles y fue empleada por primera vez por Hubby y Lewontin (1966) y Lewontin y Hubby (1966) en poblaciones de Drosophila pseudoobscura y por Harris (1966) en poblaciones humanas. El resultado inesperado fue el descubrimiento de un nivel muy elevado de polimorfismo electroforético en ambos casos. Se define como polimérfico un gen en una poblacién cuando la frecuencia del alelo mAs abundante es menor del 199%, Los numerosos estudios en muchas especies, desde bac- }terias al hombre (revisién en Selander, 1980), permiten afirmar que usualmente el 30% de las proteinas estudiadasson polimérficas (para alelos electroforéticos) y que los individuos son heterocigéticos para el 10% de los genes correspondientes, Estas frecuencias, propias de proteinas solubles facilmente analizables, pueden no ser universales; asi, por ejemplo, en las proteinas mas abundantes de Dros phila analizadas por electroforesis bidimensional, se reducen a 11% y 4%, respectivamente (Leigh Brown y Langley, 1979). Asi como los polimorfismos morfolégicos pueden ex- plicarse con cierta facilidad invocando seleccién o deriva genética segtin el caso, resulta imposible decidir las proporciones relativas de polimorfismos moleculares explica- bles por seleccién y deriva genética, respectivamente. En particular, es muy dificil explicar el mantenimiento simul~ taneo de tantos polimorfismos mediante seleccién, ya que ello implicarfa un lastre genético intolerable (discusién extensa en Lewontin, 1974, y Nei, 1975, desde los puntos de vista seleccionista y neutralista, respectivamente). Los seleccionistas afirman que la mayoria de los polimorfismos moleculares estan mantenidos por fuerzas selectivas o representan fases transitorias en la sustitucién selectiva de un alelo por otro més apto, Los neutralistas creen que la mayoria de los polimorfismos moleculares se deben a mutaciones neutras y se mantienen por deriva gené- tica, representando la coexistencia de alelos neutros o casi neutros durante el proceso de fijacién aleatoria de uno de ellos (Kimura y Ohta, 1971). A continuaci6n se dis-=10- cuten algunos aspectos del polimorfismo molecular que son relevantes para la polémica neutralismo-seleccionismo, El gran desarrollo matemAtico de la teoria neutralista (resumen en Nei, 1975) permite hacer predicciones cuanti- tativas confrontables con los datos empiricos disponibles. Las conclusiones, sin embargo, son confusas por varias razones, a saber: a) la dificultad de evaluar experimentalmente los parémetros que figuran en las ecuaciones, como tamafio efectivo de poblacién, tasas de mutacién y migra- cién y coeficientes de seleccién; b) la necesidad, para que los tests sean aplicables en rigor, de haberse alcan- zado el equilibrio entre mutacién y deriva, proceso lento de dudosa realidad (Ewens, 1977); c) la incertidumbre respecto a la proporcién de mutaciones detectables por electroforesis (Ramshaw et al., 1979) y d) la frecuencia no desdefiable de variantes enzim4ticas que no se deben a muta~ ciones del gen estructural sino a intervencién de genes modificadores (Tsakas et al,, 1980), Los zimogramas tipicos sélo pueden detectar una parte de las variantes moleculares y ello podria explicar algunas contradicciones entre teorfa y observaciones, Se ha intentado, por tanto, aplicar otras técnicas (generalmente variaciones en las condiciones de electroforesis y ensayos de termoestabilidad) para obtener una descripcién mas completa del polimorfismo molecular en poblaciones naturales."4 == En efecto, se ha conseguido detectar muchos nuevos alelos y aumentar la estima de la heterocigosidad y la capacidad de distinguir entre poblaciones de 1a misma especie (John- son, 1979a), favoreciendo las teorias neutralistas. Esta descripcién mAs completa, sin embargo, no aumenta en la misma proporcién el ntimero de alelos detectados en distintas proteinas, lo que favorece las teorias seleccionistas (Singh, 1979), De todas formas, sélo la descripeién del polimorfismo en las secuencias de ADN seria rigurosamente exhaustiva, pero es poco asequible en la practica. Se ha estudiado extensamente la relacién entre la fre~ cuencia de polimorfismo electroforético y factores tales ‘como el tamafio de 1a proteina (Nei et al., 1978), su compo- sicién de subunidades (Harris et al., 1977) y su funcién (Johnson, 19748), para averiguar los mecanismos de la pre- sunta seleccién o ara confirmar predicciones de la teorfa neutralista, Los resultados obtenidos son contradictorios e indecisos para la resolucién de la polémica. Se suele encontrar que el mismo alelo electroforético es el m4s abundante en distintas poblaciones de una misma especie, lo que se interpreta como indicio de seleccién direccional a favor de ese alelo (Ayala et al., 1972), Sin embargo, los neutralistas han demostrado teéricamente (Ma- ruyama, 1970) y experimentalmente (Aspinwall, 1974) que una pequefifsima tasa de migracién bastaria para. explicar-12- a re estos resultados. También se han encontrado con frecuencia correlaciones entre frecuencias alélicas y factores ambien- tales (por ejemplo, Christiansen y Frydenberg, 1974, y Alonso Moraga , 1981). Estas correlaciones constituyen un fuerte apoyo a la explicacién seleccionista de casos concretos, aunque no excluyen la existencia adicional de abundantes alelos neutros. Se han realizado numerosos experimentos destinados a detectar diferencias selectivas entre alelos electroforé- ticos en el laboratorio. El resultado positivo de estos experimentos apoya a la teorfa seleccionista, a pesar de las ]imitaciones inherentes a este tipo de experimentos, como la no uniformidad del fondo genético, la escasa repetibilidad de los resultados, etc... (Mukai y Yamazaki, 1980). En un trabajo reciente (Mukai et al., 1980), se de~ muestra que las diferencias selectivas son muy. pequefias, de forma que el tamafio de poblacién pasa a ser un factor eritico, del que depende que determinados alelos segreguen © no en la poblacién. En cualquier caso, se demuestra uni- camente la existencia de seleccién en algunos casos concre~ tos, pero éste no es el fondo de la polémica, ya que los neutralistas admiten una pequefia proporcién de polimorfis~ mos sometidos a seleccién, Finalmente debe citarse una notable hipétesis debida ‘a Zouros (1976), quien propone que las diferencias en lasfrecuencias de polimorfismo de distintas proteinas se deben a que cada proteina tiene una "sensibilidad" caracte- ristica a la mutacién, de forma que los parémetros enzimé- ticos estudiados son m4s susceptibles de modificarse por mutacién en unas proteinas que en otras. En efecto, se ha encontrado que la proporcién de mutaciones que alteran drasticamente la funcién es distinta en distintas proteinas de Esc ichia coli (Langridge, 1974) y se ha descrito una frecuencia anormalmente alta de mutantes sin actividad para la deshidrogenasa del alfa-glicerofosfato (a-gpd) de Drosophila tanto espontaneamente como después de tratamien- to mutagénico (O'Brien y Mac Intyre, 1972). I.3,. Una solucién posible Como puede apreciarse por la discusién anterior, 1a enorme cantidad de datos disponibles no aporta una conclu- sién firme de la polémica neutralismo-seleccionismo, Todo lo m4s, se ha conseguido demostrar la accién simult&nea de procesos de deriva y seleccién durante la evolucién molecular y en el mantenimiento del polimorfismo molecular, pero no se ha podido determinar la importancia relativa de ambos procesos o al menos cudntas y cuales son las va-_ riantes de una proteina que estan sometidas a seleccién.-14- Es interesante resaltar que el nico material analiza-— do hasta ahora ha sido el espectro de variantes enzimaticas presente en poblaciones naturales, "establecido", por tanto, por la accién combinada de procesos de seleccién y deriva sobre el espectro "naciente", o conjunto de las variantes mutacionales esponténeas, Es razonable esperar que la comparacién de los espectros "naciente" y "establecido" permitiria averiguar qué proporcién de las mutaciones nuevas estén sometidas a seleccién, qué pardmetros enzim&ticos influyen y en qué medida, con lo que podria zan- Jjarse la polémica, La dificultad de esta propuesta reside en que no tene- mos forma de estudiar el espectro mutacional “naciente", ya que en el laboratorio el aislamiento de mutantes implica siempre fuertes presiones selectivas. En la presente Tesis Doctoral se’ ha disefiado un procedimiento original para obtener y estudiar el espectro mutacional "naciente" de una proteina. En los siguientes apartados de esta Intro- duccién se discuten los datos disponibles sobre espectros mutacionales y se exponen las bases del sistema experimental utilizado.-15- II. ESPECTROS DE VARIANTES MUTACIONALES La descripcién de los espectros mutacionales (naciente y establecido) comprende tres aspectos importantes de las mutaciones: naturaleza molecular, efecto fenotipico y frecuencia de aparicién. II.1, La naturaleza molecular de las mutaciones Segiin el tipo de alteracién molecular del ADN, las mutaciones pueden clasificarse ent _ 1) Sustituciones, que incluyen transiciones (sustituciones purina-purina, y pirimidina-pirimidina) y transversiones (sustituciones purina-pirimidina), Algunas sustituciones de bases originan terminaciones prematuras; otras, la sustitucién de un aminodcido por otro, y otras no alteran la proteina, 2) Inserciones y deleciones, muchas de las cuales dan lugar a desfases en la traduccién del mensaje. 3) Reordenamientos, tales como inversiones y translo- caciones, No se han encontrado mutaciones debidas a inversién de parte de la secuencia de ADN de un gen (Auerbach, 1976), ni se han buscado lo suficiente para excluir su existencia,16 =16= Los desfases constituyen una buena parte de las mutaciones espontaneas que producen pérdida de actividad (por ejemplo, Coulondre y Miller, 1977, sobre el gen lac de Escherichia coli), Cuando la pérdida de actividad es muy desventajosa, raramente se encuentran inserciones o deleciones; asi, de 250 variantes de las globinas humanas ay 8, sélo 12 (el 5%) son deleciones o inserciones, de tamafio comprendido entre 2 y 15 bases (recopilacién personal a partir de los restimenes de "Genetics Abstracts", vols, 1-13). Se prescindirdé en adelante de los desfases, ya que neutralistas y seleccionistas estan de acuerdo en que sus drasticos efectos los convierten en blanco idéneo de la seleccién, y se discutiraén s6l0 los datos disponibles sobre las frecuencias relativas de los distintos ti-~ pos de sustituciones de bases, Los polimorfismos enzimaticos se deben, en todos los casos conocidos con suficiente detalle, a sustitucién de un solo aminoécido, explicable por sustitucién de una base en el ADN. Este es el caso, por ejemplo, de la deshidrogenasa del alcohol de Drosophila_melanogaster (Retzios y Thatcher, 1979; Chambers et al,, 1981), de la hemoglobina humana (ver, por ejemplo, Ingram, 1963) y de la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato humana (Yoshida, 1967). Los datos disponibles son insuficientes para estimar las frecuencias de los diversos tipos de sustituciones.-17- Es dificil determinar si todas las sustituciones son intrinsecamente equiprobables , ya que habria que detectar- las e identificarlas todas con igual probabilidad. Sin embargo, en algunos casos se pueden determinar las frecuencias relativas de algunos tipos de sustituciones. Las mutaciones que originan codones TAG, TAA o TGA dan lugar a terminaciones prematuras, Son faciles de detectar, porque casi siempre producen pérdida de funcién,y faciles de identificar si se dispone de los supresores ade- cuados, Si se conoce la secuencia de ADN del gen silvestre, se puede determinar sin ambigiiedad la sustitucién que ha tenido lugar, Las sustituciones de un par AT por un par GC (AT— GC) no son detectables por este sistema, ya que nunca dan lugar a terminaciones prematuras. El gen lacI ‘de Esch coli, responsable del re- presor del operén de la lactosa, es muy adecuado para estudiar la frecuencia de distintos tipos de mutacién (Coulon- dre y Miller, 1977) y, adem4s, se conoce su secuencia de ADN (Farabaugh, 1978). Se ha encontrado que 1a mutacién esponténea a terminacién prematura se debe preferentemente a sustituciones GC~AT en dos de las tres 5-metil~citosi- nas presentes en la secuencia silvestre (Coulondre et al., 1978). Como en todos los organismos se encuentran metila- ciones del ADN (ver, por ejemplo, Razin y Cedar, 1977), es posible que las transiciones GC — AT abunden entre las-18- mutaciones esponténeas. Aunque se excluyan las 5-metil-ci- tosinas (Tabla I), las transiciones (al menos las GC AT)’ son intrinsecamente m&s probables que las transversiones (especialmente las GC¢4CG y AT¢?TA). TABLA I. Frecuencias de distintas sustituciones entre mutaciones esponténeas que producen terminaciones prematuras del gen lacl de Escherichia coli. Se representa por p el néimero de codones del gen que por sustitucién de una base podrian mutar a terminacién prematura, obs el nimero de mutaciones que presentaban la terminacién y la sustitucién indicada y esp el niimero de mutantes esperado si todas las sustituciones fueran igualmente probables. No se estudiaron las terminaciones TGA, Los da~ tos proceden de Coulondre y Miller (1977), excluyendo los tres codones que contienen 5-metil-citosina (Coulondre et al., 1978). Terminaci6én TAG — Terminacién TAA Total Sustituciones p_ obs esp p_ obs esp obs esp Transiciones: GC~9AT, 19.67 43.7 12 32 22,75 99 66.45 Transversiones: GC+}CG 3 210.1 Oo- = 2 10.10 GoTA 10 37 33.6 12 28 22.75 65 56,35 ATTA 58 4° 16.8 14 12 26.50 16 43,30 TAYGC 85 11 16.8 oO - - 11 16.80 Total 23° 8477.3 26 40 49,25 94 126.55 Total general 36 121 121.0 38 72 72.00 193 193,00 X? (transiciones frente a transversiones, terminacién TAG) = 19.45 (p < 0,01). XC (transiciones frente a transversiones, terminacién TAA) = 5.50 (p < 0,05). xi (trangiciones frente a transversiones, total) = 24.32 (p < 0,05).~S ~19- También aportan informacién sobre este tema las variantes electroforéticas raras detectadas en las globinas humanas a y g (Modiano et al., 1981). Aunque se desconoce la frecuencia de cada sustitucién, ya que no existen datos fiables sobre frecuencias de las distintas variantes elec- troforéticas en las poblaciones, una elaboracién de los datos disponibles (Tabla II) sugiere igualmente exceso de transiciones (especialmente GC — AT) y escasez de transversiones (especialmente AT¢) TA), También se nota un exceso de transiciones al comparar secuencias de proteinas homélogas de distintas especies (Vogel y Kopun, 1977). TABLA II, Frecuencias de sustituciones de bases en variantes electroforéticas de las globinas humanas. Elaboracién de los datos de Modiano et al. (1981), segiin se detalla enel Apéndice 1, y Frecuencia Susti tue: observada Transiciones: GC ~ AT a7 AT ~) GC 19 Total 46 Transversiones: GC ¢) CG 26 25.55 Gc TA 5 6.25 AT VTA 3 10.55 TA GC ta 13.30 Total 45 . 55.65 Total general 91 91.00 3 (transiciones frente a transversiones) = 5,25 (p< 0.05)~20- A la vista de la clave genética, las transversiones tienen efectos fenotipicos mis graves que las transiciones, La escasez de transversiones podria deberse a que los mecanismos de mutaci6n esponténea (que requieren muchas veces la intervencién de funciones celulares) han sido mo- dificados por la evolucién para evitar sobre todo las transversiones, disminuyendo asi la nocividad de las mutaciones, Esta explicacién fue propuesta por Modiano et al. (1981). Modiano et al. (1981) han observado que los tripletes pueden dar lugar a terminaciones prematuras mediante susti- tucién de una base (tripletes "termutables") se usan menos frecuentemente que los tripletes sinénimos "no termutables en los genes de las globinas humanas ays. Los autores sugieren que se trata igualmente de una adaptacién evolu- tiva que disminuye el lastre genético procedente de las mutaciones esponténeas que originarian terminaciones prematuras, \ Sin embargo, las pautas de uso de tripletes en diver- SoS organismos (Tabla III) son notablemente complejas y parecen influidas por numerosas causas independientes, tales como la estructura secundaria de los ARNm, la disponi- bilidad de los ARNt, etc... (Del Castillo y Medina, resultados no publicados).TABLA III. Uso de tripletes termutables y no termutables en diversos grupos de organismos (Del Castillo y Medina, resultados no publicados). Se excluyen los tripletes termutables CAA, CAG (Gin), AAA, AAG (Lys), TAT, TAC (Tyr), TGG (Trp), y GAA, GAG (Glu), ya que los amino&cidos correspondientes sélo puedén ser expresados por tripletes termutables. Para el cAlculo de frecuencias esperadas se supone que los tripletes sinénimos para cada aminodcido se usan con igual frecuencia. Se recuadran en verde ynegro los casos de déficit y exceso, respectivamente, de tripletes termutables, y en azul los casos en que no hay diferencia significativa en el uso de tripletes termutables y no termutables. GRUPO DE ORGANISMOS Enterobacterias Levaduras Vertebrados ninodcido Observado Esperado Observado Esperado Observado Esperado Termutables ‘TTA, TTG 113 202.3 “97 35.0 | 62 151.7 Leu CIT, CTC " e , 7 92 No termutables{ orn” eral 494 404.7 | 8 0.0 | 392 303.3 Total 607 607.0 105 105.0 455 455.0 Termutables TCA, TCG 93 124.3 5 40.0 62 121.7 Ser 7 e {tcr, TCC A ' », No termutables| cn’ ago 280 248.7 | 115 20.0 | 303 243.3 Total 373 373.0 120 120.0 365 365.0TABLA III (Cont.) GRUPO DE ORGANISMOS Enterobacterias Levaduras Vertebrados Amino&cido Observado Esperado Observado Esperado Observado Esperado Termutables GGA 45 109.5 Ta 29.3 89 93.0 SlY J No termutables po, csc, 393 328.5 116 87.7 283 279.0 ace Total 438 438.0 117 117.0 372 372.0 7 Termutables CGA, AGA 57 128.7 | 50 19.0 74 78.7 Arg cet, cGc | No termutables eee AG 329 257.3 7 38.0 | 162 157.3 Total 386 386.0 87 57.0 236 236.0 Total tripletes termutables 308 564.8 153 123.3 287 4454 Total tripletes no termutables 1496 1239.2 246 275.7 | 1141 982.9 Total general 1804 1804.0 399 399.0 1428 1428.0 2 X? (termutables frente a no termutables) 160.8 10.35 81.59 P < 0.01 *<0.01 <0.01~23- Los resultados anteriores muestran un déficit de tripletes termutables en todos los casos en Enterobac~ terias, sdlo para Leu y Ser en Vertebrados, sélo para Ser y Gly en Levaduras y, por el contrario, un exceso de tripletes termutables para Leu y Arg en Levaduras. Los resultados globales indican un déficit de tripletes termutables en Enterobacterias y Vertebrados, y un exceso de tripletes termutables en Levaduras. En consecuencia, es discutible si la sugerencia de Modiano et al. (1981) es correcta o, por el contrario, lo que se observa no es mAs que una consecuencia indirecta de otras presiones selectivas. 11.2. El efecto fenotipico de las mutaciones También aquii se limitaré la discusién al efecto fenotipico de las sustituciones de bases, tema sobre el que se dispone de abundante informacién. Como ejemplo, se discuten a continuacién las caracteristicas bioquimicas de més de 100 variantes mutacionales de la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato humana (recopilacién personal a partir de los restimenes de "Genetics Abstracts"; una recopilacién reciente puede encontrarse en Yoshida y Beutler, 1978). Estas variantes se han detectado en bisquedas sistematicas de variantes electroforéticas y funcionales o en individuos que pre--24— sentan sintomas clinicos (anemia hemolitica, favismo, etc...), Las variantes estudiadas tienen alterada la movilidad electroforética, la actividad enzimatica o ambas cosas a la vez. Muchas tienen alterados ademas otros parametros enzimaticos, como termoestabilidad, cinética, curva actividad/pH, sensibilidad a inhibidores y energia de activacién (Tabla Iv). TABLA IV, Alteraciones enzimaticas en variantes mutacio~ nales de la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato huma— na. . ee, * Se excluyen la versién més comin, llamada BY, y las variantes rela~ tivamente abundantes A", AT y BT. ‘ Variantes Paranétro enzimatico Normal Anormal estudiadas Actividad enzimatica 28 102 130 Movilidad electroforética 41 87 128 Afinidad por glucosa-6-fosfato 35 a 106 Afinidad por NADP 50 34 84 Termoestabilidad 31 60 a1 Curva actividad/pH 47 50 97 Inhibicién por 2-desoxi~ ~glucosa-6-fosfato 51 37 88 La Tabla V resume las pruebas de asociacién de alteraciones distintas en las variantes.~25- TABLA V, Asociacién entre diversas alteraciones de las variantes mutacionales de la deshidrogenasa de la glucosa-6-fosfato humana segin pruebas G de independencia. Pardmetro enzimatico i> tos lo Ic in A Actividad enzimatica S B Movilidad electroforética x a C Afinidad por glucosa-6-P 2 i - D Afinidad por NADP 2 I Ss - E Termoestabilidad 2 2 2? or - F Curva de actividad/pH 2 I s r T - G Inhibicién por 2-desoxi- glucosa-6-P ? a ~ a MS = x: no comparados, por tratarse de los pardmetros empleados para de~ tectar las variantes. 2: datos estadisticamente insuficientes I: las alteraciones comparadas son independientes S, MS: las alteraciones comparadas estn asociadas; nivel de signi- ficacién 5% y 1%, respectivamente. La Tabla VI presenta datos m4s detallados para alteraciones significativamente asociadas. Se observa una asociacién positiva entre los cinco pares de alteraciones; es decir, las alteraciones tienden a aparecer juntas mAs que a excluirse mutuamente, Nétese que los productos de las dos primeras columnas son siempre mayores que los de las dos ultimas, Awa wrTABLA VI. Asociacién entre distintas alteraciones de las variantes mutacionales de la deshidrogenasa de la giucosa-6-fosfato humana. s Nivel de Parémetros Normal/Normal Anormal/Normal Normal/Anormal Anormal/Normal — significacién Afinided por G6P/Afinidad por NADP 23 25 8 27 5% Afinidad por G6P/Curva activ.-pH 19 39 32 23 5% Afinidad por G6P/Inhibicién por ¢ 2aGeP 25 32 4 25 1% Termoestabilidad/Inhibicién por £ 2aceP 20 26 7 23 5% Curva activ.-pi/Inhibicién por 2dc6P 35 27 9 13 1%-27- Estas asociaciones pueden deberse al sesgo introdu- cido por los métodos de deteccién de las variantes, En efecto, las alteraciones que reducen la actividad en las condiciones del ensayo rutinario (tales como inestabilidad, desplazamiento del pH éptimo, menos afinidad por el substrato) pueden encontrarse asociadas porque juntas permiten observar una actividad inferior a la normal, aunque el efecto de cada una fuera indetec- table. Por otra parte e1 grado de asociacién entre al- teracioneg distintas debe variar de una enzima a otra, segin el grado de autonomia funcional de distintas regiones o "dominios" de la proteinas, Los sesgos deben ser atin mayores en los estudios de variantes enzimaticas de ciertos organismos de inte~ » realizados exclusivamente en individuos muy deficientes | rés genético (Escherichia, levadura, Drosophila, ete., en alguna actividad enzimatica (ver, por ejemplo, Bauer et al,, 1974), Los estudios de variantes enzimdticas realizados hasta la fecha no describen el espectro mutacional naciente, unas veces por tratarse de variantes naturales sometidas largo tiempo a presiones evolutivas, y otras por haberse exigido, como criterio de deteccién, pérdi- das de actividad u otras consecuencias fenotipicas. Las variantes de actividad normal son las més interesan-~28- tes, porque neutralistas y seleccionistas .coinciden en que el déficit de actividad de una enzima importante puede ser deletéreo, pero la importancia selectiva de otras alteraciones no puede decidirse "a priori" y éste es realmente uno de los puntos centrales de la contro- versia. En consecuencia, la discusién siguiente se de- dicar4 casi exclusivamente a los datos disponibles sobre frecuencias de variantes enzimaticas que no presentan necesariamente un déficit de actividad. 11.3. Frecuencia de mutacién El anlisis del espectro mutacional naciente de una enzima podria comenzar por el estudio de mutaciones esponténeas. La probabilidad de mutacién espontdnea por nucleétido y ciclo de replicacién se estima entre 1 *( 107° (fagos) y 107 Drosophila). La frecuencia de mutaciones que producen pérdida de actividad esta entre 107> y 107© por gen por generacién (Auerbach, 1976). La Tabla VII presenta los datos disponibles sobre variantes mutacionales espont4neas detectables por electroforesis. Con estos datos puede estimarse que la frecuencia de mutaciones espontaéneas que producen alteraciones de la movilidad electroforética se encuentra entre 107° y 1076 por gen por generacién, La frecuen- COcoli (Guerola et.al., 1971; Cerd&-Olmedo y Ruiz-Vazquez, 1979), segin se detalla en el siguiente apartado de esta Introduccién. Baste decir aqui que este procedimiento sitaa la frecuencia de mutantes sin actividad alrededor del 1%, lo que permite esperar una frecuencia total de variantes enzimaticas préxima al 10%.TABLA VII. Frecuencia de variantes electroforéticas producto de nuevas mutaciones esponté— neas ,es decir, no presentes en los progenitores ,o inducidas por mutégenos. En los casos en que no se ha detectado ninguna variante, la frecuencia de mutacién, u , se calcula a partir de la férmula (1-1) = 0,05, donde N es el niimero de alelos investigados. Proteinas Namere total de Variantes Frecuencia media Organisno estudiadas alelos investigados encontradas de mutantes por gen Referencia 1. Mutaciones esponténeas _ D. melanogaster 10 669 904 “3 4.5 x 107° Tobariy Ko~ jima, 1972 D. melanogaster 7 31 598 4 1.3 x 106 Voelker et al., 1980 Ratén 340 106 080 ° <2.8 x 10° Klose, 1979 Ratén 21 290 252 ° <1.0 x 10° Johnson y Lewis, 1981 Hombre 40 522 1g ° <5.7 x 10° Neel et al. 1980“-"— TABLA VII (Cont.) Proteinas Nimero total de Variantes Frecuencia media Organismo Mutdgeno estudiadas alelos investigados encontradas de mutantes por gen Referencia 2. Mutaciones inducidas E. coli nitrosoguanidina 13 16 800 5 3.0 x 1074 Shaw et al,197 D. melanogaster metanosulfonato de 2 770 1 1.3 x 10° Grell, 1976 etilo Hamster luz ultravioleta 40 22 696 12 5.3 x 107 Siciliano,et . al., 1978 Ratén rayos X 2 15 539 ° <1.9 x 10 Russell et al. 1976 Ratén trietilenomelanina i 62 986 ° < 4.8 x 107° Soares, 1979 Ratén metilnitrosourea 340% 24 480 2 8.2 x 107° Klose, 1979 Ratén procarbazina 18 a2 880 2 2.4 x 10° Johnson et al. 1981 Ratén etilnitrosourea a1 22 512 9 4.0 x x0~* Johnson y Lewis, 1981 *pnalizadas por electroforesis bidimensional-31- cia total de variantes enzimAticas puede ser 4 6 5 veces mayor que la de variantes electroforéticas detectadas rutinariamente (Singh, 1979). Estas frecuencias son demasiado bajas para poder realizar un estudio sistematico. En consecuencia, se hace necesario incrementar la frecuencia de mutantes, lo que puede conseguirse mediante el empleo de agentes mutagénices. La efectivi- dad de los diversos mut4genos disponibles es muy varia- da, como se recoge en la Tabla VII. | @ lr ° ° w , ARNm l : GENES DE tostatasa TRANSPORTE mee DE FOSFATO Figura 1, Regulacién de la sintesis de fosfatasa alealina en E: herichia coli. Py, fosfato inorganico; R, producto del gen phoR, en sus funciones represora (RR) y activadora (RA); @, activacién; O, represién,pstB! pstA\phoT} phoS (pit) jap Figura 2. Localizacién en el mapa genético de Escherichia coli de los genes citados en esta Tesis. Las cifras indican minutos; los genes entre paréntesis no se han localizado exactamente, Referencias: Nakata et al., 1978; Wanner y Latte- rell, 1980; Tommassen y Lugtenberg, 1981; Wanner et al, 1981; Zuckier y Torriani, 1981; Cox et al., 1981.-40- gen phoB tanto in vivo como in vitro (Pratt, 1980). La pér- dida de la funcién phoB disminuye de 100 a 1000 veces la sintesis de fosfatasa, excepto en presencia de una mutacién muy ligada a phoA (Wanner et al., 1979) que podria ser una mutacién del presunto promotor del gen phoA. El gen phoB determina un efector positivo de la sintesis de fosfatasa, que no estA demostrado que sea una proteina. Se espera acla- rar pronto los aspectos moleculares de esta regulacién tras la clonacién de phoA y regiones vecinas en un plasmido (Berg, 1981; Inouye et al., 1981). En presencia de P,, el producto del gen phoR reprime la sintesis de fosfatasa y en su ausencia, la activa. La pérdida de la funcién de phoR conduce a la sintesis de fosfatasa, pero no a los mayores niveles posibles. La funcién activadora del producto del gen phoR puede ser sustituida en parte por el producto del gen phoM (Wanner y Latterell, 1980), La pérdida de funcién de cualquiera de los genes phoS y phoT da lugar a sintesis constitutiva de fosfatasa. El producto de phoS es la proteina que transporta P, por el espacio periplasmico. El producto de phoT interviene en la captacién de P, del medio, Muchos mutantes de los ge~ nes phoS y phoT no complementan entre si, lo que puede deberse al caracter polar de algunas mutaciones phoS (Cox et al ,1981) 0 a que dichos genes determinen regiones distintas de una misma proteina (Levitz et al., 1981).~41- El transporte de Py a través de la membrana plasmatica ocurre a través de dos sistemas alternativos, regidos respectivamente por los genes pst (A y B) y pit (Cox et al., 1981). La pérdida mutacional de ambos sistemas de transporte da lugar a auxotrofia para compuestos orgdnicos de fésforo (Sprague et al., 1975). Hay indicios (Wilkins, 1972; Tommassen y Lugtenberg, 1980; Zuckier y Torriani, 1981) de que la regulacién de la sintesis de fosfatasa depende de otros factores, ademas de la concentracién intracelular de Pj. La sintesis de fosfatasa est& corregulada con la de muchas otras proteinas, como una prote{na de la membrana, producto del gen phoE (Tommassen y Lugtenberg, 1981), los sistemas de transporte de Pj y _glicerol-3-fosfato a través de la membrana, proteinas periplasmicas con afini~ dad por P; (producto del gen phoS) y glicerol-3-fosfato, posiblemente una despolimerasa de polifosfatos (Wanner y Latterell, 1980) y una aminopeptidasa (Lazdunski et al., 1975). La escasez de fosfato parece regular la transcripcién ide nada menos que dieciocho genes (Wanner et al., 1981), de los que psiF y psiG, de funcién desconocida, estan muy préximos a phoA.-42- Ill.2.b. Sintesis y maduracién de la fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina de E. coli se localiza en el periplasma y es, por tanto, un ejemplo de proteina segregada a través de membranas. Los detalles del proceso de forma- cién de fosfatasa activa se esquematizan en la Figura 3. La traduccién del ARNm de la fosfatasa tiene lugar en polirribosomas asociados a la cara interna de la membrana citoplasmica (Varenne et al., 1978). Conforme se sintetiza, la proteina pasa a través de la membrana, gracias a su secuencia aminoterminal de varias decenas de aminodcidos hi- dréfobos, La existencia de esta secuencia se ha confirmado en experimentos de sintesis de fosfatasa in vitro (Inouye y Beckwith, 1977) e in vivo (Sarthy et al., 1979). Una peptidasa localizada en la membrana citoplasmica (Chang et al., 1980) corta la secuencia citada y da lugar a polipéptidos de peso molecular 43 kdal aproximadamente, inactivos y loca- lizados en el periplasma. En el periplasma existe otra peptidasa, producto del gen iap, que puede cortar la arginina N-terminal, dando lugar a una mezcla de polipéptidos con y sin arginina N-terminal, con 450 y 449 aminodcidos, respectivamente. La forma sin arginina N-terminal escasea en presencia de inhibidores de proteasas o exceso de arginina (Nakata et al., 1979) y en los mutantes iap (Nakata et al., 1978). Los polipéptidos Se asocian aleatoriamente para dar lugar a tres clases de\RNo slatasa irribosomas' wae eee MEMBRANA PLASMATICA, PERIPLASMA precursor fostatasa ™ secuencia hidrotébica s eptida: peptidasa AW Arg = polipéptido A —— Soe fap PILI + poling tid Fea 3 | HAA PARED CELULAR wy ELECTROFORESIS + HHH 8B AB AA,‘ 8,88 dimeros 2n (tt) isoen%imas activas —? Zn (11) _t-+ . —_— - letedineres ow Lead Figura 3. Maduracién de la fosfatasa alcalina de Escherichia coli.-a4~ dimeros, todos inactivos, pero capaces de unir iones Zn(II) y sufrir un cambio de conformacién, con lo que se forma la fosfatasa activa (Harris y Coleman, 1968). Por eso la fosfatasa activa es una mezcla de tres tipos de dimeros, comin- mente llamados isoenzimas. La fosfatasa alcalina madura da tres bandas en electroforesis, determinadas por la presencia de cero, una o dos argininas terminales (McManaman y Wilson, 1978). A veces se encuentran cuatro y hasta cinco bandas que probablemente corresponden a tetrameros, formados por asociacién de dimeros e jones Zn(II) adicionales (Halford et al., 1972). El electroenfoque de preparaciones purificadas revela § bandas con puntos isoeléctricos comprendidos entre 5.06 y 5.39 (Csopak et al., 1972). Se conoce la Secuencia de aminodcidos (Bradshaw et al., 1981) y la estructura de-la molécula segin difraccién de rayos X (Knox y Wyckoff, 1973). La maquinaria necesaria para la sintesis y maduracién parece ser bastante inespecifica, ya que Salmonella typhi- murium, que carece de una fosfatasa alcalina comparable, expresa y localiza normaimente la fosfatasa alcalina de E. coli si recibe el gen phoA de éste (Schlesinger y Olsen, 1968).III.2.c. Propiedades de la fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina es indefinidamente estable a tem- peraturas de 0 a 85°C, a pH entre 4 y 10, en presencia de muchas proteasas (Garen y Levinthal, 1960) y de dodecilsulfato sédico hasta 0.1% (Mather y Keenan, 1974). Se inactiva reversiblemente por calentamiento a més de 85°C y por expo- sicién a pH extremos (Garen y Levinthal, 1960). La congela- cién y descongelacién repetidas la inactivan irreversible- mente (Garen y Levinthal, 1960). Tanta estabilidad resulta sorprendente si se considera que los dos polipéptidos sélo se mantienen unidos mediante enlaces débiles, sin enlaces disulfuro (Bradshaw et al., 1981). Por cada polipéptido de la enzima hay un par de iones Zn (II) fuertemente ligados y un segundo par de tones meté~ licos, Zn (II) o Mg (II), ligados menos estrechamente. En ciertas condiciones puede existir también un tercer par de jones Mg (II), La sustitucién de estos iones metAlicos por otros, como Cd (II), Cu (II) y Co (II), produce numerosas alteraciones cataliticas y estructurales, de las que se ha deducido que el primer par de iones interviene en la cata- lisis, mientras que los restantes estabilizan la estructura terciaria de la proteina (Chlebowski et al., 1979). Se ha sugerido la participacién de residuos histidina en la unién~46- de los iones metdlicos (Krishnaswamy y Kenkare, 1970). La inactivacién de la enzima por el Acido etilendiaminotetra- cético (EDTA) se debe a su efecto quelante sabre los iones metdlicos y a la unién inespecifica del EDTA con la proteina (Csopak et al., 1972). La fosfatasa alcalina es muy inespecifica: la velocidad maxima y la afinidad relativas son casi idénticas para sustratos (ésteres de fosfato) muy distintos (Reid y Wilson, 1971). En otras palabras, la hidrélisis de sustratos del tipo R-O-P es esencialmente independiente de la naturaleza del radical R, Al parecer, la cataélisis comienza con el “anclaje" del grupo fosfato del sustrato, con intervencién ‘de residuos arginina (Daemen y Riordan, 1974), dando lugar as{ a un "complejo de Michaelis-Menten" no covalente. A con- tinuacién, el fosfato se une covalentemente a un residuo de serina (n? 102) situado en el centro activo (Milstein, 1964), dando lugar a un intermediario, fosforil-enzima, y liberando el alcohol R-OH. Finalmente el fosfato puede libe- rarse o bien transferirse a un aceptor adecuado, como el Tris del tampén (Wilson et al., 1964). Inicialmente se supuso que la cinética de la fosfatasa es del tipo Michaelis-Menten, con inhibicién competitiva por uno de los productos de reaccién, el fosfato inorganico (Garen y Levinthal, 1960). Mas tarde se observaron interac- ciones entre los dos polipéptidos durante la catdlisis y se propuso el modelo de cinética "flip-flop" (Lazdunski eta7 -47~ al., 1971), segan el cual ambas subunidades funcionarian alternativa y coordinadamente. Chappelet-Tordo et al. (1974) propuSieron un modelo similar, de cooperatividad negativa © reactividad de la mitad de los sitios activos, cuyo as- pecto ms destacable es el de no considerar equivalentes a los dos polipéptidos en su funcién catalitica. Ninguno de estos modelos alcanza a explicar satisfactoriamente todas las peculiaridades de la cinética de la fosfatasa. Des- pués de un estudio muy detallado, Waight et al. (1977) propusieron un mecanismo muy complejo, del tipo "Ping-Pong Bi- Bi". En determinadas condiciones, este mecanismo de reac~ cién puede aproximarse mediante una ecuacién de Michaelis- Menten. Se carece de datos precisos respecto al efecto de las mutaciones sobre e1 modelo a pesar de los esfuerzos realizados en este sentido (ver, por ejemplo, Chappelet-Tordo et al., 1975). III.2.d. Extraccién de la fosfatasa alealina La abundancia de la fosfatasa alcalina, que puede llegar a constituir del orden del 6% de las proteinas de E. coli (Garen y Levinthal, 1960) facilita enormemente su ex- traccién y purificacién.cs ~48- La deteccién de variantes enzimAticas requiere extractos libres de moléculas (iones metAlicos, fosfato, etc...) que interfieran con la termoestabilidad, cinética y demas parémetros enzimdticos, La necesidad de estudiar muchas estirpes desaconseja la purificacién total, que podria conseguirse eluyendo con un gradiente de NaCl una columna de DEAE-celulosa (ver, por ejemplo, Garen y Levinthal, 1960). En algunos trabajos sobre variantes enzimAticas se “han descrito artefactos experimentales ocasionados por alteraciones de la enzima durante su preparacién (Thatcher, 1977; Kreitman, 1980). Los distintos procedimientos de ex- _ trageién y purificacién de la fosfatasa alcalina de E, coli producen diferencias apreciables de actividad y contenido en metales y fosfato del producto (Simpson et al., 1968), Para la extraccién de la enzima se han empleado la sonicacién (Schlesinger y Olsen, 1968), la prensa de French (Bosron et al., 1977), los tratamientos con tolueno (Nakata et al., 1978), acetona (Aradi et al., 1971), lisozima y EDTA (Malamy y Horecker, 1964), EDTA y choque osmético (Neu y Heppel, 1965), Acido clorhidrico (Schlesinger y Olsen 1970) y calor (Garen y Levinthal, 1960). Un método muy interesante es el de calentar las célu- las a mas de 80°C (Garen y Levinthal, 1960), con lo que se inactivan numerosas proteinas, se impide la accién de~49- proteasas y practicamente toda la fosfatasa alcalina queda en el sobrenadante. Este método podria ser inadecuado para extraer la fosfatasa termol4bil de algunos mutantes. Con la formacién de esferoplastos (Malamy y Horecker, 1964), evitando la lisis de la célula, se extraen casi exclusivamente las proteinas periplasméticas, entre las que la fosfatasa constituye alrededor del 20% de la proteina total (Torriani, 1966). Este método implica el uso de EDTA, nocivo para'la enzima y responsable de variaciones en el contenido de metales (Csopak y Szajn, 1973). Por tratamiento con HCl 0.5 N (Schlesinger y Olsen, 1970) se purifica la fosfatasa disociada en los polipépti- dos que la componen y puede reconstruirse alcalinizando el medio y afiadiendo Zn(II), En estas condiciones la fosfatasa llega a constituir el 30% de la proteina extraida (Reid y Wilson, 1971), Sin embargo, los polipéptidos diso- ciados son relativamente sensibles a proteasas, y también puede temerse que determinadas mutaciones afecten a la capacidad de reasociacién del dimero, III.3. Métodos de deteccién de variantes enzimaticas Para detectar variantes enzimaticas se han estudiado en orden decreciente de frecuencia, la movilidad electro-wm = -50- forética, la termoestabilidad y la actividad enzimatica. Otros pardmetros enzimAticos, como la cinética y la gurva actividad/pH, se han estudiado en variantes mutacionales de algunas enzimas, como la deshidrogenasa’ de la glucosa- -6-fosfato humana (ver Tablas IV, V y VI de esta Introduc- cién) y para comparar variantes detectadas por electroforesis (Tabla VIII). Es de notar que dos tercios de las va~ riantes electroforéticas presentan cambios para cada uno de los otros parametros, TABLA VIII. Deteccién de variantes enzimaticas. Recopila— cién personal a partir de 44 articulos donde se estudian 26 enzimas distintas, con una media de 3 variantes electro- foréticas por enzina Pardmetro_enzimatico Termoes— * tabilidad Actividad Cinética Enzimas investigadas 19° al 17 1 Variantes electrofo~ 62 62 52 29 réticas Vaviantes electrofo- réticas también afectadas en el parémetro indicado a7 43 35 19 Las referencias consultadas, indicando sdlo revista, volumen y 1% pagi~ na fueron las siguientes 11:155; 12:449; 13:175; 14:299; 1 17:825; 17:113: Biochemical Genetics 9:213; 10:29; 11:141; 03; 141777; 15:971; 16:127; 17:631} 18:153; 18:727; 19:129; Genetica 49:173; Genetics 54: 05; 78:1175; 80:875; 84:77; 87:159; 87:177; 87:743; 91:832; 8121; 91:8141; 95:187; 95:1013; 96:743; 96:927; 97:850; 97:862; Nature 201:299; 227:959; 263:131; Proc. Natl: Acad. Sci. USA 70:3928; 71:1808; 76:2354; 78:4444; Proc. Royal Soc. B 16. 98; Science 163:943,54 -51- Todos los parametros citados sirven para detectar variantes enzimaticas, aunque no las mismas, La discusién siguiente se limitaré a comparar los métodos empleados para detectar variantes electroforéticas, de termoestabilidad y de actividad, parametros estudiados en esta Tesis. III,3.a. Variantes clectroforéticas En electroforesis la teoria, a pesar de algunos avan- ces recientes (Mufliz et al., 1977), est& muy rezagada respecto a la practica, de modo que las técnicas se aplican emp{ricamente, La electroforesis tradicional es unidimensional y a pH constante, La electroforesis bidimensional (ver, por ejemplo, Leigh Brown y Langley, 1979) y el electroenfoque © gradiente de pH (ver, por ejemplo, Milkman y Koehler, 1976) son modificaciones alentadoras para la deteccién de variantes electroforéticas, La aplicacién rutinaria de la electroforesis bidimensional es laboriosa, porque cada muestra requiere un gel entero, y muchas veces no permite la deteccién de actividad, porque una de las dimensiones suele ser-electroforesis en dodecilsulfato sédico, que desnaturaliza las proteinas. Los resultados difieren cualitativamente de los de la elec-~52- troforesis tradicional (Leigh Brown y Langley, 1979; Smith et al., 1980), Los inconvenientes practicos desaconsejaron la utilizacién de este método en la presente Tesis. El electroenfoque tiene una capacidad de resolucién muy elevada, incluso de centésimas en la estimacién del punto isoeléctrico. Es comparativamente caro y sélo detecta variantes enzim4ticas que conduzcan a una modificacién del punto isoeléctrico, por lo que pierde algunas variantes detectables por electroforesis tradicional (Ramshaw y Eanes, 1978; Basset et al., 1978). En consecuencia, tampoco el método de electroenfoque ha sido empleado en esta Tesis. El método de "cribado molecular" se basa en que la movilidad electroforética de las proteinas depende no sélo de su carga eléctrica, sino de su forma y tamafio (Ferguson, 1964; Hedrick y Smith, 1968). Los poros del gel, cuyo tama~ fio depende de 1a concentracién de polimero, “criban" a las proteinas segin su peso molecular y su conformacién (Chram- bach y Rodbard, 1971; Rodbard y Chrambach, 1974). El método, consistente en comparar electroforesis a distintas concen~ traciones de polimero, permite detectar y clasificar las variantes segin afecten a carga eléctrica, tamafio 0 confor- macién y facilita la discriminacién estadistica de los resultados (Johnson, 1977a, b; 1979a). Algunas veces las conclusiones pueden ser espectaculares: asi, estudiando 14 enzimas de sélo 20 individuos de una poblacién natural deOT -53- la mariposa Colias meadii, se han encontrado un total de 103 variantes, de las que el 29% diferian sélo en carga, el 17% sélo en conformacién y el resto (54%) a la vez en ambos parametros; adem4s, s6lo 40 de estas variantes son detectables por la electroforesis tradicional a una sola concentracién de poliacrilamida (Johnson, 1977b). El método de Johnson varia la concentracién de acrilamida y mantiene constante la de bis-acrilamida, mientras que el método original de Hedrick y Smith mantiene constante la proporcién entre acrilamida y bis-acrilamida. Curio- samente, con este ltimo método no se han encontrado variantes conformacionales, sino sélo de carga (Cobbs y Pra- kash, 1977a, bs Watt, 1977). No estén claras las razones de estos resultados y hay cierta discrepancia entre sus autores (ver Finnerty y Johnson, 1979; Johnson, 1979b). Sorprendentemente’, la estimacién de la carga eléctrica de una proteina siguiendo el método de cribado depende de la proporeién entre acrilamida y bis-acrilamida (Hedrick y Smith, 1968; Rodbard y Chrambach, 1974). El cribado molecular exige mucho trabajo experimental porque es preciso repetir la electroforesis a varias concentraciones de poliacrilamida (al menos 4 6 5 concentraciones distintas). En esta Tesis se ensayé una forma simplificada de este método, usando un aparato de electroforesis Pfleu- ger Acrylophor, pero los resultados fueron bastante errati--54— cos, probablemente por la baja calidad del aparato, y no han sido incluidos en este volumen, Para mejorar el nivel de resolucién de la electroforesis tradicional, se ha empleado un sistema combinado de varias electroforesis a distintos pH, tampones, concentra— ciones de polimero, tiempos y voltajes (ver, por ejemplo, Singh et al., 1975; Coyne et al., 1978 y Ramshaw et al., 1979). Una recopilacién personal de 15 articulos' en’ los que se investigaron 19 enzimas diferentes muestra que la electroforesis tradicional y el sistema combinado detectaron 97 y 188 variantes, respectivamente. Asi, por ejemplo, con la esterasa-5 de Drosophila pseudoobscura el namero de variantes detectadas aumenté de 17 con el método tradicional a 32 con el sistema combinado (Singh, 1979). En un estudio de 20 variantes mutacionales de la hemoglobina humana la electroforesis tradicional detecté 8 clases de movilidad electroforética y el sistema combinado, 17. Adem4s , este Ultimo sistema permitiéd discriminar variantes segtin la naturaleza quimica de los aminoacidos sus— tituidos y su localizacién en la estructura terciaria de la proteina (Ramshaw et al., 1979), de acuerdo con la hipé- * yas referencias consultadas, indicando sélo revista, volumen y 18 p4gina, fueron las siguientes: Biochemical Genetics 19:129; Genetics 84:593; 84:609; 85:697; 87:159; 87:285; 87:743; 93:997; 93:1019; 95:467; 96:727; 97:86; Nature 275:68; Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:4150; 75:5090.-55- tésis de que el distinto grado de ionizacién a distintos pH de las cadenas laterales de los aminodcidos puede producir diferencias notables en la capacidad de deteccién de variantes segtin el pH empleado (Johnson, 1974b). Con la deshidrogenasa de 1a xantina de Drosophila pseudoobscura se ha demostrado que el sistema combinado de electroforesis detecta aun més variantes que el cribado molecular (Bargiello y Singh, 1981). Por las razones expuestas, en esta Tesis se ha empleado un sistema combinado de electroforesis para la deteccién de variantes. T11.3.b. Variantes de termoestabilidad la exposicién de los geles de electroforesis a tempe- raturas capaces de inactivar parcialmente las enzimas permite detectar variantes de termoestabilidad por las diferencias de tincién resultantes de 1a pérdida de actividad (ver, por ejemplo, Wright y MacIntyre, 1965; Bernstein et al,, 1973). Segtin una recopilacién personal de 23 articulos en los que se aplicé esta técnica a 19 enzimas diferentes, la electroforesis detect6 77 variantes y la electroforesis y termoestabilidad combinadas,68 variantes mas, tas referencias consultadas, indicando sélo revista, volumen y 18 pa- gina, fueron las siguientes: Ann.Rep.Natl.Inst.Genet.Japan 29:30; Bio- chem, Genet. 6:3681; 13:721; 14:383; 14:1003; 15:971; 18:21; 1: 295 Cell 6:371; Genetics 80:637; 84:609; 87:285; 87:743; 91:s121; 93:201; 93:461; 97:56; J. Elissa Mitchell Soc. 81:17; Nature 260:42; 26: 31; 279:713; Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70:3928; 75:5090.-56- Esta técnica clasifica a las variantes en dos o tres tipos (termoestabilidad alta, baja o intermedia) pero no permite distinciones mas finas. La resolucién es mejor si se determina la cinética de inactivacién, calentando el extracto a una temperatura dada y determinando la actividad residual de muestras sucesivas (Cochrane y Richmond, 1979). La elevada termoestabilidad de la fosfatasa de E. coli hace poco practico el calentamiento de los geles y exige determinar cinéticas de inactivacién, La concentracién total de proteina, el pH, la fuerza iénica, la concentracién de iones metdlicos, etc... afectan a la termoestabilidad de una proteina (Alatossava y Lakovaara, 1981), Estas variables se pueden definir bien al calentar extractos, pero no al calentar geles, III,3.c. Variantes de actividad enzimatica Cabe sospechar que la evolucién por seleccién ha de- pendido més de diferencias en actividad enzimatica entre variantes que de diferencias en movilidad electroforética y termoestabilidad (mientras sigan estables a temperatura fisiolégica). Los polimorfismos enzimAticos con diferencias de actividad entre variantes son los que han recibido una interpretacién seleccionista m4s convincente (ver, por ejem~ plo, David, 1977).lr Se han investigado ocasionalmente los polimorfismos de actividad enzimatica, con resultados alentadores (Pra- kash, 1977; Norman y Prakash, 1980). En estos trabajos se han empleado extractos no purificados, por lo que las diferencias de actividad detectadas pueden deberse a alteraciones estructurales de la enzima o a variaciones de la cantidad de enzima presente. La distincién entre estas dos alternativas es siempre muy laboriosa, pero en la mayoria de los casosen que se ha hecho parecen predominar las muta~ ciones de los genes reguladores (ver, por ejemplo, McDonald y Ayala, 1978). IV. VARIACION MOLECULAR EN LAS ENTEROBACTERIACEAS La proliferacién de trabajos sobre evolucién y polimor, fismos moleculares (ver resymen en Selander, 1980) ha al- canzado apenas a los microorganismos. Por su interés para el presente trabajo, se resumen a continuacién los resultados obtenidos en el estudio de las Enterobacteridceas, con particular énfasis en lo referente a la fosfatasa alcalina, Los estudios inmunolégicos y electroforéticos de Cocks y Wilson (1972) demuestran la existencia de una fosfatasa alcalina similar a la de Escherichi coli en Enterobacte-~58- oe ridceas de los géneros Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Providencia y Erwinia, pero no en similares a la fosfatasa alcalina de Escherichia son las de Klebsiella, Citrobacter y Serratia (Cocks y Wilson, 1969 Bhatti, 1973). Se ha investigado el polimorfismo electroforético de diversas enzimas (pero no la fosfatasa alcalina) en varias Enterobacteridceas (Goullet y Richard, 1977 » y refs, alli citadas). Aunque la resolucién no parece muy buena, se de- tectan muchas variantes intraespecificas en todos los casos. Se han detectado variantes inmunolégicas de la fosfatasa alcalina en poblaciones naturales de Klebsiella (Steffen et al., 1972) y se ha estudiado el polimorfismo electrofo- rético de diversas enzimas, incluyendo la fosfatasa alcalina, en estirpes de E. coli aisladas de diversos Mamiferos y del hombre (Milkman, 1973, 1975; Selander y Levin, 1980). La capacidad de resolucién de la electroforesis no alcanzé a distinguir las tres isoenzimas, pero se encontré un alto grado de polimorfismo, como se recoge en la Tabla IX. TABLA IX. Polimorfismo electroforético en estirpes natura~ les de E. coli Nimero de WNimero de enzimas —_ Fosfatasa alcalina Referencia estirpes Investig. Polimérf. Variantes Frec. de la mds abundante 829 5 5 6 0.92 Milkman,1973 109 20 18 10 0.57 Selander y Levin, 1980-59- Milkman (1975) observé ademés variaciones temporales en las frecuencias de las variantes electroforéticas en muestras obtenidas de un mismo huésped. Parece, por tanto que las Enterobacteridceas constituyen un material adecuado para los estudios de evolucién y polimorfismos moleculares con la ventaja adicional de su facil manipulacién en el laboratorio y su alta tasa de multiplicacién (ver, por ejemplo, Dykhuizen y Hartl, 1980). En la presente Tesis se incluye un estudio del polimorfismo de la fosfatasa en estirpes naturales de Escherichia ab. coli, como ejemplo de espectro mutacional cido a comparar con el espectro mutacional naciente,~61- I. BACTERIAS Y FAGOS Se han utilizado las siguientes estirpes de Escherichia coli: AT3055: F™ proC-22, thr-14, his-21, ilv-18, met-75, PYIC-73, pyrA-74, ade-73, pdxC-2, str U9: Hfr K10 phoA, y $33: Hfr K10 phoA Son mutantes deficientes en fosfatasa alcalina, descritos por Schlesinger y Levinthal (1963) y recibidos del Prof, Charles W, Pratt, Massachusetts Institute of Technology, en 1976. MM7: F argG-6, leu-6, metB-1, his-1, ilv, pyrE, -6, malA-1, xyl-117, lac, gal-6, uhp, stra, nal®. SE54: derivado proC” de la estirpe MM7, obtenido segtin se describe en el apartado II de Resultados y Discusién. Rl a R49 y Vi a W1: derivadas de la estirpe SES4 tras tratamiento con nitrosoguanidina, segun se describe en el apartado Il de Resultados y Discus.~62- Nl a N50: Estirpes aisladas a partir de enfermos del Hospital Universitario de Sevilla, cedidas amablemente por el Prof, Evelio Perea del Departamento de Microbiologia, Para los experimentos de transduccién se ha utilizado una estirpe virulenta del fago P1, recibida del Prof. John Ingraham, University of California, Davis, en 1978. II. CONDICIONES DE CRECIMIENTO Para la multiplicacién de las bacterias y el aislamien- to de mutantes se incubé con aireacién a 37°C en medio mini- “mo "Pris-sales" (Maalge y Hanawalt, 1961; "Tris" significa Tris~(hidroximetil)-aminometano), con D(+)-glucosa (2 g/1) como fuente de carbono. Para inducir la fosfatasa alcalina las bacterias se incubaron durante 48 horas a 37°C con agitacién en matraces de 1 1 con unos $00 ml de un medio de cultivo que contiene: Tris, 14,5 g; NaCl, 4.68 g; KCl, 1.49 g; (NH), S0,, 2.64 @} MgCl, .6H,O, 0.2 g; CaCl, .2H,0, 29 mgs; ZnCl, 1.2 mg; FeCl, , 0.5 mg; peptona (Pronadisa), 5 g; D(+)-glucosa, 2 g; agua destilada, 1 litro y el pH ajustado a 7.5. El fosfato inorgdnico se encuentra como contaminante de la peptona comercial utilizada, en concentracién insuficiente para re- primir la sintesis de la fosfatasa.am Ah -63- Los medios minimos se suplementaron con los requeri- mientos nutritivos de los mutantes auxétrofos, a razén de 20 ug/ml de los aminodcidos, 10 ug/ml de las bases y 0.1 ug/ml de las vitaminas, Los medios sélidos se obtuvieron afiadiendo 18 g/1 de agar a los medios liquidos; el Bacto-agar Difco es apropiado por su bajo contenido en fosfato utilizable. Se determiné la turbidez de los cultivos liquidos a 450 nm con un espectrofotémetro “Spectronic 20", de Bausch and Lomb. III, TRATAMLENTO CON NITROSOGUANIDINA Se expusieron suspensiones de bacterias en fase expo- nencial a soluciones de nitrosoguanidina (100 ‘e/m) en tampén Tris-maleico (0.1 M, pH 7.5) durante 30 min a 37°C sin aireacién y se lavaron las células dos veces con el mismo tampén sin nitrosoguanidina. IV. CONTRASELECCION CON PENICILINA DE MUTANTES AUXOTROFOS PARA PROLINA Se empled el protocolo descrito por Cerd& Olmedo et al. (1968).-64— V. TRANSDUCCION CON EL FAGO P1 Se utilizaron los medios y el protocolo descrito por Miller (1972). VI. DETECCION DE MUTANTES DEFICIENTES EN FOSFATASA ALCA- LINA Cada caja, que contenia unas 500 colonias en medio de induccién, se tifié durante 2 min con 3-4 ml de una solucién de 1 mg de a-naftil-fosfato y 1.5 mg de "Rojo rapido" (4-cloro-o-toluidin-1,5'-diazonio naftalendisul - fonato) por ml de tampén Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0). Las colonias con fosfatasa se tifien de un color rojo ladrillo y las colonias carentes de esta actividad (Pho) conser- van el color normal blanco-amarillento. Con este procedimiento se clasifican como Pho” sélo las colonias muy deficientes en fosfatasa (10%, o menos, de la actividad normal), VII. ENSAYO DE LA FOSFATASA ALCALINA Como sustrato se empleé p-nitrofenil-fosfato, 0.2 mg por ml de tampén Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0) y se deter- mind con un espectrofotémetro Pye Unicam SP1700 el aumen-o ~65- to de absorbancia a 410 nm, caracteristico del p-nitrofe- nol liberado. Se define como unidad de actividad la cantidad de enzima que produce un aumento de absorbencia de 1.0 por min (Torriani, 1966). VIII. DETERMINACION DE PROTEINA Para determinar la proteina presente en extractos celulares se empleéd la siguiente adaptacién del método de Reisner et al. (1975). Se prepara una solucién de Acido perclérico a 35 g/1 en agua destilada; se afiade “Azul Coomassie G250" (Sigma Chemical Co. B-1131) hasta concentracién final de 0.2 g/l. Una vez disuelto, se filtra cuidadosamente, La solucién obtenida es estable a 4°C, Para la determinacién se incuban 2,5 ml de esta solu- cién con 0.2 ml del problema durante 45 min a 37°C y se determina la absorbencia a 620 nm, Los resultados se ex- presan en términos de concentracién de proteina por compa~ racién con una curva de calibracién obtenida con concentraciones conocidas de ovoalbimina,. Los resultados coinciden con los del método de Lowry, idos libres en el extracto (al pero no influyen aminoé menos hasta 200 yg/ml) y son éptimos para concentraciones de proteina entre 50 y 200 ug/ml).oc ~66- IX. EXTRACCION Y PURIFICACION PARCIAL DE LA FOSFATASA ALCALINA Salvo que sé indique lo contrario, se empleé el siguiente protocolo. 500 ml de cultivo en medio de induccién (del orden de 2.108 células/ml) se lavan dos veces con tampén Tris- HC1 (0.1 M, pH 8.0) y se resuspende en 6 ml del mismo tampén; tratamiento de la suspensién resultante (iol? a 1o' células/ml) durante 40 min a 85°C en tubos precalentados; centrifugacién a 16000 rpm durante 15 min; adicién de 1.2 voldmenes de acetona fria por volumen de sobrenadante; después de 30 min a temperatura ambiente, centei- fugacién a 6000 rpm durante 20 min; resuspensién del se~ dimento en 3 ml de tampén Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0); cen- trifugacién a 16000 rpm durante 15 min. Se conserva el sobrenadante, qué contiene unas 20 unidades de actividad por ml, con una actividad especifica de 30 unidades por mg de proteina, Por comparacién con la actividad de la fosfatasa alcalina purificada a homogeneidad (Malamy y Horecker, 1964), puede estimarse que esta enzima representa del orden del 3% del peso seco de los cultivos empleados y del orden del 70% de las macromoléculas presentes en preparaciones obtenidas segin el protocolo que se acaba de describir.-67- X. ELECTROFORESIS Los. extractos enziméticos parcialmente purificados se mezclaron con glicerol (proporcién 9:1 v/v) para aumentar su densidad y azul de bromofenol (100 ug/ml) como indicador de la posicién del frente de electroforesis. Tres sistemas de electroforesis se aplicaron a otras tantas muestras de cada extracto: 1. Electroforesis al 5% de poliacrilamida y pH 9.0. El tampén del gel. es Tris-HCl (0.38 M, pH 9.0) y el del tangue Tris-glicina (5 mM Tris, 38 mM glicina, pH 8.4). Se aplicaron 200 V durante 15 min y 350 V durante 2 h, 2. Electroforesis al 10%, pH 9.0. Similar al sistema 1, pero con una concentracién de poliacrilamida del 10% y aplicacién de 250 V durante 30 min y 450 V durante 6 horas. 3. Electroforesis al 5%, pH 6.5. El tampén del gel es Tris-HCl (0.38 M, pH 6.5) y el del tanque Tris-glicina (5 mM Tris, 76 mM glicina, pH 6.5). Se aplicaron 250 V durante 1h y 550 V durante 3 h, Para obtener los geles se mezclaron acrilamida y bis-acrilamida (en proporcién 49:1 y la concentracién~68- final indicada en cada caso), 2 mg/ml de persulfato amé— nico y 1 yl/ml de "Temed" (N, N, N', N"-tetrametil-etil- endiamina), en’ el tampén citado en cada caso, Los geles se colocaron entre dos placas de vidrio de 16 x 16 cm dispuestas verticalmente y se dispusieron pocillos para 20 muestras, en 8 de los cuales, dispuestos a intervalos regulares, se colocaron testigos (extractos de la estirpe SE54, productora de fosfatasa silvestre), _ Los geles se tifieron por sumersién durante 30 min en 200 ml de tampén Tris-HC1 (0.1 M, pH 8.0)\gon 0.8 mg/ ml de q-naftil-fosfato y 1 mg/ml de "Rojo rapido", se lavaron con abundante agua destilada y se secaron durante una noche a 37°C entre papeles de celofan mantenidos ten- sos mediante un bastidor. Los gelessecados de esta forma adquieren consistencia plastica y las bandas mantienen su coloracién casi indefinidamente. Los tres sistemas de electroforesis permiten separar perfectamente las tres isoenzimas de la fosfatasa; la distancia entre bandas sucesivas varia entre4 y 8 mm dependiendo del sistema empleado. «-69- XI, ENSAYOS DE TERMOESTABILIDAD Se diluyeron los extractos enzimAticos parcialmente purificados en tubos con tampén ‘Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0) precalentado a 92°C hasta que contenian 25 yg/ml proteina total y se mantuvieron a 92°C en un bloque termostatizado "Temp-blok 2091", de Lab-Line, usando silicona para ase- gurar el contacto de tubos y bloque y recubriendo el conjunto con poliestireno, Las muestras tomadas a intervalos regulares se mantuvieron a 4°C hasta ensayar la actividad; esta precaucién es esencial porgae la desnatura- lizacién térmica de la fosfatasa es raépidamente reversi- ble a temperatura ambiente (Heppel et al., 1962). Se cal- culé el coeficiente de inactivacién térmica, K, por ajuste de minimos cuadrados a la recta: in A, = In Ag+ K.t, : donde A, es la actividad de la muestra obtenida en el mo- mento t y Ag, la actividad inicial ( t = 0). Salvo que se indique lo contrario, la primeraalicuo- ta se tomé a los 6 min de diluir el extracto, tiempo necesario para que se estabilice la temperatura. En cada experimento se incluyeron dos extractos de la estirpe SE54 (productora de fosfatasa silvestre) y la termoestabilidad relativa de cada problema se expresé como el cociente de su coeficiente Ky la mediade los coeficientes de los dos extractos testigos del mismo experimento (un-70- valor mayor que 1 indica menor estabilidad que el silvestre). XII. ENSAYOS DE CINETICA ENZIMATICA La cinética de la fosfatasa alcalina de E, coli no se ajusta al modelo de Michaelis-Menten pero, para algunas combinaciones de pH, fuerza iénica y concentraciones de sustrato e inhibidor, la diferencia es poco apreciable (Waight et al., 1977). Esto permite emplear los métodos clasicos de determinacién de velocidades iniciales de reaccién y ajuste a la ecuacién de Michaelis-Menten para estimar la constante de Michaelis (Km) para el sustrato (p-nitrofenilfosfato) y la de inhibicién (Ki) para el fosfato, inhibidor competitivo. Se emplearon soluciones que contenian aproximadamente 0.03 U/ml de fosfatasa y se determinaron las velocidades iniciales de reaccién a 37°C con un espectrofotéme~ tro Pye Unicam SP1700 a partir del aumento de absorbencia a 410 nm (ver Material y Métodos, VII) durante los primeros 30 s de reaccién. 1. Estimacién de la Km para p-nitrofenilfosfato Se emplearon concentraciones de p-nitrofenilfosfato de 180.0, 89.8, 53.9, 31.4 y 13,5 uM en tampén Tris-HCl-71- (0.3 M, pH 8.6) y se estimé la Km por ajuste de minimos cuadrados a la recta: V = Vmax - Km, —, Ss donde V es la velocidad inicial de reaccién para una con- centracién S de sustrato y Vmax la velocidad maxima (a concentracién saturante de sustrato). 2, Estimacién de la Ki para fosfato inorgénico Se emplearon idénticos tampén y concentraciones de sustrato que en el caso anterior con la adicién de K,HPO,, 50.2 »M, en cada ensayo y se estimé la Ki por ajuste de minimos cuadrados a la recta: \ V = vmax - Km(1 +) , 1, Ki Ss donde V, Vmax y $ tienen el mismo significado que en el caso anterior, I es la concentracién de inhibidor (50.2 uf) y Km, el valor estimado ‘segiin se acaba de describir. Para la deteccién de variantes de cinética se incluyeron dos testigos (extractos de la estirpe SE54, productora de fosfatasa silvestre) y se expresaron las constantes cinéticas relativas del problema como el cociente entre la Km (6 Ki) del problema y la media de las dos determinaciones de la Km (6 Ki) del testigo.WI ~72- XIII. CURVA ACTIVIDAD/pH La variacién de la actividad con el pH se estudid a concentracién saturante de p-nitrofenilfosfato (2.2 mM) en tampén Tris 0.38 M ajustado con HCl al pH deseado y se determinaron las velocidades iniciales‘de reaccién como se describe en el apartado XII. Para facilitar la comparacién de las curvas actividad/pH de extractos distintos se calcularon, para cada extracto y pH, velocidades de reaccién relativas, que son los cocientes de la velocidad a cada pH y la media de dos determinaciones de la velocidad a pH intermedio (8.2), XIV. ENERGIA DE ACTIVACION La variacién de la actividad con la temperatura se estudié a concentracién saturante de p-nitrofenilfosfato (2,2 mM) en tampén Tris-HC1 (0,1 M, pH 8.0) usando un ter- mostato Pye Unicam SP876 regulado a la temperatura desea~ da (30, 36, 42, 48 y 54°C) y se determinaron las velocidades iniciales de reaccién como se describe en el apartado XII. La -energia de activacién, E(Kcal/mol),se estimé por ajuste de minimos cuadrados a la recta: ¥~73- f inves at OE 1980.7 donde V es la velocidad inicial de reaccién a la tempera~ tura T (en °K) y A una constante que depende de la cantidad de enzima presente.~75- I, PRELIMINARES La Tabla X compara varios procedimientos de extrac- cién de la fosfatasa alcalina de E. coli. El calor (paso =) es casi tan efectivo como la rotura de las células por ultrasonidos (paso A) en cuanto a liberar la fosfatasa, pero es mucho més especifico para la fosfatasa, por lo que conduce a una actividad especifica mayor, tan- to aplicado aisladamente como en combinacién con otros tratamientos (pasos B y D). El calentamientq de la enzima - pretratada con EDTA (paso D) produce una gran pérdida de actividad. Esto es achacable a la termolabilidad de la fosfatasa alterada por EDTA, segtin los resultados obtenidos con la colaboracién de un grupo de alumnos de Genética Molecular y no incluidos en este voiumen, La maxima actividad especifica se consigue con calentamiento de unos 40 min (Fig. 4). El método es igualmente eficaz para variantes muy termolabiles (Tabla XI), Para eliminar las moléculas de bajo peso molecular que inhiben a la fosfatasa (Cox y Griffin, 1967; Reid y Wilson, 1971) y se encuentran en los extractos obteni-. dos por calentamiento, se precipité la fosfatasa con ace~ tona (Fig. 5). Los resultados éptimos se obtuvieron mez- clando 1 volumen de extracto con 1.2 volamenes de acetona,TABLA X. Comparacién de varios métodos de extraccién y purificacién parcial de la fosfatasa alcalina de SE54 Actividad Proteina Actividad Paso U/ml, mg/m especifica U/mg 12.1 7.5 1.6 A+B 9.5 0.9 10.5 c 8.5 2.1 4.0 c+D 1.2 0.06 20.0 E 1.3 0.8 { 14a La ouspensién inicial contenia aproximadamente 10'° células/ml en tampén Tris-HCl (0.1 M, pH 8.0). Los pasos son los siguientes: A. Exposicién a ultrasonidos (6 min a 60-70 W y 4°C con un "Sonifier B-12", de Branson); centrifugacién a 16000 rpm durahte ? 15 min y ensayo del sobrenadante, B. Exposicién a 85°C durante 35 min en tubos precalentados; centrifugacién a 16000 rpm durante 15 min y ensayo del sobrenadante. C. Tratamiento con lisozima de huevo (0.1 mg/ml), 5 min, 37°C; tratamiento con EDTA (2 mM, 45 min, 37°C), con ligera agitacién oca~ sional; centrifugacién a 16000 rpm durante 15 min y ensayo del sobrenadante. D. Idéntico a B, pero con calentamiento durante 15 min. E. Idéntico a B, pero con calentamiento durante 60 min.100}- 7 50}- 25 9 4 0 i. ml L L 1 1. 0 10 20 30 40 50 60 70 tiempo a 85°C min Figura 4, Extracci6n de la fosfatasa alcalina de SE5S4 mediante calentamiento de las células a 85°C, @,Actividad especifica; 0,Rendimiento, porcentaje de la actividad respecto de la de extractos obtenidos con ultrasonidos (paso A de la Tabla X). 80 lop @ poiyivedse pop! (su/n)=78- en coincidencia con otros autores (Aradi et al., 1971). Este tratamiento recupera la mayor parte de la fosfatasa y duplica la actividad especifica del producto, porque algunas proteinas contaminantes se desnaturalizan irre- versiblemente (se recupera aproximadamente el 50% de la proteina inicial). TABLA XI. Comparacién de la extraccién de fosfatasa de la estirpe silvestre (SE54) y de una variante 30 veces mas termoldbil (R11), por calentamiento a 85°C durante 40 min y con ultrasonidos (paso A de la Tabla X). . Actividad Protefna Actividad Estirpe Tratamiento U/mL _ng/m) especifica U/mg SES4 85°C 11.0 0.65 16.9 ultrasonidos 12.8 8.2 1.6 RIL asec 9.5 0.60 15.8 ultrasonidos 10.4 17 1.4 Ademas, las constantes cinéticas de la fosfatasa purificada con acetona son inferiores a las de la no pu-~ rificada 9 la obtenida por otros procedimientos (Tabla XII), como se esperaria al eliminar moléculas inhibidoras de bajo peso molecular y evitar moléculas que, como el EDTA, alteran la enzima durante la extraccién,@® enriquecimiento 25. ee 4100 201 deo 1.5L 460 \ 4.0b a 440 OSL ° 420 0 05 10 15 20 25 30 35 . 40 acetona/extracto (wv) Figura $5, Precipitacién con acetona de la fosfatasa de SE54 extraida por calentamiento a 85°C durante 40 min. @,Enriquecimiento, cociente entre la actividad especifica recuperada y la existente antes del tratamiento con acetona; 0,Rendimiento, porcentaje de la actividad recuperada respecto de del tratamiento con acetona, la existente antes % ‘OJUE!WIPUSL OcS co -80- TABLA XII. Comparacién de las constantes cinéticas de la fosfatasa de SES4 extraida y purificada por diversos procedimientos Procedimiento Km para p-nitro- Ki para fenilfosfato (uM) fosfato (yM) Lisozima y EDTA (paso C, Tabla X) 13.1 11.6 Ultrasonidos (paso A, Tabla X) 12.3 9.2 Calentamiento éptimo (85°C, 40 min) 11.5 10.3 Calentamiento éptimo y acetona (1.2 voldmenes por volumen de 8.7 5.6 extracto) ~ TS ‘ Tras los tratamientos éptimos con calor y acetona se obtiene aproximadamente el 80% de la fosfatasa total de las células y la actividad especifica del producto es de unas 30 U/mg, similar a las preparaciones purificadas de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA (referencia P-4377).-81- IL, POBLACIONES EMPLEADAS PARA LA INVESTIGACION DE ESPEC- TROS MUTACLONALES Se han utilizado tres poblaciones de estirpes de EB. goli: una poblacién de estirpes naturales para investigar el espectro mutacional establecido y dos poblaciones tratadas con nitrosoguanidina para investigar el espectro mutacional naciente, II.1. Estirpes naturales de Escherichia coli N El espectro mutacional establecido de la fosfatasa se, investigé en una poblacién compuesta por 50 estirpes naturales de E. coli, citadas como Nl a NSO, aisladas de distintos enfermos y clasificadas como E. coli en el De- partamento de Microbiologia del Hospital Universitario de Sevilla, Todas las estirpes son protétrofas y todas menos una poseen una fosfatasa alcalina inducible similar a la de las estirpes de laboratorio. La estirpe deficiente en fosfatasa alcalina no ha sido incluida en este trabajo, Como comparacién, de veinte enzimas investigadas en poblaciones naturales de E, coli, se encontraron variantes sin actividad en sélo cuatro enzimas; las 109 estirpes investigadas tenian fosfatasa alcalina (Selander y Levin, 1980).~82- II.2,. Estirpes de Escherichia coli usadas para investigar el espectro mutacional naciente El espectro mutacional naciente de la fosfatasa se investigé en estirpes tratadas con nitrosoguanidina, apro- vechando la propiedad de que las células que han sufrido mutacién en un gen (como proC) tienen una probabilidad alta de haber sufrido también mutaciones en genes cerca~ nos (como phoA). Como punto de partida se necesita una estirpe auxétrofa para prolina por inactivacién del gen prot. II,2.a, Obtencién de un auxédtrofo prot Se traté con nitrosoguanidina un cultivo de la estirpe MM7, Tras contraseleccién con penicilina, el 5.7% de las células viables al final del tratamiento eran auxd- trofos para prolina (Pro). Se investigé la reversién a prototrofia y la comuta-— cién con phoA tras el tratamiento de algunos de los mutan— tes auxétrofos con nitrosoguanidina y se determiné si la mutacién responsable de la auxotrofia cotransduce con phoA (Tabla XIII). Los resultados sugieren la existencia de dos clases de auxétrofos Pro. La primera, representada por los mutantes pro-2, pro-10 y pro-12, se caracteriza por una alta frecuencia de reversién, escasa comuta~& 4 cién con phoA y nula cotransduccién con phoA. La segunda clase representada por los mutantes pro-1, pro-5 y pro- 7, se caracteriza por una frecuencia de reversién baja, comutacién alta con phoA y frecuencia de cotransduccién con phoA elevada. La primera clase de auxétrofos corresponde a mutantes de los genes proA y proB y la segunda a mutantes del gen proC, segtin se deduce de la localizacién de los genes citados en el cromosoma de E. coli (Fig. 2). La frecuencia de cotransduccién con phoA de los presuntos mutantes preC coincide con la obtenida por otros autores (ver, por ejemplo, Wanner y Latterell, 1980) y con la de la estirpe AT3085, un auxdtrofo proC usado como testigo. La propia estirpe AT3055 no pudo ser utilizada para investigar el espectro mutacional naciente de la fosfatasa por la impo- sibilidad de obtener revertientes Pro* con nitrosoguanidina (Tabla XIII). Sélo los presuntos auxétrofos pro comutan significativamente con phoA, como podia esperarse por la estre- cha proximidad de ambos genes; los indices de comutacién observados son similares a los obtenidos en estudios com- parables (Guerola et al., 1971; Hince y Neale, 1974). La gran diferencia de frecuencias de reversién de las dos clases de auxdétrofos se debe a que las mutacionesTABLA XIII. Caracterizacién de mutantes auxédtrofos Pro” Estirpe Revertientes oo enon Peters pro-L 0.21 91.2 12.4 pro-2 120 0.0 aa pro-5 0.60” 90.7 > 5.3 pro-7 0.20 92.5 8.5 pro-10 28 0.0 3.1 pro-l2* 460 0.0 2.3 AT3055 < 0,001 ‘* 92.3 no determinado Se ‘indica la frecuencia de revertientes por 10° supervivientes tras tratamiento con nitrosoguanidina, La supervivencia media fue del 2.7%. La frecuencia de cotransduccién con phoA es el porcentaje de colonias Pho” entre unos 300 transductantes Pro’ obtenidos después de infectar un cultivo de la estirpe indicada con un lisado de fagos Pl multiplicados en la esticpe $33 (Pro’ Pho"). El indice de comutacién es el cociente de las frecuencias de mutan— tesPhowntre los revertientes Pro‘ y entre los supervivientes (unas 1200 colonias de cada clase) tras el tratamiento con nitrosoguanidina de la estirpe indicada. La frecuencia media de Pho” entre los supervivientes fue de 9 x 107%ws ~85~ é de los genes proA y proB, pero no las del gen proC, se suprimen fenotipicamente si se bloquea la biosintesis de arginina por una mutacién argD (Berg y Rossi, 1974; Fig. 6). La pérdida de funcién del gen argD debe ser mucho mas frecuente que la reversién de mutaciones en los genes pro; en efecto, los presuntos mutantes proC revierten con baja frecuencia y los presuntos mutantes proA y proB revierten con frecuencias similares a las de mutaciones de pérdida de funcién. Para investigar el espectro mutacional naciente de N la fosfatasa se escogié la estirpe SE54, que lleva la mu- tacién proci. II.2.b. Poblaciones de estirpes comutantes y no comutantes Se trat6 con nitrosoguanidina un cultivo de la estirpe SE54, obteniéndose una supervivencia del 8.1% y una frecuencia de revertientes Pro’ de 0.21 por millén, Se estudiaron 2400 colonias supervivientes, de las que ninguna era Pho” y1100 colonias revertientes Pro’, de las que 18 (1.6%) eran Pho”. Estos resultados indican que SES4 responde normalmente a nitrosoguanidina, Para investigar el espectro mutacional naciente de la fosfatasa se escogieron 70 de las estirpes Pho’ obte-Y¥-fosforitglutamico ox . 9 semialdehido go 0-p-0. 0 Y-Neacetitgiutémico 5 ohteP%o po prok 0. oertto ay semialdehido-y-glutamico Nooeees / 4'-pirrolin-5-carboxflico Fs a— prot ornitina PROLINA Nocera © citrulina Figura 6. Biosintesis de prolina y arginina en Escherichia coli (modificado de Berg y Rosé 1974, y Gamper y Moses, 1974). Los Atomos de carbono se indican con circulos lienos, los de los demas Minosuccini elementos con su si{mbolo quimico op argininosuccinico yy “no se indican los Atonos de N hidrogeno. Las flechas discontinuas bneooga? indican la ruta alternativa de N N ‘0 biosintesis de prolina en los 00 mutantes proA argD 6 proB argD. ARGININA AL acumularse semialdehido y-N-acetil-glu- N témico en los mutantes argh, €1 producto N-0e0g del gen lo transforma en semialdehi ° ‘Oo do y-glutdmico. De esta forma, los auxé6- N N trofos Pro” por mutacién proA 6 proB se convierten en Pro* Arg™ por una mutacién que inactive el producto de argD. Como la estirpe MN7 y sus derivados llevan una mutacién argG, los medios utilizados conten{an siempre argi~ nina y permitfan el crecimiento de mutantes proA argD 6 proB arg).~87~ nidas en el experimento anterior; de ellas 21, citadas como V1 a V2l, eran supervivientes Pro” y el resto, citadas como Rl a R49, revertientes Prot. La frecuencia de variantes de la fosfatasa debe ser baja en ausencia de comutacién, por lo que el estudio de algunos supervivientes, no comutantes, sirve como control de la fiabilidad de los métodos de deteccién de variantes. Adem4s, la busqueda de variantes se hizo "a ciegas", de forma que el experimentador desconocia si una estirpe determinada era uRY 6 Nv, III. CARACTERIZACION DE LA FOSFATASA DE LAS ESTIRPES ES- TUDIADAS Se extrajo y purif cé parcialmente la fosfatasa alcalina de cada una de las estirpes descritas en el apartado II y se estudiéd la movilidad electroforética, la termoestabilidad y la actividad especifica de la enzima, Como testigos se incluyeron las estirpes MM7 y SES4, pro- ductoras de fosfatasa silvestre, y la estirpe U9, productora de una fosfatasa mutante alterada en los tres parametros citados (Schlesinger y Levinthal, 1963). En total se han detectado ocho alelos de la fosfatasa, citados como phoAl a phoA8, distintos entre si y de la fosfatasa de la estirpe SES4, portadora del alelo silvestre phoao.~-88- Se estudié también la cinética enzimatica, la curva actividad/pH y la energia de activacién de la fosfatasa de algunas estirpes para completar la caracterizacién bioquimica de algunas variantes detectadas por otros mé- todos e intentar la deteccién de nuevas variantes. III,1, Electroforesis La fosfatasa de cada una de las estirpes se sometid a electroforesis en tres condiciones distintas, Se uti- N 1izé hemoglobina de vaca (Sigma H-2500) como testigo en cada electroforesis (Tabla XIV), Las tres isoenzimas de la fosfatasa suelen presen- tarse en proporciones diferentes, que dependen de las condiciones de cultivo (ver, por ejemplo, Schlesinger y Andersen, 1968), En las condiciones de cultivo empleadas en esta Tesis, la isoenzima mas rApida fue casi siempre la m&s abundante (anchura de banda en electroforesis, unos 2 mm) y a veces no fueron visibles las isoenzimas menos abundantes, La fosfatasa alcalina de la mayoria de las estirpes se desplaza exactamente igual que la silvestre (Fig. 7). Nétese la perfecta repetibilidad de las observaciones.-89- TABLA XIV. Movilidad de la fosfatasa alcalina de E. coli silvestre y la hemoglobina de vaca en las condiciones electroforéticas utilizadas Condiciones electroforéticas Poliacrilamida, % 5 i0 5 pH 9.0 9.0 6.5 Recorrido hemoglobina, mm 60 65 20 Recorrido isoenzima més répida de la fosfatasa alcalina, mm 75 70 75 Distancia entre isoenzimas de la fosfatasa alcalina, mm 5 4 8 S Algunas estirpes producen una fosfatasa alcalina distinta de la silvestre en cuanto a movilidad electro- forética (Fig. 8). La mayor diferencia de movilidad corresponde a la estirpe R13 (Fig. 9). La comparacién entre enzimas de estirpes distintas se basa, en caso de duda, en la isoenzima mas r4pida, que suele ser la mas abundante o una de las més abundantes. Ninguna estirpe produce una distribucién en bandas distinta de la silvestre ; las diferencias observadas ocasionalmente (como, por ejemplo, la estirpe V1 en la Fig. 7) resultaron no ser repetibles.ae — tat cae mw ot za ine zo o Bw ws az ww lw + a nw ince u so ze. >2 aN ust usr aw Cle) Ze ze oO za ax ly ~t ™ mn +5. a - ° Bs ze a So zo - zo | ! aN w~t nw~91- La electroforesis a pH 9.0 (tanto con 5% como con 10% de poliacrilamida) distingue seis clases de movilidad electroforética, una de ellas la del silvestre. La electroforesis a pH 6.5 y 5% de poliacrilamida detecta cinco clases. La combinacién de los dos tipos de electroforesis permite distinguir en total ocho clases de movilidad (Fig. 10). Los alelos phoAl y phoA2 son indistinguibles electroforéticamente, pero se distinguen por otras caracteristicas descritas mas adelante. La Tabla XV da el desplazamiento de las enzimas mutantes respecto a la silvestre; una uniddd corresponde a un desplazamiento igual a la distancia entre isoenzimas consecutivas del silvestre; la letra "p" designa los desplazamientos menores de una unidad y los signos "+" y "=", los desplazamientos hacia el Aanodo y el catodo, respectivamente, En las 49 estirpes comitantes ("R", Pro) se detectaron tres variantes electroforéticas (phoA2, phoA3 y phoA4) y ninguna en las 21 estirpes no comutantes ("V", Pro”), De las 50 estirpes naturales, 21 tienen el alelo silvestre phoAO; las variantes electroforéticas phoAS, phoA6, phoA7 y phoA& estén presentes en 21, 5, 2 y 1 estirpes, respectivamente. La estirpe mutante U9 se distingue electroforéticamente de la silvestre, de acuerdo con Schlesinger y Levinthal (1963) y se le asigné el alelo phoA1.cATODO caTooo origen =a = = = bates Sree =a = = = == = al — = ANODO ANGBO + ! 0 2p pH 9.9 . pH 6.5 Figura 10. Esquema de la movilidad electroforética de los ocho alelos mutantes y del tipo silvestreTABLA XV. Variantes electroforéticas de la fosfatasa Estirpes Alelos Desplazamiento respecto al silvestre Testigos silvestres td phoAO SE54 phoao Testigo mutante ug J phoAL Estirpes comutantes RIL phoA2 R13 phoas R28 phoAd Todas las demas phoAd Estirpes no comutantes Todas phoad Estirpes naturales Ni, N2, Na, N5, N6, N7, NB, N12, N20, N21, N22, N27, N28, N33, N36, N37, N38, N40, N44, N47, N13 Nil, Ni9, N31, N45, NSO Nis. Todes las demis 3%, ph 9.0. 10%, pi 9.0 5%, pH 6.5 4b +1 +P +1 +1 4p +3 43 +34p ° ° on oO ° Oo oO Oo ° =? ~P oO +1 +2 41 +14 +ep +1 2p -2-p -2-p ° ° °~94- III.2. Termoestabilidad Se investigd la cinética de inactivacién a 92°C de la fosfatasa de cada una de las estirpes estudiadas (Tabla XVI), El coeficiente de inactivacién tér- mica, K, se estimé de la relacién entre actividad y tiempo de calentamiento, teniendo en cuenta sélo los experimentos en que el coeficiente de correlacién entre ambas variables fue de al menos 0,97; cuando fue necesario, se repitié el estudio de la cinética de inactivacién hasta satisfacer el criterio anterior. N Las 54 repeticiones realizadas con la fosfatasa silvestre (SE54) dieron valores de K distribuidos normalmente (Tabla XVII). Se clasificaron como variantes de termoestabilidad las enzimas cuya K diferia del valor medio del silvestre en mis de tres veces la desviacién tipica; la probabilidad de que se pro- duzca una desviacién igual o mayor por azar es menor que 0.4%, Este criterio equivale a considerar como variantes las enzimas cuya K es mayor de 0.0525 s7!, © sea, 1,85 veces el valor del silvestre. En la practica ei valor de K para la variante m4s estable fue de cuatro veces el valor del silvestre, por lo que no cabe duda de que se trata realmente de una variante y de que no se han encontrado casos dudosos.TABLA XVI. Termoestabilidad y actividad especifica de la fosfatasa. En todos los casos se da ei cociente entre el valor de la estirpe considerada y el del silvestre SE54. Para la termoestabilidad se obtuvicron los coeficientes de inactivacién térmica (en s“!) y para la actividad especffica, la relacién entre actividad total y proteina total (en unidades por mg de prote{na). Se indican con un asterisco los valores que difieren del silvestre en mas de tres desviaciones tipicas. Estirpe Termolabilidad Actividad relativa relativa Testigos silvestres x MM 1.34 0.88 .SES4 1.00 1.00 Testigo mutante ug 9.61" o,11* Estirpes comutantes RL 0.70 1:00 Re 1,32 1,12 RB 1.06 0.88 Ra 1.0L 1.17 RS 1.34 1.07 R6 0.94 1.33 R7 1.02 1.11 RB 1.23 0.90 RO 0.73 1.46 R10 1.2h 0.77 RL 31.95" 0.90 R12 0.78 0.65 R13, 4.56* 0.92 R14 1.15 1.23 R15, 1.35 0.52 RIG 0.47 1.36 seehoesTABLA XVI (Cont. ) Estirpe Termolabilidad Actividad relativa relativa Estirpes comutantes (Cont.) R17 0.72 1.18 R18 0.62 1.26 R19 0.47 0.71 R20 1.09 0.90 R2i 1.16 1.15 R22 "0.93 1.21 R23 0.88 Lan R24 1.14 1.13 R25 1.07 1.09 R26 0.78 8 17 R27 1ar 1.23 + R28 4.92" 1.20 R29 0.92 0.96 R30 1.20 1.07 R31 0.87 0.91 R32 1.27 1308 R33 0.66 1.36 R34 1.36 1.15 ROS 0,77 ae R36 1.16 1.14 R37 0.58 0.47 R38 0.77 0.83 R39 1.52 Lead Rao 1.43 1.14 Rar 0.72 0.81 Ra2 0.84 1.00 R43 0.59 1.31 Raa 0.38 0.67 RAS 1.69 0.83 R46 1.07 1.10TABLA XVI (Cont.) Estirpe Termolabilidad Actividad relativa relativa Estirpes comitantes (Cont. ) Ra7 0,65 1.00 R48 0.93 1.7 Rag 1.21 1.25 Estirpes no comutantes vi 0.69 0.72 ve 0.92 1.33 v3 0.95 0,99 va 1.00 1.17 vs 0.94 1.23 v6 1.29 0.66 v7 0.50 0.85 va 1,39 0.92 vo 0,72 1.15 vio 1.19. 0.76 via 1.31 1.32 viz 1.18 1.01 vi3 1.19 1.10 via 1.53 1.28 vis 0.86 0.87 vis aag 0.75 vi7 0.92 1.48 vis 1.12 0.90 vig 1.26 1.17 v20 0.65 0.48 van 1.41 1.01TABLA XVI (Cont. ) Estirpe Termolabilidad Actividad relativa relativa Estirpes naturales NL 0.81 0.89 n2 0.81 Ns 1.07 Na 1.01 NB 0.69 Ne 0.55 N7 0.72 ns 0.86 no: 0,61 N10 0.46 waa ‘ 0.69 iz 0.83 “nia 0.62 nia 0.86 Nis 0.84 N16 0.93 N17 0.71 N18 0.96 N19 0.99 N20 0.73 Nat 1.16 0.50 N23 1.39 N24 1,01 N25 1,02 N26 0.75 N27 0.93 N28 1.25 N29 1.42TABLA XVI (Cont. ) Estirpe Estirpes naturales (Cont.) N30 N31 N32 N33 N34 N3s N36 N37 N38 N39 N40 Naa naz N43 Naa Nas N46. Na7 Nag Nag NSO ‘Termolabilidad relativa 0.67 3.94% 1.23 1,38 0.69 1.25 0.98 0.74 0.87 1.28 0.75 1.13 1.06 0.88 0.90 4.25% 0.85 1.25 1.40 0.61 3.63" Actividad relativa 0.61 0.83 0.92 1.51 > 21.23 1.16 O.71 0.95 0.53 0.88 0.72 0.68 0.93 1.24 0.77 1.31 0,93 1.16 0.88 0.99 1,33~100- La fosfatasa alcalina de 112 de las estirpes investigadas es tan termoestable como la silvestre: sus valores de K siguen una distribucién normal indis- tinguible de la de las repeticiones del silvestre (Tabla XVII). Estas estirpes constituyen la clase Tp. Se distinguen tres clases (Tj, Tg y Tg) de mutan~ tes mis termolabiles que el silvestre (Fig. 11 y Ta~ bla XVIII), No se encontré ninguna fosfatasa significativamente mas termoestable que la silvestre. TABLA XVII. Coeficientes de inactivacién térmica, K, de la estirpe silvestre y de estirpes de la misma tertioestabilidad. Estirpes Silvestre priketes) Namero de determinaciones 54 112 Media, s~! 0.0282 0.0279 Desviacién tipica, st 0.0081 0.0081, Ajuste a distribucién normal: Clases considerados 5 7 ro 1.30 7.70 P >50 % >30% Para el ajuste a la distribucién normal se siguié el método descrito por Crémer, "Métodos matem&ticos de Estadistica", pags. S01 y siguientes. Editorial Aguilar, Madrid, 1970.100/- ely Te (phoAdQ) | clase e oa S54 | c r Ni (phoAS ° \ Re <8 Nhs {phoa7) J To *. \ a : A . 25 \, \ Noe Se Ne rt3 (phoA3) a % _: clase 10 4 Am NIT (phos) (7 ‘A 5 * "R11 (phoA2) 428 {phoAd] 3B 5 —S 3 clase 7 3 3 3 a 8 ob E ° U9 (PhoAt}] clase ON15 (phoAs}| 2 1 2 4 8 12 16 20 24 tiempo a 92°C. min Figura il. Cinética de inactivacién a 92°C de los ocho alelos mutantes y del tipo silvestre.-102- TABLA XVIII, Variantes de termoestabilidad de la fos~ fatasa, Clase de K relativo termoestabilidad Alelos al silvestre (silvestre) phoAd 1.00 phoAS: 0.93 hoa? 1.38 phoa3 4.56 phoAd 4.92 phoas 4,00 T, phoAL 9.61 phoAs 11.67 x 13 phoa2 31,95 Las ‘diferencias entre valores de K para alelos de 1a misma clase no son significativas, No se detect6 ninguna variante de termoestabilidad entre las 21 estirpes no comutantes ("V", Pro7) estudiadas. Entre 49 estirpes comutantes ("R", Prot) se detectaron dos variantes: Ty (alelos phoA3 y phoA4, distinguibles por electroforesis) y T3 (alelo phoA2), Entre las 50 estirpes naturales se detectaron las variantes 1; (alelo phoA6, cinco estirpes) y Ty (alelo phoA8, una estirpe). La fosfatasa de la estirpe US (alelo phoA1), que es mAs termolAbil que la silvestre de acuerdo con Schlesinger y Levinthal (1963), Pertenece a la clase T7. Los alelos phoAl y phoA2,-103- indistinguibles por electroforesis, se distinguen por termoestabilidad: phoA2 es unas tres veces mas termoldbil que phoAl. III. 3. Actividad especifica Se determiné la actividad especifica de la fosfatasa en extractos de cada una de las estirpes estudiadas (Tabla XVI), En 15 extractos de la fosfatasa del silvestre, (SE54) la media y la desviacién tipica de la actividad especifica fueron 34,26 y 6.37 unidades x por mg de proteina, respectivamente; el criterio de tres desviz jones tipicas define el intervalo de acti-~ vidad especifica normal entre 0.44 y 1,56 veces la media del silvestre. Sdlo la fosfatasa de U9 (alelo phoAl) difiere del tipo silvestre; su actividad especifica relativa, 0.11, coincide con la determinada por otros autores (Schlesin y \evinthal, 1963). Las 121 estirpes restantes presentan actividades especificas indistinguibles de la silvestre y distribuidas normalmente (considerando 7 clases, el X° de ajuste es 5.86, no significativo); la media y la desviacién tipica de la actividad de estas estirpes son 33.23 y 8.57 uni--104- dades por mg de proteina, respectivamente. Todas las fosfatasas mutantes estudiadas, excepto phoAl, poseen una actividad especifica idéntica a la silvestre. Las determinaciones de actividad especifica tienen incertidumbres debidas a no haberse purificado totalmente la enzima y a que los diferentes lotes de medio utilizados pueden céntener cantidades ligera- mente diferentes de fosfato utilizable (como contaminante de 1a peptona utilizada), que pueden producir diferencias en la cantidad de fosfatasa sintetizada. No obstante, el testigo mutante .U9 y algunas estirpes Pho" obtenidas en el curso de estos trabajos pero no descritas en este volumen fueron perfectamente distinguibles del silvestre por su actividad especifica. III, 4, Cinética enzim&tica Se estudiéd la afinidad por el sustrato (p-nitrofenilfosfato) y el inhibidor (fosfato) de la fosfata~- sa de los testigos silvestres (MM7 y SE54), del mutante U9, de 20 estirpes comutantes y de 10 estirpes

Variantes Mutacionales

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