Příprava materiálu byla podpořena projektem

OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Část 7 – Vlastnosti solventů (rozpouštědel)

Přehled organických rozpouštědel

Tabulka níže shrnuje velký počet solventů v pořadí stoupající polarity. Mnohé z nich
nejsou vhodné jako mobilní fáze z důvodů uvedených dříve. Z tabulky je patrné, proč některá
rozpouštědla nejsou vhodná, např. kvůli vysoké absorpce UV záření nebo třeba vysoké
viskozitě. Některé solventy jsou užívány v malých množstvích jako aditiva mobilní fáze pro
určité aplikace: přídavek aminů vede ke posunu pH do zásadité oblasti, naopak přídavek
kyselin sníží pH do kyselé oblasti.
Tabulka uvádí následující vlastnosti solventů:
Eluční síla: ε0 je parametr uvádející eluční schopnost solventu pokud je použit jako mobilní
fáze v kombinaci se silikagelem jako stacionární fází. Představuje adsorpční energii elučního
činidla vztaženou na jednotku plochy absorbentu. Tabulka solventů seřazená podle tohoto
parametru se často nazývá elutropická řada. [Často tabulky shrnují ε0 hodnoty na alumině
jako adsorbentu a jsou vyšší než na silikagelu: ε0 (Al2O3) = 1.3 ε0(SiO2)].

Viskozita: ž je uváděna v mPa a při 20 °C. Solventy s vyšší viskozitou naž voda ž = 1.0 jsou
méně vhodné pro HPLC, protože jejich použití vede k vysokým tlakům na koloně.
Index lomu: jak plyne ze zkratky, nD20, je uváděn při °C.
UV hrana (cutoff): Je to vlnová délka, při které je absorbance solventu rovna 1.0 v 1 cm
kyvetě a při aplikaci vzduchu jako referenční hodnotě (10% transmitance). Data prezentovaná
v tabulce jsou platná jen pro velmi čistá rozpouštědla. Solventy horší čistoty mají hodnoty
vyšší.
Bod varu: Příliš nízký bod varu je nevýhodný. Dochází k tvorbě bublin v HPLC systému.
Také může díky vysoké těkavosti dojít ke ztrátě solventu při jeho odplyňování zejména
proudem helia.
Dipólový charakter: π* je měřítkem schopnosti rozpouštědla interagovat s analytem
dipólovými interakcemi a polarizačními silami.
Kyselost: α je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako donor vodíku k bazickým
analytům (akceptorům).
Zásaditost: β je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako akceptor vodíkové vazby vůči
kyselým analytům (donorům).
Poznámka: π*, α a β jsou relativní čísla a jsou normalizovány tak, že jejich součet je roven
1.00. Tyto tzv. solvatochromní parametry jsou velmi užitečné při popisu a srovnání
jednotlivých rozpouštědel.
Solventy s nízkou polaritou, fluoroalkany – tetrachlormetan, neinteragují s analyty
dipólovými ani vodíkovými interakcemi a z toho důvodu u nich uvedené parametry nejsou
definovány.
Selektivita solventů
Nejúčinnější způsob ovlivnění separace je změna separační selektivity. Toho lze dosáhnout
aplikací jiného separačního modu (např. normální vs reverzní fáze) použitím jiné stacionární
fáze (např. oktadecyl- vs fenyl- silikagel) nebo využitím odlišné mobilní fáze. V tom druhém
případě je nejvhodnější zvolit solvent maximálně odlišný od původního dle výše
specifikované tabulky, a níže uvedeného diagramu, kde jsou graficky prezentovány
solvatochromní vlastnosti rozpouštědel.
 Trojúhelník v diagramu dole představuje ukazujíce vzájemné rozdíly jednotlivých
solventů vzhledem k jejich parametrům π*, α a β. Často je selektivita solventů nastavena
mícháním dvou čistých solventů A a B, je třeba připomenout, že tyto solventy musí být
vzájemně mísitelné. Dále, pokud jde o ladění selektivity v normálním modu, nemá velký
smysl zaměnit diethyl ether terc-butyl methyl etherem, protože oba solventy jsou prakticky
na stejném místě v trojúhelníku. Podobně, není smysluplné snažit se zkoušet několik různých
alifatických alkoholů v modu reverzní chromatografie.
Benzen a jeho deriváty jsou jen výjimečně používány v roli mobilní fáze z toho
důvodu, že neumožňují UV detekci.

Mísitelnost solventů
Obrázek níže poskytuje informace o mísitelnosti běžných HPLC solventů při laboratorní
teplotě. Mísitelnost je závislá na teplotě. Navíc, mnoho rozpouštědel je vzájemně omezeně
mísitelných, tedy jsou mísitelné jen v jistých poměrech. Tato skutečnost v obrázku
znázorněna není, protože je lepší míchat solventy vzájemně neomezeně mísitelné.
 Solventy plně mísitelné se všemi ostatními rozpouštědly (od hexanu po vodu) jsou
aceton, ledová kyselina octová, absolutní ethanol, isopropanol a tetrahydrofuran.

Pufry
Pufry jsou užívány např. v modu iontově-výměnné chromatografie a často také v
chromatografii na reverzní (obrácené) fázi. Pokud mají být děleny iontové nebo ionizovatelné
látky, je velmi často, i když ne vždy, třeba provádět chromatografii při dané hodnotě pH,
která je nastavena pufrem. Tímto způsoben může být také řízen stav analytu, tedy zajištěno
v jaké formě je analyt chromatografován, tedy zda v nedisociované nebo disociované.
Vybrané pH musí být alespoň o 2 jednotky pH odlišné, než je hodnota pKa analytu, jedině
pak je velká většina látky jen v jedné formě.
 Kyselé analyty: Pufry mající hodnotu pH o dvě jednotky nižší než pKa analytu zajistí
kompletní potlačení disociace kyselého solutu. Pufry s hodnotou pH o dvě jednotky vyšší
naopak úplnou disociaci kyselého analytu.
Zásadité analyty: Pufry s pH o dvě jednotky vyšší hodnotou než pKa zásaditého
analytu zabezpečí kompletní potlačení protonizace analytu, pufry s hodnotou pH o dvě
jednotky nižší než pKa analytu zabezpečí kompletní protonizaci analytu.
Pokud se jedná o iontovou sílu pufru je vhodné začít s asi 25 mmol-1 roztoky. Příliš
nízká koncentrace pufru vede k nedostatečné schopnosti pufru udržovat stálou hodnotu pH
mobilní fáze.
Vysoká iontová síla (např. 100 m mol-1) může vést k potížím s rozpustností v
organických solventech. Je vhodné si předem zkontrolovat mísitelnost pufru s organickým
rozpouštědlem v plném rozsahu předpokládaných poměrů. Roztoky pufrů musí být před
užitím jako mobilní fáze pro HPLC filtrovány! Pufry jsou náchylné k bakteriálnímu růstu,
proto může být vhodné preventivně přidat 0.1% azid sodný. Pufr nesmí zůstat v HPLC
instrumentu a v koloně v době, kdy neprobíhá dělení. Musí být nahrazen nejprve vodou a
pak, pokud jde o chromatografii v reverzním modu, 100% organickým rozpouštědlem. Pokud
je tento postup nepohodlný, bylo by to zdlouhavé provádět každý den, je třeba čerpadlo
nevypínat a v době, kdy se neměří jen snížit průtok.
Pufry plní svou funkci, tj. udržují stabilní pH, jen v blízkém okolí, asi ± 1, jejich
hodnoty pKa. Table níže shrnuje některé běžné pufry včetně jejich pKa hodnot.
Hodnota pH je jednoznačně definována ve vodném prostředí a může být počítána na
základě znalosti složení soli a kyselin, respektive báze. Pokud je přidáno také organické
rozpouštědlo, je situace obecně složitější. Potíže s definováním a měřením pH v těchto
směsných prostředí může být často obejita tak, že je pH změřeno ve vodném prostředí před
přídavkem organického aditiva a následně po jeho přídavku již měřeno není. Je třeba zde
zdůraznit, že problematika definování pH ve směsných organicko-vodných mobilních fázích
je poměrně složitá a nesmí být obecně přehlížena nebo podceňována.
 Pufry bývají připravovány také z komerčních koncentrátů, kdy správným ředěním je
dosažena uvedená hodnota pH. Pokud není možno koncentrát pufru koupit nebo to
z nějakého důvodu není vhodné, je nejlepší postup přípravy pufru založen na vážení
příslušných chemikálií, kdy jsou potřebná množství nalezena v tabulkách nebo jsou
vypočítána a následně je přidána voda a nastaven objem.
Pro kombinaci s optickým rozptylovým detektorem, pro LC-MS a pro preparativní
separace je vhodné volit těkavé pufry, ty jsou prezentovány v tabulce níže. Těkavost kyselin,
zásad a solí byla studována Petritisem a kol.1 Pufry vhodné pro ESI-MS publikoval García.2

1
K. Petritis et al., LC GC Eur., 15, 98 (2002).
2
M/C. García, J. Chromatogr. B, 825, 111 (2005).
Trvanlivost pufrů
Je dobré připravit si jen tolik pufru, kolik bude spotřebováno v krátké době. Trvanlivost
vodných pufrů bez organických aditiv je velmi krátká.
Voda z přístroje na ultračistou vodu 3 dny
Vodné roztoky (nepufrované) 3 dny
Pufry 3 dny
Vodné roztoky s méně než 15% organického rozpouštědla 1 měsíc
Vodné roztoky s více než 15% organického rozpouštědla 3 měsíce
Organická rozpouštědla 3 měsíce

Je třeba si dále uvědomit, že při míchání vodných roztoků s organickými solventy často
dochází k objemové kontrakci, proto není možné připravovat směsné roztoky tak, že by jeden
roztok byl odměřena a druhý byl k němu přilit a objem nastaven doplněním po rysku.