042A ZROSS 94247FO ce -4raaze oo0ee 1 es26 9 REGENERACION DE RAICES EN PATRONES FRUTALES MICROPROPAGADOS: pat eat TRABAJO FIN DE CARRERA MARTA CASTILLO BADIA FEBRERO, 1993AGRADECINIENTOS Quiero expresar mi gratitud a todas aquellas personas que, de una u otra manera, han contribuido a la realizac. n de este trabaj zn primer lugar, a Juan A. Marin Velazquez, quien acepté la direccién de este trabajo a pesar de los inconvenientes y las molestias que ello le suponia. En el encontré siempre el apoyo y la ayuda que necesitaba, y fue quien, en mis momentos de desénimo, me estimulé y me devolvié la confianza en mi misma. Sin su ayuda, este trabajo no hubiese sido posible. [A todos los componentes del Departamento de Pomologia de la Estacién Experimental de Aula Dei, donde se ha realizado este trabajo, quienes me hicieron sentir como parte de ellos desde el primer dia: A Ma Pilar Soteras, M® Carmen Jiménez, Arantxa Arbeloa y Alvaro Blanco, por su enorme ayuda técnica y moral, por sus consejos, y por la confianza que me brindaron. A Concepcién Tabuenca, Jefa del Departamento, por el interés tomado y la resolucién de alguna duda respecto a este trabajo. A Antonio Almudi, Jesis Aparicio y Julio Pérez, por el interés que se tomaron siempre en transmitirme muchos de sus conocimientos de fruticultura, y por todo lo que han hecho por mi. Echaré de menos su sentido del humor y sus bromas. A Javier Puente, por el compafierismo demostrado, por su ayuda y por las molestias que le haya ocasionado el que hayamos compartido el mismo cuarto de trabajo. A 61 le deseo lo mejor en su vida profesional y personal. A Pilar Andreu, o Pili, como a ella le gusta, a quien me hubiese gustado conocer mucho antes. A la Estacién Experimental de Aula Dei, por el permiso de estancia concedido para la realizacién de este trabajo. A Rafael Gella, jefe de la Unidad de Fruticultura del Servicio de Investigacién Agraria de la Diputacién General de Aragén, por haberme permitido utilizar los invernaderos de su Unidad. [A Pepe Sénchez, por el cuidado y la atencién que proporcioné@ las plantas de los invernaderos. ‘A todas aquellas personas que siempre estuvieron dispuestas a ayudarme, especialmente a Pedro Sisamén, con el que ademés de su ayuda conté con su confianza y amistad, y a Sonia Murillo, por su constante apoyo. A toda mi familia, que siempre me animé, y en especial a mi hermana Esther y a mi cufiado Carlos, que me acogieron en su casa a pesar de todas las molestias que ello les suponia. Gracias a todos. Los gastos que ha ocasionado este trabajo han sido financiados en parte por los proyectos PCA 8/89 del CONAI-DGA y AGR 91-0434 crcyr.INDICE 1. Introduccién 1.1. Generalidades del cultivo in vitro. 1 1.1.1. Introduccién histérica. 1 1.1.2. Definicién y caracterizacién del cultivo in tro. 3 1.1.3. Ventajas e inconvenientes de la micropropagacién. 4 1.1.4. Fases de la micropropagacién. 6 1.1.5. Establecimiento y mantenimiento de condiciones asépticas. 7 1.1.6. Los medios nutritivos y su composicién. & 1.1.7. Repicados. 16 1.1.8. Condiciones ambientales. 19 1.2. dJustificacién del presente trabajo. 21 1.3. Caracteristicas del material vegetal utilizado. 23 1.4. El enraizamiento "in vivo". Factores que influyen: 27 1.4.1. Condiciones ambientales. 27 1.4.2. Tratamientos hormonales. 28 1.4.3, Substrato. 29 1.4.4, Factores genéticos. 29 1.4.5. Reservas. 30 1.4.6. Edad de la planta madre. 30 1.4.7. Lesiones. 30 1.4.8, Suministro de oxigeno. 30 1.4.9. Posicién del explanto dentro de la planta. 31 1.4.10, Manipulacién. 31 2. Parte experimental 33 2.1, Introduccién. 34 2.2. Material y métodos. 36 2.2.1. Material vegetal. 362.2.1.1. Origen y puesta en cultivo. 36 2.2.1.2. Esterilizacion. 36 2.2.1.3. Repicado. 37 2.2.2. Medios de cultivo. 38 2.2.2.1. Composicién. 38 2.2.2.2. Preparacién de soluciones stock. 38 2.2.2.3. Preparacién del medio nutritivo. 40 2.2.3. Substrato. 41 2.2.4. Condiciones ambientales de la cémara de cultivo. 43 2.2.5. Aclimatacién. 43 2.2.6. Enraizamiento in vitro. 51 2.2.6.1. Pruebas de enraizamiento in vitro con distintos medios de cultivo. 51 2.2.6.2. Pruebas de enraizamiento in vitro con aplicacién de auxinas en la zona basal de los brotes. 54 2.2.6.2.1. Auxinas en polvo. 54 2.2.6.2.2. Auxinas en solucién acuosa. 55 2.2.7. Enraizamiento in vivo. 55 2.2.7.1. Tratamientos con auxinas diluidas en polvo inerte. 55 2.2.7.1.1. Tratamiento con mezclas de IBA y NAA (preparado comercial). 55 2.2.7.1.2. Tratamientos con IBA. 57 2.2.7.2. Tratamientos con auxinas en solucién acuosa. 58 2.2.7.3. Influencia de la composicién del Gltimo medio de cultivo anterior al enraizamiento. 58 2.2.7.3.1. Influencia del incremento de la sacarosa y descenso de la citoquinina en el medio de cultivo. 58 2.2.7.3.2. Influencia del medio de cultivo sélido con incremento de sacarosa. 61 2.2.7,.3.3. Influencia del medio de cultivo liquido con incremento de sacarosa sobre medio de cultivo sélido. 612.3. Resultados. 63 2.3.1. Enraizamiento in vitro. 63 2.3.1.1. Enraizamiento in vitro con distintos medios de cultivo. 63 2.3.1.2. Enraizamiento in vitro con aplicacién de auxinas en la zona basal de los brotes. 65 2.3.1.2.1. Auxinas en polvo. 65 2.3.1.2.2. Auxinas en solucién acuosa. 66 2.3.2. Enraizamiento in vivo. 68 2.3.2.1. Aplicacién de auxinas diluidas en polvo inerte. 68 2.3.2.1.1. Aplicacién de mezclas de IBA y ANA (preparado comercial) a diferentes concentraciones. 68 2.3.2.1.2. Aplicacién de IBA diluido en polvo inerte a diferentes concentraciones. 69 2.3.2.2. Aplicacién de TBA en solucién acuosa. 74 2.3.2.3. Influencia de la composicién del medio de cultivo anterior al enraizamiento. 83 2.3.2.3.1, Influencia del incremento de la concentracién de sacarosa y de la disminucién de la de citoquinina (BAP) en el de medio de cultivo. 83 2.3.2.3.2. Influencia del medio de cultivo sélido con incremento de sacarosa. 86 2.3.2.3.2. Influencia de la adicién de medio de cultivo Liquide con alta concentracién de sacarosa sobre medio de cultivo sélido (doble fase). 86 3. Discusién general. 89 4. Conclusiones. 95 5. Bibliografia. 96INTRODUCCIONENERALIDADES DEL CULTIVO IN VITRO 1.1.1. INTRODUCCION HISTORICA Se citan a continuacién algunos de los hechos y fechas més destacables dentro de la historia del cultivo in vitro: En 1838, Schwann y Schleiden lanzaron la teoria de la totipotencia, la cual establece que las células son autosuficientes y que, en principio, son capaces de regenerar una planta completa. Esta teorfia fue el niicleo del que nacié la idea.del cultive de tejidos y células. En 1902, el aleman G. Haberlandt, fue el primero que intenté, aungue sin éxito, establecer el primer cultivo de células vegetales con la intencién de estudiar la morfogénesis y de demostrar la totipotencia de las células vegetales. Sin embargo, entre 1907 y 1909, Harrison, Burrows y Carrel consiguieron cultivar in vitro tejido animal y humano. Aunque algunos investigadores habian conseguido previamente cultivo in vitro de semillas de orquidea (plantulas), embriones y érganos de plantas, fue en 1934 cuando J.P. White consiguié por primera vez un cultivo indefinido de raices de tomatera. Posteriormente, en 1939, aparecen de forma independiente los primeros resultados de cultivo de tejidos indiferenciados en zanahoria realizados por Gautheret y Nobecourt, y en tabaco por White. Después de la 2@ Guerra Mundial, el desarrollo en este campo ha sido especialmente rapido, obteniéndose resultados muy importantes para la ciencia. E1 cultivo de tejidos vegetales quedé algo rezagado con respecto al cultivo de tejidos animales y humanos, debido al tardio descubrimiento de las hormonas vegetales (reguladores de crecimiento). Hacia los afios 30, fue descubierto el primer regulador de crecimiento, la auxina IAA (4cido indolacético), pero no fue hasta 1955 cuando Miller et al., descubrieron la primera citoquinina conocida, llamada kinetina. Actualmente existendiferentes compuestos, tanto sintéticos como naturales, con actividad similar a la de estas hormonas. En 1946, Ball consiguié por primera vez desarrollar plantas completas de Lupinus y Tropaeolum a partir de yemas apicales. Con los trabajos que llevaron a cabo Morel y Martin (1952) consiguieron obtener plantas de dalia libres de virus, mediante cultivo de meristemos, y ello ha permitido la expansién de variedades libres de virosis conocidas de un amplio nimero de especies de importancia econémica. Skoog y Miller (1957) descubrieron 1a regulacién de la formacién de érganos (raices o yemas), variando la proporcién de citoquinina/auxina. Demostraron que la diferenciacién de brotes 6 raices en cultivos de callos de tabaco estaba en funcién de la relacién de estas dos hormonas en el medio. Esto dio lugar al concepto de regulacién hormonal del crecimiento. En 1960, Kanta llevé a cabo la primera fertilizacién con éxito en tubo de ensayo, realizada en Papaver rhoeas. Esta técnica de fertilizacién in vitro incluye el cultivo de évulos escindidos y granos de polen en el mismo medio, de forma que cuando el polen germina fecunda a los évulos. De esta manera se puede superar la incompatibilidad sexual que se da a nivel de estigma o estilo. Ese mismo afio, Morel aplica la técnica de cultivo de meristemos para la propagacién vegetativa de orquideas, aplicdndose desde entonces este método de propagacién a un gran niimero de especies, tanto ornamentales como frutales. Murashige y Skoog presentaron en 1962, una nueva formulacién de un medio nutritivo, con altos niveles de sales minerales, convirtiéndose en un medio muy difundido y ampliamente utilizado con éxito en una extensa gama de plantas. Dos afios més tarde, en 1964, Guha y Maheshwari obtuvieron plantas haploides a partir de granos de polen de Datura innoxia por cultivo de anteras inmaduras. Posteriormente, Bourgin y Nitsch, en 1967 demostraron la totipotencia de los granos de polen al obtener, a partir de estos, plantas haploides de tabaco. Mediante estatécnica se han obtenido nuevas variedades de arroz, tabaco y trigo. En 1970, Power et al., consiguen la primera fusién de protoplastos, y un afio més tarde, Takebe et al. consiguen las primeras plantas regeneradas a partir de protoplastos. Baséndose en estas demostraciones, Carlson et al., produjeron en 1972 el primer hibrido interespecifico entre dos especies de Nicotiana (Nicotiana glauca y Nicotiana langsdorfii). Desde entonces hasta 1a hoy, han tenido lugar enormes avances y ha aumentado mucho el ndmero de investigaciones en el érea de cultivo in vitro, incrementéndose con toda seguridad en el futuro, debido a la gran utilidad como herramienta que el cultivo de tejidos brinda a los agrénomos, mejoradores, bot4nicos, fisidlogos, biédlogos moleculares, bioquimicos, fitopatélogos, y otros. Esto se debe, a que en un principio el cultivo de tejidos vegetales comenzé con el fin de comprender el crecimiento y desarrollo de los vegetales, pero se ha demostrado su gran valor como ayuda a la propagacién de plantas, mantenimiento de plantas sanas, conservacién de germoplasma, mejora vegetal,etc. 1.1.2. DEFINICION Y CARACTERIZACION DEL CULTIVO IN VITRO. El cultivo in vitro es una técnica que consiste en el aislamiento de diversas estructuras mas o menos diferenciadas de un vegetal (semillas, embriones, 6rganos, tejidos, células o protoplastos) y su posterior desarrollo en determinadas condiciones asépticas, nutritivas y ambientales. Cuando utilicemos el término explanto (porcién de tejido escindida, u é6rgano tomado de la planta para iniciar un cultivo) nos referiremos en general, a cualquiera de las estructuras citadas anteriormente. Estas técnicas se caracterizan porque: 1. Ocurren a micro - escala, sobre una superficie relativamente pequefia. 2. Se optimizan las condiciones ambientales, en lo que se refiere 3a los factores ambientales, nutritivos y hormonales. 3, Se establecen cultivos asépticos, excluyéndose todos los microorganismos (hongos, bacterias y virus), asi como también las plagas de las plantas. 4. Generalmente no se reproduce el patrén normal de desarrollo de una planta, resultando que un tejido aislado puede dar origen a un callo, 6 a otras formas poco usuales (por ejemplo, formacién de érganos y embriogénesis somtica ). 5. La capacidad de cultivar protoplastos 6 células individuales permite manipulaciones que antes eran imposibles (fusién de protoplastos, hibridos som&ticos interespecificos, etc.) El cultivo in vitro de plantas superiores puede dividirse en varios tipos: - Cultivo de embriones. - Cultivo de semillas. - Cultivo de meristemos. - Cultivo de microsporas y anteras. - Cultivo de protoplastos. = Cultivo de células aisladas, callos, explantos y 4pices de tallo caulinares. 1.1.3. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA MICROPROPAGACION. La propagacién in vitro, también llamada micropropagacién, ha producido resultados de enorme importancia para la agricultura, horticultura y silvicultura, pues presenta las siguientes ventajas: 1. La multiplicacién in vitro es més répida que la tradicional ) 2. A veces es posible propagar especies in vitro que presentan (por semilla, esqueje, divisién, acodo gran dificultad para ser multiplicadas in vivo; esto es posible en muchos casos debido al fenémeno del rejuvenecimiento, que es relativamente f4cil de realizar in vitro. 3. El crecimiento de las plantas propagadas in vitro es frecuentemente m4s vigoroso que el de las clonadas in vivo; esto sedebe sobre todo al rejuvenecimiento y/é al hecho de que las plantas in vitro se puedan mantener libres de enfermedades. 4, Utilizando el cultivo in vitro es posible, en principio, conseguir una multiplicacién libre de enfermedades, bien por una rigurosa seleccién del material inicial, 6 bien liberando el material inicial de enfermedades. 5. ¥a que se necesita una cantidad de material relativamente pequefia para iniciar un cultivo in vitro, se puede hacer una cuidadosa seleccién del mismo antes de iniciar el cultivo. 6. La propagacién in vitro puede suponer elevados ahorros en combustible, espacios de invernaderos, superficie de viveros, etc. 7. Debido a 1a existencia de condiciones perfectamente controladas (factores nutritivos y factores ambientales), que permiten una gran precisién en el calendario de la produccién de esquejes, se puede eliminar el efecto estacional y conseguir una produccién homogénea a lo largo del afio. 8. La propagacién in vitro implica que las plantas son cultivadas con su propio sistema radicular, haciendo por tanto posible la obtencién de plantas autoenraizadas. Sin embargo, el clonado in vitro presenta también una serie de inconvenientes, como son: 1. En algunos métodos de propagacién in vitro (cultivo de protoplasts, cultivo de células en suspensién, formacién de v&stagos adventicios, cultivo de callos), la estabilidad genética es débil y existe el riesgo de que se produzcan mutaciones y variaciones genéticas. 2. A veces, las plantas micropropagadas muestran caracteristicas poco convenientes in vitro, como es el paso total a la fase juvenil. 3. Posible pérdida de 1a capacidad de regeneracién por cultivo de callos o de células en suspensién repetidos. 4. La induccién de raices es, en ciertos casos, my dificil de conseguir en algunas especies lefiosas. 5. La dificultad de conseguir la transferencia de algunas 5plantas de las condiciones in vitro al suelo. 6. El aislamiento estéril del material vegetal es, en algunos casos, muy dificil de conseguir. 7 Los precios relativamente altos que alcanzan las plantas micropropagadas, debido importante mano de obra que exige el clonado vitro. 1.1.4. FASES DE LA MICROPROPAGACION. El proceso de la micropropagacién puede dividirse en diferentes fases (Murashige, 1974; Debergh y Maene, 1981): Fase 0: Preparacién de la planta madre bajo condiciones higiénicas. Comprende aquellas operaciones que realizamos a las plantas madres antes de comenzar el cultivo in vitro, para mantenerlas, dentro de lo posible, libres de ‘enfermedades (permanencia de las plantas en invernaderos, eliminando de éstos los insectos y dem4s plagas, riego de la maceta evitando mojar la planta, prevencién de enfermedades, etc.). Fase 1: Establecimiento de cultivos asépticos. En esta fase tiene lugar el aislamiento estéril del material vegetal que vamos a introducir en cultivo. Se lleva a cabo la desinfeccién de dicho material con el fin de establecer un cultivo aséptico y obtener asi, un crecimiento y desarrollo libre de contaminaciones. Fase 2: Multiplicacién de los propaégulos. Es la fase de multiplicacién, cuyo primer objetivo es conseguir la propagacién sin perder la estabilidad genética. Existen diferentes formas de realizar esta propagacién, como son la técnica de explantos nodales y el método de yemas axilares. Fase 3: Preparacién para trasplante a suelo. En esta fase se preparan los vaéstagos y plantas para ser transferidos al suelo. Para ello se inicia la elongacién de los brotes obtenidos en la fase 2, frenando adems la formacién de brotes axilares. A continuacién se induce la formacién de raices, ya sea in vitro 6 posteriormente inFase 4: Trasplante y aclimatacién. Comprende la transferencia a suelo de las plantulas obtenidas in vitro, y su aclimatacién a las nuevas condiciones ambientales. 1.1.5. ESTABLECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE CONDICIONES ASEPTICAS. El establecimiento y mantenimiento de condiciones asépticas durante todo el proceso del cultivo es absolutamente necesario para evitar la contaminacién de éste con hongos, bacterias u otros microorganismos (figuras 3 y 4). Por ello seré necesario la esterilizacién del material vegetal, del medio de cultivo y de todo e1 instrumental empleado en el manejo de los explantos. La esterilizacién del vegetal es una operacién muy importante, pues de ella depende en gran medida el éxito de las siembras realizadas. Es ésta una operacién muy delicada puesto que algunos éxrganos vegetales son my dificiles de esterilizar sin que resulten dafiados. Para dicha esterilizacién, se sumerge el explanto en una solucién desinfectante, siendo la m4s utilizada la compuesta de hipoclorite c&lcico o sédico diluido en agua, a la que se le afiade alguna sustancia detergente, como tween 20 u 80. A veces ha sido previamente sumergido en etanol al 70%. Después de haber sido sometido a la solucién desinfectante durante un tiempo determinado, se realizan varios aclarados con agua destilada estéril. una vez realizado este proceso de esterilizacién se procede a xealizar la siembra, que consiste en aislar el explanto e introducirlo en un medio nutritivo, también estéril. La preparacién y separacién de los explantos se realiza sobre placas de vidrio o sobre papel de filtro estériles, dentro de la cabina de flujo laminar (figura 1). En esta cabina el aire del exterior se hace pasar a través de una serie de filtros de poro muy fino, pasando finalmente por una rejilla distribuidora que envia el aire estéril en régimen laminar horizontal, de manera que el flujo del aire sobre la mesa de la cabina es completamente estéril, al tratarse de un flujo de aire continuo. Dicho flujo puede ser regulado, y en la 7flujo de aire continuo. Dicho flujo puede ser regulado, y en la parte superior de la cabina se colocan tubos fluorescentes para su iluminacién, disponiendo también de lamparas de luz ultravioleta como medio de esterilizacién. El instrumental utilizado para el manejo de los explantos en la siembra y en la realizacién de los posteriores repicados (pinzas, pisturies, etc.), se esteriliza previamente a su uso, bien por inmersién en alcohol y posterior flameado, o bien introduciéndolo durante unos segundos en el interior de un aparato que contiene pequefias bolitas de vidrio a alta temperatura (250 °C). Estos instrumentos deben dejarse enfriar antes de su uso. En cuanto a la esterilizacién de los medios nutritivos, la mayoria se esterilizan en autoclave (figura 2), aparato que esteriliza por medio de vapor a presién. Hay que tener en cuenta varios parémetros, como son el tiempo de esterilizacién, la presién y la temperatura alcanzada dentro del autoclave, y el volumen del objeto a esterilizar. En ciertas ocasiones, la esterilizacién de liquidos (soluciones, medios liquidos, etc.) se realiza por filtracién, haciendo pasar a éstos a través de un filtro de membrana, el cual xetiene todos los microorganismos y virus que sean mayores que el correspondiente poro del filtro. Este método se usa, sobre todo, en el caso de que dichos liquidos contengan sustancias termolabiles. 1.1.6. COMPOSICIGN DE LOS MEDIOS NUTRITIVOS. Los medios nutritivos sirven a la vez de alimento y soporte al material vegetal en cultivo. La composicién de los mismos depende del tipo de tejido cultivado, pero todos ello estén constituidos por una serie de nutrientes (agua, macro y micro elementos, azticares y aminodécides) y de ciertas sustancias orgdénicas, como son los reguladores y las vitaminas. A la hora de fijar las caracteristicas y propiedades del medio nutritivo es necesario controlar la pureza de estos componentes para evitar la variabilidad de dicho medio.Figura 2 Figura 1: Cabina de flujo laminar, donde se llevan a cabo una serie de operaciones sobre el material vegetal en cultivo, que reguieren condiciones asépticas (siembras, aislamiento y preparacién de los explantos, etc.) Figura 2: Autoclave, aparato utilizado para la esterilizacién de los medios nutritivos.Figura 3 Figura 4 Figuras 3 y 4: Contaminaciones producidas por hongos y bacterias en el medio de cultivo cuando no se cumplen las debidas condiciones asépticas.Figura 6 Figuras 5 y 6: Repicado de los cultivos para la separacion y preparacién de los brotes producidos por proliferacién durante el Gltimo subcultivo, para ser transferidos a un nuevo medio nutritivo. El instrumental utilizado para ello (pinzas y bisturis) se esterilizaron, en este caso, en un esterilizador de bolitas de vidrio (figura 6), para evitar posibles contaminacionesAGUA. Constituye el 95 % del medio nutritivo, y por ello debe prestarse mucha atencién a su calidad. Se debe utilizar agua destilada, 6 bidestilada en el caso de trabajar con protoplastos, células 6 meristemos. AGAR. Es un derivado de un alga marina, que se usa para gelificar la mayoria de los medios nutritivos. Durante la elaboracién de este producto natural, se lava y purifica para que no contenga materiales téxicos. Posiblemente es el componente més caro de los medios nutritivos s6lidos. El agar se disuelve con la aplicacién de calor, formando un gel capaz de retener el agua y adsorber compuestos. A mayor concentracién de agar, mayor es la fuerza con la que el agua es retenida, y mAs dificil resulta para los explantos establecer contacto con el medio, limiténdose 1a absorcién de compuestos. La concentraci6n habitual para el agar es 0,6 - 0,8 % . Si la concentracién es menor (0,4), el medio nutritivo no solidifica, sobre todo si el pH es bajo. Si la concentracién es alta (1,0 %), el medio nutritivo queda muy s6lido, dificulténdose la inoculacién. Hay varios tipos de agar, y cuanto mayor es su calidad y su pureza, mejor gelifica. AZUCAR Es e1 componente del medio de cultivo que actiia como fuente de carbono y de energia, ya que los tejidos verdes no son suficientemente autétrofos en esas condiciones. Por lo tanto, es un componente esencial para el crecimiento y desarrollo in vitro. Habitualmente se usa sacarosa, a una concentracién entre el 1 11yel 5%. Generalmente el crecimiento y desarrollo aumenta con la concentracién de aziicar hasta alcanzarse un 6ptimo, y disminuye después para altas concentraciones. NUTRIENTES MINERALES Las sales minerales constituyen, después de los azticares, el grupo més importante de sustancias nutritivas en el cultivo vitro. Las distintas combinaciones de macro y micro nutrientes, su concentracién y la presencia o ausencia de determinados iones, dan lugar a una gran cantidad de medios nutritivos diferentes, de los que elegixemos uno u otro dependiendo del tipo de planta con la que trabajemos y de lo que pretendamos realizar con ella (multiplicacién, elongacién, enraizamiento). Asi, por ejemplo, el medio Murashige y Skoog (1962),(MS), es de uso casi general, aunque hay que sefialar que su contenido en sales es muy elevado. Por ello, para algunas especies lefiosas sensibles a la salinidad se puede utilizar un medio desarrollado por Lloyd y McCown (1980), llamado woody plant medium (WPM). A continuacién se presenta el contenido de sales minerales, en mg.1-!, de los dos medios citados: 12Macronutrientes MS (mg.17!) WPM (mg.17}) KNO3 1900 ---- NHyNO3 1650 400 KH PO, 170 170 CaClz.2H,0 440 96 MgSO4.7H20 370 370 Ca(NO3)2.4H20 556 K 2804 990 Micronutrientes FeS0,. 7,0 27,80 27,80 Na,EDTA 37,30 37,30 MnSOq.H20 16,90 16,90 ZnS04.7H,0 8,60 8,60 H3BO3 6,20 6,20 KI 0,83 CuSO, 5120 0,025 0,25 NazMo0,.2H20 0,25 0,25 CoCl,. 6H,0 0,025 En cuanto a las diferencias entre ambos, hay que destacar el menor contenido en sales del medio WPM, especialmente del ién amonio NH, la ausencia de iodo y cobalto, y un contenido en cobre diez veces superior al del medio MS. BH La influencia del pH del medio nutritivo en el cultivo in vitro es todavia poco conocido. 13Se trabaja con un rango de pli de 5,0 - 6,5. Un pH menor de 4,5 © mayor que 7, generalmente frena el crecimiento y desarrollo in vitro. Un correcto pH asegura la solubilidad y disponibilidad de los distintos iones en el medio de cultivo evitando la precipitacion de algunos de ellos. Cuando el pH es demasiado bajo puede ocurrir lo siguiente (Butenko, 1968): - Desciende la estabilidad de ciertos compuestos, como son la auxina IAA (&cido 3-indolacético), el Acido giberélico, la tiamina y el Acido pantoténico. - El agar no solidifica bien y pierde su rigidez. - Se retarda la absorcién de iones amonio. Durante la preparacién del medio, si el pH queda por debajo 6 por encima del valor que deseamos, lo corregiremos con NaOH 6 HCl. VITAMINAS Aunque la mayor parte de las plantas son capaces de sintetizar vitaminas in vitro, algunas de ellas es necesario afiadirlas al medio de cultivo, debido quizés al pequefio tamaiio de los tejidos. Entre ellas se encuentran las siguientes: Tiamina, inositol (ambas esenciales en el cultivo in vitro), 4cido nicotinico, piridoxina, Acido pantoténico, Acido f6lico, riboflavina, 4cido ascérbico, biotina, acido para-aminobenzoico y tocoferol. En ciertas ocasiones algunas de estas sustancias son afiadidas al medio de cultivo para que cumplan otra funcién distinta a la vitaminica. Asi, por ejemplo, a veces se afiaden altas concentraciones de Acido ascérbico para que actiie como antioxidante. Hay que sefialar que el inositol desempefia una doble funcién, al actuar como vitamina y como azticar. 14AMINOACIDOS En cultivo in vitro se emplean aminoécidos como nutrientes orgénicos, aunque se afiaden sélo alguno de ellos. El m&s comin es la glicina, aunque en algunos casos también se afiaden otros, como son L-cisteina, L-asparagina y L-glutamina. REGULADORES Las hormonas son compuestos orgénicos sintetizados por las plantas, que influyen en el crecimiento y desarrollo; generalmente, actéian en lugar diferente a donde son producidas y se encuentran presentes y activas en muy pequefias cantidades. Se han desarrollado productos sintéticos que pueden tener una actividad semejante a la de las hormonas naturales. Al conjunto de los productos sintéticos y de las hormonas, se denomina reguladores de crecimiento, y son los responsables de la distribuc. n de los compuestos que la planta biosintetiza, determinando ademds, el crecimiento relativo de todos los érganos de 1a planta. En cultivo in vitro, los reguladores de crecimiento tienen mucha importancia, sobre todo las auxinas y las citoquininas. La adicién 6 no de un tipo u-otro de regulador depende del tipo de explanto y de 1a especie vegetal. - Auxinas. Se afiaden en la mayoria de los medios nutritivos. El IAA (Acido 3-indolacético) se produce de forma natural en las plantas, mientras que el IBA (4cido 3-indolbutirico), NAA (Acido naftalenacético) y 2,4-D (Acido 2,4-diclorofenoxiacético), son auxinas sintéticas y relativamente més activas que el IAA. La accién de las auxinas es: elongacién celular y expansién de los tejidos, divisién celular (formacién de callo), y formacién de raices adventicias, inhibicién de la formacién de brotes axilares y adventicios, y frecuentemente embriogénesis en los cultivos en suspensién. 15~ Citoquininas. Dentro de este grupo , las més conocidas son la kinetina (furfurilaminopurina), BA (6-bencilaminopurina) y 2iP (6-(dimetilalilamino) purina). Generalmente, estimulan la divisién celular, sobre todo si van en compafiia de una auxina. En concentraciones elevadas (1-10 mg.1"), pueden inducir la formacién de brotes adventicios, aunque suelen inhibir la formacién de rafces. Las citoguininas disminuyen la dominancia apical, por lo que se ve favorecida la formacién de brotes axilares. Adem4s, retardan el envejecimiento. ~ Giberelinas. Suelen ser poco utilizadas en cultivo in vitro. La mAs conocida es el 4cido giberélico (GA). Las giberelinas inducen la elongacién de los entrenudos y el crecimiento de los meristemos 6 yemas in vitro. Pueden romper la dormicién de embriones aislados 6 yemas. Suelen inhibir la formacién de raices adventicias, y de vastagos adventicios. Otros reguladores conocides son el Acido abscisico (ABA), que produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, y el etileno, hormona gaseosa producida por la propia planta, y de cuya influencia en la organogénesis in vitro no existe unanimidad de criterios (Huxter, 1981). 1.1.7. REPICADOS. El cultivo.in vitro del material vegetal se realiza en varias fases. La primera de ellas es la siembra del material, que consiste en aislar un explanto, esterilizarlo y situarlo en un medio de cultivo adecuado para que estimular su crecimiento y desarrollo. Transcurrido cierto tiempo, se aislan del explanto original las nuevas proliferaciones que haya creado y se transfieren a un nuevo medio de cultivo. A este operacién se le denomina repicado (figuras 5 y 6). Estos nuevos explantos repicados se volverén a desarrollar, siendo necesario volver a repetir la misma operacién al cabo de 16cierto tiempo, obteniendo de esta manera un cultivo continuado de tejidos y 6rganos vegetales (figuras 7 y 8). El repicado se realiza en las mismas condiciones de asepsia que la siembra, de la que ya se ha tratado en el apartado 1.1.5. Son varias las razones por las que es necesario realizar el repicado, siendo las més importante: - El agotamiento de los nutrientes que componen el medio de nutritivo, debido a que son consumidos por el material vegetal en cultivo. - Alteracién de las concentraciones de los nutrientes, debido a la pérdida de agua del medio conforme transcurre el tiempo. ~ Aparicién de metabolitos de deshecho, debido a que los tejidos vegetales producen a veces sustancias téxicas que se difunden en el medio, formando un exudado de color oscuro. - Necesidad de obtener répidamente material para propagar. 17F: gura 7 y 8: Frasco de cultivo antes y después de ser repicado, Los brotes que han alcanzado una determinada longitud se preparan para ser enraizados in © in vivo, mientras que el xesto se mantienen en cultivo, produc ndose la proliferacién y el crecimiento de nuevos brotes.1.1.8. CONDICIONES AMBIENTALES DEL CULTIVO. El ambiente de cultivo viene determinado principalmente por tres factores, que influyen directamente en el crecimiento y desarrollo de los explantos. Estos tres factores son la temperatura, la luz y la humedad, los cuales pueden ser controlados en la cémara de cultivo (figura 9), lugar donde se almacena el material vegetal en cultivo. La iluminacién, en dicha cdmara, suele ser suministrada por tubos fluorescentes, y la temperatura deseada se consigue mediante elementos refrigeradores y calefactores. La influencia de la luz en el cultivo in vitro es muy compleja, pues intervienen el fotoperiodo, la irradiancia y la composicién espectral. En cuanto al fotoperiodo, el caso mas general es el de 16 horas de luz, aunque en algunos casos se usa luz continua. Las irradiancias altas suelen ser dafinas para los cultivos in vitro Normalmente suele ser suficiente una intensidad de 2000 lux. En cuanto a la temperatura, generalmente se mantiene constante entre 24 y 26 °C, aunque estos valores varian en el casos de algunas especies o para que se produzcan determinados procesos especiales (formacién de yemas florales, germinacion de semillas, etc. En cuanto a la humedad, es un factor que no exige un riguroso control en 1a cémara, ya que los cultivos se encuentran sometidos a la existente en el interior de los frascos de cultivo. Por lo tanto, la humedad de la camara es posible que sélo influya en la pérdida de agua desde los frascos al ambiente.Sin embargo, una elevada humedad en la cAmara produce mayor nimero de contaminaciones. Los valores de temperatura pueden ser registrados por un termégrafo (figura 10), pudiendo asi visualizar las oscilaciones sufridas por este parémetro y el momento en que se producen. 19Figura 10 Figura 9: Vista parcial de la cémara de cultivo, donde se controlan la luz y la temperatura, de manera que permanezcan dentro de unos valores éptimos para el crecimiento y desarrollo del material en cultivo Figura 10: Termégrafo y termémetro, para registrar y medir la temperatura en el interior de la camara de cultivo y sus posibles variaciones.2. JUSTIFICACION DEL PRESENTE TRABAJ( El objetivo de éste trabajo es encontrar un método eficaz de enraizamiento in vivo de brotes micropropagados. Es decir, inducir y provocar la formacién de raices una vez que los brotes obtenidos mediante cultivo in vitro son colocados en un substrato en condiciones ex vitro. Son bien conocides los altos porcentajes de enraizamiento que se consiguen in vitro con determinadas especies de plantas cuando se ponen éstas en un medio de cultivo adecuado, inductor de la rizogénesis. Sin embargo, el enraizamiento in vitro resulta relativamente caro, con lo cual, la obtencién directa de esquejes enraizados in vivo es especialmente importante. Las ventajas que ello supone so1 -Ahorro de tiempo, trabajo y material, debido a que nos evitamos un subcultivo y el medio de cultivo de enraizamiento, conllevando todo ello un abaratamiento de costes. -Simplificacién y acortamiento del método, realizéndose la aclimatacién de las plantas de manera simulténea al enraizamiento. ~Comodidad y facilidad de trabajo, pues es mAs cémodo y mas rapido colocar en un substrato un brote sin raices que otro con raices. Con ésto se consigue una mayor eficiencia al desarrollar mas trabajo por unidad de tiempo. -Bl precio por planta disminuye, haciéndose asi, la multiplicacién in vitro, més asequible. El enraizamiento in vivo, llamado también enraizamiento directo, ha sido poco experimentado en especies frutales micropropagadas (Zimmerman, 1988) y tendria mucho interés investigar su respuesta a éste método alternativo de enraizamiento. En este trabajo se va estudiar el enraizamiento in vivo desde diferentes aspectos con el fin de determinar las mejores condiciones para producir raices adventicias en microestaquillas de tres patrones de frutales: - Estudio de la accién de auxinas diluidas en polvo. ai- Estudio de la accién, durante tiempos crecientes, de la auxina IBA en solucién acuosa. - Estudio de la accién del estado de las reservas nutritivas de las microestaquillas. 22CARACTERISTICAS DEL MATERIAL VEGETAL ESTUDTADO Se ha trabajado con los siguientes patrones frutales: “Bdafuel’ (Prunus _amygdalo - persica (West) Rehd] Es un hibrido interespecifico esponténeo de almendro y melocotonero, localizado en la localidad de Jarafuel (Valencia), en una prospeccién llevada a cabo en 1971. Es uno de los clones que destacé en un proceso selectivo entre otros 57 hibridos esponténeos y el testigo INRA Hibrido Almendxro x melocotonero GF677. Destacé en esta seleccién por su aptitud a la propagacién. En cuanto a su morfologia, ‘Adafuel' es un clon vigoroso y de porte semierguido. A pesar de su vigor tiene poca tendencia a la emisién de anticipados. Tiene las hojas de tipo almendro y el fruto es intermedio entre el del almendro y el del melocotonero. Sanitariamente, el patrén ‘Adafuel' esté libre de virus del grupo ILAR, CLSV, Sharka y dem4s virosis conocidas. En vivero, se muestra resistente a oidio del melocotonero (Sphaeroteca pannosa), roya de los frutales de hueso (Tranzschelia_pruni-spinosae) y cribado (Coryn Beijerinckii) (Cambra e Iturrioz, 1986). Es sensible a Agrobacterium tumefaciens y muy sensible a Meloidogyne spp. (Gomez et_al., 1989). ‘adafuel' se adapta bien a suelos sueltos y calizos, pero que tengan buen drenaje. Presenta buen comportamiento injertado con variedades de melocotonero y nectarina en vivero y vergel (Cambra y Iturrioz, 1986; Cambra 1990). ‘arbucias' Es otro patrén hibrido de almendro x melocotonero, que al igual que ‘Adafuel', destacé en el proceso de seleccién de estos hibridos 23espontdneos. ‘arbucias' presenta un vigor que puede situarse en el 60 % de ‘Adafuel', con predominio de caracteres morfolégicos de melocotonero, porte erguido y aptitud al enraizamiento aceptable, aunque menor que ‘Adafuel’ (Cambra, 1983), como se puede observar en este cuadro (Cambra, 1981) donde se muestran los porcentajes de enraizamiento de estaquillas lefiosas tratadas con 4000 ppm de acido indolbutirico: % Enraizamiento 1978-79 1979-80 1980-81 1981-82 ‘Arbucias' 55 67 68 72 ‘adafuel' 92 80 91 88 Inra GF 677 4 16 72 69 Uno de los problemas de enraizamiento de este patrén es la necrosis parcial que se presenta en la base de las estaquillas, produciéndose el debilitamiento de las mismas (Cambra, 1992; comunicacién personal). El patrén ‘Arbucias' todavia no ha sido registrado en el Registro de variedades Protegidas del Instituto Nacional de Semillas y Plantas de Vivero, por lo que ain no se le conoce en el mercado ni se sabe con seguridad el nombre con el que sera registrado. Care iticas os _hibridos ocotonero x Tanto 'Arbucias' como ‘Adafuel', por pertenecer ambos al mismo tipo de hibridos, presentan caracteristicas comunes, entre las que podemos citar las siguientes: 24melocotonero, debido a los inconvenientes que planteaba el sistema de propagacién mediante sierpes empleado en la zona de origen por facilitar la transmisién de enfermedades y virosis. Se buscaban clones que ademas de reunir las cualidades positivas del Pollizo tradicional lo mejorasen por su aptitud a la propagacién por estaquilla lefiosa, la planta madre tuviera unas buenas caracteristicas para la produccién de estaquillas y que tuviera un buen estado sanitario. De esta seleccién, el clon que tuvo el mejor comportamiento fue ‘Puebla de Soto AD 101', localizado en la poblacién de ‘Puebla de Soto AD 101' (Murcia) (Cambra, 1970, 1979b). ‘Puebla de Soto AD 101' pertenece al grupo de los ciruelos llamados por Bernhard y Graselly (1958) de crecimiento lento. Sanitariamente, se encuentra libre de las virosis TLAR, CLSV, y Sharka (Cambra et _al., 1980,1981; Marenaud y Bautista, 1981). Presenta un vigor medio, algo menor que "Brompton" y un poco mayor que "San Julian A". Su porte es semierguido. Tiene hojas de ciruelo europeo de crecimiento lento. La maduracién del fruto tiene lugar a finales de julio, casi un mes antes que en otros ciruelos de crecimiento lento usados como patrones para melocotoneros (Moreno, 1989). Los resultados del estaquillado lefioso (Cambra, 1983) con estaquillas de 50 cms. de longitud y la aplicacién basal de IBA a 4000 ppm., fueron; % Enraizamiento 1979-80 1980-81 1981-82 "Puebla de Soto AD 101' 64 55 47 Como puede observarse, este patrén no propaga demasiado bien por estaquilla lefiosa, mientras que con la propagacién in vitro se obtienen unos porcentajes muy altos de enraizamiento. 261.4. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL ENRAIZAMIENTO IN VIVO 1.4.1. Condiciones ambientales. a) Humedad. En las microestaquillas puestas a enraizar de forma directa, el transporte de agua desde el substrato hacia las hojas esta interrumpido al carecer de raices. Sin embargo, las hojas siguen transpirando, por lo que hay que reducir la transpiracién para que la planta no muera por desecacién. Para ello, las microestaquillas deben permanecer en un ambiente con alta humedad relativa, hasta que formen y desarrollen sus raices, momento a partir del cual se debe comenzar a aclimatar las plantas a ambientes mas secos. b) Temperatura. Una temperatura diurna de 21 a 27 °C, y una nocturna minima alrededor de los 15 °C, son suficientes para el enraizamiento de los brotes de la mayor parte de las especies. Si la temperatura ambiental es demasiado elevada respecto a la del substrato habré una tendencia al desarrollo de las yemas antes que el de las raices, con la consecuente pérdida de agua por las hojas y gasto de reservas, que conduciré a la muerte de la microestaquilla. Por ello es deseable que se desarrollen antes las raices a que broten las yemas, La formacién de raices adventicias es estimulada generalmente por temperaturas relativamente altas, por lo cual la aplicacién de calor de fondo en la base de las microestaquillas deberé favorecer en teorfa el enraizamiento directo, pues la temperatura afecta sélo a la parte que nos interesa. ¢) Luz. Este parémetro tiene gran importancia, pues es la fuente de energia para la fotosintesis. 27Tanto la intensidad luminica, como su duracién, deberaén de ser suficientes para que la formacién de carbohidratos sobrepase los que se gastaran en la respiracién. La luz, generalmente tiene un efecto inhibidor sobre la formacién de raices, pero esto no afecta al enraizamiento in vivo, pues la parte basal, que es la parte donde se forman las rafces, no est4 expuesta a ella, al estar introducida en el substrate opaco. 1.4.2, Tratamientos hormonales: _Tipos _de _auxina concentraciones empleadas La finalidad de tratar las microestaquillas con hormonas inductoras de la rizogénesis es la de estimular el enraizamiento, incrementéndose el porcentaje de microestaquillas enraizadas, asi como el nimero y la calidad de las rafces, obteniéndose como resultado un enraizamiento més uniforme. Entre las auxinas sintéticas que se ha encontrado que estimulan la produccién de raices adventicias en esquejes, destacan el IBA y el NAA. Generalmente se utiliza el IBA, pues no es téxica en un margen mAs amplio de concentraciones, y es més efectiva para un gran nimero de especies. Asi, el IBA ha sido utilizada por diversos autores (McClelland et al, 1990, solucién de isopropanol-70%— 1mM; Rogers y Smith, 1992, 0.1% en polvo comercial; Simmonds, 1983, 0.3% en polvo comercial; Webster y Jones, 1989, 0.2% en polvo; Zimmerman y Fordham, 1985, 1,5 uM en solucién acuosa de sacarosa ~43,8 mM-), mientras que el NAA ha sido utilizado por Fabbri-Malavasi y Predieri (1988) a 25 mg.17, y Lakso et al (1986) a 4 pM en solucién acuosa. En el enraizamiento directo, estas hormonas pueden utilizarse diluidas en polvo inerte o bien en solucién con agua u otros disolventes, a concentraciones mayores o menores segin las caracteristicas y el tiempo de tratamiento del material a tratar. Se aplican sumergiendo la base de la microestaquilla en estas disoluciones durante un tiempo determinado. Otras técnicas descritas ineluyen: disolucién de IBA 1 mM en alcohol isopropilico (70%) 28(McClelland et _al, 1990); incubacién en solucién de sacarosa (43,8 mM) con 1,5 pM de IBA durante 3 a 7 dias; inyeccién de 25 mg.17 de NAA directamente en el substrato donde se iban a plantar las microestaquillas (Fabbri-Malavasi y Predieri, 1988); © haciendo flotar las microestaquillas en una solucién acuosa de NAA 4pM durante 1-2 h (Lakso et al, 1986). 3. Substrato Las principales funciones que tiene un substrato son las de mantener la posicién de las microestaquillas durante el pericdo de enraizamiento, y la de proporcionar la humedad y la aireaci6n necesarias en la base de los brotes, que permitan el buen funcionamiento de las raices. Asi pues, un buen substrato debera ser poroso, tener una alta capacidad de retencién de agua y presentar un buen drenaje. Este tipo de brotes es muy susceptible a las infecciones, por lo que es muy importante para el enraizamiento que el substrato esté exento de hongos y bacterias Para el enraizamiento de las plantas procedentes del cultivo in vitro, es recomendable la utilizacién de una turba de buena calidad, mezclada o no con perlita , vermiculita, etc., o bien la utilizacién de un substrato artificial (fibra de vidrio, lana de xoca, etc.) 1.4.4. Factores genéticos La capacidad de regeneracién de las plantas varia entre las distintas especies. Las plantas herbéceas regeneran con mucha mayor facilidad que los Arboles y arbustos. Incluso dentro de una misma especie, se ha observado que hay variedades que enraizan muy fAcilmente frente a otras que lo hacen con dificultad. 29L Reservas La rizogénesis se ve favorecida en aquellos esquejes que presentan un buen reservorio de carbohidratos, en particular de glicidos. Por ello, los explantos mayores son a veces mas fciles de enraizar que los més pequefios, debido quizés, a que posean una mayor cantidad de reservas. d_de_la planta madre Los esquejes procedentes de plantas jévenes presentan una mejor aptitud para el enraizamiento que los procedentes de las planius adultas. Esta caracteristica se observa en muchas lefiosas, y por eso en muchos casos es interesante la propagacién in vitro, pues permite obtener material de caracteres juveniles (rejuvenecimiento), y por tanto apto para el enraizamiento a partir de material adulto. Lesiones Fue Beakbane, en 1961, quien se percaté de que las heridas estimulaban el enraizamiento de las plantas. Este hecho fue demostrado en Rhododendron cultivado in vitro por Pierik y Steegmans (1975), y posteriormente por Snir y Erez (1980) en patrones de manzano. 1 Suministro de oxigeno El suministro de oxigeno es otro factor a considerar en la formacién de raices adventicias. En los medios con agar el suministro de oxigeno se encuentra limitado, y las raices que se forman poseen generalmente los pelos radicales muy poco desarrollados, debido precisamente a esta falta de oxigeno. Esta es la razén por la que las microestaquillas de algunas especies enraizan mejor in vivo que in vitro. 30