SANDWICH ELISA PROTOCOL

sandwich elisa procedure. bring all reagents to room temperature prior to use. it is strongly recommended
that all standards and samples be run in duplicate. prior to use, dilute all buffers and antibodies to 1x
according to manufacturer instructions. plate coated overnight with umlabeled capture antibody and
blocked for 1 hour . or, begin with a : legend max pre-coated plate.

reagent prepation. reconstitute lyophilized standard. prepare standard dilutions. wash the plate 4x with
wash buffer. add 50ul of assay buffer to each well.

antigen capture. add 50 ul of standard dilutions or samples to appropriate wells. seal the plate with a plate
sealer. incubate at room temperature for 2 h while shaking at 200rpm. discard the contents of the plate.
wash four times with 1x wash buffer.

antigen detection. add 100 ul biotinylatea detection antibody to each well. seal the plate and incubate at
room temperature for 1 h while shaking. discard the contents of the plate. wash four tomes with 1x wash
buffer. add 100ul Avidin-HRP solution to each well. seal the plate and incubate at room temperature for
30 min while shaking. discard the contents of the plate. wash five tomes with 1x wash buffer. note : for
this final wash soak well in ash buffer for 30-60s for each wash to minimize background.

chromogenic substrate development. add 100ul substrate solution to each well. incubate 10 min in the
dark. solutions will turn blue in color. add 100ul stop solution to each well. solution color will change
from blue to yellow. read absorbance at 450 nm immediately.

standard curve and TNF concentration

prosedur sandwich elisa. bawa semua reagen ke suhu kamar sebelum digunakan. sangat disarankan agar

semua standar dan sampel dijalankan dalam duplikat. sebelum digunakan, encerkan semua buffer dan

antibodi menjadi 1x sesuai dengan petunjuk pabrik. pelat dilapisi semalaman dengan antibodi penangkap

berlabel dan diblokir selama 1 jam. atau, mulailah dengan: legend max pelat pra-dilapisi.

persiapan reagen. menyusun kembali standar lyophilized. siapkan pengenceran standar. cuci piring 4x

dengan wash buffer. tambahkan 50ul buffer pengujian ke setiap sumur.

penangkapan antigen. tambahkan 50 ul pengenceran atau sampel standar ke sumur yang sesuai. tutup

pelat dengan penyegel pelat. inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam sambil diguncang pada 200rpm.

buang isi piringnya. cuci empat kali dengan 1x buffer cuci.

deteksi antigen. tambahkan 100 ul antibodi pendeteksi biotinylatea ke setiap lubang. tutup piring dan

inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam sambil diguncang. buang isi piringnya. cuci empat buku tebal

dengan 1x penyangga cuci. tambahkan solusi 100ul Avidin-HRP ke setiap sumur. tutup piring dan

inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit sambil diguncang. buang isi piringnya. cuci lima buku tebal

dengan 1x penyangga cuci. Catatan: untuk pencucian akhir ini rendam dengan baik dalam penyangga abu

selama 30-60 detik untuk setiap pencucian untuk meminimalkan latar belakang.

pengembangan substrat kromogenik. tambahkan larutan substrat 100ul ke setiap sumur. inkubasi 10 menit

dalam gelap. solusi akan berubah warna menjadi biru. tambahkan solusi 100ul stop ke setiap sumur.

warna larutan akan berubah dari biru menjadi kuning. baca segera absorbansi pada 450 nm.

kurva standar dan konsentrasi TNF

SANDWICH ELISA

- add 100ul coating buffer well (137 mM Nacl, 2.7 mM KCl, 8.1 Na2HPO4, 1,5mM KH2PO4).
Incubate at room temperature for 3 hours or 4C overnight. wash by 200ul 1X PBS once. ADD
200ul blocking buffer per well (5% Skim Milk in PBST (0.05 % Tween-20)). wash by 200ul 1X
PBS twice. prepare the analytes. add 100ul analyte to each well. wash by 200 1X PBS three
times. add 100ul detect antibody to each well. incubate at room temperature for 2 hours. wash by
200ul 1X PBS four times. add 80ul secondary antibody per well. incubate at room temperature
for 1 hour. wash by 200ul 1X PBS five times. add 150ul OPD per well. incubate at room
temperature for 15-30 minutes(according to the OPD manufacturer's recommedation) avoid light
exposure during incubation. turn on the ELISA reader and put plate into reader. read the plate at
OD450(OD490 for adding the stop solution)

- tambahkan 100ul coating buffer well (137 mM Nacl, 2.7 mM KCl, 8.1 Na2HPO4, 1,5mM

KH2PO4). Inkubasi pada suhu kamar selama 3 jam atau 4C semalaman. cuci dengan 200ul 1X

PBS sekali. TAMBAHKAN 200ul buffer pemblokiran per sumur (5% Susu Skim di PBST

(0,05% Tween-20)). cuci dengan 200ul 1X PBS dua kali. siapkan analit. tambahkan 100ul analit

ke setiap lubang. cuci dengan 200 1X PBS tiga kali. tambahkan antibodi deteksi 100ul ke setiap
 sumur. inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. cuci dengan 200ul 1X PBS empat kali.

tambahkan 80ul antibodi sekunder per sumur. inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. cuci

dengan 200ul 1X PBS lima kali. tambahkan 150ul OPD per sumur. inkubasi pada suhu kamar

selama 15-30 menit (sesuai dengan rekomendasi pabrikan OPD) hindari paparan cahaya selama

inkubasi. nyalakan alat pembaca ELISA dan taruh pelat ke alat pembaca. baca pelat di OD450

(OD490 untuk menambahkan solusi stop)

- Competitive ELISA.
coating 100ul of diluted antibody to each well. incubate at room temperature for 3hours or 4C
overnight. wash the plate by filling the wells with 200ul 0.3% PBST. blocking with 200ul 1%
BSA. Incubate at room temperature for 3 hours. wash the plate twice with PBST. Antibody is
incubated in the presence of its antigen. apply bound antibody/antigen complexes to coated well.
incubate at room temperature for 2 hours. wash the plate three times with PBST (The more
antigen in the sample, the less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence
"competition". add 100 of conjugated secondary antibody, diluted at the optimal concentration.
incubate at room temperature for 1 hour. wash the plate four times with PBST. Dispense 150ul of
the substrate (OPD, o-phenylenediamine dihydrochloride). after sufficient color development,
read the absorbance (450) with a ELISA reader.

- ELISA Kompetitif.

melapisi 100ul antibodi yang diencerkan ke masing-masing sumur. inkubasi pada suhu kamar

selama 3 jam atau 4C semalaman. cuci piring dengan mengisi sumur dengan 200ul 0,3% PBST.

memblokir dengan 200ul 1% BSA. Inkubasi pada suhu kamar selama 3 jam. cuci piring dua kali

dengan PBST. Antibodi diinkubasi dengan adanya antigennya. oleskan kompleks antibodi /

antigen terikat ke sumur terlapis. inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam. cuci piring tiga kali

dengan PBST (Semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat

mengikat antigen di dalam sumur, maka "persaingan". tambahkan 100 antibodi sekunder

terkonjugasi, encerkan pada konsentrasi optimal. inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. cuci

piring empat kali dengan PBST. Keluarkan 150ul substrat (OPD, o-phenylenediamine
dihydrochloride). setelah perkembangan warna yang cukup, baca absorbansi (450) dengan

pembaca ELISA.