PANORAMA » Caracteristicas basicas da replicacao de DNA in vivo > Replicacao de DNA em procariotos > Aspectos especificos da replicacao de cromossomos eucaridticos Gémeos monozigéticos | Eles sao idénticos? Desde que Merry © Sherry nasceram, as pessoas confundem as duas, e tem sido assim desde sua infancia e adolescéncia, até a vida adulta. Quando estdo separadas, muitas vezes Merry é cha- mada de Sherry e Sherry é confundida com Merry. Até mesmo os pois tém difculdade em cistingi-las. Mery e Shery so gémeas rmonocigotcas (idénticas"} ambas se desenvolveram 2 partir de tum dnico cit fertiizado. Em um estgjo inca da clivagem, © embrigo dviiu-se em duas massas de clus, cada grupo de cé- lulasdeu origer a um emrizo completo. Ambos os erbides de- senvolveram-se normalmente, e, em 7 de abril de 1955, nasceram 25 duas meninas, uma recebeu 0 nome Merry ea outa, Shey (Quatro duplas de gimeos com suas maes na low Stat Fair. Replicagdéo do DNA e dos Cromossomos 'As pessoas costumam explica 05 fentipos quase idénticos de sgémeos monozigéticos como Merry e Sherry dizendo que “eles {t8m os mesmas genes". claro que isso néo é verdade. Para set preciso, deve-se dizer que gémeos idénticos contém réplicas dos rmesmos genes parental. Mas esse cologuialismo simples sugere que a maioria das pessoas realmente acrecita que as réplicas de lum gene séo idénticas. Se o genoma humnano contém cerca de 20.500 genes, as réplicas de todos esses genes séo exatamente Jguais nos gérneos idénticos? ‘Avida humane origina-se de uma tnicacélula uma esfera dimi- ruta com didmetro aproximado de 0,1 mm. Essa célula dé origern ‘a centenas de bilhées de outras células durante o desenvolvimento fetal. Um ser humano adulto de tamanho médio tem cerca de 65 trilhées (65.000.000,000.000) de células. Com algunas excecées, cada uma dessascéluas contém uma ré- plica de todos os cerca de 20.500 genes. ‘Além disso, as células do corpo no s80 cestaticas; em alguns tecidos, as células antigas so continvamente substitufdas por novas ciulas. Por exemplo, as células da medula éssea de um individuo sau- vel produzer cerca de 2 milhdes de hhemacias por minuto, Embora nem todas as réplicas dos genes no corpo humnano sejam idérticas,o proceso de duplicacso desses genes € muito preciso. © geno- rma haploide humeno contém cerca de 3 X 10° pares de nucleotidios de DNA, ue s8o todos dupicados a cada divisio celular. Neste capitulo, examinaremos 0 mecanismo de replicagSo do DNA, des- tacando os mecanismos que garantem a fidelidade desse process.Caracteristicas basicas da replicacao de DNA in vivo ‘A replicagéo. de DNA é semiconservativa, inicia-se em origens tinicas e geralmente é bidirecional a partir de cada origem de replicacéo. Em seres humanos, a sintese de um novo filamento de DNA ocorre na proporcéo aproximada de 8.000 nucleo- ‘dios por minuto, Em bactérias, cerca de 30.000 nucleo- tidios so acrescentados por minuto a uma cadeia de DNA nascente. Sem divida, é essencial que o mecanismo celular responsavel pela replicacéo de DNA seja muito rapido, mas é ainda mais importante que seja muito pre- ciso, Na verdade, a fidelidade da replicacio de DNA é surpreendente, com uma média de apenas um erro por dilhio de nucleotidios incorporados depois da sintese © da correcao de erros durante e imediatamente apés a re- plicacio. Assim, a maioria dos genes de gémeos idénticos € realmente idéntica, mas alguns so modificados por erros de replicacio € outros tipos de mutagdes (Capitue Jo 13). Ja se conhece a maioria das caracteristicas prin- cipais do mecanismo que possibilita a replicacao répida ¢ precisa do DNA, embora ainda haja muitos detalhes moleculares a esclarecer. A sintese de DNA, a exemplo da sintese de RNA (Ca- pitulo 11) e proteinas (Capitulo 12), tem tés etapas: (1) iniciacéo da cadeia, (2) extensio ou alongamento da ca- deia ¢ (8) finalizacdo da cadeia, Neste € nos préximos dois capitulos, examinamos os mecanismos das trés eta- pas na sintese celular dessas importantes macromolécu- Jas, Primeiro, porém, apresentamos algumas caracteristi- «as principais da replicacio de DNA. REPLICACAO SEMICONSERVATIVA Quando Watson e Crick deduziram a estratura em du- pla hélice do DNA com seu pareamento de bases com- plementares, eles imediatamente reconheceram que a especificidade do pareamento de bases poderia ser 0 fundamento de um mecanismo simples de duplicagao do DNA. Portanto, 5 semanas depois de seu artigo sobre a estrutura em dupla hélice do DNA, Watson e Crick pur Blicaram um artigo descrevendo um possivel mecanismo Ge replicacdo da dupla hélice. Eles propuseram que os ois filamentos complementares da dupla hélice se de- senrolam e se separam, € que cada filamento guia a sin- tese de um novo filamento complementar (Figura 10.1). A -scquéncia de bases em cada filamento parental é usada como molde, ¢ as restrices de pareamento de bases na upla hélice determinam a sequéncia de bases no fila- mento recémsintetizado. A adenina, por exemplo, no fic Jamento parental serve de molde, gragas a seu potencial de ligacao de hidrogénio, para a incorporacio de timina no filamento complementar nascente. Esse mecanismo de replicacao do DNA é chamado de replicagso semiconser- setha (porque ha conservacio de metade da molécula pa- sental) para distingui-lo de outros possfveis mecanismos Capftulo 10 | Repicagio do DNA edos Cromessomos 223 de replicacio (Figura 102). Na replicacio conservativa, a dupla hélice parental seria conservada, ¢ uma nova dupla hélice seria sintetizada, Na replicacio dispersiva, segmen- tos de ambos os filamentos da moléculla de DNA parental seriam conservados e usados como moldes para a sintese 5 2 a z 1H FIGURA 10.1 Repicacio semiconservativa do DNA. Watson e Crick foram os primeiros a propor esse mecenismo de replicacio de DNA. ‘com base no pareamento de bases complementares entre os dois flamentos da dupla hélice. Observe que cada fllamento parental & conservado @ serve de molde para a sintese de um novo flamento ‘complementar; ou seja, 2 sequéncia de bases em cada novo filamento ‘8 determinada pelos potenciais de igacdo de hidrogénio das bases no fllamento parental224 Fundamentos de Genétice Semiconservativa DNA parental g Primeira geracio de DNASINO Seyunda geracio (de DNAiho 1 FIGURA 10.2 Os trés possiveis mecanismas de replicacio de DNA: (1) semi nservativo, no qual cada filamento da dupla hélice parental came doe gle 'a sess de um noo lento complement (2) conservativo, no qual a dupa alice parental ¢consenode © = ieee: ee dupe nélice;e (3) disparsiv,no qual segrentos de cade lament parental io conservados eguam 2 sintese de novos Segmentos de flomentes complementares que er suid, sb undos para formar os noves flamentos-fihos, dee segmentos complementares que, depois, seriam uni- dos para produzir os novos filamentos de DNA. ‘Em 1958, Matthew Meselson e Franklin Stahl demons- traram que a replicacio do cromossomo de Escherichia coli é semiconservativa, Mais tarde, em 1962, John Cairns demonstrou que 0 cromossomo de E. coli era um tnico diiplex de DNA. Juntos, os resultados apresentados por ‘Cairns e por Meselson e Stahl mostraram que a replicar gio do DNA em E. colié semiconservativa. Meselson ¢ Stal cultivaram cétulas de F. coli durante -muitas geragées em um meio no qual o isétopo leve, nor mal, de nitrogénio, “'N, fora substituido pelo is6topo pest: do, !'N. As bases purinas ¢ pirimidinas no DNA contém ni- trogénio. Portanto, o DNA de células cultivadas em meio contendo N tem maior densidade (massa por unidade de volume) que o DNA de células cultivadas em meio con- tendo IN. As moléculas de diferentes densidades podem ser separadas por cantritugagao de equilbrio por graciente de den- sidade. Usando essa técnica, Meselson ¢ Stahl conseguiram ddistinguir os trés mecanismos de replica¢ao de DNA pelo acompanhamento das alteracdes na densidade do DNA ‘de células cultivadas em meio com ™N ¢ transferidas para meio com ¥N durante perfodos variados ~ denominados experimentos de transferéncia de densidade. ‘Adensidade da maioria das moléculas de DNA é quase igual A densidade de soluges concentradas de sais pe- sados, como 0 cloreto de césio (CsCl). Por exemplo, a densidade de CsCl a 6M é de aproximadamente 1,7 g/ em’, O DNA de E. coli que contém “N tem densidade de 1,710 g/cm®. A substiuicgo de “N por *N aumenta adensidade do DNA de £, coli para 1,724 g/cm*. Quan- do uma solugao de CsCl a 6M é centrifugada a veloci- ‘dade muito alta durante longos perfodos, formase um gradiente de densidade em equilibrio (Figura 103). Se presente nesse gradiente, o DNA ocupa uma posicéo em {que a densidade da solugio de CsCl ¢ igual & sua prépria densidade. Assim, se uma mistura de DNA de E, coli con- tendo 0 isétopo pesado de nitrogénio, "N, e o DNA de E. colicontendo 0 is6topo de nitrogénio leve normal, "N, for submetida & centrifugacio de equilibrio por gradien- tc de densidade, as moléculas de DNA se separardo em ‘dvas “bandas”, uma constituida de DNA “pesado” (com- tendo #N) ea outra de DNA “leve” (contendo ™N) Meselson e Stahl retiraram células cultivadas em meio contendo !"N durante varias geracdes (€ que, portanto, continham DNA “pesado”), lavaram-nas para retirar 0 meio contendo "N e transferiram-nas para meio conten: do *N. Depois que as células foram culkivadas na presen- a de #N por periods variados, o DNA foi extraido ¢ analisado em gradientes de equilibrio de densidade com CsCl. Os resultados de seu experimento (Figura 10.4) sio compativeis apenas com a replicacdo semiconservativa, exeluindo os modelos conservativo € dispersive de sin- tese de DNA. Todo o DNA isolado das células apés uma geracdo de crescimento em meio contendo '*N tinha densidade intermediria entre as densidades do DNA “pesado” e do DNA “leve”, Essa densidade intermedia geralmente denominada densidade “hibrida’, Depois de duas geracdes de cultura em meio contendo “N, me- tade do DNA tinha densidade hibrida e metade era leve. esses resultados sio exatamente 0s previstos pelo modo de replicacao semiconservativa de Watson ¢ Crick (Figu- ra 10.2). Uma geracio de replicacao semiconservativa de ‘uma dupla hélice parental contendo ®N em meio con- tendo apenas "N produziria duas novas duplas hélices, ambas com #N em um filamento (0 filamento “antigo") ¢¢ #N no outro filamento (0 “novo” filamento). Essas mo- éculas teriam densidade hibrida. ‘A seplicacio conservativa nZo produziria moléculas de DNA com densidade hibrida; depois de uma geraciowe © Pra testo de sage arse erred DNA cnteraa Mc =N “@ certitugacio a 50.000 rpm durante 48 2 72, eee a 0 equi enre a forcacenruge eds & etabeleido Forga centruga tus Densidad de DONA de €. col “pesado” (contend #¥) as | a Densidade de DNA de €. col “eve (contenco *N) Densidade (g/cm?) 1s| no ie Ta Posiqdo no tubo da centrtga “@ Perfuracio do tubo da centrifuga para coletarfracées. cena DOO00LU000 ‘DNA contend #58 | FIGURA 10.3 Centifugacto de equiltxio por gradiente de densida- decom CsCl. de replicacdio conservativa de DNA pesado em meio leve, metade do DNA ainda seria pesada ¢ a outra metade, Jewe. Se a replicacio fosse dispersiva, Meselson e Stahl te- ‘iam observado uma passagem do DNA de pesado a leve ‘cada geracio (i. ¢, “metade pesada” ou hibrida depois de uma geracio, “um quarto pesado” depois dle duas ge- ‘acdcs, ¢ assim por diante). Essas possibilidades sto clara- ‘mente incompativeis com os resultados do experimento de Meselson e Stahl. Em seguida, demonstrouse que a replicacdo de DNA era semiconservativa em varios outros EE Capftulo 10 | Replicaglo do DNA e dos Cromassomes 225 ‘rorganismos. Leia ResoWval: Compreenda a replicacio semiconservativa do DNA c verifique sc entendeu o signi- ficado dos resultados de Meselson e Stahl. ‘A replicacdo semiconservativa de cromossomos euca- riéticos fol demonstrada pela primeira vez em 1957 pe- los resultados de experimentos realizados por J. Herbert ‘Taylor, Philip Woods e Walter Hughes em células das ex- tremidades das raizes da fava, Vicia faba. Taylor e colabo- adores marcaram cromossomos de Vicia faba mediante cultivo das extremidades da raiz por oito horas (menos ‘de uma geracio celular) em meio contendo *H-timidina radioativa. Em seguida, as extremidades da raiz foram. retiradas do meio radioativo, lavadas ¢ transferidas para meio nao radioativo contendo o alcaloide colchicina. Sa- be-se que a colchicina se liga aos microtiibulos e impede a formacio de fibras do fuso ativas. Logo, nao ocorre se- paracio normal dos cromossomossfilhos na anafase ¢, as- sim, 0 niimero de cromossomos por niicleo é duplicado ‘uma ver por ciclo celular na presenca de colchicina. Essa duplicacao do niimero de cromossomosa cada geracio ce- ular tornou possivel que Taylor e seus colaboradores de- terminassem 0 niimero de duplicacdes de DNA ocorridas em cada célula depois da incorporacdo da timidina radio- ativa. Na primeira metifase em meio contendo colchicina (cmetifase), os niicleos contém 12 pares de cromatides (ainda unidas pelos centrémeros). Nasegunda cmetifase, os niicleos contém 24 pares, ¢ assim por diante ‘Taylor e colaboradores usaram uma técnica chamada autorradiografia para examinar a distribuicao de radioati- vidade nos cromossomos das células na primeira cme- tifase, na segunda cmetafase, e assim por diante. A au- torradiografia é um método para deteccao e localizacao de isstopos radioativos em preparacdes citolégicas ou de macromoléculas por exposi¢ao a emulsao fotogréfica sen- sivel A radiacao de baixa energia. A emulsio contém hale- tos de prata que produzem diminutos pontos pretos ~ ge~ ralmente chamados de grios de prata — quando expostos as particulas carregadas emitidas durante 0 decaimento dos isétopos radioativos. A autorradiografia possibilita a uum pesquisador preparar uma imagem da localizacao de radioatividade em macromoléculas, células ou tecidos, Resolva! Compreenda a replicacao semiconservativa do DNA Uma cultura de bactérias & mantida por multas geragées em tum meio no qual o nitrogénio s6 esté disponivel na forma de ‘seu isétopo pesado ""N. Em seguida, a cultura é transferida para tum meio que contém apenas ™N por uma geracéo: depois, levada de volta para um meio contendo ™N por uma citima _geraclo. Seo DNA dessas bactérias for isolado e centrfugado até 0 equllibrio em gradiente de densidade com CsCl, qual seré ‘a divisio em bandas do DNA prevista no gradiente? > Leia aresposta do problema no site |nttp:{/gen-io.grupogen.com.br.226 Fundamentos de Genética “ (@ hs cétlos de Ecol so ctvadas em MN or wis eres. ODNAG extaido ¢ analsado or cenrfugacéo em gradiente sh, de densidade com CsCl. 7 —_—rr As cBllas séo transterdas para meio Geracdo0 contendo "N por uma goracao. CH a “Hiridot 1 esas Desiade de DNA eve Controle. : (DW pret & peso. stra de DNA pesado eleve ODNAS extrado DNA da pote da € analisado. primera geracso 6 hibvio. GeracéoT Por duas geracdes. I e ieee . went g g eeretando, -geracao é hibrida e @ Portes geracdes. neta exten ee eo Um quarto do DNA de ose woetew aan ee oe 1 FIGURA 10.4 Demonstracdo por Meselson e Stahl da replicagio semiconservativa de DNA em £. coli. A ilustracBo mostra que os resultados de seu experimento sio os esperados na repicacao semiconservativa do cromossoro de Ecol. Os resutadas obtidos seriam diferentes se a replicacio de DNA em £,col/fosse conservativa ou dispersiva (Figura 10.2), assim como a fotografia torna possivel obter uma ima- ‘gem do que vemos. A diferenca é que 0 filme usado para autorradiografia é sensivel a radioatividade, enquanto 0 filme usado na camera € sensivel & luz visfvel. A autor radiografia € muito itil no estudo do metabolismo do DNA em vista da possibilidade de marcacio especifica do DNA por cultura das células em °H-timidina, desoxirribo- nucleosidio de timina que contém um is6topo radioativo de hidrogénio (titio). A timidina ¢ incorporada quase exclusivamente ao DNA; nao esta presente em nenhum ‘outro componente importante da célula, Quando Taylor e colaboradores usaram a autorradio- grafia para examinar a distribuiclo da radioatividade nos cromossomos de Vicia faba na primeira c-metéfase, as duas crométides de cada par eram radioativas (Figu- ra 10.5A). Na segunda e-metéfase, porém, apenas uma das ‘cromitides de cada par era radioativa (Figura 10.5B). Esses sio exatamente 0s resultados esperados se a replicagio do DNA for semiconservativa, admitindo-se uma molé- cula de DNA por cromossomo (Figura 10.5C). Em 1957, ‘Taylor e seus colaboradores conclufram que a segregacio do DNA cromossémico em Vicia faba era semiconservati- Ti AM, va cada divisio celular. A conclusio de que a replicacio da dupla hélice era semiconservativa na fava teve de espe- rar dados subsequentes indicativos de que cada cromos- somo contém uma s6 molécula de DNA. Experimentos anilogos foram realizados com varios outros eucariotos, ¢, em todos os casos, 05 resultados indicam que a replica- cio € semiconservativa. Teste seu conhecimento sobre a replicagao de cromossomos acompanhando o Problema resolvido: Previsio dos padres de marcacdo com *H em cromossomnos. ORIGENS UNICAS DE REPLICACAO John Cairns estabeleceu a existéncia de um local de ini- ‘cio ou origem de replicagéo no cromossomo circular de E. ‘oli, mas nao sugeriu se havia um local especifico de ori- gem ou se esta ocorria em locais aleat6rios em uma pops- lagao de cromossomos em replicacio. Os cromossomos bacterianos ¢ virais geralmente tém uma origem tinica por cromossomo, a qual controla a replicacio de todo ‘cromossomo. Nos grandes cromossomos de eucariotos, miltiplas origens controlam coletivamente a replicacioCo ‘Autorradiografias de cromossomos de Vicia faba a7 e % . + Tam Tum ‘A Primera metéfase depois da_—_—B. Segunda metéfase depois repicacgo em Himidina, ‘de outrarepicarao em "timid, Capitulo 10 | Repicagéo do DNA e dos Cromossomos 227 ~ © desicaciosen ae imino e@ ‘toradograta “ES piesa con MMOTeCoerate picasso com eee pe >i = >| L, gg, emetitase cepois da muceria Zometétase depois da rmarcacio . Iterpretardo des autoracografias mostradas em (A e (8) ‘em termos de replicarso sericonservatva, ' FIGURA 10.5 Comprovacio da replicacao semiconservativa de cromossomos na fava, Vicia faba. Os resultados obtides por Taylor, Woods Hughes (A,B) sio prevstos pela replicacéo semiconservativa do DNA (C). da molécula gigante de DNA de cada cromossomo. Da- dos atuais indicam que essas miiltiplas origens de replica- lo em cromossomos eucariéticos também ocorrem em sitios espeetficos. Cada origem controla a replicacao de ‘uma unidade de DNA chamada réplico; assim, a maioria ‘dos cromossomos procariéticos contém um inico répli con, a0 passo que os cromossomos eucaridticos geral- mente contém muitos réplicons. ‘A origem tinica de replicacio, chamada oriC, no cro- mossomo de £. coli foi caracterizada com bastante deta- Ihes. oriCtem 245 pares de nucleotfdios de comprimento € contém duas sequéncias repetidas conscrvadas diferen- tes (Figura 106). Ha uma sequéncia de 13 pb presente como tés repeticées consecutivas. Essas trés repeticoes so ricas em pares de bases A'T, facilitando a formacao de ‘uma regio localizada de separacio dos filamentos deno- minada botha de replicagio. Lembre-se de que os pares de bases A:T sio unidos por apenas duas ligacdes de hidro- _génio, ao contrério das trés ligacdes existentes nos pares de bases G:C (Capitulo 9). Assim, 0s dois filamentos de regides ricas em A:T do DNA afastam-se com mais faci- lidade, isto & com menor gasto de energia. A formacio de uma zona localizada de desnatura¢io € uma prime 1a etapa essencial na replicacdo de todos os DNA bifila- ‘mentares. Outro componente conservaco de oriC é uma sequéncia com 9 pb repetida quatro vezes ¢ intercalada com outras sequencias. Essas quatro sequéncias sao locais de ligacio de uma proteina que participa da formacao da bolha de replicacio. Adiante neste capftulo comentare- ‘mos outros detalhes do processo de inicio da sintese de DNA nas origens e das proteinas participantes. As miltiplas origens de replicacdo em cromossomos cucariéticos também parecem ser sequéncias de DNA especificas. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, foram. identificados e caracterizados segmentos de DNA cro- mossémico que permitem a replicagio de um fragmen- to de DNA circularizado como unidade independente (auténoma), isto € como unidade autorreplicativa ex: tuacromossémica, Essas sequéncias sio denominadas lementos ARS (de Autonomously Replicating Sequences, sequéncias de replica¢ao aut6noma). Ha boa correspon déncia entre sua frequéncia no genoma da levedura ¢ 0 ntimero de origens de replicacao, e demonstrou-se ex- perimentalmente a atuacao de algumas delas como ori- ‘gens. Os elementos ARS tém cerca de 50 pares de bases de comprimento ¢ incluem uma sequéncia central rica em AT com 11 pb, ATTTATPuTTTA TAAATAPYAAAT (em Pué qualquer uma das duas purinas e Py € qualquer ‘uma das duas pirimidinas), ¢ outras c6pias imperfeitas dessa sequéncia. A capacidade dos elementos ARS de atu- arem como origens de replicacio € extinta por trocas de pares de bases nessa sequéncia central conservada, ‘A maioria das tentativas de caracterizar as origens de replicacio em eucariotos multicelulares nao teve éxito. Apesar dos indicios de que a replicacdo € iniciada em ‘sequéncias especificas in vivo da disponibilidade das se- quéncias de genomas inteiros, 0s componentes de uma origem ativa continuaram indefinidos. Aparentemente essa incapacidade de identificar origens de replicacio tem duas razdes principais. Em primeiro lugar, 08 en saios funcionais usados em leveduras ~ a capacidade da origem de propiciar a replicacao de um plasmidio ou cromossomo artificial - nao produzem resultados confié- veis em outros eucariotos. As sequéncias que propiciam areplicagio de plasmidios em células de mamiferos, por ‘exemplo, geralmente levam ao inicio da replicacio em sitios aleat6rios ou miltiplos. A segunda razao é que atu-228 Funcementos de Genética PROBLEMA RESOLVIDO Previsdo dos padrées de marcagao com 7H em cromossomos J PROBLEMA raTos coNceTos ‘Haplopappus gracts & uma planta diploide com dols pare de cro- 1, Todos os cromassomes no estégjo G, (pré-eplcagio) contém rmossorns(2n = 4), Ume cla dessa planta em estigo C, nunca uma nica duple hice de DNA. antes exposta 3 radcatividade, foi pasta em melo de cultura conten- 2 ‘A epicagio do DNA ¢ semiconservativa. 4 94-timidna. Depois de uma geracso de crscimento nesse melo, 3. As eromatides-fhas continuam unidas a um Unico centromero as dues celulas da pole foram lavedas com meio no radoativo © na metafase da mitose. transerdas para meio contendo 'H-timidin e colchicina. las cres- 4, © centromero duplicase antes da andfase; nesse momento ceram nesse meio por mais uma geaco celular e até a metéfase cada cromdtide tomna-se um cromossomo-fo. de uma segunda dvisto celular. Os cromossomos de cada cul fo- 5S. A coihicna liga-se as protelnas que formar as fixas do fuso ram dispersos sobre lina de microscSipo,coredos, fotografedos © responsdves pela separacéo dos cromossomos-hos para os ‘evpostos & emulso sensivel 3 radiaggo de bai energja. Uma das polos do fuso durante a andfase e impede a formacio de fusos clulasfihas apresentou placa metafésia com oto cromessomos, _atvos Logo, hd duplleaco do nero de cromossomos a cada todos com duas crométidesfha. Desenhe essa placa metafésica _geracBo na presenca de colhicina, mostando e distibuiclo prevista da radoativdede na autoradio- _gafia,Corsdere que nao haa crossing overt ANAUISEE SOLUGAO (s quatro cromossomas passam pelos mesmos processos de replicacSo, Portanto, s6 precisamos acompanhar um cromassomo. A primeira replicagSo na presenca de *H-timidina, mas sem colchicina,€ mostrada na lustragao seguir com flamentosradioativs em verrnelho, Dg en de {bs das laentos cont Htmina) ipcosts Deas cées Contromero _en Hi Acompantamenio do ma celia; ae bcliuhs ‘duas passam pelos Cétla rmesmos proceso. ‘A segunda e a terceirareplicacoes (em 'H-timidina) s30 mostradas na ilustragso a seguir. CCromossomo. fees ‘em Hemidina ‘mals colchicina —> Cul Dupicagdo do 0s quairo cromossomos de H. gracilis nimere de cromessomos produzem dois cromossomos metafsicos, ‘como mostra a figura aca, [Na autorradiograia dos cromossomos metatésicos produzidos, a distrbuiglo da radiotividade (indicada por pontos vermelhos) nos oito cromossomos seré a seguinte. Pye ne ye Msé _Sequéncias 13mer Quatro sos S< consecutvas eligacdo Ser S ara proteinas de itciacéo,-“ | FIGURA 106 Estrutura de ori aorigem tnica de replicagdo no cro- rmossome de E cl almente hd indicios considerdveis de que o inicio da re- plicagao requer sequéncias cle DNA relativamente longas até vérios milhares de pares de bases — em metazodrios, dificultando a caracterizaco de suas origens. opto 10 | Repicago do DNA. dos Comussomos 229 VISUALIZAGAO DE FORQUILHAS DE REPLICACAO POR AUTORRADIOGRAFIA Acestrutura geral dos cromossomos bacterianos em repli- cacio foi determinada pela primeira vez por John Cairns, em 1963, mais uma vez por autorradiografia. Cairns cul tivou células de £. coliem meio contendo *H-timidina du- ante periods variados, provocou a lise das cétulas cuida- dosamente para nao romper os cromossomos (moléculas de DNA longas so sensiveis as forcas de cisalhamento) € coletou os cromossomos em filtros de membrana, Es- ses filtros foram afixados a laminas de vidro, recobertos com emulsio sensivel a particulas B (os elétrons de baixa cenergia emitidos durante o decaimento do tritio) e arma- zenacios no escuro por um perfodo para que houvesse de- caimento radioativo suficiente. Quando os filmes foram revelados, as autorradiografias (Figura 10.7A) mostraram que os cromossomos de £. coli sio estruturas circulares que existem como intermediarios em forma de 6 durante a replicacio. As autorradiografias indicaram ainda que 0 desenrolamento dos dois filamentos parentais comple- mentares (necessario para sua separacio) e sua replica- cdo semiconservativa é simultneo ou esta intimamente acoplado. Como é preciso que a dupla hélice parental rode 360° para desfazer cada giro da hélice, é imprescin- divel que haja algum tipo de “pivé”. Agora os geneticistas sabem que o pivd necessdrio € uma quebra unifilamentar 100 um tigen Forgutba do repcagio By -“)-O-O-»-~ Forguiha do rapieacdo 8. Reolcaeao bidrecional do cromossomo circular de E, col 1 FIGURA 10,7 Imagem da replicagao do cromossomo de E.coli por autorradiografa. A. Uma das autorradiogrfias de Caim de cromossomo 130 em formato de 0 de uma célulacultivada por duas geragées na presenca de *H-timidina, com a lustrago explicativa na parte superior esquerda. Os flamentos radioativos de DNA s8o apresentados como linhas slidase os fllamentos nao radoativos, como lnhas tra- ‘ejadas. As alcas,Ae B conclulram ume segunda replicacSo na presenca de *H-timidine: a secSo C permanece para se replica pela segunda vez, B.A ilustragdo mostra como os resultados de Calms sio explicados pela replicacéo bidirecional do cromassome de E.colliniiada na origern ‘nica de replicacéo,230. Fundamentos de Genética transitéria (clivagem de uma ligacio fosfodiéster em um filamento da dupla hélice) produzida pela agio de enzi- ‘mas chamadas topoisomerases. Areplicacio do cromossomo de E. colié bidirecional a partir da origem tinica de replicacdo. Cada estrutura em forma de Y € uma forqutha de replicacio, ¢ as duas forqui- Ihas movemse em direcdes opostas sequencialmente em tomo do cromossomo circular (Figura 10.78). A replicacao bidirecional do cromossomo circular de E, coliqque acabamos de comentar ocorre durante a di sio celular, Nao deve ser confundida com a replicacio por circulo rolante, que medeia a transferéncia de cro- mossomos das células Hir para células F* (Capitulo 8). Alguns cromossomos virais replicam-se pelo mecanismo do circulo rolante; veja a secao Replicacdo por circulo rolante adiante neste capitulo. REPLICACAO BIDIRECIONAL ‘A replicacio bidirecional foi demonstrada convincente- mente pela primeira vez por experimentos com alguns dos pequenos virus bacterianos que infectam a B. coli. O bacteridfago lambda (fago h) contém uma tinica molécula linear de DNA com 17.5 wm de comprimento. O cromos- somo do fago \€ um pouco incomum porque tem uma re- gio uniflamentar, com 12 nucleotidios de comprimento, na extremidade 5! de cada filamento complementar (Figu- ro 108). Essas extremidades unifilamentares, denominadas coesivas”, sio complementares. Portanto, pode haver pa- reamento das bases das extremidades coesivas de um cro- ‘mossomo lambda para formar uma estrutura circular com ligagdes de hidrogénio. Um dos primeitos eventos a ocor rer depois da injecdo do cromossomo de um fago lambda em uma céhula hospedeira € sua conversio em molécula circular fechada por ligacdo covalente (Figura 10.8). Essa conversio da forma circular com ligacoes de hidrogénio em forma circular fechada por ligacao covalente € catali- sada pela DNA ligase, enzima importante que sela quebras unifilamentares em duplas hélices de DNA. A DNA ligase € necessiria em todos 0s organismos para replica¢iio do DNA, reparo do DNA e recombinacio entre moléeulas de DNA. Da mesma maneira que 0 cromossomo de E, cli, 0 cromossomo lambda replicase em sua forma circular por meio de intermedirios em forma de 0. ‘A caracteristica do cromossomo lambda que facilitou a demonstraco da replicacio bidirecional ¢ sua diferen- ciacdo em regides que contém alta concentracio de ade- nina e timina (regides ricas em AT) € regides com gran- de quantidade de guanina e citosina (regides ricas em GC). Em particular, estes tém alguns segmentos com alto contetido de AT (grupos ricos em AT). No fimn da década de 1960, Maria Schnés ¢ Ross Inman usaram esses grupos ricos em AT como marcadores fisicos para demonstrar, por meio de uma técnica chamada mapeamento de des- natura¢io, que a replicacio do cromossomo lambda tem. origem jinica e é bidirecional. Quando as moléculas de DNA sto expostas @ alta tem- peraura (100°C) ou a pH elevado (11,4), as ligacdes de ‘Cromossomo linear de fago A presente em virions maduros, (TTTTEREC ECE RE TERK S zr » gaacescencelt x Extremidades “coesivas" unifiamentares com 12 bases tt ER Forma circular com Tigacées de hidrogénio igagbes de hidrog ee NA \ Endonuclase especie para igase Y| a'sequércia de bases, Forma por ligacao covalente {a FICURA 10.8 Teés formas de cromossome do fago lambda. figura mostra as conversbes do cromossomo linear de A, com suas extremi- dades coesivas complementares, em cromossomo circular de \ com ligacdes de hidrogtnio e, depois, em crormossomo circular de fecha- {por ligagde covalente, A forma linear do cromossomo parece set ‘uma adaptacdo para facilitar sua injecSo da cabeca do fago, através da ‘pequena abertura na cauda co fago, para a célula hospedeira durante ‘a infeccdo, Antes da replicagdo na célula hospedeira,o cromossomo & ‘convertido na forma circular fechada por ligagdo covalente. Somente ‘as extremidades do cromassomo do fago maduro so mostradas: a linha vertical denteada indica que a porcdo central do cromossomo no é mostrada. O cromossome lambda tem ao todo 48.502 pares de rucletidios de comprimento. hidrogénio e hidrofébicas que unem os filamentos com- plementares na dupla hélice sto quebradas, e 0s dois fir lamentos se separam — um processo chamado desnatu- ragio. Como os pares de bases AT sio mantidos tinidos por apenas duas ligacdes de hidrogénio, em comparacao com trés ligacdes de hidrogénio em pares de bases CG, as moléculas ricas em AT desnaturam-se com mais facilidade (em pH ou temperatura menores) que as moléculas ricas em GO, Quando cromossomos lambda sao expostos a pH fr 11,05 por 10 min em condicdes apropriadas, os grupos ricos em AT desnaturamse e formam bolhas de desnatu- ragio, detectéveis por microscopia eletrénica, enquanto as regides ricas em GC continuam no estado duplex (Figu: ra 109). Essas bolhas de desnaturacio podem ser usadas como marcadores fisicos esteja 0 cromossomo lambda na forma linear madura, circular ou de intermedisrios repli cativos em forma de 0. Ao examinarem as posigdes dos ALCS |Caputo 10 | RepicagSo do DNA e dos Cromossemnos 231 fn yr ee 3 vee wen Vy Extremidede esauerda CP da forma near, 012345 67 8 91011 121316151617 um ‘aportanda para a A. Sitos de desnaturagoricos em AT no cromossomo linear de 2. extromidade drota B. ‘Sitios de desnaturagioricos em AT ra forma circular do cromassomo 2. CC. Bothas de desnaturacio ricas em AT em um cromossomo A em repicagao em forma de @, Interpretapdo Origer -————-Giip= D.lustrac30 na frra near do intermedisiorepicatvo de A mastrado em (C). 1 FICURA 109 © uso de stlos de desnaturacéo cos em AT como marcadoresfisicos para cornprvar que a replica do cromossomo do ago 2 € bicireconal, eno uidrecional. A Fgura mosta as posiges das bohas de desaturagoricas em AT das forma Linear (A) e cular (8) do cromossomo . micrograia eletrénica (C) mostra as posicoes das bolhas de desnaturacao (identifieadas como 2.) edasforqulhas de replica (Greuladas) em um cromossomo i pacaimente repiado.Aestrture do cromassomo parcalmente repicado em (C) étustrada em (0). Pontos de ramificacio (estruturas em Y) em relacio as po- ao redor do cromossomo circular. A Figura 10.10 mostra os sigdes das bolhas de desnaturacio em um grande ntimero resultados esperados no experimento de Schnds ¢ Inman de intermediatios replicativos em forma de 6, Schnés € In- se a replicacao for (A) unidirecional ou (B) bidirecional. ‘man mostraram que 0s dois pontos de ramificacio sio for. Os resultados mostraram claramente que a replicagao do quills de replicacao que se movem em direcdes opostas _cromossomo lambda é bidirecional. Replicas uniirecional Replicagdo bidirecional a COOR 7 O-O)-O { Demstrario \ ee parcial 1 FIGURA 10.1 Principio do processo de mapeamento da desnaturagio usado por Schndse Inman para dstinguir entre os mecanizmos (A) unidiecionale (8) birecional de replicago do cromossomo.232 Fundamentos de Genética A replicacao bidirecional a partir de uma origem fixa também foi demonstrada em Varios organismos com cro- mossomos que se replicam como estruturas lineares. A replicagio do cromossomo do fago T7, outro pequeno bacteri6fago, comeca em um sitio tinico perto de uma extremidade, forma uma estratura em “olho” (Figu- Fa 10.11) e prossegue nas duas direcbes até que uma for- quilha chegue & extremidade mais préxima. A replicacio dda estrutura em forma de ¥ (Figura 10.118) continua até A Tn ‘que a segunda forquilha chegue & outra extremidade da molécula, produzindo dois cromossomosfilhos. ‘A replicac’o do DNA cromossémico em cucariotos também é bidirecional nos casos em que foi estudada. No entanto, a replicagao bidirecional nao é universal. A replicagao do cromossomo do colifago P2, que ocorre em uma estrutura em formato de 8, como 0 cromos- somo lambda, é unidirecional a partir de uma origem ‘i Tam 1 FIGURA 10.11 Micrografiaseletrdnicas de cromossomos do bacterisfago T7 em replicagdo. Os eromossomos T7, ao contrério dos cromosso~ mos de, cole do fago lambda, replicam-se como estruturaslineares, Sua origem de replicarSoesté localizada a 17% da extremidade esquerda <0 crornassomo. O cromessomo em (A) apresenta o formato de “oho” (=>) caracterstico dos estagios incils da replicagao.A separagSo do filamento parental e a sintese de DNA prosseguem nas duas éirectes a partir da origem. Quando a forquilha que segue para 0 lado esquerdo ‘alcanca a extremidade esquerda do cromossomo, surge ura estrutura em forma de ¥, como a mostrada em (8) A repicacdo continua com a forquitha que segue para a dreita até que sejam produaidas dois cromossomoslineares. No caso de cromossomos muito maiores que T7, como ‘0s cromossomos eucariéticos, a replicagSe ocorre a partir de varias origens, com o surgimento simutténeo de muitos “olhos” em crescimento, Micrografis originals cedidas por David Dressler, Harvard University PONTOS ESSENCIAIS + A repticaciéo do DNA ocorre por mecanismo semiconservativo: & medida que os dois filamentos ‘complementares da dupla hilice se desenrolam e se separan, cada filamento serve de molde ‘para a sintese de um novo filamento complementar + Os potenciais de iguedo de hidrogénio das bases nos filamentos-molde espeificam sequncias de bases complementares nes flamentas de DNA nascentes «A replicagao inicia-se em origens vinicas ¢ geralmente prossegue nas das direcGes a partir de cada origen. Replicagdo de DNA em procariotos extremidade 9° do outro filamento (extensio 5'—> 3’) Contudo, as enzimas que catalisam a replicagao do DNA, ‘as DNA polimerases (ver Em foco: Sintese de DNA in vitro), A replicacao de DNA é um processo complexo, que exige aco conjunta de um grande niimero de proteinas. ‘idroxila livre; 0s resultados dos estudos da replicacio do DNA por autorradiografia ¢ microscopia eletrnica indicam que 08 dois novos filamentos sintetizados em cada forquilha de replicacao estio sendo estendidos na mesma direcéo geral em nivel macromolecular. Como a sintese dos fi- lamentos complementares de uma dupla hélice ocorre em polaridades opostas, a sfntese est ocorrendo na ex: tremidade 5 de um filamento (extensio 3’ 5') € na NAL, tém necessidade absoluta de um grupo 3" clas s6 fazem a sintese 5’ — 3’ (Figura 10.12). Esses re- sultados aparentemente contradit6rios criaram um pare doxo interessante. Durante muitos anos, os bioquimicos pesquisaram novas polimerases que puclessem catalisar a sintese 8’ — 5, mas nunca encontraram, Em vez disso, dados experimentais mostraram que toda a sintese de DNA ocorre na direcio 5' 3Capitulo 10 | Repiacde do DNA 60s Cromossomos 233 nino aa ° ‘SINTESE DE DNA JNVITRO plicados nos processos biolgicos por meio da técnica de rupture das lula, eparacBo das vSrasorganelas, maro- molécuiase outros componentes e, em seguid,recosttuicao de sistemas no tubo de ensao, batizados de sistemas in vite, eapazes de efetuar determinados processos metabelicos. Esses sistemas in vitro podem ser dssecados bioquimicamente com muito mais faciidade que sistemas in vivo e, portanto, deram enorme contri- buigo para oconhecimento sobre os processs bolgicos. Nunca porém,devernos presumir que um fenémeno demonstrad in vitro ‘corr in vivo. Essa extrapolarzo 6 eve ser feita quando evidén- 3. ‘A DNA polimerase | é um polipeptidio nico cam peso mo- lecular de 103.000 coditicada por um gene denominado polA. No entanto, a DNA polimerase I ndo é a verdadeira "DNA replicase” ‘em E.coli. Em 1969, Paula DeLuciae John Caims relataram a re- plicacao do DNA em linhagem de. col que nao tinha a atividade polimerase da DNA polimerase em razio de uma mutagSo no gene pol. Contudo, DeLuciae Caims também descobriram que esse mutante polA? era extremamente sensivel luz ultravoleta (Uv). Agora sabemos que uma importante fung8o da DNA pal ‘merase | em E.coli repararéefitos do DNA, como os induzidos por UV (Capitulo 13). Mas, como veremas adiante neste captulo (lniciaglo das cadeias de DNA com iniciadores de RNA}; a ONA palimerase | também tem um papel importante na replicacae do Hoje, estudos in iro esto sendo usados para caracteriar as DONA polimerases em muites organismas diferentes. Vrias po- limerases descobertas recentemente, derominadas pelimerases transtesio, porque So capazes dese replicartrarspondo lees ou efeitos no DNA que bloqueiam a repicacdo pela mairia das po- limerases, estdo despertando grande interesse, Em seres humanos © outros mamiferos a DNA potimerase eta (r) tem papel importante na replicagio do DNA lesado.Indvidues homozigotos para muta- «es com perda de funcéo no gene POLH também denominado gene XPV) que codfica a polimerase m tém xeroderma pigmentoso (XP), um tipo de distirbio hereditsrio. As pessoas com XP s80 ex- tremamente sensiveis& luz solr; desenvalvem varios cancers de pele depos da exposiclo& radiagdo UV ne luz solar (Capitulo 13). SINTESE CONTINUA DE UM FILAMENTO E SINTESE DESCONTINUA DO OUTRO Como ja foi discutido, os dois filamentos nascentes sin- tetizados em cada forquilha de replicacio estio sendo estendidos na mesma direcio no nivel macromolecule. Como os filamentos complementares de uma dupla hé- lice de DNA tém polaridades quimicas opostas, um fila- mento € estendido na direcdo geral 5’ —> 3" ¢ 0 outro, na direcao geral 3' — 5’ (Figura 10.13A). Mas as DNA poli- erases 86 podem catalisar a sintese na direcio 5'— 3'. Esse paradoxo foi resolvido com a demonstracio de que a sintese de um filamento de DNA é continua, enquan- to a sintese do outro filamento é descontiaua. No nivel molecular, a sintese dos filamentos complementares de DNA esté ocorrendo em direcdes fisicas opostas (Figu- +2 10.138), mas 0s dois novos filamentos sio estendidos na| EUR Mam Capftlo 10 | Replicaslo do DNA © 60s Cromossomes 233, inico i a ‘SINTESE DE DNA INVITRO plicados nos processos bioligicos por meio da técnica de rupture das células,separacdo das vérias organelas, macro- rmoléculas € outros componentes e, em seguida, reconsttuigao de sistemas no tubo de ensalo, batizados de sistemas in vitro, capares de efetuar determinados processos metabdlicos. Esses sistemas Invitro podem ser dissecados bioguimicamente com muito mais faciidade que sistemas in vivo e, portanto, deram enorme contri- buigo para o conhecimento sabre os processos biolégicos. Nunca, porém, devernos presumir ue um fenémeno demanstrado in vitro ‘corra in vivo. Essa extrapolacso sb deve ser feita quando evidén- cias independentes de estudas in vivo vaidam os resultados dos estudos in vito. A replicagao de DNA € uma rea em que os estudos in vitro foram, e continuam a ser, inestimavels. Grande parte de nosso ‘onhecimento sobre 0 processo de replicacSo do DNA fo inicial- mente deduzido desses estudos. Em 1957, Arthur Kornberg e seus colaboradores foram os primeiros a demonstrar que a sintase de DNA poderia ocorrer in vito. Kornberg recebeu um Prémio Nobel por esse trabalho apenas 2 ancs depois (1955), 0 que demonstrou 2 importanciaatrbulda por outros cientistas a essa inovaczo. Ko- berg e colaboradoresislaram uma erima de E.coli que catalisa 2 adigdo covalente de nucleoticios a cadeias de DNA presxistentes.. Inicialmente batizada de DNA polimerese ou “enzima de Kom- berg’ essa enzima agora é conhecida como DNA polimerase | por ‘causa da descoberta subsequente de vérias outras DNA polime- rases em E. col ‘Ao longo de muitos anos, Kornberg e colaboradoresrealizaram ‘extensos estudos in vitro sobre o mecanismo palo qual essa enzima catalseva a sintese de DNA, e muito do que sabemos sobre as DNA polimerases ¢ baseado em seus resultados. A DNA polime- ras | requer 05 5'-trifosfatos de cada um dos quatro descnribo- rucleosiios ~ trifosfato de desoxiadenosina (4ATP),trifosfato de 3" ¢ 0 outro, na direcao geral 3' — 5’ (Figura 10.13A). Mas as DNA poli- merases 86 podem catalisar a sintese na direcio 5' — 3. Esse paradoxo foi resolvido com a demonstracdo de que a sintese de um filamento de DNA € continua, enquan- to a sintese do outro filamento é descontinua. No nivel molecular, a sintese dos filamentos complementares de DNA esti ocorrendo em direcdes fisicas opostas (Figu- +2 10.138), mas os dois novos filamentos sio estendidos na234 Fundamentos de Genética bird, | Ss Cosa ) Diregéo de extenso dacadea Precursor de dTTP 1 FIGURA 10.12 Mecanismo de aco das DNA polimerases: extensao ‘covalente de um filamenta iniiador de ONA na direcSo S' —> 3°. ‘cadeia existente termina na extremidade 3° com o rucleotidio de- soxiguarilato (5'-fosfato de desoxiguancsina).A ilustragéo mostra 0 acréscimo, ctalsado por ONA-polimerase, de monofosfato de deso- sétimidina (d precursor trifosfato de desoxitimidina, TTP) a extremi- dade 3" da cadela, com liberacao de pirofostato(P,0,). mesma diregio quimica 5’ > 8'. A sintese do filamento estendido na direcdo geral 5’ — 3", 0 filamento continuo (U- der), & continua. O filamento estendido na direcéo geral 3" — 5’, 0 filamento descontinuo (atrasado), cresce pela sintese de fragmentos curtos (sintetizados na direcao 5’ 3’) € pela ligacdo covalente subsequente desses fragmentos curtos. Portanto, a sintese do filamento atrasado ocorre por mecanismo descontinue. A primeira evidéncia desse mecanismo descontinuo de replicago do DNA surgiu em estudos nos quais in- ativamente pela cultura de células de E. colie de células de E. coli infectadas pelo bacteri6fago T4 por perfodos muito curtos em meio contendo *#timidina (experi- mentos de prulselabeling [marcacio por pulso]). Os DNA marcados foram isolados, desnaturados ¢ caracterizados por medida da velocidade de sedimentacao em gradien- tes de sacarose durante centrifugacio de alta velocidade. Quando as células de E. coli foram marcadas durante 5, 10 ou 30 segundos, por exemplo, grande parte do mar cador foi encontradaa em pequenos fragmentos de DNA, com 1.000 a 2.000 nucleotidios de comprimento (Figu- ra 10.13C). Esses pequenos fragmentos de DNA foram batizados de fragmentos de Okazaki em homenagem. a Reiji Okazaki e Tuncko Okazaki, os cientistas que os descobriram no fim da década de 1960. Em eucariotos, os fragmentos dle Okazaki tem apenas 100 a 200 nucleo- tidios de comprimento. Quando sio usados perfodos maiores de marcacio, encontrase maior quantidade do marcador em grandes moléculas de DNA, provavelmen- te do tamanho dos cromossomos de £. coli ou do fago 'T4, Se as células forem marcadas com ‘H-timidina por ‘um curto perfodo e transferidas para meio nao radioati- vo por um longo perfodo de crescimento (experimentos de pulse-chase [pulso e busca), a timidina marcada estard presente em moléculas de DNA do tamanho do cromos- somo. Os resultados desses experimentos de pulse-chase sio importantes porque indicam que os fragmentos de Okazaki sio verdadeiros intermedidrios na replicagéo de DNA, ¢ nao algum tipo de subproduto metabslico. FECHAMENTO COVALENTE DE CORTES NO DNA POR DNA LIGASE Se o filamento atrasado de DNA for sintetizado de ma- neira descontinua, conforme descrito na seco anterior, sera necessirio um mecanisino para unir os fragmentos de Okazaki € produzir os grandes filamentos de DNA presentes em cromossomos maduros. Esse mecanismo € garantido pela enzima DNA ligase. A DNA ligase catali- sa 0 fechamento covalente de cortes (perda de ligacdes fosfodiéster; sem perda de bases) nas moléculas de DNA usando a energia do dinucleotidio nicotinamida adeni- na (NAD) ou trifosfato de adenosina (ATP). A ligase da E. coli usa 0 NAD como cofator, mas algumas DNA liga- ses usam 0 ATP. A Figura 10.14 mostra a reagio catalisa- da por DNA ligase. Primeiro, 0 AMP do intermediario ligase-AMP forma uma ligagio fosfoéster com 0 5'-fosfato no corte €, depois, um ataque nucleofilico pelo grupo 3-H no corte no tomo de fésforo proximal do DNA produz uma ligacio fosfodiéster entre os nucleotidios adjacentes no sitio do corte. A DNA ligase sozinha nao tem atividade em quebras no DNA em que ha perda de ‘um ou mais nucleotidios - denominados falhas (gaps). ‘As falhas s6 podem ser preenchidas e seladas pela a¢o combinada de uma DNA polimerase e uma DNA ligas ‘A DNA ligase tem papel essencial nao s6 na replicacio de DNA, mas também no reparo € na recombinagao do DNA (Capitulo 13). INICIAGAO DA REPLICACAO DO DNA ‘A replicacao do cromossomo de E: coli comeca em oriG, a sequéncia tinica em que ¢ iniciada a replicacio, com a formacao de uma regiao localizada de separacao de f- lamentos denominada bolha de replicacdo. Essa botha de replicagao é formada pela interacio de proteinas préini- ciadoras conn oriC: (Figura 10.15). A primeira etapa da préiniciagio parece ser a ligacio de quatro moléculasme ERO eee Captulo 10 | Replicagdo do DNA.e dos Cromossomes 235, “Técnicas de resolugiorelaivamente baica, como aautoradiografia ca ricrosopia elettnica, mostram que, em alvel macromolecular, as ‘use cadens de DNA nascentes slo ‘ctedias na mesma desloge, ‘ue cada fog de replica. =| z A 3s <2 Fao Be 5 i 5| Ba é <—________» | ‘Tamanho das molculas de DNA © Anslise do gradiente de densidade de sacarose dde DNA de E coli marcado com pulsos de 4 B Técnicas biogumicas de alta resolu, como -pulse-labeling anise por gradient de densidad, SHimidina, exraido e desnaturado durante centrifiugardo. Os gradientes usados separa. rmoléeulas de DNA de acordo com o tamanho. ‘mostram que replicago do filmentoatrasado & -descomtinua—fragmentos euros so sinfetiados na iro 5‘ 3 e,em seguids, unidos por DNA ligase. 1m FIGURA 10.13 Evidéncas da sintese descontinua do flamento atrasado. A. Eibora os dois flamentos nascentes de DNA sintetizados em uma Forgquilha ce eplicacao parecar ser estendidos na mesma direcdo (8), no nivel molecular, eles esto sendo sintetizados em direqBes opostas. C. Os resultados de experimentes de puse-labeling de Rej e Tuneko Okazaki e colaboradores mostrando que o DNA nascente em E.coli exste em fragmentos curtos com 1,000 a 2000 nucleotiios de comprimento.A seta vermelha mostra 2 posiglo dos “ragmentos de Okazaki” no gradient do produto do gene dnaA ~ proteina DnaA ~ as quatro repeticdes de 9 pares de bases (pb) em oriC. Em scguida, as proteinas DnaA ligam-se de maneira cooperativa para formar um cerne de 20 a 40 polipeptidios com DNA de oriCenrolado sobre a superficie do complexo proteico. A separacao do filamento comeca nas trés repeticdes con- secutivas de 13 pb em oriC e propagase até a criacio da bolha de replicacio. Um complexo de proteina DnaB (a DNA helicase hexamérica) e proteina DnaC (seis molé- culas) une 0 complexo de iniciacio ¢ contribui para a formagio de duas forquilhas de replicacao bidirecionais, A proteina DnaT também esta presente no complexo de proteina de préiniciacio, mas sua funcao € desconheci- Enzima + NAD 1 FIGURA 10.14 A DNA ligase catalisa o fechamento covalente de cortes no DNA. A energa necessria para formar a lgacéo éster & fornecida por trifosfato de adenosina (ATP) ou dinucleotido de nico- tinamida-adenina (NAD). dependendo da espécie,236 Fundamentes de Genética ore REE ETO Tepes de Sub Rapebates eID te IS Le © spraehacran pee a5 ato : teobctes de, Protea Drak Sphen ore Outras motéculas 6a prateina DnaA igamse cooperativamente, ‘ormando um complexo com (Fi enrolado na superficie. TJ Asencio do aero comera nas repetnies de 130 "@© A proteins DnaB (DNA helicase) ‘ea proteina DnaC unemse 20 Complex de iniciacao e produzem uma bolha de replicacao. Oy Protina One®, (DNA helicase) Proteina Dna | FIGURA 10.15 Pré-iniciacBo da replicaggo de DNA em oriC no cro- mossomo de E.coli da, Outras proteinas associadas ao complexo de iniciagao em oriG sao a proteina Dna], a proteina Dnak, a protei- na PriA, a proteina PiB, a proteina PriC, a proteina de ligagao ao DNA HU, a DNA girase e a proteina de ligacio a0 DNA unifilamentar (SSB). Em alguns casos, porém, nao ha comprovagao de sua participacao funcional no processo de pré-iniciacio; em outros casos, sua partici- pacdo é conhecida, mas o papel € ignorado. A proteina DnaA parece ser a principal responsivel pela separacao Jocalizada dos filamentos em oriC durante o proceso de iniciagao. INICIACAO DE CADEIAS DE DNA COM INICIADORES DE RNA ‘Todas as DNA polimerases conhecidas tém necessidade absoluta de um grupo $'-OH livre na extremidade do filamento de DNA estendido e um filamento-molde de DNA apropriado (especificando o filamento nascente complementar) para que scjam ativas. Nenhuma DNA polimerase conhecida é capaz de iniciar a sintese de um novo filamento de DNA. Portanto, € preciso que haja a- gum mecanismo especial para iniciar a s{ntese de novas cadcias de DNA uma vez formada a bolha de replicacio. Ha muito tempo se sabe que a RNA polimerase, uma enzima complexa que catalisa a sintese de moléculas de RNAa partir de moldes de DNA, é capaz de iniciara sinte- se de novas cadeias de RNA em sitios especificos no DNA. ‘Quando isso ocorre, forma-se um hfbrido RNA-DNA no qual o RNA nascente: esti ligado por hidrogénio ao mol- de de DNA. Como as DNA polimerases sio capazes de estender cadeias de DNA ou RNA contendo um grupo 3/-OH livre, of cientistas comecaram a testar a ideia de ‘que a sintesc de DNA poderia ser iniciada pelo uso de ini- ciadores de RNA. Os resultados comprovaram essa ideia Pesquisas subsequentes mostraram que cada nova ca- deia de DNA é iniciada por um iniciador de RNA curto sin- tetizado por DNA primase (Figure 10.16). A DNA primase de E, coli é 6 produto do gene dnaG. Em procariotos, esses iniciadores de RNA tém 10 a 60 nucleotidios de com- primento, ao passo que em cucariotos si mais curtos, ‘com apenas cerca de 10 nucleotidios de comprimento. (0s iniciadores de RNA oferecem os grupos 3'-OH livres necessdrios para extensio covalente de cadeias polinucle- otidicas por DNA polimerases. Em E. coli, a enzima que catalisa a replicagdo semiconservativa do cromossomo 6 uma polimerase denominada DNA polimerase Il (veja & seco Miiltiplas DNA polimerases ¢ revisio). A DNA po- Jimerase TI catalisa 0 acréscimo de desoxirribonucleoti- dios aos iniciadores de RNA, seja de maneira continua no filamento lider, seja de maneira descontinua pela sin tese de fragmentos de Okazaki no filamento atrasado. A DNA polimerase III termina um fragmento de Okazaki quando colide com o iniciador de RNA do fragmento de Okazaki anterior. Em seguida, os iniciadores de RNA sio excisados e substituidos por cadeias de DNA. Essa etapa € realizada pela DNA polimerase I em E. coli. Além da atividade da iniciador de RNA 3'- OH 1m FIGURA 10.16 A iniciagSo de filamentos de DNA com iniciadores de RNA.A enzima DNA primase catalsa a sintese de flamentos de RNA curtos (10.2 16 nucleotides de comprimento) que sso complementa- res aos flamentos-molde. MT,a vm te RR HH ‘Aividade de polimerase 5’—> 3° Ye: oy geetaate aATeER EC AN 05 Clvagem Atividade de exonucl Cpitulo 10 | Replicagdo do DNA e dos Cromossomes 237 “SYN eK, | FIGURA 10.17 As tés atividades da DNA polimerase | em E.coli, As moléculas de DNA so representadas por esquemasplanificados com Um filamente complementar em cima ¢ outro embabo. Os esquemas enfatizam bem a polaridade quimica oposta (5’ > 3° e 3" —> 5") dos flamentos complementares. Como comentado no texto, as tes atividades — (A) atividade de polimerase 5’ —» 3, (B)atividade de exonuclease 51 — 3 e (C)atvidade de exonuclease 3” — 5’ ~sdo importantes em células de Ecol, polimerase 5' —> 8’ mostrada na Figura 10.12, a DNA po- limerase I tem duas atividades de exonuclease: uma ati- viidade de exonuclease 5" — 8', que apara os filamentos de DNA a partir das terminacdes 5', ¢ uma atividade de exo- nuclease 3’ —+ 5°, que cliva nucleotidios das terminacées 3" dos filamentos de DNA. Portanto, DNA polimerase I tem és atividades enzimaticas especificas (Figura 10.17), ¢ as trés so importantes na replicacio do cromossomo de E.coli. Aatividade de exonuclease 5’ — 3" da DNA polimera- sc I excisa o iniciador de RNA ¢, a0 mesmo tempo, a ati vidade de polimerase 5’ —> 3° da enzima substitui o RNA por uma cadefa de DNA usando o fragmento de Okazaki adjacente com seu grupo 3/-OH livre como iniciador. Como poderiamos esperar de acordo com esse meca- nismo de substituicao do iniciador, mutantes da palA de E.coli que no tém atividade de exonuclease 5” > 3' da DNA polimerase I falham na excisio de iniciadores de RNA e na unio de fragmentos de Okazaki. Depois que a DNA polimerase I substituiu o iniciador de RNA por ‘uma cadeia de DNA, 0 grupo 3'-OH de um fragmento de Okazaki esta préximo do grupo 5'fosfato do fragmen- to de Okazaki precedente. Esse produto € um substrato apropriado para a DNA ligase, que catalisa a formacio de uma ligacao fosfodiéster entre os fragmentos de Oka- zaki adjacentes. As etapas da sintese € substituicio dos iniciadores de RNA durante a replicagao descontinua do filamento atrasado sio ilustradas na Figure 10.18. DESENROLAMENTO DE DNA COM HELICASES, PROTEINAS DE LIGAGAO AO. DNA E TOPOISOMERASES A replicacio semiconservativa requer que os dois fila- mentos de uma molécula de DNA parental sejam se- parados durante a sintese de novos filamentos com- plementares. Jé que uma dupla hélice de DNA contém238 Fundementes de Genética Fiamento irico Sito de de DNA solace, inciacdo prérepicatvo eserrlado, e so fm Sto de inciacdo Iniciagdo da sintese do iriciador ‘de INA pola ONA primase em Md 2 dssociagdo da DNA primase \* Etersdo 5 3d rad de RNA polimerase Il inciada no grupo 50H lie do riciador de RNA pr |W aeeraemere : t 5 noms a ARAL "] reas smstne co adr de RWA porous de cxomunee Se ch BRspareraceesese’s—~ 3 por de bomesce 68 DNA place | 8 se 1G Fecarerto covente eos : Sree 3 ALU 1m FIGURA 10.18 Sintese e substituigdo dos inciadores de RNA durante a replicacio do flamento atrasado de ONA, Um flamento curto de RNA G sintettzado para prover um inilador de 3-OH para sintese de DNA (Figura 10.16). Em seguida, 0 iniiador de RNA € removido e substitui- ddo por DNA pelas atividades duplas de exonuclease S’ —> 3" e polimerase 5’ —> 3” presentes na DNA polimerase |. Depos, a DNA ligase une por ligagdo covalente a cadeia de DNA nascente,catalisando a formacdo de ligacées fosfodiéster entre 3'-hidroxias e 5'-fsfatos adjacentes (Figure 1014) dois filamentos que nao podem scr separados sem que scjam desenrolados, volta por volta, a replicaco do DNA requer um mecanisino de desenrolamento. Considerando-se que cada giro, ou volta, tem aproxi- madamente 10 pares de nucleotidios de comprimento, € preciso que a molécula de DNA seja rodada 360° uma ‘vez para cada 10 pares de bases replicados. Em E. coli, 0 DNA ¢ replicado na proporcéo aproximada de 30.000 nucleotfdios por minuto. Portanto, é preciso que uma molécula de DNA em replicacio gire a 3.000 revolu- Ses por minuto para facilitar o desenrolamento dos filamentos de DNA parental. O processo de desenrola- mento (Figura 10.194) conta com a participacao de en- zimas denominadas ONA helicases. A principal DNA heli case replicativa em E. coli € 0 produto do gene dnaB. As DNA helicases desenrolam moléculas de DNA usando energia derivada do ATP. Depois que os filamentos de DNA so descnrolados pela DNA helicase, é preciso manté-los na forma unifila- mentar estendida para replicacao. Esse estado é mantido por um revestimento de proteina de ligacio ao DNA unifilamen- ‘ar (proteina SSB) (Figura 10.198). A ligacdo da proteina SSB ao DNA unifilamentar € cooperativa; isto ¢, a liga Go do primeiro monémero de SSB estimula a ligacio de outros monémeros em sitios continuos na cadeia de DNA. Em vista da cooperatividade de ligacio da protefna SSB, toda a regido unifilamentar de DNA € rapidamente revestida por proteina SSB. Sem a cobertura de proteinaem — ‘ val — Dnatekse AP > oP a SSB, poderia haver renaturagao dos filamentos comple- ‘mentares ou formacéo de estruturas em grampo intra- Slamentares por ligacdes de hidrogénio entre segmen- tos curtos de sequéncias nucleotidicas complementares ‘ou parcialmente complementares. Essas estruturas em .grampo impedem a atividade das DNA polimerases. Em E.coli, a proteina SSB ¢ codificada pelo gene ssb. Lembrese de que 0 cromossomo de E. coli contém uma molécula circular de DNA. Com 0 DNA de E. coli girando a 3,000 revolucdes por minuto para permitir 0 -desenrolamento dos filamentos parentais durante a re- plicacdo (Figura 10.20), o que prové o pivd ou eixo de ro- tacdo que impede o entrelacamento (superhelicoidiza- ‘ 5’; no entanto, tem uma exonuclease 5! —> 3" ativa apenas no DNA unifi- lamentar. As DNA polimerases IV e V caracterizadas mais recentemente, com a polimerase IT, tém papéis impor-242. Fundomentos de Genética tantes na replicagio do DNA lesado, ea polimerase usada depende do tipo de lesio (Capitulo 13) (Os organismos eucariéticos codificam ainda mais po- limerases ~ ¢ até hoje jé foram identificadas pelo menos 15 DNA polimerases diferentes. As DNA polimerases ceucaribticas foram denominadas a, B, 7, 8, 8, « £1, 8 bs Hs € Revl, Duas ou mais DNA potimerases (0, 8 e/ou e) alam em conjunto para levar a cabo a replica- ‘do semiconservativa do DNA nuclear. A DNA polime- rase ‘y € responsivel pela replicacio do DNA em mito- cOndrias, e as DNA polimerases B, 6K, £5 mh 8, Ks Rs Hh 6 Revl sio enzimas de reparo do DNA ou tém outras funcdes metabélicas. Algumas DNA polimerases eucari6- ticas nao tém aatividade de exonuclease 3’ +5" presente na maioria das DNA polimerases procariéticas. “Todas as DNA polimerases estudadas até hoje, proca ridticas ¢ cucariéticas, catalisam a mesma reacio bisica: ‘um ataque nucleofilico do grupo 3’-OH livre da termina- 10 do filamento iniciador a0 atomo de f6sforo nucleoti- dil do rifosfato de nucleosidio precursor. Portanto, todas asDNA polimerases necessitam de um grupo S'-hidroxila livre em um filamento iniciador preexistente, Nenhuma dessas DNA polimerases inicia a formacio de novas ca- deias de DNA de novo, ¢ toda a sintese de DNA ocorre na direcao 5’ +3". ‘As principais DNA potimerases replicativas so extra- ordinariamente precisas, com uma frequéncia inicial de incorporacio de nucleotidios errados de 10° a 10°. (Al gumas polimerases de reparo sio propensas a erro ~ ver Capitulo 13.) Estudos da estrutura cristalina do comple- xo formado por uma DNA polimerase monomérica, um precursor do tifosfato de nucleosidio ¢ um DNA mol deiniciador contribuiram para a compreensio da alta fidelidade da sintese de DNA. Nesses esttidos, publicados em 1998, Sylvie Doublié ¢ colaboradores identificaram a estratura da polimerase do fago T7, que é semelhante 4 DNA polimerase de E.coli, com resolucao de 0,22 nm. Os resultados mostram que a polimerase tem 0 formato de uma pequena mio, na qual o tifosfato de nucleosidio recebido, o molde e a terminacao do iniciador esto to- dos firmemente apreendidos entre o polegar, os outros dedos ea palma (Figura 10.24). A enzima justapoe 0 wifos fato de nucleosidio recebido & terminacio do filamento iniciador, em posicao para formar ligacdes de bidrogénio com a primeira base sem par no filamento-molde. Por tanto, a estrutura desse complexo de polimerase € uma explicagio simples para a selecio, guiada pelo molde, dos nucleotidios recebidos durante a sintesc de DNA. 'ADNA polimerase III, a “replicase” em F. coli, € uma enzima multimérica (enzima que tem muitas subuni- dades) com massa molecular aproximada de 900.000 dal- tons em sua forma completa ow holoentima. © ceme minimo que tem atividade catalitica in vitro tem trés subunidades: « (produto do gene drab), ¢ (produto de dnaQ) e 6 (produto de dolk). © acréscimo da subunidade 1 (produto de dinaX) provoca dimerizacio do cerne ca- talitico e aumento da atividade, O cere catalitico sinte- tiza filamentos de DNA bastante curtos em vista de sua TMM... corns RA 10.24 Esquema (A) € modelo espacial (B) da estrutura do ‘complexo entre a DNA palimarase do fagoT7. 0 DNA molde-iniciador uma molécula precursora de tifostato de nuceosidio (dGTP). © filamento-molde, o filamento iniclador e 0 trfosfato de nucleosidio so mastrados em amarelo, magenta e ciano, respectivamente, Os Componentes protelcos so mostrados em roxo, verde, laranja ecinza. ‘Observe ajustaposicdo entre otrifasfato de nuceosidio,a terminacéo do iniciador eo filamento-molde em (8) tendéncia a diminuir molde de DNA. Para sintetizar as ‘moléculas de DNA longas presentes nos cromossomos, € preciso eliminar essa frequente dissociacio da polimera- se do molde. A subunidade B (produto do gene dnaN) da DNA polimerase III forma uma pinga dimérica que impe-dea polimerase de diminuir o DNA molde (Figura 1025) O dimero B forma um anel que circunda a molécula de DNA em replicacdo e possibilita que a DNA polimerase Ill deslize ao longo do DNA enquanto permanece pre- saa ele. A holocnzima DNA polimerase II, responsivel pela sintese de ambos os filamentos de DNA nascentes em uma forquilha de replieagio, contém no minimo 20 polipepifdios, A complexidade estrntural da holoenzi- ma DNA polimerase II ¢ilustrada na Figure 10.26; 0 desc- nnho mostra 16 dos potipeptidios mais bem caractexizados coxificados por sete genes diferentes, Conforme jé comentamos, a fidelidade da duplicacio do DNA ¢ inerivel — com apenas um erro em cada bilhiio de pares de bases logo apés a sintese. Essa alta fidelidade € necesséria para manter a carga de mutacio em nivel toleravel, principalmente em grandes genomas como os de mamiferos, que contém 3 X 108 pares de nucleotidios. Sem a alta fidelidade da replicacio de DNA, 0 fenotipo dos gémeos monozigéticos comentados no inicio deste capitulo seria menos semelhante. Na verdade, quando se levam em conta as estruturas dindmicas dos quatro nucleotidios no DNA, a fidelidade observada da replica: se 7 Duis renders re co sduneaeE 5 5 2 Dinero da stn forms um ae cecleanie oer Gora Se 8 | FIGURA 1025 O modelo espacial (A) © o desenho (8) mostram 10 duas subunidades 8 (verde-clara e verde-escura) da DNA poli- ‘merase Il prendem a enzima 8 molécula de DNA (az). | FIGURA 10.26 Estruture da holoenzima DNA polimerase Ill de E coll. Os nimeros indicam as massas des subunidades em daltons, cio de DNA € muito maior que a esperada. As alteragdes termodindmicas em nucleotidios que possibilitam a for- maco de outros pares de bases ligados por hidrogénio além de AT ¢ G:C preveem taxas de erro de 10° a 10, ou um erro por 10.000 a 100.000 nucleotidios incorpo- rados, A taxa de erro prevista dle 10,000 vezes a taxa de erro observada suscita a duvida sobre o mecanismo para alcancar essa alta fidelidade de replicagio do DNA. 0s organismos vivos desenvolveram um mecanismo de revisio durante a sintese da cadeia de DNA nascente para resolver © possivel problema da fidelidade insuficien- te durante a replicacio do DNA. O processo de revisio. inclui a varredura das terminagées das cadeias de DNA nascente a procura de erros € sua correc, Esse processo € realizado pelas atividades de exonuclease 3! — 5! das DNA polimerases (Figura 1027). Quando um DNA mol de-iniciador tem um erro de pareamento terminal (nio parcamento ou pareamento errado de uuma base ou uma sequéncia de bases na extremidade 3" do iniciador), a ati- vidade de exonuclease 8’ +5’ da DNA polimerase corta as bases ndo pareadas (Figura 10.27). Quando é produ- zida uma terminacao com pareamento de bases correto, a atividade de polimerase 5’ —> 3° da enzima reinicia a sintese por acréscimo de nucleotidios a extremidade 3° do filamento iniciacior Enzimas monoméricas, como a DNA polimerase I de E, coli, tem atividade de exonuclease 3’ > 5 intrinseca, Em enzimas multiméricas, a atividade de exonuclease de revisio 3! 5 geralmente est presente em uma subuni- dade separada. No caso da DNA polimerase III de E. coli essa fungio de revisio é realizada pela subunidade &. A DNA polimerase IV de E. coli ndo tem atividade de exo- nuclease, Em eucariotos, as DNA polimerases 7, 8 ¢ « tém. atividades de exonuclease cle revisio 5” —>5', mas as poli merases a ¢ fi nio tém essa atividade. Sem revisio durante a replicagéo de DNA, as aparén- cias de Merry ¢ Sherry, as gémeas apresentadas no inicio deste capitulo, seriam menos semelhantes. Sem revisio, asalteracdes teriam se acumulado em seus genes durante 0s bilhdes de divisdes celulares ocorridos desde que eram pequenos embrides até se tornarem adultas, Na verdade, aidentidade dos gendtipos de gémeos idénticos depende tanto da revisio do DNA durante a replicagio quanto da atividade de um arsenal de enzimas de reparo do DNA244 Fundamentos de Genética At x c 1m FIGURA 10.27 Revisdo pela ativdade de exonuclease 3’ —> 5" das DNA polimerases durante a replicacio do DNA. Assim como na Figu= 2 10-17,s matéculas de DNA so apresentadas ern esquema. Ao encontrar um molde e um iniciador com erro de pareamento na terminagSo 1 do iniciador (A), a DNA polimerase ndo catalsa a extens8o covalente (polimerizaro). Em vez disso a atividade de exonuclease 3° —> 5°, funcdo intinseca de muites DNA polimerases,civa © nuceotidio terminal errado(B).Entdo, quando o par de bases na termina do iniciador std corrto, a DNA polimerase catalisa a extensio covalente 5’ —+ 3° do flamentoiniciador (C). (Capitulo 18). Essas enzimas fazem a varredura continua do DNA a procura de varios tipos de danos ¢ executam 0 reparo antes que as transfor mages causem alteragoes genéticas hereditarias. © PRIMOSSOMO E O REPLISSOMO ‘A iniciagdo dos fragmentos de Okazaki no fila ‘mento atrasaclo é executata pelo primossomo, com- plexo proteico que contém DNA primase ¢ DNA helicase. O primossomo movese ao longo da mo- lécula de DNA, alimentado pela energia do ATP. A medida que avanca, a DNA helicase desenrola 4 dupla hélice parental, e a DNA primase sinteti 12 08 iniciadores de RNA necessérios para iniciar sucessivos fragmentos de Okazaki. Os iniciadores de RNA sio estendidos por ligacdo covalente com coacréscimo de desoxirribonucteotidios pela DNA polimerase III As DNA topoisomerases produzem quebras transitérias no DNA que servem como pivos para o desenrolamento do DNA ¢ mantém ‘0 DNA desentrelacado. A proteina de ligacio a0 DNA unifilamentar recobre 0 DNA pré-replica- tivo desenrolado ¢ 0 mantém estendido para a DNA polimerase IIT. Os iniciadores de RNA slo substituidos por DNA pela DNA polimerase I, ¢ 08 cortes unifilamentares deixados pela polimerase I sio fechados pela DNA ligase. Essa sequéncia de eventos que ocorre em cada forquilha de repli- cacéo durante a replicacio semiconservativa do ‘cromossomo de £, colié ilustrada na Figura 10.28. ‘A medida que uma forquilha de replicacio se move ao longo de uma dupla hélice parental, dois filamentos de DNA (o filamento continuo ¢ 0 f Tamento descontinuo) sio replicados na série al “Topoisomerase Protea de lgacdo 20, DNA uniflamentar (SSB) oloenzima DNA polmerase I : Fiomento 9 Fant Flmeto 3s 1 cua 1028 Diagrams de ume frqiha de replicaso emt ol mostan- dos prnclais eormponents do apaeho de replica. NMP = monoost- tos de bonaceesiia. RANEtamente coordenada de reacdes j4 descritas, © aparelho de replicacao completo que se move ao longo da molécu- Ja de DNA em uma forquilha de replicacio € 0 replssomo (Figura 10.29). O replissomo contém a holoenzima DNA. polimerase Ill; um centro catalitico replica o filamento continuo, o segundo centro catalitico replica o filamento descontinuo, € 0 primossomo desenrola a molécula de DNA parental e sintetiza os iniciadores de RNA necessiios paraa sintese descontinua do filamento atrasado. Para que 0s dois centros cataliticos da holoenzima polimerase IIL site tetizem tanto o filamento lider quanto o filamento atrasado nascentes, acredita-se que o filamento atrasado forme uma alga que se estende do primossomo até 0 segundo centro catalitico da DNA polimerase IIT (Figura 10.28) Em E. col, 0 término da replicacéo ocorre em sitios varidveis nas regides denominadas terA ¢ ierB, que blo- queiam o avanco da forquilha de replicacao nos sentidos antihorario e horério, respectivamente, Entio, as DNA topoisomerases ou enzimas de recombinacio especial facilitam a separacdo das moléculas nascentes de DNA. © DNA € condensado no nucleoide, ou genoma dobra- do, de E, coi, em parte pela super-helicoidizacao negativa produzida por DNA girase. No inicio deste capitulo, comentamos a extraordina- xia fidelidade da replicacio de DNA. Agora que examina- ‘mos 0 mecanismo celular responsével pela replicacio de DNA em organismos vivos, essa fidelidade nao parece tio surpreendente. Um aparelho muito sofisticado, com pro- tec6es intrinsecas contra disfuuncdes, se desenvolveu para garantir que as informacées genéticas de E. coli sejam. ‘transmitidas com precisio de uma geragao para outa. REPLICAGAO POR CIRCULO ROLANTE Nas segdes anteriores deste capitulo, nds abordamos a re- plicacio do DNA em formato de 8, de olho € de Y. Agora examinaremos outro tipo importante de replicacao do Ccaptulo 10 | Replcacdo do DNA edos Cromossomos 245, DNA denominado replicagéo por circulorolante. A replicagao por circulo rolante € usada (1) por muitos virus para du- plicar o genoma, (2) em bactérias para transferir DNA de ‘células doadoras para células receptoras durante tum tipo de troca genética (Capitulo 8) e (3) em anfibios para am plificar DNA extracromossomicos com aglomerados de genes de RNA ribossémico durante a ovocitogénese. Como indica o nome, a replicacao por cfrculo rolante um mecanismo de replicacdo de moléculas circulares de DNA. O aspecto peculiar da replicacao por circulo rolante é que um filamento de DNA circular parental permanece intacto e rola (daf o nome efrculo rolante) ou gira, servindo como molde para a sintese de um novo filamento complementar (Figura 1030). A replicacdo € iniciada quando uma endonuclease especifica de uma sequéncia cliva um filamento na origem, produzindo ter- minacdes 8-OH e 5'fosfato. A terminacao 5’ € desloca- da do circulo enquanto o filamento-molde intacto gira em torno de seu eixo. Hi extensio covalente no grupo 8-H do filamento clivado. Ja que o DNA molde circu- lar pode girar 360° muitas vezes, com a sintese de um filamento de DNA completo ou com uma unidade a cada volta, a replicacio por cfrculo rolante gera caudas unifi- Tamentares mais longas que © perimetro do cromossomo circular (Figura 10.30). A replicacao por circulo rolante pode produzir DNA uni ou bifilamentar. As molécutas ‘unifilamentares circulares sio produzidas por clivagem sitio-especifica das caudas unifilamentares nas origens de replicagio e recircularizacdo das moléculas produzi- das com uma unidade de comprimento. Para produzir moléculas bifilamentares, as caudas unifilamentares sio usadas como molde para a sintese descontinua de fila- ‘mentos complementares antes da clivagem e circulariza- ‘0. As enzimas participantes da replicacao por circulo rolante ¢ as reacies catalisadas por essas enzimas so ba- sicamente iguais As responsaveis pela replicago do DNA ‘com a participagao de intermeditrios tipo 8. DNA polimerase i, efetuando 2 replicacdo continua do ‘lamento lider Fragmento de Okazaki novo 2 replcacdo descontinua do flamento atrasado Subunidade B Fragmento de Okazaki antigo 1m FICURA 10.29 Diagrams do replissomeo de E.coli que mostra os dots cernes catalticos de DNA polimerase Il replicando os Flamentos lider ‘eatrasado € o primassomo desenvolando a dupla hélce parental einiciando a sintese de novas cadeias com iniciadores de RNA. Todo o replis- somo move-se a0 longo da dupla hélice parental, cada componente executa sua fung3o de maneira orquestrada. Na verdade, 0 complexo de replicacéo provavelmente no se move. Em vez disso, 0 DNA é puxado através do repissomo. A replicagdo esté ocorrendo da esquerda pare a direita. Mcrografia original cedida por David Dressler, Harvard University.246 Fundamentos de Genética Dupls hece de ‘DNA ceva parental = Ofgem de rptiaréo | GF Aendncieare especie ae 1 Sequels predu m ora ta ongem Ys extremiade 5) ¢ desocada 2 ‘tens covalent comers no g.00 3-OH. re 2D Y 0 tamertoalde cc coreue 9 rar” ‘comontense easier grupo 3-OF 2 TS 2® $H ooneianetr 4 pad pr sese Seshor oor epee con 3 ‘Sofa none cone nde sequin ow Sones recreoracdo Fropmentos de tazak fe |B FIGURA 10.30 O mecanismo de circulorolante da repli- » cacio de DNA, © material dos novos cromossomas (0 caso, DNA unifiamentar para o virus @X174) € produa- do por cépla continua de um culo de DNA biflamentar cortado, ¢ flamenco intacto serve de molde. Micrografa letrnica ced por David Dressler, Harvard Univers PONTOS ESSENCIAIS «4 rplicardo de DNA é comple, exigindo a partcipao de wn grande nmere de proeinas + A.sintese de DNA & continua no flamento que eta sendoetondid na dre gral 5 —> 3, ‘nas 6 dscontnua na filamenta que cnsce nadir geal 3» 3° + Nowascadeas de DXA so inivadas or niiadoes de RNA curtos sinttizades por DNA primase + Asintese de DNA écatlisada por encimas chamadas DNA polimerases 1s Tadas as DNA polimerases necessitam de um filamento iniciador, que é estendido, e um filomento mole, que écopiado Todas as DNA polimerass tim necesidade absolute de wm grup 3-OF lor no ilamento inicio eta a sintese de DNA ocore na diecio 5'—> + Avatvidades de exonuclease 3'—+ 5' das DNA fomerassrevisam os fitamento & mer queso sintetizadas,romovendo nucleotdis com paneamento errado nas terminagies dos Filaments inciadores «As ensimas eas proenas de ligacdo ao DNA participants da eplcardoreinense cm um replisiono em cada forgilha de mplicac eatuam em conjunta & medida que w forqulha cvanca ao lingo da molécla de DNA parental.rm 8 Rn mamma ht mee MMMM 8 Capitulo 10 | Repicagbo do DNA edos Cromossomes 247 Aspectos especificos da replicagao de cromossomos eucaridticos Embora as principais caracteristicas da replicagao de DNA sejam iguais em todos os organismos, alguns pro- cessos ocorrem apenas em eucariotos. A maioria das informagées sobre replicacio de DNA re- sultou de estudos de E. colie alguns de seus virus. Ha me- ‘nos informacdes disponiveis sobre a replicacao de DNA ‘em organismos eucaridticos. No entanto, hid informacSes saficientes para concluir que a maioria dos aspectos da seplicacio de DNA é semelhante em procariotos © eu cariotos, inclusive em seres humanos. Os iniciadores de BNA e os fragmentos de Okazaki si0 mais curtos em ew. ariotos do que em procariotos, mas os filamentos lider ‘© atrasado replicam-se por mecanismo continuo ¢ des continuo, respectivamente, nos eucariotos assim como ‘sos procariotos. Todavia, alguns aspectos da replicacio Ge DNA eucaristico sio exclusivos dessas espécies de es- xa mais complexa. Por exemplo, a sintese de DNA ‘ecorre durante uma pequena parte do ciclo celular nos -excariotos, € ndo continuamente como nos procariotos. “A replicacio das moléculas de DNA gigantes presentes ‘cx cromossomos eucariéticos seria demorada cemais se a cromossomo tivesse uma tinica origem. Portanto, 08 -cromossomos eucariéticos tém muiltiplas origens de re- “plicacio, Em ver de usarem dois complexos cataiticos de ‘sma DNA polimerase para replicar os filamentos lider ¢ ‘srrasadlo em cada forquilha de replicacao, os organismos ‘excari6ticos usam duas ou mais polimerases diferentes. Como discutimos no Capitulo 9, 0 DNA eucaristico € cmpacotado em nucleossomos, estruturas que contém ‘bisconas, Esses nucleossomos impedem o movimento das Sorquilhas de replicacio? Caso nfo impecam, como o -ccplissomo transpde 0 nucleossomo? O nucleossomo € -desmontado total ou parcialmente, ou a forquitha des- ‘iza de alguma maneira além do nucleossomo & medida que 0 replissomo duplica a molécula de DNA enquan- st» ainda esta na superficie do nucleossomo? Por fim, os cromossomos eucaridticos contém moléculas lineares de DNA, e a replicacio descontinua das extremidades das -smoléculas Iineares de DNA eria um problema especial, “Abordaremos esses aspectos da replicacio de cromatina ‘em cucariotos nas secdes finais deste capitulo. CICLO CELULAR Quando as bactérias esto crescendo em meios ticos, a replicagio de DNA ¢ ininterrupta durante todo o ciclo celular. Em eucariotos, porém, a replicacio do DNA é res ita a fase S (de sintese; Capitulo 2). Lembrese de que © ciclo em uma eélula eucariética normal € dividido em ase G, (logo apés o fim da mitose; G, de gap, intervalo), fase S, fase G, (preparo para mitose) ¢ fase M (mitose) (veja detalhes no Capitulo 2). Nas células embriondrias em rapida divisio, G, ¢ G, si0 muito curtas ou inexisten- tes. Em todas as eélulas, as decisées de prosseguir no ci- clo celular ocorrem em dois pontos: (1) entrada cm fase Sc (2) entrada em mitose. Esses pontos de verificacio ajudam a garantir que s6 haja uma replicacao do DNA a cada divisio celular MULTIPLOS REPLICONS POR CROMOSSOMO ‘As moléculas gigantes de DNA nos maiores cromossomos de Drosophila melanogaster contém cerca de 6,5 X 10" pax res de nucleotidios. A taxa de replicagio do DNA em ‘Drosophila é de aproximadamente 2.600 pares de nucleo- tidios por minuto a 25°C, Portanto, uma tinica forquilha de replicacio levaria cerca de 17,5 dias para replicar uma dessas moléculas gigantes de DNA. Com duas forquilhas de replicacio que se movem nas duas direcdesa partir de ‘uma origem central, essa molécula de DNA seria replicada em apenas 8.5 dias. Como os cromossomos de embrides de Drosophila se repticam em 3 a 4 min € 05 niicleos se dividem uma ver a cada 9 a 10 min durante as clivagens iniciais, esta claro que cada molécula de DNA gigante tem de conter muitas origens de replicacio, Na verdade, a replicacio completa do DNA do maior cromossomo de Drosophila em 3,5 min exigiria mais de 7.000 forquilhas de replicacio distribusdas a intervalos iguais ao longo da ‘molécula, Portanto, miltiplas origens de replicacao sio necessdrias para que as moléculas muito grandes de DNA ‘em cromossomos eucaridticos se repliquem nos perfodos de divisio celular observados. ‘A primeira evidéncia das miiltiplas origens em cro- mossomos cucaristicos surgiu com os experimentos de pulselabeling com cétulas de hamsters chineses em cultu- ra. Em 1968, quando Joel Huberman e Arthur Riggs mar- caram céhulas com pulsos de *FL-timidina durante alguns minutos, extrairam 0 DNA e analisaram por autorradio- grafia o DNA marcado, observaram séries em tandem de graos de prata expostos (Figura 10.314). A interpretacio mais simples dos resultados é que cada macromolécula de DNA contém miiltiplas origens de replicacdo. Quando o periodo de pulse-labeling foi seguido por um curto inter- valo de crescimento em meio nao radioativo (experimen- tos de pulsechase), as séries continham regides centrais de alta densidade granular com caudas de densidade gra- nular decrescente nas duas extremidades (Figura 10.316) Esse resultado indica que a replicacio em eucariotos € bidireeional, assim como ta maioria dos procariotos. AS caudas de densidade gramular decrescente sio resultado da diluicdo gradual dos actimulos intracetulares de "Ht ‘midina por 'H-timidina & medida que as forquilhas de re- plicacio avangam das origens centrais, nas duas direcdes, até as terminacdes de replicacdo (Figure 10.310).248 Fundementos de Genética ‘Um segmento de DNA cuja replicacio esteja sob con- trole de uma origem ¢ duas terminagdes é denominado réplicon. Em procariotos, geralmente o cromossomo in- tciro é um réplicon. A existéncia de miltiplos réplicons por cromossomo cucaristico foi verificada diretamente por autorradiografia microscopia eletronica em va rias espécies diferentes. Os genomas de seres humanos € outros mamiferos contém aproximadamente 10.000 origens de replicagio distribu(das nos cromossomos a intervalos de 30.000 a 300.000 pares de bases, Sem diivi- da, 0 niimero de réplicons por cromossomo nao € fixo durante todo o crescimento e o desenvolvimento de um = ™ Seams rdoatves 109i bog A Autorradiografia de parte de uma molécula de DNA de uma célula Leia resposta do problema nossite http://gen-io.grupogen.com.br. 0 omamamamemnnimirnem em mt a 0h NO em = Capitulo 10 | ReplicagSo de DNA e dos Cromossomes 249) uma DNA helicase. Os filamentos desenrolados so man- tidos no estado estendido por uma proteina de ligacio ao DNA unifilamentar denominada proteina de repli- cagio A (Rp-A). No entanto, a0 contrério do proceso ‘em procariotos, a replicacdo do DNA cromossémico em ‘eucariotos requer a atividade de trés diferentes DNA po- limerases ~ polimerase a (Pol a), polimerase 8 (Pol 8) € polimerase ¢ (Pol e). No minimo duas polimerases, tal- ver todas as trés, esto presentes em cada forquilha de replicacio (replissomo), e cada polimerase contém miil- tiplas subunidades. Além disso, enquanto o replissomo de E, colicomtém 13 proteinas conhecidas, 0s replissomos de leveduras e mamiferos contém no minimo 27 polipep- ‘dios diferentes. Em eucariotos, a Pol « € necesséria para o inicio da replicagio nas origens e para iniciagao dos fragmentos de Okazaki durante a sintese descontinua do filamento atrasado. A Pol existe em um complexo estavel com a DNA primase; na verdade, elas copurificam durante 0 isolamento. A primase sintetiza os iniciadores de RNA, que entio sio estendidos com desoxirribonucleotidios pela Pol « para produzir uma cadeia de RNA-DNA com comprimento total de aproximadamente 30 nucleoti- dios. Entio, essas cadeias iniciadoras de RNA-DNA sio estendicas pela Pol 5. A Pol & completa a replicacao do filamento atrasado, enquanto a polimerase & catalisa a replicacio do filamento lider. A Pol 8 tem de interagir com proteinas PCNA (antigeno nuclear da célula em proliferacio) ¢ o fator de replicacao C (REC) para ser ativa (Figura 10.32). © PCNA é 0 grampo deslizante que prende a Pol § ao DNA para possibilitar a replicacao processiva (para evitar que a polimerase diminua o mol- de); O PCNA é equivalente & subunidade B da DNA polimerase III em £. coli (Figura 10.25), O REG é ne- cessirio para carregar 0 PCNA sobre 0 DNA. © PCNA € uma proteina trimérica que forma um anel fechado, ‘¢ REC induz a mudanga da conformacao do PCNA que torna possivel circundar o DNA, produzindo o grampo Geslizante essencial. As polimerases 8 ¢ & contém a clease 8" — 5! necessaria para revi Elas, porém, nao tém atividade de exonuclease 5’ > 3; portanto, nao removem iniciadores de RNA como faz a DNA polimerase I de E. coli. Em vez isso, 05 i dores de RNA sio excisados por duas nucleases, ribo- nuclease HI (que degrada o RNA presente em diiplex RNA:DNA) e ribonuclease FEN-1 (FI nuclease 1). A Pol 3 entio preenche as lacunas ¢ a DNA ligase fecha 0s cortes, produzindo filamentos fechados por ligacdo co- valente. Como jé foi mencionado, ha pelo menos 15 DNA po- limerases diferentes ~ a, B, 7, 8, €, «, £1, 8, Ks Hh, 0 & € Revl ~em eucariotos. A DNA polimerase y € responsé- vel pela replicacao do DNA em mitocéndrias, ¢ as outras DNA polimerases tém papéis importantes no reparo do DNA c em outras vias (Capitulo 13).250. Fundamentos de Genétics Feator de repicagio C sues cortnua do 5” SOREN irons Be Sintese descontinua do ——= srs flamento atrasado |W FIGURA 10:32 Alguns dos componentes DNA poimerase 8 PCNA (= "grampo") DNA polimerase © Proteina de repicacdo A Fragmenio de Okazaki ortantes de um replissomo ern eucariotos. Cada replissomo contém trés diferentes polimerases, «4,8 @ 2.0 complexo DNA polimerase a-DNA primase sintatiza os iniciadores de RNA e acrescenta segmentos curtos de DNA. Entéo, @ DNA polimerase 8 completa a sintese dos fregmentos de Okazaki no flamento atrasado, @ a polimerase« catalsa 2 sintase continua do filamento Uider. © PCNA (de proliferating cell nuciear antigen, antigeno nuclear da célla er prolferagdo) equivale & subunidade B da DNA polimerese Ide €colfele prende as erases 6 e «8 molécula de DNA, faciitando a sintese de cadelas ongas de DNA. As ribonucteases Hie FEN-1 (FI nuclease 1) remover os inciadores de RNA, a polimerase 8 preenche a fenda, ea DNA ligase (no mostrada) fecha os cortes, assim como na E. col (Figura 10.18). DUPLICACAO DE NUCLEOSSOMOS NAS FORQUILHAS DE REPLICACAO Conforme comentamos no Capitulo 9, 0 DNA em cro- mossomos interfasicos cucariéticos € empacotado em nucleossomos, que medem aproximadamente 11 am. Cada nucleossomo contém 166 pares de nucleotidios de DNA enrolado em duas voltas em torno de um oc- timero de histonas. Em vista do tamanho dos nucleos- somos € do grande tamanho dos replissomos de DNA, parece improvavel que uma forquilla de replicacio pos sa ultrapassar um nucleossomo intacto. No entanto, as micrografias eletronicas da cromatina em replicacao em Drosophila mostram com clareza nucleossomos com es trutura ¢ intervalos aproximadamente normais nos dois lados das forquilhas de replicacao (Figura 10.334); isto é, ‘08 nucleossomos parecem ter estruturas e espacamentos iguais imediatamente atrés de uma forquilha de replica- cdo (DNA pésreplicativo) e na frente de uma forquilha de replicaciio (DNA pré-replicativo). Essa observacio su- gere que é preciso desmontar os nucleossomos para que © replissomo possa duplicar 0 DNA empacotado neles e, depois, remonté-los rapidamente; isto é, a replicacio do DNA ¢ amontagem do nucleossomo tém de estar estrei- tamente acopladas. Ja que a massa de histonas nos nucleossomos equivale 4 de DNA, € preciso que haja sintese de grande quanti- dade de histonas a cada geracio celular para que 0s mi dleossomos se dupliquem. Embora a sintese de histonas ocorra durante todo 0 cielo celular, hd um pico de bios- sintese de histonas durante a fase $ que produz histonas suficientes para duplicacio da cromatina. Quando se rea- lizaram experimentos de transferéncia de densidade para ‘examinar 0 mecanismo de duplicagao dos nucleossomos, constatouse que os nucleossomos nas duas moléculas de DNA produzidas continhan complexos de histona anti- 08 (préreplicativos) € novos (pés-replicativos). Portan- 10, no nivel das proteinas, a duplicacio do nucleossomo parece ocorrer por mecanismo dispersivo. \Vatias protefnas participam da desmontagem e mon- tagem dos nucleossomos durante a replicagio do cro- mossomo em eucariotos. Duas das mais importantes sio a proteina 1 de montagem do nucleossomo (Nap-1, de ‘mucleosome assembly frotein-I) e o fator 1 de monta- gem da cromatina (CAF-L, de chromatin assembly fac- tor-1). Nap-I transporta histonas de sew local de sinte- se no citoplasma até 0 miicleo, e CAF-1 levaas até os sitios cromossémicos de montagem do nucleossomo (Figura 10.338). CAI leva as histonas até 0$ locais de replicagio do DNA por ligacdo ao PCNA (de proliferat- ing cell nuclear antigen, antigeno nuclear da célula em prolifcracio) ~o grampo que prende a DNA polimerase 8 a0 molde de DNA (Figura 10.32). CAF-1 € uma protef na essencial em Drosophila, mas néo em leveduras, nas quais outras protefnas podem executar algumas de suas funcdes. “Muitas outras protefnas afetam a estrutura do nucleos- somo. Algumas participam da remodelagem da cromatina —modificacao da estrutura do nucleossomo de maneira a ativar ou silenciar a expressio dos genes nele empacota- dos. Outras modificam a estrutura do nucleossomo pelo acréscimo de grupos metila ou acetila a histonas especifi- «as. Além disso, os eucatiotos contém varias histonas me- nores, com estruturasligeiramente diferentes das histonasmn Capitulo 10 | Replcacio do DNA dos Cromossomés 251 ‘Montagem de nucleossomos durante a replicagao do cromossomo. Protena 1 de montagem do nucleossomno (Nap) “he Citoplasma Nucleossomos Dimeros Ge higtona Fator 1 de montagem da Nucleossomo parental ecémamontados 1 FIGURA 10.33 Desmontagem e montagem de nucleassomos durante a repicagio de cromossomos em eucariatos.A. Micrografia eletrbnica -mostrando nucleossomos nos dais tados das duasforquilhas de replicacdo em Drosophila. Lemibre-se de que a replicac3o do DNA ¢ bidirecional portanta, cada ponte de ramificagao & uma forqullha de replicacSo. B.A montagem de novos nucleossomos durante a replicagSo do cromos- ‘somo requer protainas que transportam histonas do citoplasma para o nucleo e que as concentram no lacal de montagem do nucleossomo, PCNA = antigeno nuclear da cSiula em prolferagdo (Figura 1032). principais, ¢ a incorporacdo dessas histonas menores aos nucleossomos pode modificar sua estratura, Em. Droso- hila, por exemplo, a incorporacio da histona H3.3 aos rnucleossomos causa altos nfveis de transcri¢do dos genes neles contidos. Assim, a estrutura do nucleossomo nao invariavel; ao contrério, tem um papel importante na mo- dulagdo da expressio génica (ver O futuro: Remodelagem da cromatina e expressdo génica no Capitulo I ¢ a secio Remodelagem da cromatina no Capitulo 19). TELOMERASE | REPLICACAO DAS TERMINAGOES DO CROMOSSOMO. Apresentamos as estruturas especiais dos telomeros, ou extremidades cromossdmicas, no Capitulo 9. Um motivo inicial para acreditar que os telomeros tenham estruturas especiais foi o fato de que as DNA polimerases no repli- cam 0 segmento de DNA terminal do filamento atrasado de um cromossomo linear, Na extremidade da molécula de DNA replicada de maneira descontinua, nao haveria {lamento de DNA para oferecer um grupo 3'-OH livre (iniciador) para polimerizacao dos desoxirribonucleoti- dios depois da excisio do iniciador de RNA do fragmen- to de Okazaki terminal (Figura 10.344). Assim, € preciso ) que © telmero tenha uma estrutura exclusiva que facilite sua replicacao ou (2) que exista uma cnzima espe- cial que resolva esse enigma de replicacao da terminacio do filamento atrasado. Na verdade, as evidéncias com- provaram as duas opcdes. A estrutura especial dos teld- meros garante um mecanismo perfeito para o acréscimo de telomeros por uma enzima que contém RNA, a telo merase, Essa enzima exclusiva foi descoberta em 1985 por Elizabeth Blackburn e Carol Greider. Blas receberam 0 Prémio Nobel em Fisiologia ou Medicina de 2009 com Jack Szostak, que, com Blackburn, descobriu como as es- truturas especiais dos teldmeros protegiam-nos contra 2 decomposicao.252 Fundarentos de Genética 0 problema do iniciador do flamento atrasado no telomero. Extremidade proximal ‘ ‘a0 ceatrémero, Extremidade distal y Sian 5 Fragmento de Okazaki ciador de RNA | Fame 3 2 enmemelLLLLLLLLLLLUL LLL 5. a ustcia de 3-04 para a ‘exlensdo covaente A telomerase resolve o problema do iniciador terminal. Fumento prea Taceeiaccetiaceer™y _FFlamento arssado rem sitetiza, nome Tfeeeeriacee a Or icomerase eseta treme 2 tteze de DNA pormode deh) Telomerase eageTTacee 5 ee O reensocacio TTaeeetiaceaTince : se Osis reetcaes cb eteneao edo tensocact, bet ca teomerase eee § Tee eee rneeerTRaeET TT 5 coda ees mln Oc )ONA palimerase (sintese de Baowaoee oa TrrrTrraaariacee 5 (Os telémeros dos seres humanos, que contém a se- quéncia repetida consecutiva TTAGGG, serio usados para ilustrar como a telomerase acrescenta extremidades 20s cromossomos (Figura 10.348). A telomerase reconhe- ce a sequéncia de telomeros rica em G na extremidade 3" cestendese no sentido 5! — 3’, uma unidade repetida por vez. A telomerase no preenche a lacuna oposta extremidade 3’ do filamentomolde; ela apenas estende a.extremidade 3’ do filamento-molde. A caracteristica es- pecifica da telomerase é o seu molde de RNA intrinseco. Depois que a telomerase acrescenta varias unidades re- petidas ao telémero, a DNA polimerase catalisa a sintese do filamento complementar, Nao fosse a atividade da te- Tomerase, haveria encurtamento progressivo dos cromos somos lineares. Se as delecdes das terminagdes abranges- ‘sem uum ou mais genes essentciais, esse encurtamento do cromossomo seria letal. Uma alteragao observada em muitas cétulas cancero- ‘a8 6 a expressio dos genes codificadores da telomerase, que nao sao expressos na maioria das células somaticas. Portanto, uma linha de tratamento do cancer foi tentar desenvolver inibidores da telomerase de modo a promo- ver a perda dos telémeros dos cromossomos nas células cancerosas € a morte dessas células. Contudo, outras c& Iulas cancerosas nao tém telomerase ativa, o que dificulta esse procedimento. COMPRIMENTO DO TELOMERO E ENVELHECIMENTO EM SERES HUMANOS ‘Ao contririo das células da linhagem germinativa, a maioria das células somaticas humanas nao tem ativida- de da telomerase, 01a tem em niveis muito baixos. Cé- Tulas sométicas humanas em cultura dividem-se apenas ‘um ntimero limitado de vezes (geralmente apenas 20 270 geracoes celulares) antes da senescéncia e morte. Quando 0 comprimento dos telémeros é medido em vVirias culturas de células somsticas, observase que ha correlacao entre 0 comprimento do telomero € 0 mi- mero de divisoes celulares antes da senescéncia e morte. Células com telmeros mais longos sobrevivem por mais tempo ~ dividemse mais vezes ~ que as células com te- Témeros mais curtos. Como seria esperado na auséncia de atividade da telomerase, 0 comprimento do teléme- 15 FIGURA 1034 Replicagio de telomeres do cromossomo.A. Em vista a necessidade de um grupo 3'-OH ive n extremidadedofilamento iniciador, as DNA polimerases no podem substitu um iniiador de RRNA que inciaasintese de DNA na terminacB0 ou perto da termi- nagio do flarento atrasado. B,Esss terminagées des eromossomos do replicadas pela telomerase, uma enzima especial que impede ‘encurtamento das extremidades ds cromossomos a cada epicacdo, A sequéncia de nuclecttis ne terminacSo do flamento avvasado 6 especicada por uma moléculacurta de RNA presente como um ‘componente essencial da telomerase. A sequenca telomérica mestre- dda 62 de sares humanos. KERR,me ‘mer ro diminui a medida que aumenta a idade da cultura celular. As vezes, observam-se céhulas somaticas que ad- quirem a capacidade de proliferar indefinidamente em cultura, ¢ demonstrou-se que essas células imortais tém atividade de telomerase, ao contrario de suas progenito- ras, Jé que a tinica caracteristica comum a todos os cén- ceres € a diviséo celular descontrolada ou imortalidade, 6s cientistas propuseram que uma técnica de combate a0 cincer humano seria inibir a atividade da telomerase nas céhulas cancerosas, Outra evidéncia da relacdo entre comprimento do te- Jomero ¢ envethecimento em seres humanes foi obtida ‘em estudos de individuos com disttirbios denominados progérias, docncas hereditérias caracterizadas por enve- Thecimento prematuro. Na forma mais grave de pro- géria, sindrome de Hutchinson-Gilford (Figura 1035), a scnescéncia - surgimento de rugas, calvicie e outros sintomas do envelhecimento ~ comeca imediatamen- te aps 0 nascimento, e geralmente hi morte na ado- lescéncia, Essa sindrome € causada por uma mutacio dominante no gene codificador da lamina A, proteina gue participa do controle do formato dos mticleos nas células. Nao se sabe por que essa mutaczo causa enve- Thecimento prematuro. Em uma forma menos grave de progéria, a sindrome de Werner, a senescéncia come- sana adolescéncia, e a morte geralmente sobrevém na faixa de 40 anos, A sindrome de Werner é causada por ‘uma mutacdo recessiva do gene WRN, que codifica uma proteina participante dos processos de reparo do DNA. Mais uma vez, ainda nao sabemos como a perda dessa protefna causa envelhecimento prematuro, No entanto, as células somaticas de individuos com as duas formas de progéria tém telomeros curtos e apresentam menor capacidade proliferativa em cultura, 0 que € compati- ‘cl com a hipétese de que 0 encurtamento do telémero contribui para 0 envelhecimento. PONTOS ESSENCIAIS Exercicios 253 Capitulo 10 | Repicagio do DNA e dos Cromessomos 1 FIGURA 10.35 John Tacket, 15 anos, de Bay City, Michigan, fala sobre sua doenca, progéra, durante uma coletiva de imprensa, convocada fem Washington, em 16 de abril de 2003, para anunciar a descoberta do gene causador desse distlibio genético raroe fata. caracterizado or causar envelhecimento acelerado. A direta de Tacket, esté o Dr. Francis S. Collins, dretor do Nationa Institutes of Health. Atualmente, a relacio entre o comprimento do telé- mero € a senescéncia da célula € deduzida por correla- ao. Nao ha evidéncia direta de que o encurtamento dos telomeros cause envelhecimento, Todavia, a correlagao é surpreendente, ¢ a hipstese de que o encurtamento dos tclémeros contribui para o processo de envelhecimento ‘em seres humanos requer estudo complementar. A nplicagao das grandes moléculas de DNA em exomossomos eucariticos€bidirecional a parler das miltipias aigens + Hib trés DNA polimerases (0,8 ¢€) em cada forquilha de replicaciio em eucariotos «Os tlémeras, sequéncias especiais nas extremidades dos cromassomas, sd acrescentados aos cromossomos por wma enzima especifica denominada telomerase 1. Células de £, coli cultivadas em meio normal con- tendo "N sao transferidas para o meio que contém apenas 0 isétopo pesado de nitrogénio, "N, para uma geracio de crescimento. Como sera distribui- cio de “Nc ™N no DNA dessas bactérias depois de uma geracio? Resposta: Como a replicacdo do DNA é semiconservativa, os filamentos parentais cle DNA contendo ™N serio con-254 Fundamentos de Genética servadios ¢ usaddos como moldes para sintetizar novos filamentos complementares contendo "N. Portanto, cada dupla hélice de DNA contera um filamento leve e outro pesado, como mostra o esquema adiante, 2 Acrescentase timidina radioativa (*H) ao meio de cultura que tem uma eétula de camundongo. Essa célula munca foi exposta & radioatividade antes. Se a célula estiver entrando na fase S no momento do acréscimo de *H-timidina, qual sera a distribuicio de radioatividade no DNA cromossomico na meti- fase subsequente (a primeira metifase depois do acréscimo de *Hetimidina)? Resposta: £ preciso lembrar que cada cromossomo pré-re- plicacéo contém uma tinica molécula gigante de DNA que se estende de uma extremidade & outra do cromossomo passando pelo centromero. A replica- cao dessa molécula de DNA sera serniconservativa, assim como as mokéculas de DNA em Ecol jé apre~ sentadas. Na metafase, porém, as duas hélices duplas estario presentes nas cromatidesirmas ainda unidas no centrémero, como mostra o esquemaa seguir. Crométiesinmss Repicacao na resanca de timing Contrémero Centromero Cromassome prérepica¢o Cromossomo metatisica 3. As DNA polimerases s6 sto capazes de sintetizar DNA na presenga simultinea de um filamento-mo!- de e um filamento iniciador. Por qué? Quais sao as fangdes desses dois filamentos? Resposta: As DNA. polimerases s6 podem estender ca- deias de DNA com um grupo 3'-OH livre porque ‘0 mecanismo de extensio requer um ataque nucle- ofilico do grupo 3'-OH ao tomo de fosforo inter no do trifosfato de desoxirribonucleosidio precur- sor com a eliminacio do pirofosfato, O filamento ‘com o grupo 3-OH € 0 filamento iniciador; ele 6 estendido durante a sintese. O filamento-molde es- ST a ETE ONMML. pecifica a sequéncia de nucleotidios do filamento sintetizado; 0 novo filamento sera complementar 20 filamento-molde. Essas fun¢Ses so ilustradas da seguinte maneira: —" PTET CETOAICS she thes Flamato itor Op a do SB 4, Como se pode usar a autorradiografia para distin- guir entre replicacio uni e bidirecional do DNA? Resposta: Caso as células sejam cultivadas em meio con- tendo *Htimidina por um curto periodo e, depois, transferidas para meio nao radioativo para conti- nuarem crescendo (experimento de pulse-chase), a replicagio uni e bidirecional preveré padrées de marcacio diferentes, que podem ser distinguidos por autorradiografia, como é mostrado aqui: Replicaedo unidirecional, Replicacao bidirecional Origen ake tigen Wrepicaio om | “Hiimdna gem _Forquha Foratha_y ee VAN oe, VQ cocina te Precio TS ure buzea } com tH mina t le 7 Sererse ‘as Aecrescente de gros de pata Cua inca com densiade ecrescente de grdos de prota 5. Por que a maioria das céhulas somiticas deixa de se dividir depois de um ntimero limitado de divisoes| celulares? © que aconteceria se elas continuassem se dividindo? Como as células cancerosas superam| esse obsticulo? Resposta: A maioria das células somiticas tem baixa ou nenhuma atividade de telomerase. Logo, 08 telé- meros dos ¢romossomos tornam-se mais curtos a cada divisio celular. Se as células somaticas conti- rmuassem a se dividir na auséncia de telomerase, 08 cromossomos perderiam os telémeros ¢, por fim, hhaveria perda de genes essenciais perto das extre- midades dos cromossomos, causando morte celt- lar, Uma das etapas essenciais na conversio de uma célula somatica normal em célula cancerosa é ativar ow aumentar a sintese de telomerase de maneira {que nao haja perda dos telmeros durante as divi oes descontroladas das céulas cancerosasue 1m NRA: mem Autoavaliagao 1. Célula de Escherichia col foram cultivadas por mui- tas geragdes em um meio no qual 0 nitrogénio sé est disponivel na forma de seu isstopo pesado "™N. ‘Em seguida, as células foram coletadas por centrif- gacio, lavadas com tampao € transferidas para um meio que continha “N (0 is6topo leve normal do nitrogénio) . Depois de duas geracdes de cultura em meio com #N, foram transferidas de volta para meio com ™N para uma tiltima geracio de cresci- mento. Depois dessa geracio final de crescimento em presenca de !°N, as células foram coletadas por centrifugacio. O DNA dessas células foi extraido ¢ analisado por centrifugacéo de equilibrio por gra- diente de densidade com CsCl. Qual seria a distri- buigdo esperada desse DNA no gradiente? Resposta: Meselson ¢ Stahl demonstraram que a repli- cacao de DNA em E. coli é semiconservativa. Seus cexperimentos de controle mostraram que as duplas hélices de DNA com (1) N nos dois filamentos, (2) #N em um filamento ¢ #N no outro, ¢ (3) ¥N ‘nos dois filamentos separavam-se em trés bandas no gradiente, chamadas (1) banda leve, (2) banda hi brida ¢ (3) banda pesada, respectivamente. Quan- do se comeca com uma dupla hélice de DNA com ©N nos dois filamentos e se faz a replicacdo semi- conservativa por duas gerages na presenca de “N Geragio 1 Repicacao semiconservatia em MN Gereéo 2 Reolcacdo semiconservatva em #N : zR Peta 1 Pala bros Bs iarertos tari contém #'N 0 ents anus cantén 6 Capitulo 10 | Repicagio do DNA edos Cromossomes 255 € por uma geracio na presenca de ®N, o resultado sf0 oito moléculas de DNA, duas com "N nos dois filamentos e seis com “N em um filamento e #N no outro filamento, como mostra o esquema a segui Portanto, 75% (6/8) do DNA estaro na banda hi- brida, ¢ 25% (2/8), na banda pesada, © cromossomo X de Drosophila melanogaster contém, ‘uma molécula gigante de DNA, com 22,422,827 pa- res de nucleotidios de comprimento. Durante oses- tiigios iniciais de clivagem do desenvolvimento em- brionario, a divisio nuclear leva apenas 10 min. Se cada forquilha de replicacio avancar 2.600 pares de nucleotidios por minuto, quantas forquilhas serdo necessarias para a replicacio de todo 0 cromosso- ‘mo X em 10 min? Considere que haja espacamento uniforme dessas forquilhas de replicagio ao longo da molécula de DNA. A divisio celular € muito mais lenta nas células somiticas da mosca-dasfrutas adulta, Se voce esti ver estudando céulas somaticas com um tempo de geracdo de 20 h e uma fase S de 8 h, quantas forqui- Ihas de replicacio seriam necessérias para conciuiir a replicacao do cromossomo X durante a fase S da mitose? Se o tamanho médio dos fragmentos de Oka- zaki em Drosophila for de 250 nucleotidios, quantos fragmentos de Okazaki serao sintetizados durante a replicacao do cromossomo X? Quantos iniciadores de RNA serio necessirios? Resposta: Se urna forquilha de replicacdo avangar 2.600 pa- res de nucleotidios por minuto, atravessaré 26.000 pares de nucleotidios em 10 min e catalisaré asintese de cadeias de DNA com 26.000 nucleotidios de comprimento em cada uma das duas duplas héti- ces produzidas. Dada a presenca de 22.422.827 pares, de nucleotidios no cromossomo X ¢ a replicacio de 26,000 pares de nucleotidios por forquilha de repli- cacio em 10 min, a replicacio completa do DNA nese cromossomo durante 0s estigios de clivagem do desenvolvimento embriondrio exigiria 862 for quilhas de replicacio (2.422.827 pares de nucleo- tidios/26.000 pares de nucleotidios replicados por forquilha em 10 min) uniformemente espacadas a0 Jongo da molécula de DNA. ‘Da mesma maneira, no caso das céluias somiticas da moscadasrutas adulta com uma fase S de 8h, seria necessitio o espacamento regular de 18 forqui- thas de replicagao 20 longo do DNA no eromosso- ‘mo X para concluir a replicacio em 8 h. Uma for quilha de repticacio replicaria 1.248.000 pares de nuucleotidios em 8 h (2,600 pares de nucleotidios por minuto X 480 min). Portanto, no caso de es pacamento uniforme das forquilhas de replicacéo,