Preparacées Microscépicas a Fresco LINTRODUCAO Preparasoes microscépicas compreendem ‘écnicas pelas quais espécimes microbianos so colocados sobre léminas, para serem observados a0 microscépio. Duas téenicas gerais permitem 0 exame microsc6pico. Uma é a suspensio de microrganismos em meio liquido, conde podem ser examinados vives, com 0 auxilio ou no de corantes vitals; na outra, as células microbianas sto fixadas pelo calor ¢ coradas com corantes quimicos especificos. A visualizagdo microscépica 2 fresco dos microrganismos Gificl, dado 0 reduzido tamanho destes e o indice de refragio, que & préximo ao da Agua, 0 que os toma praticamente incolores quando suspensos em ‘meio aquoso. Apesar da dificuldade de Il. OBJETIVOS visualizagio, as preparagSes microscépicas a fresco slo tteis para se observar viabilidade ¢ atividades celulares como motilidade ¢ fissio bingria e também para se observar o tamanho ¢ a forma natural das células microbianas. Isto porque as preparagSes fixadas provocam distorgses na morfologia das células, dada a exposigo 20 calor e a0 efeito das substéncias quimicas durante a coloracdo. Nesta pritica, serio preparadas laminas a fresco de amostras contendo grupos distintos de microrganismos, tais como bactérias, alas, protozoirios ¢ leveduras. Seré _observada_a dimensio das bactérias em relagdo aos outros microrganismos, a diversidade das células microbianas quanto a0 tamanho ¢ & forma, assim como a ocorréncia ou nio de motilidade. 1. Preparar Himinas a fresco para observag3o microscépica de amostras de bactérias, leveduras, protozodrios e algas; 2. Treinar o manuseio adequado do microscépio dtico composto. IM. MATERIAIS Microrganismos: Leveduras do fermento do pao em suspensio aquosa, infusdo de batata ¢ amostras de gua estagnada Meios e solugies: Solugio de azul de metileno. Equipamentos e Utensilios: Microscépio dtico composto, léminas, laminulas e pipetas Pasteur. IV. PROCEDIMENTO 1. Coloque sobre a lamina limpa uma gota do material a examinar. Ao observar leveduras, coloque antes sobre a lémina uma gota de azul de metileno (corante vital) ¢ depois uma gota da suspensio de leveduras (para evitar a contaminagio do corante com o microrganismo!) 2. Encostando um dos bordos da laminula na gota, deixe-a descer suavemente para evitar a formagio de bolhas de ar entre a lamina e a lamfnula, 3. Focalize conforme procedimento descrito no item abaixo: Observagio de microrganismos 20 microscépio dtico.4. Procure campos onde os organismos exibam motilidade, utilizando os parafusos do “charriot” 5. Observe as diferengas entre os microrganismos focalizados e desenhe-os, considerando tamanho, forma e coloracdo. 6. Terminada a observagio, desligue a luz; gire o revélver para encaixar a objetiva de menor aumento, pasando pela objetiva de 10x; abaixe a platina e retire a lamina, 7. Apés a observacio, descarte a limina e a laminula nas bandejas com detergente e desinfetante, colocadas na bancada lateral. ‘Observagao de microrganismos ao microseépio ético 1. Destrave 0 microscépio, movimentando a TRAVA; 2. Gire o REVOLVER, encaixando a OBJETIVA de menor aumento (4x); 3. Coloque a lamina sobre a PLATINA e prenda-a com a presilha (certifique-se de que a lamina esteja ‘bem encaixada); 4. Acenda a luz do microscépio; 5. Regule a quantidade de luz utilizando 0 DIAFRAGMA e abaixando 0 CONDENSADOR. (Para ‘organismos mais transparentes, diminua a luminosidade, regulando a abertura do diafragma e abaixando 0 condensador); 6, Levante a platina, movimentando o MACROMETRICO até o scu ponto maximo; Othando pela ocular e utilizando 0 parafuso macrométrico, abaixe lentamente a platina até que 0 material a ser observado possa ser visualizado. Corrija a focalizacao, utilizando somente © parafuso MICROMETRICO; 8, Encaixe a objetiva de 10x e faga o ajuste da focalizago com o micrométrico; 9. Observe 0 material, selecione uma determinada drea e encaixe a objetiva de 40x. 10. Trave o microscépio e ajuste a focalizagdo sempre com o parafuso micrométrico, ATENCAO: Nao levante a platina do microse6pio (movimentando 0 macrométrico) com a objetiva de maior aumento encaixada! Y. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1, NEDER, R.N. Microbiologia: manual de Laboratério. Sao Paulo. Novel. 1992. 138p. 2. PELCZAR, M., CHAN, E.CS., KRIEG, N.R. Microbiologia: conccitos e aplicagdes. Sdo Paulo, Makron Books do Brasil, 1996, v.1. 524p.13 VI. RESULTADOS Matricula. Turma, Nome:. Preparagées a fresco: Desenhe os campos observados, fazendo distingao entre as diversas amostras de microrganismo, com relagao a forma, ao tamanho e & motilidade. Aeua do Lazo Leveduras Infusao de batata ‘VIL. QUESTOES 1. Por que algumas células de levedura se colorem de azul e outras permanecem incolores, quando utilizamos o corante vital azul de metileno? 2. Quais so as vantagens e as desvantagens da observagio de léminas em preparagdes a fresco?Preparagdes Microsc6j -as Fixadas: 1. Coloraco simples LINTRODUGAO P reparagdes microscépicas fixadas ¢ coradas so tteis para visualizar os microrganismos diferencié-los_ em grupos, para fins de diagnéstico ou de estudos de suas propriedades. Corante é geralmente um sal, em que um dos fons é um eroméforo. Se 0 croméforo & positive, o corante & bésico ou catiénico, como € 0 caso do azul de metileno ou da fuesina. Se 0 croméforo é negative, o corante € feido, como o dcido picrico. Corantes basicos sto ideais para corar baetérias, porque 0s acidos nucléicos © alguns componentes da parede celular apresentam carga negativa e atraem os croméforos catiénicos. Os corantes basicos mais, I OBJETIVOS ‘comuns so 0 azul de metileno, o cristal-violeta ea fucsina. Nas técnicas de coloragio simples, células microbianas séo inicialmente espalhadas sobre @ Jémina, formando um esfregago; em seguida, sio fixadas pelo ealor ¢ coradas com um nico corante. Essa técnica é util para visualizar a forma (cocos, bacilo ou espirilo) ¢ © arranjo de células bacterianas. Algumas eestruturas internas das células microbianas também podem ser visualizadas, como granulos metactométicos (polifosfato) e de glicogénio. Nesta aula pritica, serio realizadas técnicas de coloragio simples, para comparar forma ¢ arranjo de diferentes células bacterianas. 1. Treinar técnicas de preparagdes fixadas e coradas de bactérias para exame microscépico; 2. Diferenciar bactérias de acordo com a forma ¢ 0 arranjo de suas células. I], MATERIAL Solugées: Fucsina ou safranina, cristal violeta, Sgua destilada. Culturas bacterianas: Escherichia coli, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus (em meio liquide ou sélido); Equipamentos ¢ Utensilios: Microscépio ético composto, alga de repicagem, laminas, bico de Bunsen, bbandejas e suportes para laminas. IV. PROCEDIMENTO Preparo do esfregago: 1. Limpe bem uma lamina com papel, flambe-a com o bico de Bunsen ¢ deixe-a esfriar & temperatura ambiente; 2. Esterilize a alga de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen;1s 3. Quando a bactéria estiver em meio liquido, transfira assepticamente com a alga de repicagem uma gota da cultura de bactérias para o centro da lamina, Se a cultura estiver em meio s6lido, prepare uma suspensio de células da seguinte maneira: coloque uma gota de agua destilada sobre a lamina e colete ‘0 material assepticamente, raspando, levemente, a superficie do agar com a alca de repicagem (com cuidado para nao retirar pedacos do meio de cultura, pois o crescimento do microrganismo ocorre somente na superficie). 4. Prepare o esfiegaco, espalhando a suspensdo com a alga de repicagem. Faga movimentos circulares até obter uma camada uniforme ¢ fina de células em pequena drea central da lémina (do tamanho de uma moeda de 1 centavo); 5. Deixe 0 esfregago secar a0 ar; 6. Fixe o esfregaco, pasando trés vezes o lado oposto (ao que foi realizado o esfregago) da lamina cima da chama do bico de Bunsen. Evite o aquecimento excessivo, para no queimar as células; 7. Deixe a lamina esfriar; 8. Inicie a coloragdo, utilizando as bandejas e os suportes colocados em cada bancada, Coloque a Jamia sobre o suporte € cubra o esfregago com fucsina por 30 segundos ou, se utilizar © corante cristal-violeta, por | minuto; 9. Lave a preparagao, utilizando a piseta com gua destilada (evite jato de gua muito forte sobre 0 cesfregago, para ndo desprendé-l0); 10, Deixe secar ao ar; 11, Focalize o material usando, seqiencialmente, as objetivas de 4X, 10X e 40: 12, Trave © microscépio; adicione uma gota de dleo de imersio sobre 0 esfregayo € visualize com a “objetiva de 100X, usando 0 micrométrico; 13. Apés observagdo, descarte o material nas bandejas com detergente, colocadas nas bancadas laterais. V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS |. CAPPUCCINO, J.G., SHERMAN, N. Microbiology, a laboratory manual. Benjamim/Cummings, Publishing Company, Inc., 1987. 458p. 2. PELCZAR, M., CHAN, E.CS., KRIEG, NR. Microbiologia: conceitos © aplicagées, Sido Paulo. Makron Books do Brasil, 1996, v.1. 524p.16 VI. RESULTADOS: Preparagées fixadas: - Coloragdo Simples: desenhe os campos observados, fazendo distingao entre a forma ¢ 0 arranjo das bacterias. Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus bietiva, Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus VII. QUESTOES 1. Qual é o propésito da fixacdo do esfregaco pelo calor? Compare as técnicas de preparagio microsc6pica a fresco com preparagées fixadas e coradas. Cite vantagens e desvantagens de cada uma. Por que os corantes basicos so ideais para corar as bactérias? 4, O que sao praticas assépticas?