Preparagdes Microscépicas Fixadas Il. Coloracao Diferencia LINTRODUGAO técnica de coloragdo diferencial requer 0 uso de pelo. menos trés reagentes quimicos, aplicados _seqtlencialmente sobre 0 esfregago fixado. O primeiro reagente € um corante que confere cor a todas as células; 0 segundo reagente & um descolorante, que pode ou no remover completamente 0 primeiro corante da célula ou de algumas de suas estruturas. As estruturas descoloridas podem adquirir a cor de um segundo corante, corante de contraste. Assim, grupos de células ‘ou suas estruturas podem ser diferenciados com base no corante que é retido. Técnicas de coloragao diferencial permitem nao sé a isualizagio de estruturas como flagelo, ipsula, esporo € miicleo, mas também a separagdo de microrganismos em grupos. A ‘técnica diferencial mais importante em bacteriologia € a coloragdo de Gram, que separa as bactérias em dois grandes grupos, Gram-positivo e¢ Gram-negativo, _sendo importante para 0 diagndstico e a classificagao das bactérias. Il, OBJETIVOS: |: Gram A coloragio de Gram envolve a aplicagio de quatro solugdes. Cristal violeta (CY), primeiro corante, que colore as células de roxo escuro, Lugol, ou solugao de lodo (1), € a segunda solugio, um mordente que aumenta a interagdo entre a célula bacteriana € © primeiro corante, formando um complexo insolivel, Cristal violeta-lodo (CV-1). Alcool, a terceira solugdo, & um descolorante. As bactérias Gram positivas, quando lavadas com © descolorante, retém © complexo (CV-I) ¢ as bactérias Gram negativas perdem 0 complexo (CV-D, ficando incolores. A agi0 do Alcoo! como removedor do complexo CV-I da célula depende da concentragdo de lipideos e da espessura da parede celular bacteriana. O timo reagente ~ 0 corante de contraste, Safranina ou Fucsina, diferente na cor do cristal-violeta, que colore as bactérias Gram- negativas de rosa-avermelhado, mas no altera a cor roxo-escura (azulada) das bactérias Gram-positivas, 1. Realizar uma das técnicas de coloragio diferencial de células microbianas para 0 exame microscépico, 2. Diferenciar bactérias de acordo com sua resposta a coloragdo de Gram. IIL MATERIAIS Solugdes: Cristal violeta, Fucsina ou Safranina, Lugol (solugdo de iodo), élcool, égua destilada Cult s bacterianas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus sp. (subtilis Culturas com 24 horas de crescimento em meio liquido ou sélido. Equipamentos ¢ Utensilios: Microscopio otico composto, alga de repicagem, laminas, bico de Bunsen, bandejas e suportes para liminas. ou cereus)18 IV. PROCEDIMENTO Coloragio de Gram: 1, Prepare um esfregago, transferindo assepticamente uma pequena porgo da cultura pura em meio sélido para uma lamina previamente limpa e flambada contendo uma pequena gota de agua destilada. Com movimentos circulares, utilizando a alga de repicagem, espalhe a suspensio, formando uma ‘camada fina € uniforme na érea central da lamina. Deixe secar ao ar. ixe 0 esfregago, passando duas a trés vezes a limina sobre a chama do bico de Bunsen, Deixe a lamina esfriar ao ambiente; 3. Inicie a coloragao de Gram (Figura 1). RESPEITE O TEMPO INDICADO PARA CADA REAGENTE. Cubra 0 esfregago com o corante cristal-violeta por um minuto; em seguids, utilizando 2 piseta, lave com agua destilada; 4, Cubra com a solugao de Lugol, por um minuto; 5. Lave 0 excesso de Lugol com aguas 6. Lave a lamina com etanol 95% , rapidamente, até que nao se desprenda mais corante da preparagio; 7. Lave 0 excesso de dleool com égua; 8, Cubra o esfregago com solusdo de Fuesina, durante 30 segundos; 9, Lave a lamina com 4gua. Em seguida, deixe secar ao ar ou entre folhas de papel de filtro; 10, Focalize o material usando, seqUencialmente, as objetivas de 4X, 10X e 40X; 11. Trave © microscépio; adicione uma gota de dleo de imersio sobre o esfregago ¢ visualize com a objetiva de 100X, usando 0 micrométrico; 12. Apés observagdo, descarte 0 material nas bandejas, com detergente, colocadas nas bancadas laterais. V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. NEDER, R.N.M. Microbiologia: manual de Laboratorio, So Paulo. Novel, 1992. 138p. 2. CAPPUCCINO, J.G. & SHERMAN, N. Microbiology, a laboratory manual, Benjamim/Cummings. Publishing Company, Inc., 1987. 458p. 3. PELCZAR, M., CHAN, E.CS., KRIEG, N.R. Microbiologia, conceitos ¢ aplicagées. Sdo Paulo. Makron Books do Brasil, 1996, v.1. 524p.PROCEDIMENTO PARA COLORACAO DE GRAM 3-Cubra com a solugdo de Lugol por 1 min 4- Lave 0 excesso de Lugol com agua. 7-Cubra oesfregago 8 Lave oexcessode ‘9 - Deixe a preparagdo com solugdo de Fucsina Fucsina com agua. secat ao ar ou entre folhas por 30 segundos. de papel de filtro. Figura 1 - Procedimento para coloragdo de Gram (Adaptado de Cappuccino & Sheman, 1987).VI. RESULTADOS, Nome:... N° Matricula. Turma.... Desenhe os campos observados, anotando: microrganismo utilizado, forma, arranjo e cor predominante. Relatar a diferenga obtida na coloragao de Gram: Gram-positivas so as células capazes de reter o corante inicial (cristal violeta), ndo se descolorindo com a ago do alcool. Gram-negativas so a células que descolorem com o Alco! e coram com a fucsina aplicada na etapa seguinte ao tratamento com o élcool. Preparagao fixada - Coloracio diferencial de Gram (Objetiva de 100x): Escherichia coli Bacillus sp. Staphylococcus aureus Microrganismo Forma ‘Arranjo Predominante VI. QUESTOES: Por que a coloragao de Gram é importante em Microbiologia? Qual & 0 primeiro corante usado na coloragao de Gram e qual é a sua cor? Qual é a importancia do Lugol (iodo) na coloragao de Gramm? ‘Qual é a fungao do élcool na técnica de coloragdo de Gram? Qual é 0 segundo corante (contra-corante) utilizado na coloragao de Gram e qual é a sua cor? Dé exemplos de outras téenicas de coloragio diferencial, além da coloragao de Gram.