Preparo e Esterilizacaio de Meios de Cultura L INTRODUGAO cultivo de microrganismos em laboratories requer a formulagdo de meios de cultura e 0 estabelecimento de condigdes que favoregam o seu desenvolvimento fora de seu habitat natural, Os meios de cultura devem proporcionar todos os elementos que compdem a célula (C, N, S, P.... Existem meios naturais, como infusto de batata, sangue ¢ leite, nos quais a composigio quimica ndo é conhecida. Existem meios sintéticos com componentes quimicos puros, orginicos e/ou ‘inorganicos. So encontradas algumas denominagées especiais dos meios de cultura, relacionadas & sua composi¢ao ou fungdo. O meio minimo (MM) é sintético e fornece somente os nutrientes essenciais ao desenvolvimento da célula; o meio diferencial contém substincias quimicas mais complexas ¢ permite diferenciar. os microrganismos quanto a0 seu crescimento ¢ ‘morfologia; o meio de enriquecimento favorece © crescimento de determinada populagio, enquanto o meio seletivo inibe o crescimento de determinadas populagies. Dependendo da finalidade a que se destinam, os meios de cultura podem ser Preparagses liquidas, usadas em estudos de crescimento, em fermentagio e na produgao de biomassa; meios s6lidos, tteis para contagem © isolamento de microrganismos, ou semi-solidos, utilizados para a detec¢io de placas de lise em culturas bacterianas infectadas por virus. O agente solidificante utilizado em Microbiologia geralmente é 0 Agar, por sua propriedade de fundir a 96°C e solidificar a 45°C, sendo portanto capaz, de suportar temperaturas mais clevadas de incubagao. Os microrganismos diferem quanto 4s suas exigéncias nutricionais. Alguns, como os autotroficos, sdo capazes de se desenvolver em meios inteiramente minerais, e utilizam CO; como fonte de carbono. Outros, os heterotréficos, requerem compostos orgénicos como fonte de carbono e de energia. ‘Além dos requerimentos nutncionaus, fatores fisicos interferem no crescimento microbiano, como temperatura, presenga de oxigénio, de luz, salinidade © 0 pH. Cada espécie bacteriana cresce sob faixas de temperatura caracteristicas: psicréfilos (15 20°C), meséfilos (25-40°C) € terméfilos (45- 60°C). Quanto presenga de oxigénio livre, existem —bactérias —aerdbias, _anaerdbias, anaerébias facultativas € microacréfilas. Para a maioria das bactérias, 0 pH sumo de ‘crescimento varia entre 6,5 € 7.5. Esterilizacio € 0 proceso pelo qual climinam-se todas as formas vivas presentes em ‘um material ou ambiente. A esterilizagdo pode ser realizada pelo calor, pela radiaga0, pela filtragdio e por agentes quimicos. Esses processos destroem células microbianas numa progressio geométrica; portanto, quanto menor a opulagio inicial, mais répida é a esterilizacdo, ‘As relagdes tempo/temperatura. volume/érea do material ou meio a ser esterilizado, bem como a eficiéncia de penetragao ou difusdo do agente letal, devem ser consideradas na definigio do proceso de esterilizagao. ‘Nesta aula pritica teremos oportunidade de preparar meios de cultura liquide € sélido € esterilizé-los por calor timido em autoclave, um dos métodos de esterilizagao de meios de cultura ‘mais comuns no Laboratorio de Microbiologia2 I. OBJETIVOS 1. Preparar os meios de cultura: caldo nutriente e égar nutriente; 2. Executar esterilizagdo em autoclave (calor timido) dos meios de cultura; 3. Observar a esterilizagao, por filtragdo, de liquidos contendo substincias termolabeis. II. MATERIAL Reagentes: Na; HPO, , NaCl, extrato de carne, peptona, gua destilada; Equipamentos ¢ Utensilios: espétulas, vidrarias (pipetas, provetas, Béqueres, bastio de vidro, Erlenmeyers), tampdes de algodio, filtro Millipore, autoclave, potenciémetro. IV. PROCEDIMENTO Preparo dos meios de cultura: 1. Pese, isoladamente, nos Béqueres, 0s componentes do meio de cultura para o volume final de 100 mL de caldo nutriente: Caldo Nutriente: ‘COMPOSICAO. ‘QUANTIDADE NasHPO. 0.28 ‘NaCl 03g Extrato de Came 0.5% Peptona O58 Agua destilada 100 mi 2. Dissolva cada componente em Béquer, adicionando um pequeno volume de gua destilada e agitando ‘com bastiio de vidro; 3. Transfira cada componente dissolvido para um frasco Erlenmeyer, misturando os componentes; 4, Complete 0 volume com agua destilada para 100 mL; 5. Avalie 0 pH do meio, utilizando um potenciémetro; o pH do meio deve ser aproximadamente 6,8-7,0; 6. Transfira 50 ml dessa mistura para um Erlenmeyer, obtendo, assim, dois volumes de 50 ml. de caldo nutriente; Agar Nutriente: A formulagio do agar nutriente é 2 mesma do caldo nutriente, variando somente a digo de Sgar-igar a 1,5% (piv), ou seja, 1,5 g para 100 mL de meio: 1, Adicione a um dos Erlenmeyers contendo 50 mL de caldo nutriente, 0,75 g de agar, quantidade suficiente para se obter uma concentragio de 1,5% (p/v)..23 Esterilizagio dos meios de cultura: 1. Complete o nfvel de égua da autoclave; 2. Introduza o material a ser esterlizado na autoclave; 3. Feche a autoclave conforme recomendagaio do fabricante; 4, Inicie o aquecimento; 5. Abra a vélvula de equalizagdo para remogdo de ar, o que se garante deixando 0 vapor sair continuamente por 5 minutos. Assim, obtém-se vapor saturado; 6. Feche a valvula de equalizagao; 7. Verifique, pelo manémetro, a elevago da pressio da autoclave. Apés atingir 15 Ibipol’, comece a contar 0 tempo de esterilizagao, que seré de 15 minutos; 8, Terminado o tempo de esterilizagao, desligue 0 aquecimento e espere a autoclave esfriar, até que 0 ‘mandmetro alcance 0 valor zero; s6 entdo abra a tampa da autoclave. Os meios que contém égar devem ser misturados na saida da autoclave, para garantir a completa dissoluglo e homogeneizagao dos mesmos. V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. PELCZAR, M., CHAN, E.CS., KRIEG, NR. Microbiologia: conceitos € aplicagdes. Sdo Paulo. Makron Books do Brasil, 1996, v.1. 524p. 2, SEELEY Jr., H.W., VanDEMARK, P. J. Microbes in Action. A Laboratory Manual of Microbiology. Freeman, 1981, 385p. 3, ALCAMO, I. E. Fundamentals of Microbiology. Benjamin/Cummings Publishing, 1994. 916p.24 Saida de vapor sob presséo Camara Jaqueta Valvula de saida de ar Entrada de Vapor Figura 1: Esquema de funcionamento de uma autoclave, utilizada para esterilizagdo de materiais por calor timido. Fito | ‘Tubo Estesit Figura 2: Aparato utilizado para esterilizagao de solugdes por filtragao. Fonte: adaptado de SEELEY Jr. & VanDEMARK, 1981,25 VL RESULTADOS Nome:. .N* Matricula: Turma:. 1. Desenhe (trace) um fluxograma da pritica, iniciando com 0 preparo do meio, incluindo esterilizagdo, ¢ terminando com a distribuigo do gar em placas, apés sua saida da autoclave. Mencione detalhadamente todos os euidados para que 0 seu material nao seja contaminado, VIL QUESTOES: 1. Sugira as fungdes dos componentes dos meios de cultura, caldo nutriente e agar nutriente, que voce reparou nesta pratica 2. Defina “meio minimo”, “meio de enriquecimento”, “meio seletivo” e “meio diferencia uma situagdo em que se utiliza cada um desses meios. ", e indique 3. Por que, algumas vezes, a esterilizago de meios de cultura por calor sob pressto, em autoclave, no & adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos?