EL 1 a Capitolul 4 EXPRESIA INFORMATIEI EREDITARE (FUNCTIA GENEID) Tonel Sandovici, Vlad Gorduza, Mihai Ioana, Natalia Cucu, Elena Braha, Claudia Banescu, Mircea Covic Gregot Mendel (1865) a intuit existenja unor .fac- tori ereditari” (numiti ulterior gene) ce determina for- marea caracterelor fenotipice ereditare. Aforismul ,o gen —> un caracter” a dominat genetica clasied, pnd cfnd s-a stabilit c& genele sunt aledtuite din ADN, iar substratul molecular al oricarui caracter este 0 pro- teind structurala sau 0 enzima. Conceptia clasica 0 gend -> un caricter” a devenit 0 gena (ADN) — 0 protein (polipeptid)”, postuland c& informatia ere- ditar& con{inuta in ADN se exprima prin sinteza unor proteine specifice, care stau la baza caracterelor. Utteriors-astabilite& gena determin’ un produ final functional, ARN sau polipeptid, iar relafia nu este tot- ‘mai multe potipeptide” sau ,mai multe gene ~> 0 pro teina”, In prezent, gena este considerati o unitate de informatie de transcript), find definité ca wn segment de ADN care contribuie la realizarea unui fenotip sau a unei functi. Expresia genei este un proces precis coordonat gi reglat in raport cu programul dezvoltiri ontogenetice a organismului sau cu necesitajile sale in anumite conditii metabolice, impuse de mediu A. Conceptia clasica despre functia genei 1. Gena — unitate de functie si mutatie Relatia ,o gendi -> un caracter” este axioma gene- ticiiclasice. Aceasta ,dogma” poate fi analizata prin studiul mutafiilor: modificarea genei poate produce © schimbare ereditara a caracterului determinat de gend, De exemplu, gena GPR/43', localizati pe ero- ‘mozomul X, este implicata in biogeneza melanosomi- Jor (mai ales la nivelul retinei), iar mutatia ei determina albinismul ocular, prin deficit complet sau parjial de ‘melanina la nivelul retinei in genetica clasicd, mutatia ,,developeazi” exis- tenja unei gene normale gi furnizeaza informagii pri- vind modul ei de actiune si de transmitere. De aceea, numele genei a fost stabilit initial pe baza denumirii 1 in treeut OAL. in limba engleza a fenotipului clinic mutant, iar sim- olul genei printr-o abreviere/an acronim de 2-3 litere a numelui bolii (serisa cu litere latine, majuscule si italic) + numerale arabe; de exemplu, FH — pentru familial hypercolesterolemia; PKD! pentru polycys- tic kidney disease type 1. Ulerior, cand produsul genei/ functia a fost identificat(®), numele genei a fost schim- bat cunumele proteinei, pastrnd inte paranteze numele initial’. De exemplu, dupa ce in acondroplazie s-a identificat produsul genei —receptorul 3 al factorului de crestere fibroblastica — numele genei a devenit fibroblastic growth factor receptor 3 (achondroplasia), iar simbolul ei, in loc de ACH, FGFR3, Se poate con- cluziona cd, in genetica clasica, se pleca de la caracter la gena, iar gena era considerata unitatea de functie si de mutatie, Relatia .o gend —> un caracter”, care 2. Ghidu internayional pentru nomenclatura genelor poate fi accesat pe www. genenames.orgBe ENE HUA MEUILALA reflecti in esenta relatia ,genotip > fenotip”, este {ns mult mai complex, datorité fenomenelor de poli- genie, pleiotropie, interactiuni genice gi eterogene- titate genetic’. 2. Poligenia Anumite caractere fenotipice complexe (normale sau anormale) sunt produse prin acfiunea a doua sau mai multe gene nealele (situate in loci diferifi) care au efecte canttative, mici si aditive (cumulative). Acest fenomen se numeste poligenie. in acest caz, ,,abate- rea” de la regula ,o gen —> un caracter” este apa- rent, deoarece fiecare gen& determina ,.o parte” din caracter, Numarul de gene care participa la realizarea caracterului este necunoscut; el variaza la persoane diferite si, de aceea, distributia caracterului respectiv {n populatie va corespunde unei curbe de distribuie continu, de tip gaussian (figura 4.1). Numar de barbati 74d 460160170180 190200 Inatimes (om) Figura 4.1, Distribufia continua (gaussiand) a {inalfimil intr-o populatie de barbati adulfi {adaptat dupa Connor si Ferguson-Smith, 1997) Poligenia prezinté urmatoarele caracteristici esen- fiale: + genele nealele, care produc caracterul, acfioneazdt independent unele de altele; intre ele nu exist’ relajii de dominanfé-recesivitate sau epistazie; + expresia fenotipica a genelor este influenyarci de factor’ de mediu; de aceea, caracterele produse prin ‘actiunea combinata a mai multor factori genetici (poligenie) si factori negenetici se numese curent caractere complexe sat multifactoriale; + spre deosebire de caracterele monogenice, carac- terele poligenice nu au o transmitere mendeliandi (desi prezinta agregare familial) si variazi dupa un gradient continu, avand o distributie gaussi- ana. Caracterele multifactoriale normale (talia, tensiu- nea arterial, culoarea pielii inteligenta s.a.) sau anor- male (malformatii congenitale izolate/unice, bolile comune ale adultului, unele forme de cancere etc.) sunt frecvente si vor fi discutate pe larg in capitolele 6.F §i 14.B. Totusi, este important de subliniat c& bolile multifactoriale mu au o distribugie continua in popu- lajie; factorii genetici determina 0 predispozifie la boalé, conditionata de numérul de gene de suscep- tibilitate pe care le are individul (distribuyia numa- rului acestor gene este continud in populatie), dar aparitia bolii este legat& de interventia unor factori nocivi de mediu la persoane ce au numar mare de gene de rise (este depasit un anumit ,prag”) (vezi figura 6.32). 3. Pleiotropia Pleiotropia (polifenia) reprezint fenomenul in care fo singur& aleld (dominanta) sau o pereche de alele (recesive) produc efecte ferotipice multiple si diverse, in mai multe sisteme de organe si funcfii. Explicagia acestui fenomen este fie ci gena se exprima diferit in fesuturi diferite, fie c& are o functie de semnalizare asupra unor ,finte” diferite. in genetica clinic& se intélnese numeroase boli sau sindroame, determinate monogenic, care au mani- festati clinice multiple si variate, in organe diferite. Sindroamele pleiotrope ridici probleme dificile de diagnostic pentru ci simptomatologia este deseori incomplet, fie din cauza manifestirii la anumite var- ste, fie din cauza expresivitatii variabile. {in unele cazuti, existd 0 corelatie patogenic’ intre muta- fie si manifestirile clinice ale boli, pleiotropia find considerata relajionald, Un exemplu in acest sens este sindromul Marfan (OMIM # 154700), 0 boala eredi- tard cu transmitere autozomal dominanta si expresivi- tate variabila, Acesta se caracterizeaza in principal prin semne: scheletice, oculare si cardiovasculare (vezi sub- capitolul 12,D.5). Modificarile fenotipice din sindromul Marfan sunt rezultatul unei singure mutatii genice. Abaterea de la regula ,o genii—» un caracter” este apa renti, deoarece mutajia genei FBNJ determina sinteza nei fibrline anormale, component majord a fesutulut conjunctiv. Pentru numeroase afectiuni pleiotrope, conexiunea dintre diferite manifestiri mu este nici evidentd si nic bine inje- Teast, {n aceste cazuri se vorbeste de 0 pleiotropie nere- Jagionala, dar acest termen exprimd de cele mai multe ori cunoastere incompleti a patogenie’ lor. Un exemplu Ilreprezinti sindromul Bardet-Biedl (OMIM #220290), ‘maladie caracterizats prin polidactilie, obezitate, sur- ditate, hipogonadism, retina pigmentard i retard min- tal. Initial, in absenja cunoasterii legaturii patogenice dintre modificarile fenotipice, sindromul Bardet-Biedl a fost considerat o boat caracterizati prin pleiotopie nere- lationala, generaté de mutajii recesive ale unei singure ‘gene. Ulterior, a fost stabilit faptul c& boala este oli- ‘gogenica si poate fi produsi de mutafi in 14 gene BBS Aiferite, care codificd proteine ce alcdtuiese corpusculul LiLi 1 d bazal al cililor celulari si actioneaza intro cale de sem- nalizare cu jinte diferite. Toate structurile ce prezint& astfel de cili sunt afectateasadar sindromul Bardet-Bieall devine ,o boalA ciliara” (vezi subcapitolul 12.E.1) eu 6 evident pleiotropie relational 4, Interactiunile genei Expresia fenotipicd a unei gene poate depinde de: interactiunile dintre alelele genei (situate in acelasi locus pe cromozomii omologi), influenta altor gene, ‘actiunea mediului gi efecte stocastice (intimplatoare).. 4.1. Interactiunile alelice Alelele unei gene, situate in loci omologi, pot fi iden. tice (la homozigofi) sau diferite (la heterozigoti). in stare heterozigoti (N/a sau A/n)', manifestarea ale- lelor depinde de relatile ,,de forta” care se stabilese intre ele. Uneori se manifesta fenotipic numai una dintre alete si atunci alela si caracterul corespunzaitor (N sau A) sunt numite dominante. Alela (a sau 7) care nu se exprima in aceasta situafie se numeste rece- sivi; ea se manifesta numai in stare homozigota (a/a ‘sau n/n) sau la hemizigoti (XaY). Alteori, la hetero- Zigoti se manifesta fenotipic ambele alele; in aceasta situatie, alelele sunt codominante. De exemplu, pentru Jocusul grupului sangvin ABO exist patru alele intre care exist urmatoarele relafii: Al este dominant raport cu A2, ambele sunt codominante fata de B gi toate trei sunt dominante fata de 0 ([(A1>A2)-B}>0) Astfel, grupul A1 poate fi determinat de genotipurile AI/A1, AV/A2 sau A1/0, grupul A2 poate fi determi- nat de genotipurile 42/42 sau 42/0, grupul B poate fi determinat de genotipurile B/B sau B/O, grupul 0 este determinat de genotipul 0/0, grupul AIB este determinat de genotipul 41/B, iar grupul A2B este determinat de genotipul 42/B. Nofiunile de dominanta si recesivitate sunt valabile la nivel fenotipic, iar clasificarea alelelor ca domi- ante sau recesive se face pe baza expresiei lor fenoti- pice. La nivel molecular sau biochimic nu se poate face nici o distinetie intre alelele ,dominante” sau ntecesive”, deoarece, de cele mai multe ori, ambele tipuri de alele se manifesta, codificand variante ale aceleiasi proteine. Dominanfa poate fi completd,atunci cind fenotipul heterozigotului 4/n este identic cu cel al homozigotului ___Capitolul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENE!) 83 A/A, sau incompletd (partial) sau semidominanta, cind fenotipul heterozigotului A/n este intermediar intre cel al homozigotilor 4/A si n/n; de aceea, in unele boli cu transmitere dominantd (de exemplu, in hipercolesterolemia familiala), homozigofii 4/A sunt mult mai grav afectati decat heterozigotii A/m. 4.2. Interactiunile nealelice Expresia fenotipicd a unei gene este deseori influen- {ati de acjiunea altei/altor gene (nealele) sau de efec- tul unor factori de mediu. Aceste actiuni determina gradul de penetranfé si expresivitate al unei gene sau sunt implicate in fenomenul de epistazie. a) Penetranfa defineste probabilitatea unei alele ‘mutante de a se manifesta fenotipic, indiferent de inten- sitate, Valabila in special pentru genele dominante in stare heterozigotd, penetranta este 0 nofiune can- titativad ce desemneaza probabilitatea purtdtorului ale- {ei mutante dea prezenta un fenotip anormal’. Penetranja este un parametru statistic determinat la nivelul unei populatii prin identificarea procentajului de persoane bolnave raportat la numiirul total de purtatori ai ale- lei mutante (A/A sau A/n). La nivel individual pene- {ana are ins un aspect calitativ, de tipul ,totul sau nimic”, purtitorul alelei anormale avand sau nu feno- tipul anormal. Penetranja depinde de factori genetici (cum ar fi, de exemplu, relaiile ce se stabilesc inte alela mutant’ si alte gene modificatoare) si de factori ne-genetici (factori de mediu sau factori stocastici). Alelele pot avea 0 penetranja completa, cAnd tofi purtatorii de alelé dominanta o vor manifesta fenotipic, indiferent de genotip, Pentru majoritatea alelelor dominate este prezenti, insi, 0 penetranfa incompleta, caracteri- ati prin absenta expresiei fenotipice a genei mutante lao parte dintre heterozigotii A/n (,nonpenetranfa). Totusi, aceste persoane pot transmite gena mutant’ a urmasi, la care aceasta poate fi exprimati sau nu, cea ce genereaza ,un salt” peste una sau mai multe generatii (figura 4.2) Penetranta este un fermen clinic ce poate fi influ- enjat de varsta si sex, precum gi de capacitatea de explorare a fenotipului pacientului, astfel incat dese- ori ea poate fi dificil de evaluat corect in multe boli monogenice cand debutul simptomelor se face la var- ste diferite si este influentatd de factori modificatori genetici sau din mediu. 3. In prezentarea abreviata a genotipului (de exemplu, A/a; AB/ab) lini ce separa simbolurile genelor ne aratd ci acestea sunt dis- puse pe cromozomi omologi dstinei; petra simpificare, tn situlile n care ne referim in general Ia 0 gen dominaata (N sau AA) sau recesiva (n sau a) vom folosisistemul clasic de scriee, cu majuscule pentru genele dominant si cu litre mici ~ pentra enele recesive 4. 0 penetranga de 75% semmificd prezenta fenotipului anormal la 75% din purttorialelei anormale84. GENETICA MEDICALA Figura 4.2, Penetrantd incompleti si expresivitate variabild intr-un arbore genealogic al uni familii cu camptodactilie Persoana I, dey nu manifest anomalia, a mos- tenit gena mutant de la mama sa gio va trans- mite celor dou fet, lncare genase exprima. Se observa i afectareavariaté a degetelor,unilate- sala [sou bilateral ill 1b) Expresivitatea reprezints gradl(intensitatea sau severitatea) de manifestare clinica (fenotipic’) a unei alele mutante si penetrante la bolnavii din aceeasi fami- lie (figura 4.2) sau din familii diferite. Expresivitatea, spre deosebire de penetrangé, este 0 notiune calitariv Deseori, alelele dominante cu efecte multiple (pleiotrope) se manifesta diferit la persoane cu acelasi ‘genotip (4/n). In aceste cazuri, expresivitatea variabild poate interesa: spectrul semnelor (anomaliilor) mani- feste, severitatea, virsta de debut a bolii sau alte ele- mente componente. La bolnavii diferiti din acceasi familie se pot intalni forme complete de boali, forme parjiale sau fruste (oligo-¢monosimptomatice). De cexemplu, in cazul sindromului Marfan, la unii bolnavi pot s nu apard anomalii la nivelul tuturor celor trei sisteme afectate (schelet, ochi, aparat cardiovascular) sau severitatea clinicd poate s& fie diferita. Expre- sivitatea variabilé este freeventa in bolile dominante autozomale pleiotrope, dar se poate intalni la toate maladiile ereditare, indiferent de modul de transmitere, Cauzele expresivitiii variabile nu sunt deplin cunos- cute (vezi si subcapitolul 6.D.2.2.¢). Se invocé factori de mediu ce influenfeazA intensitatea de manifestare a boli, interacfiunea alelei mutante cu alte gene, numite gene modificatoare, si, in final, mutatiidiferte (ca localizare si efecte) in aceeasi gend (,cterogenitate alelica”), Penetranfa si expresivitatea unor gene mutante sunt termeni clinici. Cunoasterea lor are important practic& deoarece pot influenta calitatea diagnosticului si, in functic de aceasta, corectitudinea sfatului genetic. ©) Epistazia Un alt fenomen de interactiune genica ce se referi la situafiile in care dou sau mai multe gene imeractioneazd in realizarea normald a unui caracter; daci una dintre gene sufera o mutatie, ea suprima efectul celeilalte/celorlalte gene. Fenomenul in care efectele unei gene sunt modificate (pozitiv sau negativ) de una sau mai multe alte gene nealele (numite uneori modificatoare) se numeste epistazie. Un exemplu de epistazie il reprezinté statusul seere- tor, definit prin capacitatea unor indivizi (,secretori”) de a secreta antigenele de grup sangvin ABO in secre- fille apoase ale organismului (saliva, lacrimi,lichid sper- ‘atic etc.), Caracterul secretor este determinat de gena FUT2 care codific’ 0 a(1,2) fucoziltransferazi ce con- troleazA transferul antigenelor ABO in secrejii, prin ata- tea unui rest fucozl la persoanele ce aualela dominant, Se (Se/Se sau Se/se). Indivizii se/se nu au antigene ‘ABO fn secreji,fiind consideraji ,.nesecretori”, chiar daca antigenele ABO exist pe hemati Existenga genelor modificatoare explicd expre- sia mai frecventd sau exclusiv8 a unor caractere (deter- minate de gene autozomale) la un anumit sex, cum sunt, spre exemplu, calvifia frontald, guta gi keratoza palmoplantara ~ mai frecvente la bairbati - si aplazia smalfului dentar sau cderea precoce a dintilor — mai freovente la ferme Influengarea actiunii unei gene de o alt& gen’ poate fi explicata prin implicarea succesivei a genelor respec- tive in dezvoltarea unui organ sau regiuni anatomice, respectiv prin implicarea unor enzime codificate de genele respective in transformarea in etape a unui substrat intr-un produs final de metabolism. ‘Studiul interactiunilor genetice este extrem de impor- tant in genomica functional deoarece permite iden- tificarea unor cai sau refele prin care mai multe gene intervin in realizarea unei functii. 4.3. Interactiunile genelor cu mediul in condifiile in care mediul celular este influentat de factori ai mediului extem, gradul de penetranja si expresivitate al multor gene depinde, intt-o oarecare miisura, de factorii de mediu (fizici sau chimici). De exemplu, la om, expresivitatea variabila a polidac- tiliei nonsindromice (boal’ autozomal dominanta) este conditionata de mediu, astfel incét in cadrul aceleiasi familii spectral de manifestare clinic& poate varia de a hexadactilie la toate membrele, pani la hexadac- tilie la un singur membru, ‘Un exemplu in care interventia medicala blocheazi evolutia unei boli monogenice, prin modularea unui factor exogen, este fenilcetonuria (PKU), care apare ca urmare a incapacitatii organismului de a utiliza un aminoacid esenfial: fenilalanina (vezi subcapitolul 12.B.2). Dieta alimentara restrictionat& in fenilala~ nina previne retardul mintal determinat de pierderea functiei fenilalanin-hidroxilazei. Un alt exemplu al interactiunii dintre gene si factorii de mediu este ris- punsul variabil al diferitelor persoane la anumite Li13 Eu Capitolul 4: EXPRESIA INFO! ‘medicamente (farmacogenetica). Astfel, la persoa- nele cu deficienja in GOPD, absenta enzimei devine evidenta (printt-o criza de anemie hemolitica) dupa actiunea unor factori de mediu, precum utilizarea unor medicamente cu efect oxidant (antimalarice, sulfamide) sau al consumului de bob. 4.4. Efecte stocastice Un exemplu de efect stocastic (intimplator) este pene- tranga variabild a genelor de predispozitie pentru dife- rite forme de cancer (retinoblastom, cancer de sin etc.). In aceste forme de cancer, majoritatea pacien- filor au o alela mutanté mosteniti, dar prezenta acestei alele mutante nu inseamna in mod obligatoriu apa- rifia cancerului, Transformarea maligna este depen- dent de inactivarea celei de-a doua alele (normal) si este un proces aleatoriu. Purtitori la care inacti- varea celei de-a doua alele nu se realizeaz nu vor dezvolta tumora, dar au 0 probabilitate de 50% de a 6 transmite la tofi descendentii lor. 5. Eterogenitatea genetica ‘Numeroase boli ereditare umane prezintd eterogeni- tate geneticd. Exist trei tipuri de eterogenitate: ete~ rogenitatea de locus sau nealelica, eterogenitateaalelica si eterogenitatea clinica. a) Eterogenitatea de locus (nealelica) este situ- ajia in care mutatii in gene diferite, ce ocupa loci diferiti, determind acelagi fenotip clinic. Eterogenitatea de locus poate fi usor demonstrata prin analiza arbo- rilor genealogici ai diferitelor familii in care 0 boala genetic se manifest identic. Aceasta analizé gene- alogica poate evidentia modalitati diferite de trans- miitere ale aceleiasi afectiuni (autozomal dominant sau recesiva, legati de cromozomul X), dovedind existenta unor mutafi diferite in loci diferiti. Ele pot fi confirmate prin studiul ADN. De exemplu, retinita pigmentara (RP) (OMIM # 268000) — 0 cauza frecventa de afectare si pierdere fa vederii (1:3.000-1:5.000 persoane), datoratd unei dis trofiiretiniene progresive ce intereseaza fotoreceptorii sau epiteliul pigmentar retinian, poati fi produsi de ‘mutatiidiferite in cel putin 70 de loci, mutatii care se transmit ereditar dferit: autozomal dominant (23 forme; 30-40% din RP), autozomal recesiv (45 forme; 50-60% din RP), legat de X (7 forme; 5-15% din RP); exist si forme legate de Y, mitocondriale sau digenice, pre- cum si forme sindromice (8 forme, dintre care sindro- sul Usher este cel mai feevent), Analiza genotipici moleculara a demonstrat ci multe afectiuni cu un mod unic de transmitere pot fi eterogene. De exemplu, nanistnul hipofizar, osteogeneza |ATIEI EREDITARE (FUNCTIA GENE!) 85 imperfecta, rinichiul polichistic ete. pot fi produse de mutafii in loci diferiti. Evident, in aceeasi familie tofi bolnavii vor avea acelasi genotip sau, mai exact, aceeasi mutatie. b) Eterogenitatea alelicl este reprezentata de situ- afii in care mutatii diferite in aceeasi gen& produc fenotipuri asemandtoare clinic, deosebite doar prin intensitatea de manifestare a bolii Unexemplu caracteristic il reprezinta distrofia mus- culard Duchenne $i boala Becker ~ atectiuni relativ frecvente (1:3.500 nou-nascui baieti) caracterizate prin atrofie musculara progresiva (OMIM # 310200) (vezi subcapitolul 12.D.1); ele sunt determinate de mutajii diferite ale aceleiasi gene DMD, situat’ pe cromozomul Xp21. Desi efectele fenotipice sunt ase- manitoare, boala Becker este 0 form’ moderati de distrofie musculara. Acest fenomen este explicat prin capacitatea unor alele mutante ale genei DMD de a determina sinteza unor proteine anormale, ce pis- ‘reaza totusi o anumita capacitate functionala. Exist numeroase alte exemple de eterogenitate ale- lica: fibroza chistict (forme cu sau fia insuficientd pan- creatict), hemofilia A, f-talasemia, neurofibromatoza, surditatea, boala Tay-Sachs etc, Se spune cd eterogeni- tatea alelic& este o regula in bolile mendeliene la om, De aceea, in multe boli recesive, bolnavii nu au geno- tipuri purhomozigote; ei sunt deseori heterazigoti com- pusi, deoarece au dou alele mutante diferite (al/a2). in unele afectiuni genetice (de exemplu, muco- polizaharidozele, homocistinuria, osteogeneza imper- fectd, surditatea congenitalA ete.) se intalnesc ambele forme de eterogenitate, alelicd si nonalelicd (de locus). ¢) Eterogenitatea clinic. Uneori eterogenitatea alelicd nu produce fenotipuri aseménétoare, mutafii Aiferite ce intereseaza aceeasi gend (dar in exoni dife- rifi), avand un aspect clinic variat, cu producerea une- ori chiar de boli diferite; acest fenomen se numeste eterogenitate clinica sau fenotipicd. De exempl, muta tii diferite in gena pentru -globina produc siclemia (AR), B-talasemia (AR), hemoglobina instabila (AD) si methemoglobinemia (AD). Eterogenitatea clinica este frecventi si importanta; explicafia cea mai sim- pl a acestui fenomen este ci exonii si, implicit, domeniile distincte ale unei proteine pot indeplini functii diferite, iar prin mutafii variate in aceeasi geni, dar in exoni diferiti, sunt afectate aceste func- fii, rezultand boli diferite 4) Importanta practic’ a fenomenului de ete- rogenitate genetic’ Fenomenul de eterogenitate genetic’ are 0 deo- sebitd importanfi practic’ pentru acuratejea diagnos- ticului clinic gi etiologic, tratamentul diferengiat al unei manifestiri clinice produse de genotipuri dife- rite gi, bineinteles, pentru realizarea unui sfat genetic corect (in functie de modul diferit de transmitere).B. Conceptia actuala despre functia genei in prezent, gena este definita ca ,,un segment de ADN care contribuie la realizarea unui fenotip sau 4 une funcyii" ind o unitate de transcript care deter- ‘mina un produs final functional, polipeptid sau ARN. Deoarece caracterele fenotipice ale organismului au Ja bazi o proteina (un polipepti), in prezentarea func- fiei genei ne vom centra pe mecanismele prin care genele structurale determina sinteza proteinetor. 1. Gene ce controleazi sinteza proteinelor Explicéind functia genei prin relatia ,o gend — un caracter”, genetica clasica nu a putut rispunde la intre- barea: ,cum actioneaza genele in formarea, dezvoltarea si functia organismului?”. Primul cercetator care a presupus existenja unei legaituri specifice intre gene si proteine a fost Archibald Garrod, care in 1902, descrie alcaptonuria, boal cereditara (OMIM # 203500) care se transmite in suc cesiumea generatilorin concordanficu egile lui Mendel. Bolnavii suferd de artrita, calculi renali, iar urina, transpiratia si cerumenul lor capata o culoare brun- inchisa/neagra dupa expunerea la aer. Garrod a pre- supus c boala este determinata de un blocaj biochimic produs de lipsa enzimei care metabolizeaza acidul homogentizic (figura 4.3). Simptomatologia bolii este rezultatul acumulirii acidului homogentizic in orga- nism, ca urmare a blocirii caii metabolice. Prin ace- lagi mecanism el explicd mecanismul altor trei boli ereditare, inclusiv albinismul, unde exist un blocaj metabolic pe calea de transformare a tirozinei in mela- nina. Garrod a stabil astfel o relatie clara intre gene sienzime gia introdus in medicina conceptul de erori inndscute de metabolism (prefigurand era patologiei moleculare), Ulterior, numeroase alte dovezi obtinute la micro- organisme, plante, animale i om au demonstrat incontestabil c& genele igi exerciti controlul asupra organismului prin intermediul proteinelor. Prin enorma lor diversitate si complexitate, ca gi prin rolul lor structural, catalitic (enzime) sau reglator, proteinele determina aproape toate caracterele organismului, Relatia 0 gen —> o enzimé (protein8)" a devenit in scurt timp ,o gen —> un polipeptid”, deoarece unele proteine formate din doua sau mai multe polipeptide (de exemplu, hemoglobina) sunt codificate de gene distincte, care controleazA fiecare sinteza unui poli- peptid. Aceasti relatie nu este general valabila, deoa- rece unele gene codifica diferite tipuri de ARN; dé aceea, gena a fost definita ca un segment de ADN ce determina sinteza unui produs functional. Genele care codificd proteine au fost numite si gene struc- turale. 2. Structura proteinelor _ - ‘Intrucat proteinele reprezint& ,,suportul” biochimic al caracterelor noastre fenotipice, iar sinteza lor este determinati genetic, pentru a injelege mecanismul ALIMENTATIE FENILALANINA —3> ACID FENILPIRUVUC (excretat in urin in feniicetonurie) 1 MELANINA <(—-— DOPA <— TIROZINA ———}-——> TIROXINA 2 4 a ACID HOMOGENTIZIC DOPAMINA. (excretat in urind in alcaptonurie) 3 ACID ACETO-ACETIC. 602 +H,0 Figura 4.3. Metabolismul fenilalaninei si tirozinei cu blocurile biochimice care produc cfteva ,erori indscute de metabolism” |, fenileetonuria; 2. albinism; 3. aleaptonuria; 4. deffcienta congenital in tiroxindCapitolul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENEI) 87 complex al relatiei ,o gend — 0 protein” sunt utile cditeva nofiuni sintetice despre structura acestor com- pusi organici. Proteinele sunt alcdtuite din una sau mai multe catene polipeptidice, formate prin polimerizarea a 20 de tipuri de aminoacizi. Desi diferiti in complexi- tatea lor, ei au la baza o structurd comuna de tipul: Radicalul R difera de la un aminoacid a altul si determina structura si proprietafile aminoacidului. Aminoacizii se unese intre ei prin legaturi pept (-C-N}), intre gruparea NH, terminal a unui am noacid si gruparea carboxil a altui aminoacid. Se for- meaza o catena polipeptidicd liniard, care prezinta 0 coloana vertebrald” (in zig-zag) alcatuita din lega- turile peptidice, pe care se fixeaz lateral gi in mod alternativ gruparea R (figura 4.4). Numarul, tipul si secventa aminoacizilor in lanful polipeptidic alcatuiese structura primari a polipeptidului (proteinei). Secvenfa aminoacizilor dintr-o proteins reprezinta elementul esential al structurii sale, deoarece este unica, constanta, specifica fiectrei proteine si este determinata genetic. Secventa aminoacizilor deter- mind rolul proteinei si antigenicitatea ei, deoarece prin interactiunile dintre aminoacizii situati in dife- rite situri din structura polipeptidului se realizeaza structurile spatiale, tridimensionale, ce determina acti- vitatea sa biologica. Prin legiaturi de hidrogen intre aminoacizii invecinati se formeazi, in anumite portiuni/zone ale proteinei, structuri secundare de tip alfa (in elice) sau beta (foaie plata). Prin interactiuni intre aminoacizi din diferite pozitii ale catenci, aceasta capata spontan o configu ralie tridimensionala, spatial, ce reprezinta structura tertiard a polipeptidului (Figura 4.5). Unele proteine au doua sau mai multe catene identice sau diferite ce on Amino terminal formeaza, singure sau impreund cu alte molecule nepro- teice (cofactor sau liganzi), complexe macromoleculare (structura cuaternaril). Configurata spatiald caracte- ristica unei proteine determing rotul ei structural/ ‘functional, De notat c& proteinele funcfionale nu sunt totdeauna sintetizate in forma lor activa. Ele suferd ‘modificdti post-translationale care determin activa- rea proteinei Aminoacizii care interactioneazA intre ei pentru a forma structura tridimensional, biologic activa, sau care aledtuiesc asa-numitele ,situri functionale” ale proteinei sunt deosebit de importanti; inlocuirea lor, in urma unor mutafii, genereaza o protein’ anormal (cuo structura spatial modificata) si conduce la pier- derea/schimbarea activitiii proteinei. inlocuirea altor aminoacizi, neimplicafi in legiturile spatiale sauin situ functional, este mai pufin importanta si poate pro- duce variante proteice normale. 3. Genele structurale determina secvenfa aminoacizilor in proteina Genele care codifica proteine contin mesajul codifi cat necesar pentru asamblarea specifica (intr-o anu- mit ordine) a aminoacizilor in proteina. Aceasta relatie a fost demonstrata prin studiul mutatiilor care produc diferite tipuri de hemoglobin anormala si, in special, prin descifrarea mecanismului patogen al drepanocitozei (siclemie, anemic faleiforma®), o form de anemie hemolitics Drepanocitoza este 0 boala sangvina ereditara, cu transmitere autozomal recesiva, freeventa in popu- latia originara din regiuni endemice pentru paludism, precum Africa tropicala (1:500 nou-nascufi), bazinul mediteranean, Orientul Mijlociu sau India. Aceasta distributie geografica specifica se explicd prin avan- tajul selectiv al heterozigotilor sinatosi — N/a (1:25 nou-ndscufi), care au imunitate naturalé fad de para zitul din specia Plasmodium. i s—chy Figura 4.4. Structura unui polipeptid Faleform” provine de la termenul latin fale ce inseamna coasa/secer88 GENETICA MEDICALA Figura 4.5, Structura terfiard si cuaternari a hemoglobinei (modifica dupa Stine, 1989, Thompson er al, 1991) A) Structura teriard a molecule, cu 8 regiuni helical, notate de la A la H, si ,punga” hemului; B) Structura custernaré ‘eu dous languri alfa identice (im gri si doua lanquri beta identice (in alb) Boala se manifest la homozigoti (al) printr-o anemie ‘hemolitcd severd, produs& prin distrugerea hematilor cu forma anormala, ,,in secera” (figura 4.6.a); aceste hhematii anormale apar prin precipitarea hemoglobinei in condifi de presiune seizutd a oxigenulu, in special in teritorile capilare. Formele acute se insojese de dureri in mAini/picioare sau alte organe (splind, mez~ center, rinichi etc.), produse de microinfarcte, prin oclu- 2a capilarelor de cétre hematiile fn secera, care sunt rigide sau o lexbilitate redus8. Hemoliza se asociazA ‘cu splenomegalie si infarcte splenice recurente, care ..cfJo.. >. Y y y T u Val —> Hos ARE (FUNCTIA GENE!) 89 Hemogiobina A Hemoglobina S Hemoglobing C/A, P origine 8 Hes Hs. SOLUTE FIBRA OXI DEZOX) —> l ¢ COCLUZIE-CAPILARA, c Figura 4.6. Anemia hemolitici cu hematii in secerd (siclemia sau drepanocitoza) AA) Frotiu sangvin eu hemati in see; B) electroforeze hemoglobinei A, S gi C la dferti bolnavi (I-4); © patogenia molecular a siclemici tertiare multiple (pleiotrope), la nivel fenotipic, de organ/organism (semne si simptome). in toate bolile ‘monogenice se cunoscefectele terjare ale genei mutante, adicd simptomatologia boli in timp ce efectele pr mare (proteina anormala) si secundare (modificai celulare) sunt cunoscute pentru moment doar in unele boli monogenice. (3) La heterozigoti (W/a) se manifesta (exprima) Ja nivel molecular ambele alele gi persoanele hete- rozigote cu trisdtura siclemic& produc si HbA si HbS. Rezulta cf nofiunile de dominant si recesiv NU sunt valabile la nivel molecular, ci numai la nivel fenoti- pie (de organism). (4) Expresia ambelor alele la heterozigoti permite identificarea lor, prin studiul efectelor primare si uneori secundare (la nivel celular). Depistarea heterozigo- filor sdindtosi purtitori de alela mutanta are valoare practicd in prevenirea nasterii de copii bolnavi (doi piirinti heterozigoti, N/a, au un rise de 25% dea avea un copil a/a homozigot, bolnay). (5) Cunoasterea modificarii nucleotidice in alela mutant care produce o boali moleculara permite, prin metodele actuale de analiza a ADN, diagnosticul -genotipic precoce al bolii in stadiile asimptomatice, fie prenatal, fie postnatal. Se deschid, de asemenea, perspectivele terapiei genice; de exemplu, in drepa- nocitoza, insertia unei gene normale pentru beta-glo- bina in celulele unui boinay va asigura vindecarea boli 4. Complexitatea relati un polipeptid” 0 gen’ > Evolutia cunostintelor despre structura moleculara a genei, bazati pe posibilitatea analizei ei directe, a cevidentiat o serie de fenomene care se abat de la rela- fia fundamentala 0 gend (de structurd) —> un poli- peptid”. in esenté, este vorba de situatiile in care o gen’ poate produce mai multe polipeptide asemiinatoare/ diferite sau invers, mai multe gene distincte, parti- cipa la sinteza unui singur polipeptid sau a unei pro- teine multipeptidice. Primul fenomen, ,0 gend.—> mai multe polipep- tide” se realizeaza prin mecanisme diverse ce intervin in diferite etape ale expresiei genei, cel mai freevent90 GENETICA MEDICALA la nivelul transcriptiei (de exemplu, matisarea alter- nativa). Al doilea fenomen, ,mai multe gene -> un poli- peptid’, se observa in cazul proteinelor/polipeptidelor alcatuite din segmente diferite, codificate de gene diferite. De exemplu, lanfurile usoare (L) si grele (H) ale imunoglobinelor prezint& o regiune variabilé (V) ~ care alcatuieste situl de recunoastere gi fixare al anti- ¢genului si o regiune constant& (C); ele sunt codificate de familiide gene distincte, situate la distant pe acelasi cromozom. In limfocitele B, care produc anticorpi, se produce o rearanjare (recombinare somatic) a geno- ‘mului si o anumit& gen V este asociati cu 0 gen& C, formand o secvent& completa functional ce codific& Janful respectiv al imunoglobinei (vezi capitolul 17). 5, Interactiunile genice in conceptia actuala Conceptia clasica despre functia genei postuleazi ci expresia fenotipicd a unei gene este influenjat& de alte gene alele sau nealele, precum si de actiunea ‘mediului. Aceste interactiuni sunt mult mai evidente la nivel molecular. Interactiunile alelice, exprimate prin relajile de dominanfé.— recesivitate dintre aletele unei gene, sunt valabile la nivel fenotipic, influengind expresia unui caracter. La nivel molecular se manifesta de obicei ambele alele ale unei gene, producdnd o proteind nor- ‘mal sau anormal, in cazul alelelor mutante. Uneori, anumite alele nu au nici un efect primar (alele amorfe/ silengioase) cum sunt, spre exemplu, alela 0 a siste~ ‘mului de grup sangvin ABO sau alelele mutante rece- sive pentru agamaglobulinemie sau afibrinogenemie. La heterozigotii N/a, alela mutanti a poate codifica proteina (enzima) nefunctionala; cantitatea totala de proteina/enzima normalai se reduce la jumdtate, fiind totusi suficienta, in condigii bazale, pentru a asigura o functie normala gi, ca atare, individul sa fie (aparent) sinatos (vezi trasatura siclemicd). Interaciunile nealelice si, in special, fenomenul de epistazie pot fi demonstrate mai convingator la nivel molecular, prin acfiunea coordonaté a mai multor gene ce intervin in producerea unui compus final. Un exemplu ilustrativ il reprezint& formarea antigenelor ‘ABH de pe suprafaja hematiilor si din secret Antigenele A, B gi H sunt macromolecule complexe prezente sub forma alcool-solubila (glicostingolipide) pe suprafafa hematiilorsihidrosolubila(glicoproteine) {in secrefii, dar numai la persoanele ,secretoare”. Anti- genele ABH eritrocitare sunt glicosfingolipide co plexe care au o parte central fixati cu un capat in ‘membrana eritrocituluis pe acest ,mie2" se leagi Iate- ral, in 2ona extramembranard, mai multe catene glu- cidice, Specificitatea antigenica este determinati de ‘glucidul terminal. Formarea antigenelor A, B, H este determinatl de actiunea coordonati a genelor H, Se si ABO cate, prin intermediul unor enzime (glicoziltrans- feraze), fixeaza diferite tipuri de glucide la axul sfin- golipidic sau glicoproteic (figura 4.7), Mombrana ettroctars CSL-—-GLU—-GAL—-N-GLU—- GAL ERICA a fost ctu — cal — natu — cat 2 GAD {ost — ot —cat neat —cat 16a) | GSL = glcostingolipide GLU = alucozs N-GLU = Nacotiglucezaming GAL = galactors NGAL = Nacotigalactozamina FUC = fucoz Figura 4.7. Interactiunile nealelice dintre genele implicate in formarea antigenelor ‘A, B, H pe suprafaja hematiilor + Gena H (localizata pe eromozomul 19) codifica. una din enzimele galactozid 2-alfa-L-fucoziltrans- ferazi. Aceasta actioneaza asupra unui precursor siadauga o molecult de fucozd, formand substanja H. Au fost descrise dou tipuri de alele: H, alels ‘dominant, ce determina sinteza unei enzime func sionale, sh, alela recesiva ce determin’ sinteza de enzime nefunctionale responsabile, in stare homo- Zigotd, de ,,fenotipul Bombay”. 5. a Romania gi alte {iri est-Europene se foloseste nomenclatura ,0” (zero), in loc de O, semnificénd lipsa antigenului A sau B. In alte fl temul de grup sangvin se numeste ABO (O provine din germand, cuvantul ome [,fira"] adie fir aglutinogen). 6. in cazul fenotipului Bombay, persoanele nu vor avea aici un fel de antigen ABH pe ertrocite, chiar daca genele A sau B sunt funcfionale, iar la testarea wzuald a grupelor ABO vor fi declarate ca avnd grup 0,iA | ot Capitolul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENE!) 1 + Gena ABO" (localizats pe cromozomul 9934) produce © enzima cu activitate de glicoziltransferaza. Au fost descrise tei tipuri de alele:alela A, dominant ~ care codificd 0 alfa-1-3-N-acetilgalactozaminiltransferaz, ce determina fixarea unei molecule de acetilgalactoza- ‘min pe substanta H, alela B, dominant ~ care codi- ficd 0 alfa-1-3-galactoziltransferaza, ce determin’ fixarea unei molecule de galactozi pe substanja H si alela 0, recesivi — care produce o enzim nefunctio- nal, care nu va modifica substanfa H. + Lasecretori altri de gena H, actioneaza si gena Se care codificd o alta enzima, alfa(1,2)-L-fucoziltrans- feraza, Aceasta va permite solubilizarea substanjei Hl si excreta antigenelor A, B si H. Au fost identificate dout tipuri de alee: alela Se, dominant8, ce permite ‘modificarea substantei H, gi alele sese, recesive, care determina sinteza de proteine inactive, substana H rimannd astfel netransformats si insolubifa, Gena ‘Se are astfel acfiune epistatck asupra genei H. fectul mediului asupra expresiei genelor se mani festa in reglajul cantitativ (si uneori calitativyel sin- tezei proteinelor. C. Mecanismele moleculare ale expresiei genice Conform dogmei centrale a geneticii, expresia informafiei genetice se realizeaza, in toate celulele, pe baza unui flea informational, unidirectional $i universal, de tipul: ADN-+ARNm- polipeptid (proteina). Prima etapa a expresiei informatiei ereditare este copierea informatiei din ADN intr-o moleculé de ARN mesager; aceasta etapa are loc in nucleu si mitocon- drii si se numeste transeripfie. A doua etapa, numita translafie, are loc in citoplasmi, Ia nivelul ribozo- milor si consta in decodificarea (traducerea) infor- mai din ARNm intr-o anumita seevenf de aminoacizi, caracteristicd unui polipetid Realizarea acestor etape se bazeaz pe principiul coliniaritait: 0 secvenga liniar& de nucleotide din ADN este copiati (complementar) intr-o secvenfa liniara de nucleotide in ARN; apoi ea este decodificata (prin .citire” in grupe de trei nucleotide numite codoni) intr-o secventi, de asemenea liniard, de aminoacizi ce formeaza un polipeptid. fiatregul proces al expresiei informatie genstice este supus unui riguros control care determing tipul de celula in care se produce sinteza proteinei, pre~ cum si momentul, cantitatea gi ritmul in care se des- Rigor. 1. Transcriptia 1.1. Date generale ‘Transcriptia este procesul de copiere a informatiei genetice de la nivelul seeventei centrale a unei gene, sub forma codificatd, complementara si antiparalela, intr-o moleculd de ARNm, ARN este o forma de acid nucleic monocatenar, con- stituit din ribonucleotide, cu structura generall [P-R-N},, {in care P = acid fosforic, R = riboza , iar N= baza azotata (Adenina, Guanina, Citozina si Uractul). In cursul sintezei proteinelor intervin: ARN mesager (ARNm) ~ forma codanta ~ care prin translatie gene reazii un polipeptid; mai multe tipuri de ARN ribozo- mal (ARN) care participa Ia formarea ribozomilor; ARN de transfer (ARNO ce asigurd transportul aminoaci- Zilor la ribozomi. Sinteza in vivo a ARNim este asigurat& de apara~ tul de transcriptie, constituit din: + ocatend de ADN (transcrisa), ce functioneazi ca matritas + ARN polimeraza de clasa I (dependent de ADN); + factori de transcriptie (TF), ce regleazi ghidarea si activarea ARN polimerazei; * un complex mediator intre TF si ARN pol II; + ribonucleotide activate (sub forma de ribonucle- o7id-trifosfati). (1) Catena transerisi, Numai una dintre cele dows catene ale ADN (3'-95’) este transcrisi gi serveste ca ,matrita” pentru sinteza unei molecule comple- mentare si antiparalele (5’3°) de ARNm; dar, la gene diferte, transcripfia (in directia 3°->5") se poate face pe una sau cealalta catend a ADN (figura 4.8) Alegerea catenei transcrise depinde, in mare parte, de localizarea si orientarea promotorului, locul unde 7. Analiza molecular a genelor A, B, 0 a fost recent realzat. inte aleele A si B exist o diferent de seoventi de numai patra nucleotide. Alela 0 prezintéo deleie a unui nucleotid care (find o mutatie ,cu decalarea cadruli de Lectura) determina pierde- rea activitifi transferazice. 8 Inreaitate hx informational nu est excisv uniditectonal univers nee sevente de ADN (retrotranspozoni) sunt tan- serge in ARN fi apo, sub aciunea une ransriptaze inverse, sunt retrocopat integrate alata in ADN prin acelas meea- nism ule retoviusui (de exempi, HIV), cae au ca material genetic ARN, se pot inser in ADN celulelorevcrotea ADN, | 3 ARN m——, 3 Se a Nay ai 3 5 Figura 4.8. Catena transerisi din ADN diferd de la gend la gen se fixeaz ARN polimeraza, prin intermediul facto- rilor de transcriptie. ARNm, care se formeaza prin transcriptie, va avea ace- easi secvena de nucleotide (exceptind inlocuirea T cu U) si acelasi sens (5? —> 3") ca gi catena ADN netran- serisd sau ,catena de referin{a”, motiv pentru care aceasta se numeste catend sens, iar catena transcris& este numiti adesea antisens’. 5'wATGTTACGACGT...3°__catena ADN , sens” (netranscrisi, de referings) catena ADN ,antisens” ((ranseris) 3°..TACAATGCTGCA... 5 ‘Transcriptie 5’..AUGUUACGACGU... ARNm Catena transeris prezint, in amonte de regiunea centrali, 0 serie de secvente cis-reglatoare, specifice (fiecdrei gene $i constituite din promotor si seeven- {ele de reglare proximale si distale acestuia (vezi subcapitolul 3.B.1.2), care interactioneaza cu factori de transcriptie (TF) trans-reglatori (figura 4.9), deter- ‘minand fixarea, pozitionarea si gctivarea ARN pol IL, astfel ca transcriptia si inceapa exact la situl de start al transcriptiei (SST). (2) ARN polimeraza II (RNAP sau pol 11)" transcrie catena matrité a genelor ce codifica prote- ine (sintetizand 0 copie complementara si antipara- lel de ARNm) si a unor gene ARNne. RNAP incepe transcriptia la SST, dupa fixarea prealabila la pro- motor, proces initiat de interventia factorilor de transcriptie. (3) Factorii de transeripsie (figura 4.9) sunt generali si speciali, Factorii de transcriptie generali (TFID" se atageaz si se asambleazi secvential la promotor si apoi recruteazi RNAP, formind impre- und complexul de initiere al transcriptiei. Factorii de transcriptie speciali sau activatori se fixeaz& la elementele cis-reglatoare situate in amonte de pro- ‘motor, influentind momentul si intensitatea transerip- tiei. (4) Mediatorul este un complex multiproteic care funcjioneazi ca activator al TF $i RNAP. Expresia unor gene specifice este conditionatt de realizarea unei configurafii ,deschise” a cromatinei (incare ADN obignuit este compactat sub forma fila- mentului cu nucleozomi) asigurat& de remodelarea cromatinei (decondensarea) in teritoriile transcrise, produsi de acetilarea histonelor si deplasarea nucle- ‘ozomilor, astfel incat genele devin accesibile ARN polimerazei si proteinelor reglatoae. Procesul de transcriptie la eucariote se desfisoard in dowd mari etape, interdependente, determinate de structura discontinua (fragmentata) a genelor euca- riote. Acestea sunt: + formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm) sau transcriptul primar, prin transcripfia integrala a genei (exoni gi introni); + maturarea pre-ARNm, printr-o serie de modifi- cari din care rezults ARNm matur, ce va trece in citoplasma. 1.2. Formarea ARNm precursor Dupa decondensarea local a cromatinei, formarea pre-ARNm se realizeaza in trei mari etape: (1) Initierea transcriptiei, Prirmul pas al transcrip- tiei este fixarea si pozitionarea ARN-polimerazei in regiunea promotor (alcatuitd din secventele consens TATA box, CCAAT box si GC box), astfel ca tran- scriptia si poatd incepe in ,situl de start” (SST sau Inr) cu primul nucleotid (numerotat ,,+1"). ARNpoli- meraza II nu recunoaste direct promotorul si nici nu inijiazd singurd transcriptia, necesitind prezenfa unor factori de transcriptie generali (TF II sau de clasa 11) care se fixeaz secvential pe elementele promotoru- lui pentru recruta, ghida si activa ARN-polimeraza. 9. Referrie la structura gene se fac intotdeauna la catena sens (de exemplu, seevenjelereglatoare dela capatul ‘al genei se refer In seeveajee situate Is capatul "al catenei sens simu al cateneitranscrise) 10. in anul 2006, Roger D. Kronberg a primit premiul Nobel pentru chimie pentru analiza molecular activitatii RNAP in diferite stadii ale transeripfc 11. TPM} in numar de sase (A, B, D, E, F, H), sunt codificati de gene diferite gi aleauii flecare din mai multe subunitii; migrarea si fixarea lor la clementele cis eglatoare este determinant pentru demarajultranscripfiei(int-un anumit moment gi tip celular) Ltce jul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENE!) trang: Elemente Gs-reglatoare ura 4.9. Schema unor elemente cis- si trans-regulatoare situate pe o geni ipotetici Reprezentarea schematicd nu implied nici prezenta, nici ordinea tuturor elementelor cis-reglatoare mentionate gi nici fixarea simultand a tuturor factorilor trans-reglatori. Legend&: TF — factor de transcritie; TBP ~ subunitate a FTUD care se fixeaza la secvenja TATA; TAF ~ factori asociaii TBP; BRE ~ elementul de recunoastere a FTUB; CTF ~ tor de transcriptie asociat Ia secvenja CAAT; CRE — element de rlspuns la AMPc; HRE - element de rispuns la 933 Elemente roglatoare ADN Jhormon (H) atagat printr-un receptor (R): NRE ~ element de reglare negativl; ACT ~ element activator (enhance). ec ‘etivator ‘ARN poll Figura 4.10, Formarea complexului transcriptional bazal (de initiere) (Modificat dupa Jorde et al, 1999 si Haffee, 2000) 8) Complexul transcriptional bazal format prin ixareafaetorlortranscripfionali generali (la secvenfa TATA) si ARN polimerazei I (la situsul de start af transcritiei~ In); TBP este o subunitate a TFIID; TAF sunt factori asociati TBP. up& fixarea TFIID se fixeazA secvential si alti GTF care fixeaza si pozioneaza ARN polimeraza. Este indicat dea- semeni complexul multiproteie SWI/SNF, care functionnd ca o helicaza desface structura cromatinei ({ilamental cu rnucleosomi).b) Activarea complexului transcriptional bazal prin interventia TF Spl, fixat la seevenia GC, gi a unei proteine activatoare (ACT) fixate la elementul cis de activare (activator) Enzima si factorii de transcriptie formeaz& comple- xul de inifiere sau aparatul transcripfional bazal. Primul ,actor” este TFIID care (prin subunitatea TFB. si alte molecule, numite TAF) se fixeaz4 la secvenia TATA (sau alte secvente similare la promotorii fra TATA box) (figura 4.10.a); apoi se fixeaza alti cinci ‘TF (in ordine, A, B, F, E si H) care, prin intermediul complexului mediator, reeruteazi si fixeazé ARN pol I. formand complexul de inifere. Sub actiunea TEU E si H se desfac cele doua catene ale ADN, este acti- vat ARN pol Is incepe transcriptia (la un nivel minim, bazal); modularea transcripfici se face de eatre act- vatori sau represor! care, fiind situati la distangd de promotor, sunt ,adusi” in aceast regu printzo modi- ficare conformational (bucl8) a ADN (Figura 4.10.b).94 GENETICA MEDICALA (2) Transeriptia propriu-zisd (elongatia). ARN polimeraza si unii TF se deplaseaza in lungul mole- culei de ADN; cele doua catene se separa (prin acti- unea TFIIH, cu rol de helicazd), eliberdndu-se catena transcrisi 35’, care serveste drept matrita (tipar) pentru asezarea secvengiald si complementara a ribo- nucleotidelor activate'*; ele vor fi apoi polimerizate de catre ARN polimeraza, forméndu-se ARNm pre~ cursor, in care sunt copiafi atat exonii, ct i intronii. Transcriptia se face numat in sensul 5'-»3" (deci ARNm este antiparale! faja de catena transcris®),fapt ce asigura fidelitatea ,citirii” informatiei genetice. ARNm se desprinde treptat de pe catena transcris& (rimanénd fixat temporar numai la capatul 3°), iar cele dowd catene ale ADN se reunesc gi refac dublul helix. (3) Terminarea transcriptiei se face cind ARN- polimeraza intalneste situl de terminare a transcrip- fiei; aici se afl& secvenja AATAAA (citité pe catena netranscris&) care semnaleaza clivarea 3” transcrip- tului primar. Sectionarea ARNm sintetizat"® are loc (sub actiunea unei exonucleaze) la 15-30 nucleotide in aval de situl de poliadenilare. ‘Transcriptia unei gene poate fi realizata concomitent demaimultemolecule de ARN polimeraz,forméndu-se ‘mai multe copii de ARNm ce contin aceeasi informatie geneticd (aceasta amplificare va creste considerabil ‘n cursul translajiei si astfel.o gend va determina sin- teza concomitentéa mii de moleculé proteice identice). 1.3. Maturarea ARNm precursor Transcriptele primare (ARNm precursor) suferd un proces de maturare nuclearé, ce cuprinde doua pro- ese distincte (derulate pe misura realiziri transcrip- fiei) destinate si fack ARNm mai disponibil si mai util translatiei (figura 4.11). ) Modificarea extremititilor ARNm precur- sor determin’ cresterea stabilitayi sale (protectie la degradarea de catre ribonucleaze) si faciliteaza trans portul in citoplasma, precum si recunoasterea gi fixa- rea sa la subunitatea 40S a ribozomului. + La capatul 5° se adaugi, la primul nucleotid al transcriptului primar, o molecul& de 7-metil-guano- Zina, ce formeaza o structur’ specialé, numita in limba englezi cap (capac sau calotay; + La extremitatea 3” se adauga (prin acfiunea unei poli-A polimeraze) o serie de 50-200 de nucleo- tide cu adenina, formand 0 ,coada” poliadenilica. Aceasté operatie de poliadenilare este caracteristica ARNm, find indispensabil& pentru protecta si sta- bilitatea ARNm, precum si pentru initierea trans- lagiei. b) Procesarea ARNm precursor. Transcriptul pri- mar confine secvente complementare regiunii tran- sorise din gena (cadrul de lectur8) alcatuita din exoni (regiuni codante) gi introni (regiuni necodante). Pe ‘misura ce se sintetizeaz&, transeriptul primar suferd Gena umana a S'UTR > | Transcrpe [~~ 3uTR | Procesare SUTR 1 Protein Nia | verse SUTR 4 a cooH gene umane ,.tipice” si procesarea transcriptului primar in ARNm matur gi protein 12, Tn acest proces intervin si anumiti factor de elongayle”. 13, Pentru multe gene clivarea se produce in poziiidiferite, ezultind produsi de transeripie deri. 7 4Capitolul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENE!) 95 © procesare complex, ce consti in decuparea precisa si eliminarea ARN intronic, urmati de innddirea (lega- rea) ,cap la cap” a ARN exonic, cu formarea ARNm matur, alcatuit dintr-o serie continud si contigueé de exoni. Procesul denumit splicing, in limba engleza, sau épissage, in limba francezi, poate fi tradus in limba romana prin matisare (termen tehnic care se referii la innddirea a dou capete), Excizia $i reunirea fragmentelor de ARN sunt deosebit de precise: 0 eroate de decupare a unui singur nucleotid schimba cadrul de lectura si, dupa translatie, va produce o protein’ anormala. Procestil este favorizat de secvenje nucleotidice-sem- nal, situate la granifa exoni-introni: 5*GU sau situs donor 51 3°AG sau situs acceptor; o alta secvenf’ important situati foarte aproape de capatul 3° al intronului este situsul de conexiune sau de legdturd (branch site”), ce confine nucleotidul A. Mecanismul de decupare (figura 4.12) se deruleazit in treietape: (1) sectionarea Joncfiunii exon-intron 5°GU; (2) atasarea nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de conexiune i formarea unei structuri in lasowbucla; (3) sectio- narea intronului la jonctiunea 3°AG, indepartarea lui si unirea segmentelor de ARN exonic. Reactiile sunt ‘mediate de un complex de matisare ARN: proteine (numit {in engleza ~ spliceosome), ce cuprinde cinci tipuri de ARNsn (small nuclear) si numeroase proteine Sm $i ta A eran serene (© sts dor” Sts scoeptck_ Yamal O rs. Matsare Eiminarea buce s y ARN mati pvela Figura 4.12. Matisarea ARNm precursor siformarea ARN matur La Ordinea exonilor din ADN si transeriptul primar sunt pistrate in ARNm matur. Exist insi o 14, Mutatile genei ce codi flexibilitate de utilizare a exonilor, prin care (sub acjiunea unor factori putin cunoscuti), in celule dife- rite, vor fi refinufi in ARNm matur numai o parte din exoni, alfii putdnd fi indepairtati odata cu intronii, proces numit matisare alternativa (sau diferentiala) si care permite sinteza a mai multor tipuri de ARNm si deci de proteine de catre o singura gend (vezi sub- capitolul 4.D.3.1). 1.4. Controlul calitéyii ARNm Erorile de transcriptic si matisare se produc frecvent (20% din transcripte), find induse de: persistenfa unuia sau mai multor introni, absenfa codonului stop sau prezenta de codoni stop prematuri, Celulele posed ins mecanisme complexe de detectie si degradare a ARNm anormali, denumite mecanisme de suprave- ghere a ARN, care asigura precizia transcriptiei, fri de care ar fi sintetizate proteine anormale, deseori cu efect toxic. 2. Translatia A doua etapa a expresiei genice este translafia, pro- cesul de decodificare a informatiei genetice din ARNm (reprezentata de 0 secventa de codoni) intr-o secvenfi specifica de aminoacizi, ce formeazi un polipeptid; acesta-va suferi ulterior o serie de modificdri deve- rind o proteina activa. Procesul de translatie necesita un dictionar”, reprezentat de codul genetic, si un aparat de trans- latie, care include, printre alte componente, si ,tra- ducitorul”, reprezentat de moleculele de ARN de transfer. 2.1. Codul genetic Informatia genic’ este asigurati de suecesiunea spe- cificd a celor patru tipuri de nucleotide: A, G, T, C. Ea este copiati (transerisé) complementar (U, C, A, G) in ARNm gi apoi ,,tradust” intr-o anumité see- venfii de aminoacizi, care vor forma o catena poli- peptidicas aceasta translatie se face cu ajutorul unui fel de ,dictionar bilingv” care este codul genetic. Codul genetic reprezint& un sistem de corespon- denye intre o anumitt seevenf detrei nucleotide, numit ‘codon si un anumit aminoacid (tabelul 4.1). Cu cele ptr ltereale.,alfabetului” genetics pot scrie ,cuvinte”, alcatuite din trei litere; gena ar fi deci ,o fraza” for- mati dintr-o ingiruire de codoni, ce determina o anu- mitd secventa a aminoacizilor intr-un polipeptid. 4 proteinele SMN (,Survival of Motor Neurons”) produc amiotrofia spinal ereditar,‘Tabelul 4.1. Codul genetic Descifrarea codului genetic'® (1965) a fost o desco- perire extraordinara, deoarece a marcat decisiv debu- tul erei biologie’ moteculare. Codul genetic prezinti urmatoarele proprietati (1) Codul genetic este triplet, in conditile in care prin combinarea céte trei a celor patru baze azotate (4°) se formeaza 64 de combinatii, suficiente pentra cei 20 de aminoacizi standard care se gasesc in struc- tura proteinelor. (2) Codul genetic are un codon initiator (AUG) si trei codoni stop (UAA, UAG, UGA), veritabile »semne de punctuafie”, cu care se incepe si se ter- mina sinteza polipeptidului. Codonul initiator AUG (cu care se incepe cadrul de lectura al genei) semni- fic metionina. Codonii stop sunt numiti si codoni rnonsens, deoarece nu semnific& nici un aminoacid; ei semnaleaz& incheierea sintezei si eliberarea poli- peptidului format (prin fixarea unor factori de elibe- rare). Ceilalti 61 de codoni sunt codoni sens ce semnificd cei 20 de aminoacizi (tabelul 4.1). (3) Codul genetic este redundant (degenerat), deoa- rece mai mulfi codoni semnifica un acelasi aminoacid, PRIMA ‘ADOUA BAZ x BAZA v € x ¢ TREIA BAZA WOU [phe [UCU [ser [WA [yr [0c [9s U vu uc | phe | UCC [ser | UAC UGC Cc WUA| leu | _UCA | ser A WUG_| leu | UCG_| ser G cuu | leu | ~ccU_|~ pro | cau ag | _U c uc [leu | Cec | pro | CAC | his | CGC | arg c GUA | leu [| GCA | pro] CAA | gin | CGA | arg A ‘cuG_[ teu [CCG [pro | CAG [gin | CGG_ | arg G ‘AUU_| ile [ACU [thr | “AAU | asn [AGU | ser v A ‘uC [ile | Aacc_{~thr_| AAC | asn | AGC [ser c ‘AUA, ie | ACA [thr | AAA | lys__| AGA | ag A ‘ACG [thr [| AAG [ys | AGG [arg G Guu_|val__| Gcu [ala | GaU_|~ asp | Gou_| el v G uc_|val_| Gcc_[~ ala | ~Gac_|~ asp | ~GGc_| el c ‘GUA_|val_| GCA [ala | GAA | glu | GGA | gh A Guc_|val_| GcG [ala _[ GaG | gu | GGG | ely G ‘Abrevierl pentra aminoai ala (A) — alanina sly (G) ~ alicina pro (P) ~ prolina arg (R) — arginina his (H) — histidina ser (S) ~ serina asn (N) — asparegina ile (1) — isoleucina thr (1) ~ treonina asp (D) ~ acidul aspartic leu (L) ~ leucina tp (W)— triptofanul cys (©) — cisteina lys (K) = lizina tyr (Y) — tirozina gin (Q) ~ glutamina met (M) — metionina val (V) ~ valina glu (©) ~ acidul glutamic phe (F) ~ fenilalanina X | = stop Tn anumite condii UGA poate specifica selenocisteina (al 21-tea aminoacid) find numiti codoni sinonimi. Excepténd metionina si triptofanul, codificati de un singur codon, ceilalti 18 aminoacizi sunt codificati de 2-6 codoni, de regula diferiti prin cel de-al treilea nucleotid. in general, redundanfa intereseaz aminoacizii cei mai reprezen- ‘afi in proteine, avantajénd celula, deoarece unele sub- stituti genice produc codoni sinonimi, ir% a modifica proteina codificati de gen& (mutalii silenjioase sau izo-semantice). Aceasti proprietate a codului gene- tic este un veritabil sistem de protectie contra efec- telor mutatiilor. (4) Codul genetic este nesuperpozabil (deoare codonii vecini nu au nici un nucleotid comun) si fa virgule (intrucat codonii sunt adiacenti nefiind sepa- rafi de nucleotide fira rol codant, cu rol de ,virgula”). Astfel, pot fi explicate efectele grave ale deletiilor sau inserfiilor a 1-2 nucleotide (sau a unui alt numsr care nu este un multiplu de trei) prin care se produce odecalare a cadrului de lecturd al genei", rezultind ‘© succesiune de alfi codoni si, implicit, schimbarea ordinii aminoacizilor din protein’, incepand cu locul {in care s-a produs mutafia. ce 15, Pentru descifrarea codului genetics rolului sau in sinteza proteinelor, Robert Holley, Har Gobind Khorana si Marshall Nirenberg, au eastigat premiul Nobel pentru medicinl (1968). 16, Mutailframe-shift.(5) Codul genetic este lipsit de ambiguitate, intru- cét un codon semnificd intotdeauna un anumit ami- noacid, intotdeauna acelasi (6) Codul genetic este universal", fiind acelasi Ja toate organismele: bacterii, plante, animale sau om. Caracterul universal al codului genetic este important in ,,ingineria genetics”, deoarece bacteriile recombi- nante, in care s-a introdus 0 gen umand, fabricd pro- teina umand folosind codul genetic bacterian care, in fond, este acelagi ca si la om. 2.2, Aparatul de translatie Aparatul de translaje este alcdtuit din numeroase com- ponente: ARNm, ribozomi, ARNt, aminoacizi, fac- tori de initiere, factori de elongate, enzime, surse de energie etc. in-sintezi, ARNm — ce confine informatia (secventa de codoni) care va fi translaté int-o sec- ‘ven de aminoacizi din proteind ~ se fixeazi pe ribo- zom; folosind informajia din ARNm, ,translatorul” ARNt fixeazi un aminoacid specific si apoi il ampla- seazi in povitia corespunzitoare codonului din ARNm. 8) Ribozomii sunt organite citoplasmatice (descrise de George Emil Palade, premiul Nobel pentru medi- cina in 1974) ce aleatuiese platforma de asamblare 8 aminoacizilor in proteine, pe baza instructiunilor ARNm, Ribozomii eucariotelor sunt alcatuiti din doua subunitati inegale (care se deosebese prin constanta de sedimentare, 40S 5i 60S); in repaus ele sunt diso- ciate gi libere in citoplasma, reunindu-se la inceputul translatiei pentru a forma ribozomul activ. subunitate este alcaituitt din ARN ribozomal' si prote- ine, care au rol structural si functional/catalitic (faci- liteaza fixarea moleculelor de ARNm si ARNt la ribozom). Ribozomii prezinta patrusituri functionale: pe subunitatea mica se afl situl de fixare al extre- mitajii 5’ a ARNm, iar pe subunitatea mare: situl P (peptidil) si A (aminoacil) unde se fixeaza moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizii lor specifici, precum si situl de iesire (E — exit”). in procesul de translatie, ribozomii se deplaseazad in lungul moleculei de ARNm, spre capaitul 3°, céte trei nucleotide la fiecare pas. Pe misura deplastti, alti ribozomi pot incepe translatia aceleiasi molecule de ARNm, aledtuind impreund un poliribozom. Capitolul 4: EXPRESIA INFORMATIE! EREDITARE (FUNCTIA GENE!) 7 b) ARN de transfer (ARNO) transport aminoacizii din citoplasma la ribozomi. ARNt funetioneazi ca ntranslator” asigurand recunoasterea codonului din ARN corespunzitor aminoaciduluitransportat si pozi fionarea specificd a aminoacidului in dreptul codomul ARNteste un micropolimer de ribonucleotide (75-85, nucleotide), monocatenar, cu 0 structur’ secundara sitertiara in trefla”, cu trei ,,braje” bicatenare si patru nbucle” (figura 4.13), relativ identica la toate tipurile de ARNt. El posed doua situsuri importante: ents t Figura 4.13. Structura bidimensionali @ ARN de transfer (cup Strachan gi Read, 1999) + extremitatea 3OH este terminati prin nucleotidele CCA, Ia riboza adeninei fiind fixat aminoacidul transportat, prin intermediul aminoacil-ARNt-sin- tetazei, + anticodonul, este un grup de trei nucleotide situat in bucla opusa extremitatii 3'OH i care este com- plementar codonului din ARNm corespunzator aminoacidului”, ©) Enzimele si cofactorii proteici. Pepridil-transfe- raza catalizeazi formarea legiturii peptidice intre doi aminoacizi. Aminoacil-ARNt sintetazele sunt 20 de enzime cu o dubla specificitate: fiecare recunoaste ‘un anumit aminoacid (foarte probabil pe baza marimii si conformatiei radicalului), precum si ARNt sau ARNt 17, Codul genetic mitocondrial are mici diferenfe fat de cel nuclear (codoni cu sensuridiferite) situa similar existing gi la levi, pparameci sau unele rheobacteri 18. La eucariote subunitatea mic& are un tip de ARNr (18S) si 33 protein ribozomale, iar cea mare tei tipuri de ARNr (5S, 5.88, 288) si 45 proteine ribozomale. Moleculele de ARNr sunt codificate de gene prezente in mii de copii pe bratele scurte ale ero- ‘mozomilor acrocentrici, care formeaza ,regivnlle organizatoare de nucleoli. Diferenjele de strcturi ale ARNr gale proteinelor ribozomilor la procarioteexplica afiunea anumitor antibiotie (de exemplu, streptomicina), care blocheasintezaprotccabaceriand, {iri ao influenta pe cea a mamiferlor. 19. Numi de molecule de ARN este de ~40, mai mie decit eel al codonilor sens (61), dar superior celui de 20 de aminoacizis astfel, acelasi ip de aminoacid va fi purtat de mai mulfi ARNL specifici (izo-acceptori,diferii prin al teilea nucleotid din anti- ccodonul lor; aceasta flexibilitate este denumité in limba englezd ,wwobble” (,ezitare”).izo-acceptori corespunzator(i) (pe baza secventei lor nucleotidice). in acest proces de ,,incircare”, mecanismul de recunoas- tere intre o anumit& enzim& si ARNt specifica fost recent descifrat: enzima recunoaste specific fie o pereche de nucleotide (de exemplu, UG pentru enzim’+alanind) situate spre extremitatile terminale 5” gi 3° ale ARNt, fie anticodonul unor molecule de ARNt; ele formeazi un veritabil al doilea cod genetic. Cofactorii proteici intervin in diferite etape ale translafiei. Ei sunt reprezentati de factorii de initiere UF 1-6), factorit de elongatie (EF 1-2) si un factor de terminare (RE). Inactivarea lor (de exemplu, prin toxine microbiene) blocheaza procesul de translatie si produce moartea celulara 2.3. Procesul de translatie ‘Translatia se realizeaz cu consum energetic (furni- zat de ATP sau GTP), in etape succesive — activarea trans ‘Terminarea translate! aminoacizilor, inifierea, elongatia yi terminarea trans- laiei,fiecare controlath de molecule reglatoare dife- rite (Figura 4.14) in etapa de activare, aminoacil-ARMt sintetaza fixeazi covalent (prin grupul carboxil) un anumit ami- noacid la ARNE corespunzitor, proces extrem de fidel A td, Ciclul 2 — a <—— 1 Amors& /ADN nou 1 | Net I sura 5.4. Etapele reacfiei de polimerizare in lant ~ PCR (polymerase chain reaction) {modificat dupa Friedman eral, 1992) | | 1 Denaturarea termica (90°) separa catenele ADN-tinth;b. Pozitionarea si hibridarea amorselor (37°) la capetele 3, ale Fiecirei catene; e. Polimerizarea nucleotidelor (Taq-polimersza, 70°) si extensia amorselor.14 ise GENE LIGA MEVIGALA |ADN genomic uman Gena Digestie cu enzime de restricie ‘Sond marcaté SEES radioactv cu =P Denaturar termica * * ——a | Hibridizarea Aplcarea membranei dentrocelilezs Seo ianston Lege |e | ‘onde dovelopare fim cuAON ‘aplicarea ‘nui ra radiologic Tite Figura 5.5. Tehnica Southern blot (modificat dupa Mueller si Young, 1998) (extensia amorselor sau sinteza enzimatic’ ADN); se produce astfel o amplificare exponenfiala a can- titatii de ADN: dupa N cicluri se obtin, teoretic, 2% exemplare din segmentul initial de ADN. Dupa 30 de cicluri, fara si fie necesard adaugarea de amorse sau enzimi proaspati, acest segment este amplificat de circa un miliard de ori. Prin aceasté clonare ace- Julard, plecand de la o cantitate infima de ADN (chiar si de la o singura celuld) se poate obine, prin PCR, © cantitate suficienta de ADN-fint, care poate fi vizu- alizata prin fluorescenta in UV si/sau analizata direct, Avantajele clonari acelulare a ADN prin PCR sunt, determinate in primul rand de simplitatea sa (nu nece- sitd nici o alta maniputare, in afara variatilor termice necesare diferitelor etape ale reactiei, gi de aceea se preteaza la automatizare, folosind un termociclor’, in al doilea rand, PCR este 0 metoda rapid, sensi- bila (foloseste céteva nanograme de ADN genomic), eficace si ieftind. Metoda PCR a devenit metoda de electie in analiza genotipic’, mai ales in detectia muta- {iilor punctiforme si studiul polimorfismelor genot pice. Fari PCR nu ar fi fost posibild secventierea genomului uman, Dezavantajele majore ale PCR sunt necesitatea unor informatii prealabile despre secventa capetelor terminale ale ADN-tint& (pentru a fabrica oligonu- cleotide specifice), dimensiunea mic& a fragmentului amplificat (rareori mai mare de 5 Kb, in tehnicile uzuale de PCR)’, cantitatea limitata de produs, pre- cum si infidelitatea replicarii ADN (recventa relativ crescutd a erorilor de imperechere generate de Taq polimeraza, care nu poseda activitate de corectie a erorilor) sau riscul contamindtilor si amplificarilor parazite (amorsele nu se fixeazi pe secventa-tinta), ‘Metoda PCR a condus in timp la dezvoltarea unei game largi de variante care au fost dezvoltate pentru aplicatii specifice. Prezentim doar céteva dintre acestea. = PCR eu specificitate aleticd permite amplificarea ADN a unei singure alele, excluzdind amplificarea celeilalte, = PCR multiplex foloseste mai multe perechi de amorse (fiecare permifind amplificarea unui frag- ‘ment diferit de ADN) alese in aga fel incdt si aiba temperaturi de aliniere asemanatoare si totodatt si produc ampliconi cu lungimi diferte, ce pot fi dife- renfiai prin electroforeza. Atunci cénd metoda PCR multiplex este combinati cu metoda PCR cu spe- cificitate aelied pot fi analizate intro singur& reac- fie mutafile cele mai frecvente care determina 0 anumita boala genetica. 7. Ou vatianta long-range PCR produsul amplificat poate ajunge la peste 30 Kb.Capitolul 5: ANALIZA STRUCTURII $I FUNCTIEI GENELOR 133 = REEPCR (reverse transcriptase PCR) folosestedrept matri’ ADNe obfinut in urma unei reat de tran- scriee invers& a ARN total sau ARNm poliadeni lat = PCR cantitativ (Q-PCR) si PCR in timp real (real-time PCR) se bazeaz’ pe folosirea unor component fluorescenfi in reactia PCR si s unor termocicloare care permit masurarea fluorescentei produsului PCR in cadrulfecinuciclu de amplifcare (vezi si subcapitolul 5.C.1). Principalele aplicati ale acestei metode sunt: cuantificarea expresiei genelor, detectarea mutafiilor sau a polimorfisme- Tor mononucleotidice (single nucleotide poly- ‘morphisms ~ SNPs) ¢i misurarea abundenfei unor seevenfe ADN sau ARN in produse clinice (de ‘exemplu, in monitorizarea evoluieiinfectei cu viru- sul HIV sau cu virusul hepatitei B) in timp real, pe rmisura progresiei reacjiei PCR B. Detectia si analiza acizilor nucleici Analiza relafiei fundamentale dintre genotip si fenotip s-a bazat mult vreme pe analiza fenotipica, deci pe studiul manifestarilor genei sau explorarea produselor sale de expresie, Recent a devenit posibila analiza genotipica prin explorarea direct& a ADN. Pentru a identifica si studia 0 gen’/secventa sau pentru a pune diagnosticul molecular al unei boli la ‘© anumitd persoand este necesara o sondd genoripica adecvatii care s& permit recunoasterea directl a genei sau a unor markeri genotipici (secvenje necodante) situafi in vecindtatea genei. Aceasti recunoastere se bazeazi pe principiul hibridizitrii moleculare a aci- zilor nucleici pe baza complementaritijii. Sonda de acid nucleic (oligonucleotid cu o seevenf& cunos- uta), marcati fluorescent, se va fixa pe bazd de complementaritate pe secventa-tint& (formand un heteroduplex/un hibrid molecular), evidentiabil prin marcajul sondei. Degi prezinté numeroase dificultati, analiza geno- tipica® are o valoare teoretica si practic’ deosebita, + inplanul cercetdrilor fundamentale analiza geno- tipic& permite: studiul structuri genei; determinarea CASETA 5.1 secvengei si structurii genomului uman; eluci- darea mecanismelor de expresie genica si in spe- cial a modalitajilor de reglaj, cheia unor procese biologice fundamentale: diferenticrea celular, morfogeneza, senescenta, functia sistemului ner- vos sau sistemului imun. + Inmedicina practica (vezi subcapitolul 9.B) analiza enotipic& este folosita pentru: studiul patologiei moleculare produsa de mutatiile ADN, in patolo- gia ereditard sau cancere; diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al unor boli chiar si atunci cfind gena gi efectele ei nu sunt cunoscute sau nu sunt evidente; recunoasterea unei infectii virale latente. 1, Hibridizarea moleculara a acizilor nucleici Hibridizarea se bazeazi pe capacitatea unor mole- cule monocatenare de acid nucleic de a forma, pe bazdi de complementaritate, molecule bicatenare. ‘Tipuri de sonde folosite pentru hibridizarea acizilor nucle Sondele folosite in tehnicile de hibridizare ale acizilor nucleici sunt de trei tipuri: ADN, ARN $i oli- gonucleotide sintetice. Sondele ADN sunt obtinute, de reguld, prin metode de clonare celularci sau prin amplificare PCR si au lungimi intre 0,1 Kb si sute de Kb, Sondele oligonucleotidice sunt fragmente |) monocatenare de ADN foarte scurte (de regulé 15-50 nucleotide) generate prin sintezd chimicd. Sondele | ARN (ribosonde) sunt molecule de ARN monocatenare, cu lungimi de sute de pb pénd la cdteva Kb ‘objinute prin clonarea unor fragmente ADN in plasmide de expresie, ce conjin un promotor fagic. Pentru a permite vizualizarea heteroduplexului sondai-fintd, sondele trebuie marcate. Marcarea son- delor poate fi objinuté cu produsi radioactivi (sonde calde) sau cu produsi fluorescenti (sonde reci) {folosite in prezent. Fluorocromii sau fluroforit sunt compusi chimici care absorb fotoni cu o lungime de nda specified si 0 re-emit la 0 lungime de undii mai mare, dar caracteristica. Cei mai folostifluorocromi || pentru marcarea sondelor sunt: AMCA (aminomerilcumarind —albastru), DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol — aalbastru), FITC (fluorescein izotiocianat ~ verde), CY3 (indocarbocianind — rogu), TRITC (tetrametilro- damind izotiocianat ~ rosu), rodamina (rosu) si CYS (indodicarbocianind ~ rosu). ‘8. Prezentarea va fi sinteticd, pundnd accent pe principit ‘na pe detalii tehnice (pentru care recomandim bibliog Li1 Ls GENETICA MEDICALA Fragment ADN: TTATACGGTCATCGTCGCATGCTAG HULL ATGCCAGTAGCAGC ‘Sond oligonucleotide mareata cu P+) ‘Psat la mucleotidul dCTP Tehnicile standard folosese o sondi monocate- nara de acid nucleic (oligonucleotid cu o structur’ definita), pentr a identifica o seeveny’ similaréintr-un amestec complex gi eterogen de molecule de acid nucleic, fit” (de obicei imobilizat pe un suport solid). Daca inta este 0 molecula de ADN dublu catenara, atunci catenele trebuie mai intai separate/denaturate (prin caldura sau tratament alcalin). in conditii adec- vate, sonda (vezi caseta 5.1) se fixeaz’ specific §i stabil pe seeventa sa complementara din proba test sau fint& forménd un heteroduplex. Pentru a identi- fica si izola hibridul molecular, sonda este mareara ‘cu un compus fluorescent sau cu un trasor radioactiv. Prin detecjia semnalului se va identifica seeventa/ gena ce poseda o secventi ADN omoloaga sondei folosite. Fenomenul este de o specificitate extraor- dinar, pentru ca o sonda este capabilé s& recunoascd © secventa unic& printre milioane de alte seevente. 2. Metode de hibridizare cu tintd imobilizata Eficienga identificdrii heteroduplexurilor sonda-,inta este foarte redusa in solufii. De aceea, amestecul-inta de acizi nucleic este imobilizat pe un suport soli precum 0 membrana de plastic sau o lama de sticlé, Aceasta forma de hibridizare sti la baza metodelor de analiza Southern blot, Northern blot sia analizei ‘cu sonde oligonucleotidice cu specificitatealelics, 2.1. Analiza ADN genomic prin metoda de transfer Southern Obiectivul principal al metodei descrisi de Edwin Southern (1975) —cunoscuta sub numele de Southern blot (figura 5.5) — este de a evidentia, cu ajutorul unei sonde specitice prezenfa sau absenfa unui frag- ‘ment de ADN omolog (,int&”), obtinut prin fragmen- tarea ADN genomic cu o anumita enzima de restrictie. Fragmentele sunt separate, dupa mérime, prin elec- troforezi in gel de agarozi, denaturate gi apoi trans- ‘ferate (prin capilaritate/sugere — in engleza blotting) si imobilizate pe 0 membrana solida de nitrocelu- oz, pentru a fi hibridizate cu o sond& monocatenara specifica, marcata radioacti. Sonda se va fixa numai pe secvenja complementari de ADN (daca este prezenta), iar pozitia ei pe membrana va permite evaluarea frag- mentului de ADN ce confine sonda complementar’. Rezultatele objinute prin metoda Southem se com- pard apoi cu profilul normal al domeniului genomic explorat de sonda, Prin aceastii metoda pot fi evi- dentiate dou’ tipuri de mutagi + deletii sau insertii genice mai mati de 50-100 pb ‘care determina modificarea lungimii fragmentelor realizate de enzima de restricfie; + muta punctiforme ce creeaz sau anuleaza un situs de restricfie pentru enzima de restrict folosita, antre- niind 0 modificare a lungimii fragmentelor de restric- tie (RFLPs). Analiza genotipicd realizati cu aceasta tehnicd a fost utilizata in special pentru diagnosticul bolilor prin expansiunea repetitilor trinucleotidice. ‘Metoda Southern nu permite evidentierea unor modifi cari mici din structura ADN (microdeletii, mutafi punc- tiforme ale unei pb), decit dack acestea afecteaza un sit de restrictie. Trebuie si subliniem ci metoda Southern are si alte inconveniente: este laborioasé, complex, costisitoare gi prezint& numeroase dificultai de inter pretare. in plus, laboratorul trebuie si posede dotiri adee- vate pentru manipularea izotopilor radioactivi, A fost {nlocuita in mare masurd cu metode bazate pe PCR. 2.2. Analiza ARNm prin Northern blot Northern blot? este o variant a metodei Southern blotin care acidul nucleic-tinta este ARNm. Obiectivul principal al metodei este objinerea de informatii pri- vind profilurile de expresie tipul celular, abundenja, transcriptului) a unei anumite gene (deja clonata), Punerea in evidenta a unui anumit ARNm se bazeazit pe hibridizarea molecular a ARN cu 0 sonda com- plementara monocatenaré (ADNe denaturat; oligo- nucleotide ARN antisens). 2.3. Hibridizarea in situ a cromozomilor variant de analiza a ADN des folosité in prezent este hibridizarea in situ pe preparate cromozomiale in pro-metafazi si pe nuclei interfazici folosind sonde mareate (de obicei cu molecule fluorescente ~ FISH sau CGH) judicios alese, in functie de obiectivul urmarit (vezi subcapitolul 2.D.3.2). Dac& se banu- ieste 0 microdeletie pentru o anumité regiune cro- mozomiald, sub limita vizibilitatii microscopice, se utilizeaz& 0 sonda marcat& corespunzatoare genelor din regiunea respectiva; absenfa semnalului cores- punzitor sondei traduce deletia regiunii 9, Metoda este denumita ,Northern” (nordie8) prin opozitie umoristied fat de metoda descris de Edwin Southem (suit) i, cu toate ed nu este un numé propru, prin analoge se recomanda srietea cu majusculeCapitolul 5: ANALIZA STRUCTURII $I FUNCTIEI GENELOR 135 2.4, Identificarea ADN al organismelor exogene Orice infectie sau infestare cu un microorganism bacterian, viral, fungic sau parazitar poate fi detec- tat intr-un esantion biologic prin hibridizare mole- culari, dacd exists sonde corespunzitoare genomului ofganismului patogen. Hibridizarea moleculara ofer& ‘multiple avantaje fafa de metodele clasice: simpli- tate, rapiditate gi specificitate (perspective de auto- matizare), posibilitatea de a detecta agenti infectiogi dificil sau imposibil de cultivat in vitro, posibilitatea de depistare directé a unui agent patogen intr-un ames- tec polimicrobian (in mijlocul unei flore comensale) si pe orice tip de esantion patologic. ‘in practicd metodele de hibridizare molecular au gasit deja importante aplicaii pentru caracterizarea rapid a germenilor cu crestere lent (mycobacteri, treponeme, Brucella etc.), pentru identificarea virusului hepatitei B sau C, virusului papiloma (HPV) siin special in cazu- rile de SIDA (HIV). 3. Metode de hiibridizare a acizilor nucleici pe microrefele (hibridizarea invers’) incepiind cu 1995, au fost dezvoltate noi tehnologii de hibridizare ale acizilor nucleici cu ajutorul unor microrefele (, microarrays”) care permit teste de hibri- dizare simultand (parateld) multipld, cu mii de sonde diferite, imobilizate pe un suport; hibridizarea mono- catenelor de ADN (pe baz de complementaritate) se face concomitent si in aceleasi condi. Deoarece, spre deosebire de hibridizarea standard, sondele sunt nemarcate $i fixate pe un suport solid, in timp ce populatia/proba test ,jinta” de acizi nucleici este mar- cati si aflata intr-o solutie apoasi, metoda este cunos- utd si sub numele de hibridizare inversi. ‘Tehnologiile pan-genomice bazate pe microretele permit detectarea cu o inaltd rezolutie gi cu un ,debit” mare a anomaliilor genomice cantitative, de marimi variabile: de la aneuploidiile ce afecteaza un cromo- zom intreg, pana la dezechilibrete de talie foarte mic&: variafii ale numérului de copii (CNV ~ de la copy ‘number variants), microdeletii/microduplicatii 3.1. Tipuri de microrefele si principii tehnice Microrefelele sunt alcdtuite din cdteva zeci, chiar sute de mii de sonde oligonucleotidice diferite (fiecare find specifica pentru o anumitd secventa ADN), nemar- cate, fixate pe o lama de sticl& sau pe un cip de silicon, {in mici puncte (spots) cu coordonate precise, dispuse in randuri ordonate, sub forma unei tejele (grile) cu densitate inalt& (.cip ADN’). Sondele oligonucleotidice diferd ca lungime, in func tie de firma producatoare, de la 20-25 nucleotide (meri) (Affymetrix®) pana la 50-70 nucleotide (meri) (Agilent®, Roche®, Nimblegen®, Illumina*). Oligonucleotidele pot fi sinttizate in situ (Adiymetrix®, Agilent®, Roche®, ‘Nimblegen®) sau presintetizate (Illumina®). Proba test (,int&”) confine o populatie de fragmente de ADN, ADNe sau ARNe, in solutie apoast, denatu- rate, care se vor hibridiza cu sondele moleculare fixate pe microrejea. Dupa spare (ce indeparteaz’ sondele nehibridizate) gi uscare, semnalele fluorescente ale hibrizilor din fiecare ,pozitie/punct” al refelei vor fi detectate cu un scanner laser de inalta rezolutie $i analizate cu un soft special de analiza digital, care converteste imaginea obfinutd in valori numerice ale intensitajii fiectrui fluorocrom pentru fiecare punct, al refeei. oud tipuri de microrefele sunt utilizate in diagnos- ticul genetic: microrefele CGH (comparative genomic hybridisation”) — cu sonde non-polimorfice si micro- refele SNP (,single nucleotide polymorphism”) — cu sonde polimorfice. Acestea scaneaza intreg genomul ao rezolutie foarte bun, ambele detectind anoma- lii genomice cantitative; tehnica de microrejele SNP permite in plus genotiparea, precum si identificarea regiunilor cu absenfa heterozigotiei (de exemplu, diso- mia uniparentala) sau a mozaicismelor. + _Analiza genomic prin tehnica sondelor non-poli- morfice ~ microrefele CGH se bazeaz§ pe mar- careaa oui esantioane de ADN (pacient si control) cu doi fluorofori (de obicei Cy5 ~ rosu si Cy3 — verde) si cohibridizarea lor cu sonde oligonucleo- tidice, imobilizate pe o lama, pentru a objine 0 ‘comparatie direct8 a numérutui de copii intre proba test si control (figura 5.6). Se evalueazA un singur parametru, intensitatea semnalului generat de fluo- roforul corespunzitor pacientului raportaté la inten- sitatea semnalului generat de control (log? ratio). Microrefelele CGH permit realizarea unui ,cariotip digital” si identificarea precisé a microdel si microduplicatiilor (vezi CMA ~ Chromosome Microarray Analysis, subcapitolul 2.C) + Analiza genomica prin tehnica sondelor poli- morfice — microretele SNP se bazeazi pe hibridi- zareaADN pacientuluicusondeleoligonucleotidice, care corespund regiunilor care contin SNP-uri (figura 5.7). Sondele oligonucleotidice au o lun- gime de 60 meri si sunt fixate pe bile de siliciu de 3pm, fiecare bild de siliciu confinind aproxima- tiv 100.000 sonde identice (Illumina), Rezultatele ‘objinute sunt comparate cu cele ale altor pacienti cevaluafi anterior. 1 aLt ‘aon nope lopa= 06, ee tacie = Figura 5.6. Imagine schematizati a tehnicti sondelor non-polimorfice ~ microrefele CGH ADN control este marcat cu luorofor Cy3 verde (negn in figurd) iar ADN test (pacient) cu flu- orofor rogu (gr in figura) AON pacient p22 DoossDoossee | fe Seoesecccoces |, |*osscoocessses eto 8 oe hud Sant cget8o seseessscees ]T, 828889989088 88ee8888883 63 | Tver AN acon! exon rudd ng Or, Raw ele “08 upton Figura 5.7. Imagine schematizati a tehnicii sondelor polimorfice ~ microretele SNP FFiecare sonda analizeaza un SNP, ceea ce per- mite pe linga determinarea CNV si a genotipu- Ii acelui SNP (genotp homozignt AA, bomnozigot [BB sau heterozigot AB). Pentr fecare sonds SNP se evalueaza doi parametri: intensitates semna- Tuli generat raportatd la intensitatea semnalului lunei referinfe interme (log R ratio) si genotipul (freeventa alelei B. ‘Tebnologia performanta a microrejelelor ADN a accelerat multe tipuri de investigati, folosindu-se in special pentru analiza simultand a expresiei unui mumar foarte mare de gene sau profitul de expresie, folosind principiul tehnicii Northern blot. ARN mesager este purificat din celule si amplificat in vitro pentru a obtine © cantitate suficienté de ARN marcat cu un epitop spe- cific (adesea biotina). Amestecul de ARN obfinut (ce corespunde diferitilor produsi de transcripje ale genelor 1. Bazele de date: Decipher, UCSC, DGV, ECARUCA, ISCA. exprimate in celulele analizate) este hibridizat pe o ‘microretea ce confine sonde ADN sintetizate in situ pentru fiecare din miile de gene umane cunoscute. Astfel poate fi determinat profilul de expresie (tran- scripfie) al unui tip celular sau al unui fesut, util in stabilirea rolului diferitelor gene in procesul diferen- sierii si dezvoltiri, precum in diferite stiri patologice (de exemplu ,amprente” sau ,semnturi” moleculare pentru diferite tipuri si grade de tumori) si pentru studiul ‘actiunii medicamentelor; ‘Numarul de sonde utilizate in construirea micro- rejelelor poate fi foarte mare, atunci cdnd acoper’ genomul in totalitate numindu-se whole genome array (WGA). Secventele corespunzitoare sondelor pot fi partial suprapuse, realiziindu-se astfel o ,rejea/plasi” strains ordonatd (tiling array in englez8") cu milioane de micro-spoturi corespunzéind unei regiuni bine defi- nite a genomului, Acest tip de microrejele poate fi utilizat pentru a realiza o analizi cu o rezolufie extrem de important, sau poate fi combinat cu imunopre- cipitarea (tehnic& numita ChIP-chip) pentru studiul secventelor de ADN fixate la anumite proteine. Noile tipuri de cipuri ADN permit determinarea CNY, genotiparea, studiul expresiei genelor in con- ditii normale (diferentiere, dezvoltare) sau patolo- gice (profilul de expresie in cancer), interactiunile dintre proteinele cromatinei etc. Aplicarea acestei noi tehnologii in cercetarile biomedicale gi diagnos- ticul genotipic va avea un impact major in practica medicala, 3.2. Interpretarea si validarea datelor objinute prin tehnici de microrefele Pentru a distinge anomaliile patogene si potential patogene de CNV observate in mod normal la indi- vizii sAndtosi, se utilizeaza mai multe criteri: talia CNV si continutul siu in gene, tipul CNV (duplica- Jie/deletie), existenta unor studii precedente! referi- toare la patogenitatea unui CNV, efectul morbid al ‘genelor coninute in acel CNV (gene morbide OMIM), analiza parintilor (CNV de novo sau mostenit). in ‘urma acestei evaluari, CNV sunt etichetate ca find: patogene, benigne sau cu semnificatie necunoscuta (VOUS, variants of unknown significance). CNV ben- igne sunt variante mostenite sau de novo, observate la paciengi sanatosi, fird a fi descrise in asociere cu patologia si care nu contin nici o secvenf& codanta. CNV patogene, mostenite sau de novo, sunt CNV pentru care existé argumente bibliografice solide in favoarea patogenitai Tehnicile de microretele identifica CNV, insi nu ot indica localizarea acestora; pentru a determina 0. De la letting array in englez8, datorits comparaii cu jglele care se acopera partial pe acoperigul unet case.Capitolul 5: ANALIZA STRUCTURII $I FUNCTIEI GENELOR 137 poziia si, de asemenea, pentru a verifica rezultatele obfinute se indic& folosirea unei tebnici de validare (FISH, PCR cantitativ, MLPA). In cazul determina ri unui CNV potential patogen la pacient, se va efec- tua o analiza parental, pentru a determina dack acest CNV este mostenit sau de novo, Tehnica FISH poate preciza mecanismul care st& la baza aparitiei CNV ‘ceea ce permite acordarea unui sfat genetic adecvat. Atunci cénd tehnicile de microrefele identified un CNV ca fiind deletie, acesta poate semnifica totodatt si o translocatie dezechilibrata. CNV de tip duplicatie pot fi: duplicafii, insertii, cromozomi marker sau trans- locaii neechilibrate, 3.3. Avantajele si dezavantajele analizei genotipice prin microrejele Analiza bazata pe microrefele are ca rezultat un cari- ‘tip virtual pangenomic cu o rezolutie foarte bun’ (este o analiza FISH cu mii/milioane sonde), cea ce permite o detectie a rearanjarilor genomice de talie mica, chiar 1 Kb. Aceste tehnici au un grad de obiec- tivitate mai mare decit cel intalnit in tehnicile xgenetice clasice, interpretarea datelor brute ficindu-se utilizind algoritmuri bioinformatice obiective. Un avan- taj important al tehnicii sondelor polimorfice-micro- refele SNP este ca permite detectia genotipului si a disomiilor uniparentale. Alte avantaje ale acestor ana- lize sunt urmatoarele: + nu presupun cultura celulard, astfel riscul unei selectii clonale este absent; + pot utiliza ADN provenit de la un fesut proaspat sau conservat; + identifica bine mozaicismele celulare; + determina posibile dezechilibre cromozomiale in cazul unor translocatii aparent echilibrate in cari- ‘microdeletiile clasice permit observarea unor duplicafii reciproce in regiunile implicate; + permit identificarea unor sindroame noi in CNV recurente, asociate unui anumit fenotip si identi- ficarea genelor implicate. Limitarile acestor tehnici sunt reprezentate de: + imposibilitatea precizarii in anumite situatii a pato- sgenitiii unor CNV (variante cu semnificatie necu- noscutii— VOUS), limitand stabilirea diagnosticului etiologic, fapt important indeosebi in perioada prenatala; + imposibilitatea detectiei anomaliilor cromozomi- ale echilibrate; + imposibilitatea determindrii mecanismelor respon- sabile pentru dezechilibrul cromozomial; + analiza poate dezvalui informatii nedorite (de exemplu, diagnosticul prenatal al unor mutafii responsabile de boli cu debut la varsta de adult sau evidenfierea unei consangvinitafi). 3.4. Aplicafii clinice ale microrefelelor a) Diagnosticul prenatal Desi folosirea tehnicilor de microrejele in peri- cada prenatal& este discutabil& (vezi mai sus), in anu- mite situafii aceste metode sunt alese prioritar pentru reevaluarea anomaliilor cromozomiale aparent echi- librate in cariotipul clasic, atunci cdnd sunt asociate cu semne ecografice de alarm& (edem nucal cu dimen- siune mai mare de 3,5 mm, retard de crestere intrau- terin, anomalii congenitale multiple). in toate situafiile in care se identifica un dezechilibra cromozomial, acesta va trebui si fie validat printr-o tehnic’ com- plementara (FISH, PCR cantitativ) iar studiul paren- tal este obligatoriu. b) Anomalii constitufionale in perioada post- natal ‘Tehnicile de microrefele sunt considerate in prezent investigatii screening de primi linie in cazul suspiciu- nilor clinice de boala cromozomiala, intrucat crese semnificativ procentul diagnosticarii anomaliilor con- stitufionale, imbundtafind astfel managementul cli- nic (vezi subcapitolul 2.C.3). Principalele indicafi sunt: sindroame dismorfice, anomalii congenitale multi- a dizabilititile de dezvoltare si tulburdrile neuro- jatrice (deficienta intelectual, retardul global de dezvottare,tulburdrile din spectral aust, eplepsia) (figura 5.8). Aceste tebnici au permis identificarea de gene responsabile de sindroame clinice (de exem- plu, gena CHD7 in sindromul CHARGE) si permit © caracterizare mai buna a anomaliilor cromozomi- ale observate la cariotip. ©) Oncologie ‘Natura complex a tumorilor maligne (eterogene, ‘cu o mixtura de clone celulare diferite asociate unor linii celulare normale, degradarea ADN-ului_ prin necroza tumoral) conduce la 0 interpretare dificil, care necesita algoritmuri de detectie si de decizie diferite fafa de testarea anomaliilor constitutionale. Totusi, fafa de tehnica FISH, aduce avantaje impor- tante prin faptul cf este o analizi pangenomica. Tehnologia microrefelelor este indicat& atat pentru studiul modificdrilor genomice, cat si pentru evalua- rea expresiei genice. Se indica utilizarea unor micto- rejele specifice acestor patologii, care sunt imbogatite cu sonde la nivelul regiunilor clinic relevante in oncologie. Pentru identificarea unor anomalii cunos- cute se indica folosirea unor platforme cu o rezolutie ‘mai micé, iar pentru anomaliile neprecizate se indica tehnici de inalta rezolutie. id1 1 Figura 5.8. a) Microrefele CGH: duy GENEIIGA MEDIGALA ee ee ie 8p 21.2 ~ 8q11.2 Ia un pacient cu retard global de dezvoltare. b) Microrefele SNP: duplicatie 7q11.23 la un pacient cu autism (colectia dr. Diana Miclea) 4, Seeventierea ADN Dupa izolarea i amplificarea unui fragment de ADN (gen), etapa principala de analiza genotipici este determinarea secvenjei nucleotidice, deci a informa- tiei genetice a fragmentului respectiv. Aceasta actiune este decisiva pentru a stabili structura genei, precum gi cea a seeventei de aminoacizi a proteinei codificats de gend (in cazul in care ea nu a fost identificata), Cunoasterea seeventei permite identificarea tipului de mutatie care a produs 0 boala genetic’. Stabilirea secvengei nucleotidice este util si pentru sinteza amor- selor folosite in PCR, larg utilizate in diagnosticul molecular, Secventietea ADN a devenit indispensa- bild pentru cercetarile stintitice — culmindnd cu s venjierea genomului uman gi altor organisme ~ dar si pentru diagnostic sau biotehnologie Metodele pentru determinarea secventei nucleo- tidice a unor fragmente de ADN au fost descoperite (1970) independent de Walter Gilbert (tehnica de degradare chimica) si Frederick Sanger (tehnica de sintezi enzimatica), care in 1980 au primit impreun& premiul Nobel pentru Chimie. ‘Metoda cea mai folosita a fost tehnica de sintezai enzimaticd a lui Sanger (,secventierea de prima generafie”) care utilizeazi didezoxinucleotidele ca sterminatori” de catend nucleotid specifici si croma- tografia bidimensionala. Ulterior, au fost dezvoltate noi tehnici de secventiere automata bazate pe culoare (Alworofori), mult mai simple gi, mai ales, mai rapide si au fost inventate pirosecventierea (o tehnologie de secventiere a ADN complet diferita de metoda Sanger) si secventierea masivé paraleld (,mext-gene- ration sequencing”) a unui numar enorm de frag- mente diferite de ADN (tehnicile de secventiere de generafia a doua si a treia), Toate acestea au trans- format radical genetica molecular, aducdnd-o in zilele noastre la performante altédaté de neimaginat. 4.1. Metoda de secventiere prin sinteza enzimaticd (Sanger) In aceasta metoda se sintetizeaza o caten’ nou’ de ADN, complementara fragmentului cu secvenfi rnecunoscuta? (ce functioneazi ca matrii), utiliznd 0 ADN polimeraza gi 0 amorséi radiomarcata (fixatai 12, Fragmentele de ADN sunt clonate in vectori sau produse prin amplificare PCRCapitolul 5: ANALIZA STRUCTURII $I FUNCTIEI GENELOR 139 la extremitatea 3° a fragmentului). Reactia poate fi oprita in dreptul unui anumit nucleotid, prin folosi rea unot analogi nucleotidici de tipul didezoxinu- cleotidelor (dANTP) (care au pierdut gruparile 2'-OH si 3'-OH). ADN polimerazd poate adduga un astfel de nucleotid, dar, dupa ce acesta a fost incorporat, reactia se opreste datorita absenfei gruparii 3’-OH din didezoxinucleotid, necesar& continuatii polime- rizarii (catena sintetizatd este ,terminata” de ultimul dNTP). Se realizeaza astfel fragmente cu o lungime ‘egal distantei dintre amorsa gi locul unde s-a incor- porat un anumit didezoxinucleotid. Molecula de ADN ce trebuie secventiat& este mai ‘nti separatd in cele doua catene. Fiecare catend este clonatd intr-un vector monocatenar (fagul M13), fiind inseraté (cu capitul 3°) intr-un anumit sit, dupa o secventa (primer) cunoscuta si marcaté radioactiv, ce are rolul de amorsa (figura 5.9). Aceste monoca- tene de ADN servesc ca matrifd pentru sinteza unei catene noi, complementare, folosind ADN polimeraz si nucleotidele necesare sintezei. Reactia se desf’- Soar concomitent in patru eprubete, in fiecare se va Stabili localizarea unui anumit nucleotid folosind ca analog inhibitor un anumit didezoxiribonucleotid ADN de secventiat 8 EE ETAGGCATTAG 4 SATSCSTAATE FA ingen int ‘monocatenar enaturare mn vector 3 FToeATGeGTAATO AAS 9 AS cineca ADN sonored +ADN polimere Eprubete ce contin tadomayeats Boles Fare ance 7 dAOTP GaATP aaTTP GASP ddezoxinudeotd SATS + cTacccattads s== CTACGCATTAIA += CTACGCATMST += CTACGCAGaT += CTACGC Msn s—= CTACGadC t= CTAC dss. t= cTAgsc scr asa 2 Cat 1 ac Cpricea sinezei ADN laleeu ncorporar unui “dieoxinucleais ccomplementar matrie Sens de migrare tea Gel de secventore ‘utoasiograte Metoda enzimatica Sanger inarea seevenfet nucleotidice ‘a unui fragment de ADN (modifieat dupa Nussbaum, Melnnes si Willard, 2016) De exemplu, in eprubeta ce va stabil localizarea G se va adauga un amestec continind dGTP si didezoxiribo- ‘nucleotidul ddGTP; atunci end potimeraza intilneste un C pe catena complementard va incorpora in catena in curs de formare fie un dGTP, fie un ddGTP, caz in care sinteza se opreste, Daca a fost incorporat un dGTP, cfind ppolimeraza intilneste urmatorul nucleotid C fenomenul se repeta si tezultd fragmente cu 4 nucleotide gi respec tiv 9 nucleotide (figura 5.9). Se va produce astfel 0 colec- tie de fragmente ADN de diferite lungimi, fiecare avind Ja capatul terminal un anumit ddNTP. Aceste fragmente sunt separate prin migrare in gel de poliacrilamida (cu 0 concentratie crescut’ de uree pentru a mentine ADN ‘monocatenat); se observa o serie de benzi la pozitii ce ccorespund localiziri fiectrui G. Reacfi similare pentru rucleotidele cu A, T si C vor furniza seri corespunzatoare de fragmente (fiecare proba inr-un anumit,canal” a gelu- lui de potacrilamids). Ansamblulcelr patra reacti poate fi atu pe o ,scari” pozitional drectionats de la fragmentele cele mai mici la cele mai mar; astfel se poate determina secvenja de nucleotide a fragmentuluianalizat. 4.2. Secvenfierea prin terminatori ddNTP marcati fluorescent Metoda de sinteza enzimatica descrisi de Sanger a fost perfectionata continuu. intr-o etapa ulterioari a fost introdusa tehnica dye-terminator sequencing in care ddNTP terminatori ai catenei sunt marcati cu fluorocromi diferiti fapt ce permite secventierea intr-0 singura reactie (comparativ cu patru reactii in metoda ce foloseste marcarea radioactiva a amorselor, descrist anterior); fragmentele nou sintetizate migreaza in gel printr-un tub capilar de sticld lung gi extrenrde sub- fire. La capatul capilarului o raza laser produce exci- {alia fluorocromilor si un monitor detecteaz4 semnalul fluorescent al fragmentului de ADN ce trece prin gel, iar computerul inregistreaz4 si stocheazi un profil distinct pentru fiecare fluorocrom colorat diferit, sta- ind secventa nucleotidicd determinata. Metoda de secventiere cu terminatori marcayi flu- orescent a permis realizarea secventiatoarelor auto ‘mate cu debit inalt” care cresc enorm viteza sieficienfa procesului de secventiere si scad costurile. 4.3. Pirosecventierea iterativa Metoda ,clasica” a ddNTP, folosité timp de trei dece- nii, implica electroforeza in gel pentru separarea frag- mentelor de ADN nou sintetizate si clonarea lor in diferite celule-gazda; aceasta etapa era laborioasa si fficea tehnica putin eficienta i costisitoare, in anul 2000 a fost introdusa o tehnologie de sec- venfiere a ADN complet diferité care nu necesiti elec- troforeza in gel si care permite inregistrarea secventei de ADN pe masurd ce un nou nucleotid este incor- porat in catena nou sintetizati de cdtre ADN polimeraza. ‘Aceasti metoda foloseste o serie de reactii succesive de piroseeventiere (figura 5.10): catenele noi de ADN, sunt sintetizate de catre 0 ADN polimerazi, care foloseste precursori dezoxinucleotid trifosfat (GNTP) so matrit Li t J.1 a Capitolul 10 CONSULTUL SI SFATUL GENETIC Marius Bembea, Cornel Popovici, Vlad Gorduza, Vasilica Plaiasu, Cristina Rusu, Mircea Covic Bolile genetice si malformative sunt diverse, se manifesta la varste diferite si afecteaza orice sistem sau organ; de aceea, bolnavii cu aceste afectiuni se pot adresa unor medici din diverse specialitati. in conse~ cin, cunoasterea unor principii de genetica medi- cealé este necesard si utilé oricdrui practician confruntat cu patologia genetic’, acesta trebuind si cunoasca si aplice metodologia generala a consultului ge sd indice adecvat efectuarea unor explorari genetice, si injeleaga si sa interpreteze corect rezultatele lor is poaté oferi—‘in limitele sale de competenfa—un sfat genetic corect pentru pacient si/sau familia sa, confruntat& cu un rise genetic. Consultul si sfatul genetic sunt insi activitati specifice medicilor spe- cializati in genetica medicals. A. Consultul genetic 1. Definitie. Obiective Consultul genetic este un act medical specializat si complex, prin care se tabileste sau se evalueazd diag- nosticul unei boli, se precizeazé natura sau compo- nenta sa genetica si se acorda un sfat genetic bolnavului sau familiei sale. Obiectivele majore ale consultului genetic sunt: + realizarea unui diagnostic clinic edt mai precis; acest lucru este deseori dificil, dar necesar deoa- rece conditioneazs prioritaile si calitateaingrijiilor medicale, prognosticul, prevenirea complicatiilor si corectitudinea sfatului genetic, de care depind opfiunile reproductive ale pacientului sau cuplu- luis + stabilirea naturii sau a componentei genetice a bolii; pe baza istoricului familial sia explorarilor genetice, medicul genetician trebuie sa diferenti- eze bolile genetice de cele conditionate genetic sau negenetice; + acordarea sfatului genetic; 0 actiune specificd con- sultului genetic, prin care bolnavul sau rudele sale cu rise sunt informati/sfatuiti in cea ce priveste: natura si consecingele bolii (istoria naturals, prog- nosticul), posibilitatile de ingrijire si tratament, riscul de recurenta gi cdile prin care riscul poate fi redus sau prevenit (optiunile reproductive, posi- bilitatile de diagnostic prenatal). Realizarea acestor obiective presupune o temei- nica pregatire de specialitate, 0 mare disponibilitate de colaborare cu alti specialist, intt-o echipa in care _geneticianul reprezintai punctul de convergent (deci- zie), el fiind cel care stabileste concluziile finale, 2. Cadrul organizatoric Consultul genetic este realizat de citre medicul gene- tickan, care, pe lang’ o pregitire medical de baz pentru a infelege boli ce afecteazi orice organ, la orice varsti! —, trebuie si aiba si o pregitire specifica in domeniul geneticii medicale, solida si mereu actua- lizata, in plus, medicul genetician trebuie s& posede 1. y-Geneticieniiclinicieni sunt probabil ultimit generalisti adevarati in medicina actuals” (Hall, 1999).310 GENETICA MEDICALA psihologice pentru a putea face fata difi- cultatilor de comunicare cu bolnavii cronici sau fami- lille care se confrunta cu un diagnostic sever. Abordarea corecta si completa a patologiei gene- tice si malformative se realizeaza in centre de gene- 1 medicald specializate (vezi subcapitolul 10.D), Obiectivul principal al acestor servicii este de a ris- punde necesitajilor individului si familiei, care sunt confruntaji cu o boald genetic’, in special dorintei lor de a sti dacd au sau nu un risc de a dezvolta sau transmite o boalA cu o componenta genetic’, precum side a afla ce posibilitai terapeutice exista. 3. Indicafiile consultului genetic Consultul genetic este solicitatde obicei de 0 persoand sau un cuplu, confruntat cu 0 problema cu implicaii genetice + Persoand bolnavit—cuo afectiune posibil geneticd sau cu 0 anomalie congenital — solicita diagnos- tic, ingrijire si/sau evaluarea riscului de recurent la descendenti. + Persoand séindtoasd, dar cu rise genetic crescut (are 0 ruda apropiata afectats), doreste sa stie dact va face” boala (diagnostic presimptomatic) sau act va transmite o gen mutant la urmagi; mult, mai rar, ea solicit& un sfat premarital, determinat de o viitoare uniune consangvina (de regula veri) sau de apartenenfa la un grup populagional cu rise crescut de a fi purtatori de anumite boli genetice, + Cuplul séinditos — poate solicita diagnostic gi sfat genetic: — preconceptional: in situatia unor rude afectate de boli genetice sau posibil genetice, cfnd varsta rmaternd depigeste 35 de ani (sarcini cu risc), ‘nd exist tulburari de reproducere (infertilitate, avorturi spontane repetate) sau in caz de con- sangvinitate; prenatal: in cazul unor antecedente familiale pozitive, dupa expunerea la teratogeni (infectii, expuneri profesionale la substane chimice sau radiafii, medicamente), dupa identificarea unor semne ecografice de alam sau teste de sereen- ing pozitive, deci a unei sarcini cu rise; — postnatal: dupa nasterea unui copil cu anomalii congenitale sau atunci cénd la un copil apar tulburari decrestere sau dezvoltare psihomotorie, dizabilitafi intelectuale, boli metabolice, tul- burdri pubertare. Deseori consultul genetic este indicat de alti spe- cialisti care solicits medicului genetician 0 opinie de diagnostic, evaluarea etiologiei genetic, stabilirea prognosticului si posibilitatilor de tratament, dar mai ales pentru a discuta cu consultantii aspectele gene- tice ale bolii, riscul de recurenta la o alté sarcina si, eventual, posibilititile unui diagnostic preconcepfional sau prenatal la o sarcina viitoate, 4, Principiile de baz ale consultului genetic ‘Complexitatea consultului genetic impune aplicarea ‘unor principii de acjiune. Pe baza experientei dobéndite fn acest domeniu, propunem urmatorul decalog: (1) Evaluarea pacientului si familie’ sale se va face metodic, in etape succesive de actiune, fiecare cu obiective gi activitai distinct. (2) Anamneza personalai si, mai ales, anamneza “familialé sunt foarte importante deoarece furnizeaza informafii pretioase pentru diagnosticul si manage- ‘mentul pacientului gi familiei sale. (3) Examenul clinic, precoce, complet si repetat, este decisiv, chiar 5 in conditiile medicinei moderne ultratehnologizate; (4) Spriin psihologic, atent i constant, pentru paci- ent si familia sa, (6) Acordarea unei perioade de timp adecvata pro- cesului de comunicare, care va fi simplu si clar, adap- tat fiectirei etape de actiune (explicdnd ce se face si de ce) $i nivelului de percepfie al pacientului/parin- “™ filor, plin de intelegere si simpatie. (©) Abordarea $i solusionarea in echipa (cu alti colegi geneticieni sau de diferite alte specialitaji) a fiecarui caz de patologie genetic’. (1) Medicul genetician reprezinta punctul de con- vergenta al tuturor datelor obtinute despre consul- tanji in etape succesive, din surse variate, Acest ucru impune colectarea, ordonarea gi interpretarea datelor sau, cu alte cuvinte, un stil special de lueru, ce trebuie dublat de rabdare si prudenfa, pentru a evita concluzii si diagnostice pripite, pand ce faptele vor fi bine stabilite si documentate. Este mai bine si nu gresim decat si punem un diagnostic cu orice pret. (8) Arta diagnosticului genetic (caseta 10.1) se ‘bazeazl pe cunoasterea morfologiei si morfogenezei normale si anormale, precum sia principiilor de gene- ticé umana si medical (9) Biblioteca, computerul si internetul sunt indis- pensabile pentru accesul curent gi permanent la infor- rai si baze de date. (10) Medicul genetician trebuie si fie ribdator gi tenace atunei cdnd nu a reusit, cu ocazia primului consult, un diagnostic specific si precis, urméarirea in timp a bolnavului $a familiei sale va aduce cu sigu- ranj8 beneficii diagnostice si de ingrjire. LdLi a. _Capitolul 10: CONSULTUL $1 SFATUL GENETIC. CASETA 10.1 Arta pierduti a dismorfologie” Dismorfologia (,,studiul morfologiei umane anormale”) este un domeniu al geneticii clinice care se ‘ocupeé cu recunoasterea $i diagnosticul unor sindroame specifice la pacienti cu anomalii congenitale ‘multiple, majore si/sau minore. Dismorfille sunt ,forme anormale”, deci caractere (defecte) structurale (de obicei vizibile) care nu se regdsesc la persoane de aceeasi varsta, etnie sau familie. Sindroamele dismorfice sunt caracterizate printr-o combinatie specifica de caractere structurale anormale (dismorfi), care au 0 cauzé sau un mecanism comun. Dismorfologia este o arta si 0 stiinfa deoarece dismorfologii si-au dezvoltat abilitafi care ,,le permit un succes constant acolo unde alfii au esecur! repetate”. Dismorfologia este o artis intrucdt diagnosticul dismorfologic este un diagnostic vizual si mental care presupune 0 serie de aptitudini (spirit de obser- varie, perseverentd, prudent) si trasdturi de personalitate. Dismorfologia este so stint, deoarece necesita |) cunostinte despre morfologia si morfogeneza normale si anormale, dublate de 0 metodologie riguroasd de || obinere si interpretare a datelor, care sii permitd un diagnostic. Esenta dismorfologiei este diagnosticarea unui sindrom specific. Dar diagnosticul clinic este subiectiv si prezumtiv; el trebuie validat prin teste genetice sau — in absenta lor ~ prin verificarea unor criterii clinice. Deseori diagnosticul specific nu este posibil intr-o prima instanjd, find necesare urmarirea in timp a paci- entului, consultarea bazelor de date (POSSUM, London Dysmorphology Database, Orphanet, Gene Test, Gene Review) si a literaturii de specialitate, precum si colaborarea cu alti colegi Dismorfologia este considerata gresit ca ,,un domeniu limitat/ingust ce se aplici unui numeir mic de ‘pacienti” si férd ,,prea mare importanjé clinica”, mai ales in stadiul actual al geneticii moleculare. Se uitt/ ignoré cd dismorfologia se ocupa de boli ce afecteazéi orice organ, iar anomalille congenitale majore se _gasesc la 3% dinire now-ndiscufi vii, dintre care circa 1/3 au dismorfii multiple (50% fiind sindroame speci- {fice). Se uitd de asemenea ci, fir fenotip mu poate exista (intelege) genotipul, iar fr clinica nu existdfenotip”. Din pacate dismorfologia devine, treptat, in Roménia, 0 arta... pierduta” deoarece + neonatologii si pediatrii, primii care se confrunta cu copii dismorfici, sunt acum mai putin interesati de acest domeniu; - + pregiitirea rezidengilor de geneticii medicala este deseori lacunard in dismorfotogie/sindromologie: + stabilirea unui diagnostic specific la copii dismorfici este pentru multi descurajanta, in special din pricina unei pregatiri si experiente reduse. ‘Numérul mic de unitaqi clinice si de geneticieni care lucreazd efectiv in elinied, precum si , arta. pierdutd a dismorfologiei” sunt o problema importanta, deoarece realitatea asistenfei medicale a bolilor rare in general este dureroasa: ,,bolile sunt rare, dar, fiind numeroase, bolnavii sunt multi, iar medicii care ar trebui sé se ocupe de ei sunt prea puini”. ||, Arta diagnosticului” clinic in dismorfologie/geneticd clinica este 0 indeménare accesibild, ce poate || fi obfinutai de tofi cei care doresc acest lucru $i care poate fi perfectionata prin exercitiu 5. Etapele consultului genetic + comunicarea concluziilor si sfat genetic; + urmarirea evolufiei bolnavului; Evaluarea pacientului si familii sale se va face meto- + contactarea rudelor cu risc genetic erescut. dic, in etape succesive de actiune, fiecare aviind obiec- tive si activitati distincte: + evaluarea inifiala a bolnavului (anamneza, exa- men clinic) ~r optiuni de diagnosti + alte examene clinice gi explorari paractinice; + analiza gi interpretarea datelor diagnostic pre- umtiv; in toate etapele, procesul de evaluare va fi dublat side un sprijin psikologic corespunzator. 5.1. Contactul initial cu boInavul Primul contact cu bolnavul, deseori copil insotit de cineva din familie, este important pentru a stabili o + explorari genetice; + finalizarea consultului genetic ~» diagnostic spe- cific; prognostic; plan de ingrijire si tratament; rise genetic de recurent; atmosfera de incredere si cooperare. De obicei, se incepe cu intrebarile clasice prin care se identifica ‘motivul consultatiei gi problemele majore care fra- ‘mint pacientul sau familia sa. Stabilirea obiectivului 2, Tit easetei a fost inspirat de colebra carte adr. Bernard Lown: Arta pierduti a vindecariconsultafiei va concentra atentia medicului asupra anu- mitor probleme gi va permite si stabilirea nivelului de anxietate al consultantilor Perioada inijiala de acomodare reciproca si de observare a comportamentului pacientului poate fi prelungit prin analiza documentelor medicale exis- tente, ce permite identificarea elementelor obiective. 5.2, Anamneza personalé si familiala ‘Anamneza se desfigoara pe dowd direct majore: anam- neza personala gi cea familial’, a) Anamneza medical personal vizeaza toate etapele viefii individului si, evident, istoricul bolii Desigur, varsta pacientului gi tipul de patologie vor influenfa secvenfa si ponderea informatiilor. Sche- matic, putem deosebi: (J) Anamneza gestationald — care se va referi la {storicul reproductiv, evolufia sarcinii si nastere. Istoricul reproductiv: antecedentele reproductive si varsta paringilor, eventualele boli cronice (di bet zaharat, epilepsie s.a.), grupele sangvine, data debutului sarcinii Evolufia sarcinii: boli si expuneti la factori tera- togeni in trimestrul I, aparitia, intensitatea si evo- ufia miscarilor fetale, cantitatea de lichid amniotic si datele ecografice. Nasterea: varsta gestational, durata travaltului, prezentajia, anomalii ale lichidului amniotic, ale cordonului ombilical si placentei, scorul APGAR/ reanimarea nou-niscutului, coordonatele sale mor- fologice (greutate, talie, perimetru cranian). Din analiza acestor date se pot refine o serie de .semnale de alarma”, utile in analizele ulterioare (vezi secfiunea 10.A.5.5). (2) Anamneza neonatald permite identificarea difi- cultafilor de adaptare a copilului la viafa extrauterina sau unele manifestiri anormale care pot semnala mal- formatii si/sau malfuncjii congenitale. Dintre acestea meniondm: crize de apnee, dificultati de supt, var- situri, hipotonie, convulsii, cianoza, ieter prelungit, complicatii obstetricale. (3) Anamneza postnatal vizeaz’ evaluarea cres- terii, a dezvoltarii psihomotorii si sociale (achizitii motorii, comportament, limbaj, scolarizare, perfor- manje ete.) bolile copitérei si — atunci cand este cazul ~ ale dezvoltarii pubertare. (4) Istoricul bolii pacientului: momentul debu- tului, manifestari, evaluari clinice si paraclinice, ingri- jiri medicale ete. Dar, indiferent de tipul de afectare, trebuie evaluata functionarea tuturor organelor, pen- tru identificarea unor elemente corelate cu boala de baza b) Anamneza familial (1) Definifie, importanga, condigit Anamneza familial& reprezinta, in esenfa, o sum de informatii despre relatile biologice si sociale, des- pre starea fizica si mental a indivizilor familiei (mini- mum trei generafii), precum gi despre functia lor reproductiva. Aceste informatii se inregistreaza si se reprezint& grafic intr-o forma standardizaté denumit’ arbore genealogic (in engleza, pedigree), ‘Anamneza familial& poate furniza informagii deci- sive pentru: diagnosticul medical, decizia strategiilor de testare, stabilirea modului de transmitere, determi- narea riscului de recurenfa, identificarea persoanelor cu rise genetic crescut etc. Datoritd importangei sale, anamneza familiald necesit® o tehnicd perfecta(inclu- siv in realizarea unei bune colaborati cu familia paci- entului), acuratefe, timp si eficienté. Aceste rafiuni ne determin’ si prezentim mai pe larg metodologia, ‘anamnezei familiale gi a constriri unui arbore genealo- gic. Vom face ins&, mai intl, céteva preciziti generale, Mascutin | Feminia ny ivi ex fenotipe) Botney a) See ne | Na cont, una une s Mai mui cop FQ|22|0o|@ @|,0 REPRO |@ @].0 eon — ww. facweneay | Pf 2am. ome ape ea old ema cafe ale -— a E E Terminaea sarin (TS) be ab E “Terminarea vel sacin normale E Consutand xs Some | “sso aa a | © Figura 10.1. Simbolurl standardizate pentru aledtuirea arborelui genealogic (edapiat dupa Bennett RL etal, 1995) 11 1 1 Capitolul 10: CONSULTUL $1 SFATUL GENETIC _ 313 Realizarea unei reprezentiri corecte, precise si usor si existenfa consangvinitati, precum si legenda sim- de interpretat este nu numai o obligatie, ci si o boluritor particulare sau a abrevierior. proba de profesionalism. Realizarea unui istoric familial se face, de obicei, de catre medicul consultant, printr-un interviu fat in fafa” (cu pacientul sau apartinatorii sai, dack este copil sau fara discernamant), intr-o ambianta confortabild, fara elemente perturbatoare, care si asigure confidentialitatea telatarilor. Efectuarea arborelui genealogic este 0 component a evaluarii medicale ce devine document medical; , + Arborele genealogic incepe, in mod obignuit, cu individul care solicita consultatia genetica si care poate fi, sau nu, afectat; el se numeste consul- tand. Pentru prima persoana bolnava care aduce familia in atengia medical se foloseste termemul proband (denumit si propositus sau caz index). Deseori, consultandul si probandul sunt una si ace~ agi persoand. Istoricul familial are 0 mare ineareatura psiholo- de aceea se va face pe o hartie ,oficiala”, cu antet, ict si emotional8, Medicul trebuie si fie prudent, si intr-o forma standard (de preferat marimea Ad, politicos, sensibil la unele aspecte culturale, etnice, cu pitriele, in lung). religioase sau socioeconor Obfinerea infor- {In antet se vor preciza: servciul, numsirul igi de con- matiilor despre istoricul familial reprezinté ins sult genetic”, data, numele si prenumele consultandu- © excelent oportunitate pentru examinator de a lui/probandului, numele persoanei care relateaz datele stabili 0 relatie de incredere cu pacientul si/sau sial examinatorului, motivatia consult, eventual eta familia sa, de a face observatii psihologice utile Defi Comenat T ns de eghucd ‘Dac este posi parteneral masala sev pasa Insti paren feminis 3. tina tragiet_ | 2: tina deseeadenei] Fra vor psa in onines nape dela stings fa drespes RA Feats ne ge Oo Individual va imal eure 4. ina invigu 1. Lini de legiurt (riz) = Legian ——O)_| tnreruperea Fa ini de egtart| 5S Indic falc relaga numa exis , Conangvinitae ‘Se va mention deasypr ini O-0 pdt de Indie (ex. vert a 11D 2. Linia descentesjel(veical sau obied) TOO _] Pesewoent ain paring Boogie Gane Maasai] Bawa] Remo | taic odtamaie Inge simboluet Indic [pemeni monazipe Tstorie filial nocancecut Se indict mative, Absenjavoluntae a eopilo Asc ext canon ‘Steritate Seas nx, faa ‘etna semnfia apt, ss ones purr Prisca sau biologie ‘unc nou pa ln de Tegatrs punta sau lin Figura 10,2. Definitia liniilor folosite in intocmirea arborelui genealogic (adaptat dupa Baker etal; 1998)privind: interacjiunea dintre cuplu gi familie, nive- lul de stres al persoanelor, ideile si miturile lor privind cauzalitatea boli, sentimentul de vinova- fie etc. Multe rispunsuri si reactii vor depinde de limbajul folosit si de calitatea intrebarilor. 2) Simboluri $i informatii standard folosite in realizarea arborelui genealogic Pentru constructia arborelui genealogic se vor folosi simboluri gi abrevieri standardizate (figurile 10.1 si 10.2). + Un barbat este desenat printr-un pdtrar si, daca este posibil, se plaseaza la stinga partenerei, 0 femeie ddesenat printr-un cere. Probandul i consultandul vor fi obligatoriu identificasi print-o sdgeatd, inso- jitd de litera P pentru proband (figura 10.1). + Relatiile dintre indivizii familiei se marcheaza prin ppatru tipuri de lini (figura 10.2): linia de legaturd ‘unestedoi parteneri; dact s-a produs separarea lor, linia de legaturd se taie cu dows liniuje oblice, iar dacl partenerii sunt inruditi se deseneaz& o linie ddubl8, Dac& partenerii nu sunt c&satorij oficial, linia de legaturd va fi punctatt, Linia descendenjei merge vertical pan la linia orizontald a fratriei, din care se desprinde — pentru fiecare frate-sora linia indi- vidului. Simbolurile pentru membrii din fiecare ‘generatie se deseneazi pe acelasi rind, arin fratrie, de preferat in ordinea nasteri, dela stinga la dreapta, Uneori, datele despre copiii sinatosi se pot reda sintetic printr-un numzir (echivalent cu numarul de frayi sau numaul de suror)plasat in interior sim- bolului de sex masculin sau ferinin, ( sarc’ incurs de evolutieeste simbolizatéprint-un patrat sau cere, dacl se cunoaste sexul, sau un romb (ex necunoscut) in care se serie litera S (de la sar- ind); sarcinile care se sfargese inainte de termen (avort spontan sau intrerupere) sunt reprezentate printe-un ériumghi (sub care se scriesexul, dact se cunoaste), iar linia individului va fi mai scurtd. In figura 10.2 sunt prezentate si semnele pentru gemeni, nascuji mort si copii adoptafi. In cazul cuplurilor sterile, linia descendentei va fi barat (O persoand afectat se vareda printr-un simbol hay- rat; dac& sunt mai multe afectiuni, simbolul va fi ‘mparjt in sectoare, fiecare reprezentind 0 boalt (figura 10.3); acelai sistem se foloseste gi pentru afectiunile cu expresivitate variabil, dar in acest caz fiecare sector va corespunde unei manifestati clinice majore; in ambele cazuri, semnificaiafie- ccirui cadran se va menfiona in legend, ( linie diagonala ce trece printr-un simbol (pitrat, ‘cere, romb, triunghi) semnificd faptul ct individul respectiv a decedar. Generatile se numeroteaz& cu ciffe romane de sus ‘in jos, iar indivizi din fiecare generate se nume- roteaz’ cu cifte arabe de la stinga la dreapta. in acest fel, fiecare persoand va fi denumita printt-o cif romana gi una araba (ex.: I 7). CChiar dact se folosese simbolur standardizate, este bligatoru si se includ pe fon cu arborele genealogic r “AS ne se a Co. - $0. G8” Legend Barner Genes pin Eid Ssprrecaus BE] som ZY roe cscs © * examinat personal sau analizat docummente puritor ssimptomatic Figura 10.3. Arbore genealogic ipotetic ce demonstreazi modul in care se scriu diferite informafii (modificat upd Bennett RL. 2008)i LL © legenda care va cuprinde informatie necesare interpretai Arborele genealogic va cuprinde, de asemenea, ‘© serie de informa standard despre persoanele incluse, notate clar, complet sau abreviat (tabelul 10.1). Dac& informatiile nu sunt certe, este preferabil si se puna tilda (~), iar daca nu se cunose date despre istoricul familial al ascendentilor sau descendengilor, se va pune semnul de intrebare (?). 3) Metodotogia istoriculu/anamnezei familial(e) ‘Medicul genetician va incepe anamneza familiala explicand pe scurt pacientului si/sau aparfinitorilor scopul si utiitatea informatiilor despre familie si garan- tind pastrarea confidengialitayié lor. Realizarea isto- ticului familial si constructia arborelui genealogie se vor face pas cu pas; intrebarile se pun secvensial, ghi- Varsta/anulnastert pacientulut si membrilor familiet sale 7] | Varsta la deces si cauza decesului; peniry nou-nascutii mortise noteazavirsta gestational } = Statusul pacientului: afectavsinatos (definit in legends prin umbrirea simboluli) — Informa retevante pentru sintate (de exemplu, tale, greutate) — Sarcind; se noteazi data ultimei menstruaji (UM) sau varsta gestfionala (VG) in stptimani Complicatile sarcinii: avort spontan, sarcind ectopicd, intreruperea sarcinii316 GENETICA MEDICALA La finalizarea diagnosticului se va reveni asupra istoricului familial, deoarece intrebarile pot fi mai precis directionate spre unele manifestari ale boli De asemenea, cu ocazia evaluarilor ulterioare, datele familiale objinute vor fi reactualizate. (4) Interpretarea anamnezei famil arborelui genealogic Geneticianul trebuie s& interpreteze cu grija datele sintetizate in arborele genealogic al familiei, pentru a stabili corect riscul de recuren{a si persoanele cu rise. Pentru aceasta va lua in calcul toate modalitatile de transmitere ereditara gi va fi foarte atent la feno- menele de expresivitate variabild, penetranta (inclu- siv dependent de varstd) si eterogenitate genetica (descrise in detaliu in subcapitolul 6.D). le si analiza 5. Examenul clinic este decisiv in genetica medicald si dismorfologie, deoarece reprezinti, impreund cu isto- ricul medical, temelia unui diagnostic clinic corect, si complet. El este prima proba a calificdrii unui cl nician si necesita: + conditiioptime (pacient cooperant si relaxat,lumin& si temperatura optime, iar pentru copii ~ prezenja mamei); + 0 fehnica impecabila, ce include o evaluare meto- dica si completa, atent&.si minutioasa; + abilitatea de a fi un observator priceput; aceast& abilitate se objine in timp, fiind atent la detalii si dezvoltand ,.simfurile” (de apreciere a) marimii, proportiei, pozitiei si simetriei (dismorfologia este in principal o specialitate vizwala); + un fond de cunostine bacale, reprezentat de cunoas- terea morfologiei si injelegerea morfogenezei nor- male si anormale, Examenul clinic Evaluarea genetic& medicala se bazeazi pe exa- minarea clinicd standard a copilului sau adultului, dar confine anumite elemente particulare, generate de prezenfa dismorfiilor produse de tulburari ale pro- cesului de morfogeneza. a) Examinarea generala ‘Componentele de baz ale examinariiclinice gene- rale a unui bolnav sunt: + evaluarea generald a stdrii de sdindtate si statu- ssului nutritional; + determinarea parametrilor de crestere (talie, greu- tate, perimetru cranian), habitusul general al cor- pului si proportile sale; + examinarea metodic& a sistemelor si structurilor anatomice; ordinea examinarii poate varia in func- fie de varsta pacientului si acuzele principale, dar esenfial este ca examenul sa fie complet. 1b) Examenul clinic/dismorfologic Examenul dismorfologic are ca obiectiv recunoas- terea formelor anormale (dismorfi) 51 identificarea tuturor anomaliilor majore sau minore ce pot realiza un model caracteristic. Evaluarea clinica va fi completa si minutioasa. Se va incepe cu examinarea segmentelor si regiuni or anatomice; se vor observa cu atentie forma, mari- ‘mea, proportille, pozitia, conturul,pliurile, spatierea, simetria tuturor elementelor anatomice (a c&ror morfo~ logie normala, cu variantele descrise, trebuie bine cunoscutd?). O atentie deosebita se va acorda anoma- liilor minore ~ modificari subtile ale unor structuri. Pentru incepatori (si nu numai) este util o list de semne pe segmente si regiumi. Inspectia loco-regio- nal a structurilor de suprafata se va completa cu palparea lor gi cu o serie de manevre active, Urmeazi examenul aparatelor, inclusiv al organelor de simt si sistemului nervos (examen neurologic) i muscular, ‘uneori ignorate, Evaluarea va fi calitativd (absent/prezent ~ deta- Iii) si/sau cantitativa (pentra structurile ce pot fi mdisu- rate obiectiv, cu tehnici corecte si instrumente adecvate). ‘Misuritorile vor fi evaluate prin comparatie cu stan- dardele de varstd si sex. Un mijloc pretios de obiectivare $i comparare este ‘fotografia medicald saulsi inregistrarea video; ima- ginile sunt, deseori, mai bune decat orice descriere detaliata. Fotografiile se realizeaza in condifii stan- dardizate si trebuie sa ilustreze corect elementele patologice. Examinatorul va acorda 0 atentie deosebitl feno- tipului comportamental: expresia faciala, activitatea motorie (migciri neobisnuite), limbajul, reactii la sti- uli ete Vom mentiona c& abordarea clinica a diferitelor situati particulare (mactocefalia’microcefalia, statura mic’, displaziile scheletice, copilul ,moale”, am guitafile genital, retardul mintal etc.) necesit& 0 meto- dologie adecvati, prezentata in cirtile de Genetica clinica’. situafie particulara o reprezint& examemul fizic al now-nascutului mort In acest caz, se vor parcurge urmatoarele etape: stabilirea varstei gestationale; masurarea taliei, greu- tafii, perimetrului cranian; examinarea fetusului, a cordonului ombilical (posibilitatea existenfei unei 3. Recomandim medicilor compendiul clinic ,Genetica in pediatric” ~ Marius Bembea, ed, Risoprint, Cluj-Napoca, 2016, 4. Recomandim o carte foarte utili care nu ar trebuisB ipseased din cabinetul unoi genetician: Firth HV, Hurst JA, Hall JG. Orford desk reference ~ Clinical genetics. Oxford University Press, 2005,artere ombilicale unice) gi a placentei; fotografierea general si pe segmente; efectuarea unei radiografii a intregului corp; necropsia sistematica si atent efec- tuata de catre un fetopatolog; punetia cardiaca (per- mite prelevarea unei cantititi de snge) sau biopsia cutanata®, in vederea efectuirii unui cariotip (avand jin vedere ca 20% din cazuri sunt cauzate de boli pro- duse de anomalii cromozomiale) sau a unor anali ADN. ©) inregistrarea si sinteza datelor. Plan de inves- tigasil in finalul evaluarii, datele objinute se vor inte- gistra corect intt-o fist de consult genetic” ~ cu 0 structurd standard, care si faciliteze culegerea si descri- erea lor. Anomaliile vor fi descrise precis (folosind terminologia dismorfologica standard) si se va men- fiona clar care dintre elemente suit certe sau pro- babile. Se va face 0 sintezd primaré a datelor objinute, stabilind care sunt anomaliile majore si minore, pre- ‘cum si distributia lor pe segmente si/sau regiuni ale corpului, Pe aceasti baz se vor formula mai multe optiuni posibile de diagnostic. Acest lucru este nece- sar pentru a se intocmi un plan individual de exa- mene clinice de specialitate si explorari paraclinice, care si valideze sis nuanjeze elementele ident cate la examenul fizic si s& permita o diferentiere intre optiunile diagnostice. 4) Informarea paringilor La activititile consultafetinitiale (anamneza, exa- men fizie) se vor adauga actiuni de sustinere psiho- logica si sfat medical al parinjilor/cuplului/bolnavului [Nu trebuie si uitim cd ei traverseazi o criza psiho- logica si, de aceea, chiar de la acest prim contact, ar trebui sé inceapii procesul de consiliere, care va evo- lua gi se va dezvolta odatd cu actiunile de diagnostic si grijire a bolnavului La sfargitul evaluarii, medicul trebuie si prezinte ~ ‘intr-o forma simpla gi accesibila — 0 schifa a proble- melor identificate (anomalii, semne, simptome) si un plan de evaluare medicala si ingrijire (management), ‘ira un diagnostic detaliat sau informatii despre ris- cul de recurenta, Este adevarat c& parinjii sunt nerab- datori, dar trebuie explicat, cu prudenta si delicatefe, C8 diagnosticul nu este de obicei o urgenta si cere ; din aceste motive manda un , diagnostic preliminar”, cu descrierea anomaliilor io opinie rezer- vat asupra diagnosticului final. Chiar dac& procesul de diagnostic nu s-a incheiat, este bine ca medicul consultant s& informeze gi in scris pacientul/parintii supra rezultatelor evaluarii sale, precum si medicul care a trimis cazul Capitolul 10: CONSULTUL $I SFATUL GENETIC. 37 5.4. Alte examene clinice si explordri paraclinice Datele obtinute prin anamneza si examen clinie tre- buie deseori validate si confirmate prin expertiza altor medici specialisti (colaboratori ,antrenai” in studiul patologiei genetice gi malformative in specialitatea lor) si a unor explorari paraclinice. Medicul genetician va solicita colaborarea altor specialisti (,de organ”) si apoi va fi responsabil de colectarea $i integrarea unitard a tuturor datelor obfi- nute de el prin anamnezit si examen fizic, precum si ale acelora ce provin din alte evaluat clinice sau para- clinice. + Examenele clinice de specialitate vor fi ghidate printr-o trimitere ce va cuprinde elementele sem- nificative si, eventual, supozifiile de diagnostic, preciznd ce anume se urmareste. + Testele functionale (hepatice, renale, hematologice, metabolice, echilibrul acido-bazic si electrolifiete.) vor fi directionate spre anomaliile inregistrate. + Evaluarile radiografice, in special ale scheletul sunt nevesare pentru diagnosticul displaziilor shi letice si sindroamelor cu anomalii congenitale osoase. + Studiile imagistice speciale ~ ecografie, ecocar grafie Doppler, CT, RMN ~ vor fi bine motivate si ,tintite” pe anumite organe. Subliniem cd ima- ~gistica completeaz evaluarea ,de suprafafa” a dismorfologului cu 0 evaluare ,,de profunzime” si este decisiva pentru anumite categorii de sin- droame. 5.5. Analiza $i interpretarea datelor Uncori, diagnosticul este instantaneu® deoarece multe sindroame au un aspect particular care permite o recu- noastere rapid, un diagnostic vizual si mental ime- iat (de exemplu, sindromul Down, acondroplazia 5.a.), Acest tip de diagnostic se bazeazA pe experient’ si pe abilitatea naturalé a omului de a fixa imaginile (in special cele faciale) in memorie gi de a le evoca cind sunt necesare o comparare si 0 recunoastere. Dismorfologii nu fac de obicei eforturi speciale de memorare vizuala, ci mai curénd descompun imagi- nile pacientului in elemente fizice individuale gi apoi Je recompun intr-un model unic, specific unui sin- drom. Recunoasterea instantanee se bazeaz’i pe experienti, dar poate duce la eroti din cauza manifestiri vatiabile asindroamelor sai datorita tentafiei de a pune un diag- nostic rapid (inainte de ase finaliza 0 evaluare completa ‘5. Prelevarea de material biologic util pentru analiza cromozomiala se poate fae doar in primele 12 ore de la deces. 6. Pentru diagnosticulinstanteneu al unor sindroame se folosese, pe toate fianele, un cuvnt derivat din germund ~ gestalt,‘a pacientului sau ignordnd unele elemente clinice sem- nificative). De cele mai multe ori diagnosticul este analitic, bazindu-se pe analiza si interpretarea datelor anam- nestice, clinice si paraclinice referitoare la un pacient sau cuplu, care solicits un consult genetic. Aceasta abordare interpretativa orienteazi diagnosticul spre anumité categorie de boli/sindroame genetice si spre una sau cdteva entitafi. Actiunea cere timp pentru ca medicul si adune datele, sa le valideze si ordoneze, iar apoi, pe baza unei analize logice, sa le interpre- teze, incercénd si le explice gi s& le coreleze. Practic, sindromologul trebuie sé-si explice ce observa. Diag- nosticul necesitd nu numai informati, ci si cunostinfe, ‘capacitate de analiza si sintezA, experient& ‘a) Colectarea si ordonarea datelor trebuie si se finalizeze cu stabilirea existenfei unor elemente de alarma (tabelul 10.2), precum sia anomaliilor/simpto- melor certe $i probabile. Ele vor fi notate pe o pagina distinct a dosarului clinic al pacientului. ‘Tabelul 10.2. Semne de alarms pentru existenta ‘unor malformatii congenitale sVsau sindroame plurimalformative [Vass ateriavansatl (pentru anomalilecromozomiale) Varsta pater avansata (pentru mutatii noi) Avortri spontane repetate ‘AnamnezA famiialé semanificativa | Prezentatie pelvind— Perturbarea cresteri intrauterine a capului (de exemplo,) microcefaie, evaluat prin ecografic) | Retard sau acceterare de crestere postnatala |crestere disproportionate exempts, membre sure) |Obezitate precoce | 'Anomali minore multiple |Microcefalie Intrziere in dezvoltarea psinomotorie sau retard mental, asociati sau nu cu fenomene neurologice (spastictate) sau pshice (autism) Hipotonic + contracturi(artrogripo7’) Laxitatea (articular, cutanata) a fesutuluiconjunctiv | Afectare scheletic’, senzoriala, b) Interpretarea datelor se va face prin prisma proceselor embriologice (perioada cronologicé de pro- ducere, tipuri si corelafii intre anomalii, mecanism de producere $.a.) sia datelor genetice (categori etiolo- gice), in mai multe etape, folosind eventual un algo- ritm de diagnostic. (1) Se va incepe cu stabilirea precisi a existentei unei anomalii congenitale izolate (unice) sau a unor anomalii multiple (tabelul 10.3). Actiunea este deci- siva pentru diagnosticul final si depinde de calitatea examenului fizic (evidenierea 5 integistrarea tuturor anomaliilor minore), precum si de identificarea sec- venjelor si a defectelor de camp de dezvoltare care, desi se prezinta sub forma unor anomalii multiple, reprezinta, din punct de vedere patogenic, defecte uunice (vezi capitolul 15). (2) Anomaliile congenitale izolate trebuie dife- renfiate in anomalii majore si anomalti minore (Rar semnificatie medicalé sau cosmetica), iar acestea din rma trebuie deosebite de variantele familiale. De precizat c&: + anomaliile majore nu sunt mai importante pentru diagnostic decat cele minore; ele sunt doar mai evidente si mai grave, atrdgénd mai rapid atenfia medicului + anomaliile minore (ce trebuie bine cunoscute §i cfutate) pot semnala existenta unei anomalii majore neidentificate si pot constitu repere prefioase pen- tru diagnostic. (3) Anomaliile majore izolate vor fi clasificate pato- genic in anomalii primare (malformayii i displazii) sau secundare (disruptii si deforma) + anomaliile primare se produc precoce (embrio- pati) printr-un proces primar si intrinsec de dez~ Voltare anormal: fie a unor componente anatomice (de exemplu, anencefalia, polidactilia, agenezia renalf s.2.), fie a fesuturilor din care sunt formate (de exemplu, osteocondrodisplazi); + anomaliile secundare — se produc tardiv (fetopatii), pe structuri normal formate, care sunt deformate (de ‘exemplu, piciorul stramb) sau distruse (de exempla, atrezia intestinal sau amputatile congenitale) pe parcursul dezvoltirii fetale; 0 atentie deosebiti se va acorda unor posibile secvenfe (vezi capitotul 15). Includerea unei anomalii congenitale majore in tuna dintre cele patru categorii (malformatii, disrup- sii, deformafii, displazii) are valoare prognostica si pentru stabilirea riscului de recurenté. Dificultatea major este reprezentati de faptul c& un anumit tip de anomalie poate fi produsa prin mecanisme si cauze diferite (vezi capitolul 15), (4) Anomaliile congenitale multiple pun cele mai Aificile probleme de diagnostic, deoarece ele pot forma sindroame specifice, asociatii sau combinafii intdm- pltoare de anomalii congenitale care individual sunt freovente, Pentru a stabili un diagnostic de grup sau de tip sunt utile o serie de actiuni interpretative”. + Stabilirea momentului ontogenetic de producere ‘a anomaliilor prezente la pacient permite (printr-o serie de date anamnezice sau fizice) deosebirea defectelor prenatale (prin erori de morfogeneza) de cele perinatale sau postnatale, Defectele prenatale se pot produce fie in perioada de blastogenezA (2-4 siptiméni dupa fecundare), ccind afecteaz4 intregul embrion, producind mal- formatii majore multiple (de exemplu, asociatiaot Capitolul 10: CONSULTUL $I SFATUL GENETIC 319 ‘Tabelul 10.3, Categorii de anomali congenitale Categorie | Subcategorie | Detintie |[Defecte iotate _ [ Prezente la > din populate Pete mongoliene Variante normale Deviait de structuri, forma si/sau Tancte care sunt considerate anormale ‘Rnommali majore | Anomaii cu consecinfe medicae, chirgicale |[Despedturd plating sau cosmetice ‘Anomalii minore | Efect minim asupra sSnAtiindividului; tile | Urechi jos plaate in diagnostic. Malformajii | Defecte morfologice produse prinirun proces [Aplazie radial primar si intinsee de dezvoltare anormal | Displaa Organizarea anormal eelulelor in fesutur, | Hemangioame Disrupit Distrugerea exrinseed a unei structuri normal | Bride amniotice Anomalit | formate Deformati’ [Forma sau poaifie anormal a unei pani cor |Picior stm congenal pului produsa prin forte mecanice. Secvente (© combinatie ce anomali ce deriv dinte-o | Secvenfa malformativl singura anomalie inijalé sau este produsi de_| Pierre Robin factori mecanici. Secventa deformativii Potter| Defecie de cimp 0 unitate de morfogenezi (un set de primor Speci de dezvottare |i embrionare) ce reactioneaza identic la | holoprosencefalic cauze diferite, produednd mai multe anomali Sindrom ‘Anomalii multiple considerate a fi etio-pato-|Sindrom Dowo genic corlate gi care na reprezin o seevenfi, | Sindrom Marfan Sindrom Zellweger [Defecte multiple [Asociatic Tridinivesnefntimpiltoare, Ia unul sau mai | Asocajia VA(C)TER(L) nul indivzi, a mai multor malformagi ce nu sunt identiticte ea find o seeventa sau un | = : sindrom, __ _ | VACTERL), fie in siptiménile 5-8, cand afecteaz’ ‘organe ~ in functie de orarul lor ~ si produc malformatii majore izo- late, Dupa siptimana a 9-a, edd majoritatea rey unilor gi organelor sunt deja formate, este alterata reglarea find a edificari structurilor embrionare gi par anomalii minore. ~ Defectele perinatale se produc spre sfryitul sarin, {in cursul travaliului/nasterii sau postpartum prin alte- rari hipoxice, care se insojesc secundar de microce- falie, contracturi,deficiente de crestere, hipertricoza. — Defectele postnatale apar la un copil ndseut nor- ‘mat conformat, dupa © anumita perioada de timp de la nastere, ed urmare a unor evenimente acute sau cronice care schimbsi morfologia si altereazA progre- sivstatusul neurologic siderite organe (de exemplu, ‘mucopolizaharidozele). De subliniat cin mute sin- ddroame (mai ales displazice) uncle componente defi- nitorit pentru diagnostic apar in perioade diferite de viata (de exemplu, sinéroamele Bardet-Biedl, Marfan, neurofibromatoza tip-1). Existd o serie de informatiisugestive pentru deter- ‘minarea debutului prenatal al defectului: alterari ale varstei gestationale; anomalii ale debutului activitati fetale si/sau natura activitapii fetale; perturbari ale cantitafii de lichid amniotic (oligohidramnios sau polihidramnios); incidena crescuta a prezentatici pel- vine; deficit de crestere cu debut prenatal (,mic pentru vrstd gestational normala”); dificultifi de adaptare neonatala, in special respiratorii). Determinarea distribufiei anatomice a anomaliilor ‘multiple permite orientarea spre anumite diagnostice (de exemplu, sindroamele oto-palato-digital, velo- cardio-facial, oro-facio-digital etc.) si permite cau- tarea lor in bazele de date informatizate sau atlase. Identificarea unor modificdiri clinice ce pot evoca existenta unor sindroame (tabelul 10.2). Stabilitea relayiilor etiopatogenice dintre anoma- liile congenitale multiple 5 incadrarea lor intr-un sindrom sau asociatie (vezi tabelul 10.3 si capi- tolul 15), = Un sindromdismorfc sau plrimalformativ esto com- binatie caracteristicd de anomali congenitale majore si minore observate impreuni, int-un mod predic- tibil, la mai multi pacienfi; acestea au foarte proba- bil o cauza sau un mecanism comun de producere (pe aceasta bazi se deosebese:sindroame cromoz0- tmiale, necromozomiale sau teratogene). Elementele componente sunt nespecifice (pot fi prezente gi in alte sindroame si pot aves eauze diferte si rareori tuna dintre anomalii duce la diagnostic; combiratia este unica, si nu partie sale320 GENETICA MEDICALA = Asociayiie sunt combina neintimplitoare ale mai ‘multor malformagii majore, ce nu au o cauz8 comunds ‘evident care si ducd la un model predictibil; exem- ple: VACTERL, CHARGE sau MURCS. Spre deo- sebire de sindroame, asociatiile nu includ anomalii rminore si prezint& o mare variabilitate clinica, diag- nosticul afirmandu-se ori de cate ori gasim la un pacient cel pufin 2-3 dintre elementele componente. (5) incadrarea bolnavului intr-o categorie diag- nosticé este rezultanta actiunilor de analiza’ si inter- pretare a datelor pacientului (vezi tabelul 10.3). Pentru se ajunge la optiuni adecvate de diagnos- tic specific se pot folosi algoritmi (caseta 10.2) si hei de diagnostic. Foarte utlé este identificarea/selec- area cétorva semne utile sau evocatoare (primare, calitative, mai rare); cu aceste semne ce pot avea 0 semnificaie diagnostic’, se vor consulta literatura de specialitate, bazele de date electronice (POSSUM, LM, Orphanet, GeneClinic, OMIM ete.) si alficolegi care au fiecare experienfa lui personal& si poate au ‘mai vizut cazuri asemantoare Pe baza datelor si cunostinfelor dobandite se inca~ dreaz& cazul intr-o anumit& categorie (in functie de care se vor stabili testele genetice necesare): + boald genetic, sindrom, asociatie; + sindrom malformatiy, disruptiv, deformativ sau displazic; + sindrom cromozomial, rionogenic (mendelian), poligenic, teratogen, de cauzé necunoscuta; + subgrup particular de sindroame’ malformative caracterizat printr-un element major: sindroame ‘cu hipostaturd sau talie inaltd, sindroame cu obe- zitate,sindroame cu contractur sau cu laxitate arti- cular, sindroame cu despicaturi palatine, displazii scheletice ete. 5.6. Explordiri (teste) genetice © valoare deosebita pentru diagnosticul final 0 au, desigur, testele genetice: analize cromozomiale, bio- chimice/metabolice gi teste bazate pe studiul ADN (vezi secfiunea urmatoare). Acestea pot fi planificate dupa examenul clinic al pacientului.sau, mai bine, dupa ce s-au adunat toate datele gi se stabilese ele- mentele ce pledeaz pentru o boal cromozomialt, ‘© boald metabolicd sau o boalé monogenic’. indnd cont de caracterul ,decisiv” al acestor teste, trebuie si subliniem c& laboratoarele care Ie reali- zeaz& trebuie si fie acreditate, s& foloseasca tehnici standardizate gi si fie incluse intr-un control extern de calitate. Medicul consultant, care planifica 51 solicita teste genetice, trebuie: +s cunoasca bine indicatiile si limitele testelor, ‘vom preciza ci nu exista teste pentru fiecare boal sau sindrom plurimalformativ (si, in acest caz, clinica este ,suveran&”), precum si faptul c& fie- care metoda are limitele ei; + sistie ce produs biologic trebuie s& recolteze, moda- litatea de obfinere si stocare, modu! si mijloacele de trimitere la laborator; + s& objin un consimfdmnt informat scris al pacien- tului/parinjilor (vezi capitolul 21); + s& asigure confidentialitatea rezultatelor gi utili- zarea lor numai cu acordul persoanei. 5.7. Finalizarea consultului genetic La finalul etapelor descrise mai sus, medicul gene- tician va trebui: (1) si formuleze un diagnostic spe- cific gi un prognostic; (2) s& intocmeased un plan de ‘urmarire/ingrijie a bolnavului (ce va inelude si posii tafile de recuperare, prevenire a complicatiilor); si 3) si stabileasca riscul genetic de recurenfé, precum, sieventualele opfiuni reproductive ce ar pute limita acest rise, ‘Acuratefea si precizia unui diagnostic clinic si etiologic sunt esentiale, deoarece acesta nu este numai .,0 sentinfa pentru 0 viata”, ci si un element care influ- enjeaz& hotiritor o serie de decizii, Nu in ultimul rand, un diagnostic specific este benefic pentru linis- tea pacientilor si/sau a familiei (care vor intelege si accepta mai usor ,,handicapul genetic” si vor dez- volta o atitudine realist gi pozitiva), Cu toate eforturile specialistilor, intr-o proportie variabil& de cazuri (30-50%), nu se poate formula un diagnostic specific. Situatia este delicat% pentru ‘medic gi trebuie explicata clar si onest pacientului/ familiei, oferindu-le doua soluii: consultarea altor specialisti cdrora si le fie trimise dosarul clinic si fotografiile pacientului; posibilitatea unor teste genetice suplimentare: ‘urmarirea si evaluarea la anumite intervale de timp; ‘simptomatologia unor boli sau sindroame (cu expre- sivitate variabila) se poate completa in timp. Responsabilitatile medicului nu se incheie odata cu finalizarea unui diagnostic. O actiune la fel de importanté, sau poate mai importanta pentru parinfii unui copil afectat de 0 boala geneticd sau un sindrom, malformatiy, este stabilirea unui plan de ingrijire a pacientului (inclusiv de educate), bazat pe manifes- tirile boli ce trebuie influenjate pozitiv, precum si pe evolutia ei (istoricul natural) pentru prevenirea unor complicatii si stabilirea unor actiuni in favoarea pacientului. Fiecare sindrom are o lista de compli cafii potentiale, care formeaza baza unor ghiduri de management prevent. Astfel de ghidur,standardizate” sunt disponibile astizi pentru cele mai frecvente boli sisindroame (veri Cassidy i Allanson, Management of genetic syndromes, 2010). Ld.