İmmunohistokimya Ve TUNEL

Immunohistochemistry
HÜCREYİ İNCELEME YÖNTEMLERİ
İMMUNOHİSTOKİMYA ve TUNEL
H. SEDA VATANSEVER
Celal Bayar Üniversitesi
Tıp Fakültesi
Histoloji-Embriyoloji AD
MANİSA
sedavatansever@yahoo.com
YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ
DESAM
UYGULAMALI HÜCRE KÜLTÜRÜ KURSU
Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Immunohistochemistry
İmmunohistokimya

DESAM
2 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Protein Analiz Yöntemleri
 ELISA
 Gel Elektorforezi
 Western blot
 Immunopresipitasyon
 Spektrofotometri
 Enzim assay
 X-ray kristalografi
 İmmunohistokimya

DESAM
3 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İmmunohistokimya
 Antijeni görünür hale getirmek
 Antikor-antijen kompleksi
 Yeri
– Sitoplazmik
– Nükleer
– Hücre membranı
 Sayısı
DESAM
4 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antigen and Antibody
Antijen ve Antikor

DESAM
5 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antijen
 Antijen antikora spesifik olarak bağlanan protein veya

glikoprotein
– Kesitler (Parafin, Frozen, Epon, Araldit)
– Hücre kültür hücreleri
– Kan yayma örnekleri
– Aspirasyon sıvıları
– Embriyolar

DESAM
6 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antijen
 Antijen antikora sfesifik olarak bağlanır
antibody
epitope surface of the antigen

DESAM
7 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor
 Antikor bir antijenle ilişki kurarak antijene karşı cevap

oluşturan bir serum proteinidir.
 Antikorlar serumlarda bulunan gammaglobulin

fraksiyonudur ve genelde immunglobulin (Ig) olarak
isimlendirilir.
 İmmunohistokimyada kullanılan antikorlar genelde IgG

sınıfına aittir.

DESAM
8 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor
 Her antikor 4 polipeptid içerir- 2 ağır zincir ve iki hafif

zincir olarak "Y" şeklinde molekül.
Hafif zincir
Ağır zincir

DESAM
9 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor Yapısı
 Klasik Y yapısında antijen-spesifik kısım Fab ve alt kısımda

Fc olarak adlandırılır.
Fab
Fc

DESAM
10 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor Yapısı
 Fab kısmı farklı amino asit yapısında olup, farklı antijenlere

spesifik olarak bağlanmasından dolayı değişken bölge
olarak adlandırılır.
variable region

DESAM
11 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor Yapısı
 IF, IHC, IHC (P)

 WB, ELISA, IP, etc
constant region

DESAM
12 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor
 Antikorlar kendi içinde: IgG, IgM, IgA, IgD ve IgE.
 Ağır zincir kısmı IgG, IgM, IgA, IgD, ve IgE, için sırası ile
gamma, mu, alpha, delta ve epsilon.
 Hafif zincir kısmı ise içerdiği polipeptid yapısına göre kappa

veya lambda olarak tarif edilir.

DESAM
13 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antiserum
 Tavşana ilk subkutanöz enjeksiyonu takiben uygun bir

zaman sonra 2. bir enjeksiyon yapılır.
 Antikorları kontrol etmek için kan alınır.
 Antikor oluşumu için standart süre verilmez çünkü kişisel
bir olaydır.
 Kan santrifüj edilerek eritrositler ayrılır.
 Antikor plazmada bulunmasına rağmen kullanılan solüsyon
yanlış olarak antiserum olarak adlandırılır.
 Antiserum ELISA , RIA veya blotting tekniği ile test edilir.
 Antiserumda en çok olarak IgG bulunduğundan antikorlar
IgG yapısındadır.
DESAM
14 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antibody-Antigen Reaction
Antikor-Antijen Reaksiyonu

DESAM
15 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
 Hidrofobik, iyonik, Van der Waals veya hidrojen bağ
 Antijene karşı yüksek afinitede olmalı
 Yüksek bağlanma kuvveti olmalı
 Yüksek konsantrasyonda olmalı

DESAM
16 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
 Sıcaklık
– Sıcaklık arttıkça, bağlanma daha hızlı olur.
 Kullanılan tampon solüsyonun pH

– pH ve iyon konsantrasyonu hem antikor hemde antijende
aminositlerin değişimine olanak sağlar

DESAM
17 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antibody Production
Antikor Üretimi

DESAM
18 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antikor Üretimi
 Antikorlar deney hayvanlarının immunizasyonu sonucu

elde edilir.
 Poliklonal ve Monoklonal

DESAM
19 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Polyclonal Antibodies
Poliklonal Antikorlar

DESAM
20 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Poliklonal Antikor
 Tavşanları ( veya kobayları) antijenle immunize ederek

üretilir.
 Antijen tamamen saf olmalı veya sentetik olmalıdır ki
mümkün olduğunca özgün bir antikor oluşabilsin.
 Dönor hayvanın serumu birçok doğal antikor içerir ve

bunlar doku elemanları ile reaksiyona girebilir.
 O nedenle pozitif görünen bir immunreaksiyon kontroller

yapılmadan spesifik ve istenen antijen –antikor reaksiyonu
olarak kabul edilmemelidir.

DESAM
21 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Poliklonal Antikor
Poliklonal antikorlar birçok epitopu tanıyabilir

Her bir antikor farklı B hücreleri tarafından üretilerek elde edilmiştir.
DESAM
22 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Polyclonal Antibody Production
Poliklonal Antikor Üretimi

DESAM
23 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
antijen
Tavşan (intradermal veya subkutan) saf antijen ile immunize

edilir.
DESAM
24 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
antikor
Y
Y
Y
Tavşan immun sistemi verilen antijene karşı spesifik antikor

üretir.
DESAM
25 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Tavşanın kanı alınır.

DESAM
26 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Y
Y Y
Y Y
Y
Eritrosit ve pıhtılaşma faktörleri uzaklaştırılarak antiserum

elde edilir.
DESAM
27 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
 Poliklonal antikorlar Protein Purifikasyon veya Antijen

Affiniti Kromotografisi ile elde edilir.
 Protein Purifikasyonu serum proteinlerini elimine eder

fakat non-spesifik immunglobulin fraksiyonlarını elimine
edemez.
 Antigen Affiniti Kromotografisi edaha spesifik olup, non-

spesifik immunglobulin fraksiyonlarını da elimine eder.

DESAM
28 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Monoclonal Antibodies
Monoklonal Antikorlar

DESAM
29 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Monoklonal Antikor
 Monoklonal antikorlar B hücrelerinden tek tip

immunglobulin olarak elde edilirler.
 Daha sonra kültür ortamında fare myeloma hücreleri ile

kaynaştırılarak hibrid hücreler elde edilir.
 Bunlar kültürde bölünür ve antikor oluştururlar.

DESAM
30 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Monoklonal Antikor
 Monoklonal antikorların en büyük avantajı antijene özgün

oluşudur.

DESAM
31 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Monoklonal Antikor
Monoklonal antikor benzer epitoplara bağlanır.

DESAM
32 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Monoclonal Antibody Production
Monoklonal Antikor Üretimi

DESAM
33 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
antijen
Fareye (intradermal veya subkutan) saf antijen verilir.

DESAM
34 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
antikor
Y Y
Y
Fare immun sistemi antijene özgü antikor üretir.

DESAM
35 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
dalak
B-lenfosit
Antikor üreten B-hücresi dalak veya lenf düğümünden elde

edilir.
DESAM
36 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
miyeloma hücresi B-lenfosit
B hücresi miyeloma hücresi ile füzyonu sağlanır.

DESAM
37 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Hibridoma hücresi aynı özellikle antikor üretir.

DESAM
38 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Hibridoma hücresi ya peritoneal kaviyete transplante edilir ve

peritoneal sıvıdan antikor elde edilir.

DESAM
39 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Yada hibirdoma hücresinin bulunduğu kültür vasatı toplanarak

antikor olarak kullanılır.

DESAM
40 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Primary Antibody
İmmunohistokimya İçin Ön Hazırlık

DESAM
41 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Primer Antikorlar
 Doku eldesi ve fiksasyon

 Yöntem Seçimi
 Antikor seçimi
 Sekonder antikor seçimi
 Görüntüleme

DESAM
42 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Doku Eldesi ve Fiksasyon
 Doku Tipi : Taze doku veya hücre, Embriyo, Farklı tespit

solüsyonu uygulanmış doku
 Fiksasyon
 Ancak uygun olmayan veya uzamış fiksasyon antikor-
antijen bağlanma yeteneğini önemli ölçüde azaltır.
 Tüm antijenlerin uygulaması için ideal bir evrensel fiksatif
yoktur.
 Fiksatif seçimi sırasında kullanılacak antikor için belirlenmiş
tespit yöntemi dikkate alınmalıdır.

DESAM
43 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Fiksasyon
 Otoliz ve ölümden sonra olabilecek değişiklikleri

durdurmak,
 Doku elemanlarını canlı haldeki yapı ve pozisyonlarında
tutmak ve korumak,
 Yumuşak olan doku örneklerini sertleştirerek daha sonraki
doku takibi basamaklarında harap olmasını engellemek ve
kesit alınmasını sağlamak,
 Sitoplazmanın yapısını yarı akışkan halden yarı katı hale
getirmektir.

DESAM
44 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Fiksasyon
Fiksatif Uygulama alanı İnceleme Avantaj Dezavantaj
Formalin Parafin bloklar Işık Mikroskobu Doku hazırlığı Non spesifik

(% 10 ) iyidir. boyama riski
bulunmaktadır.
Paraformaldehit Frozen kesitler, Işık ve Floresan Nonspesifik Hücre yapısı

(% 4) Kültür hücreleri, Mikroskobu boyanma azdır. korunmasında
Boyama sırasında post- problemler olabilir.
fiksasyon
Gluteraldehit Parafin bloklar, Epon Elektron ve Işık Hücre yapısı Non spesifik
(% 0.2-2.5) yarı-ince veya ince Mikroskobu çok iyi korunur. boyama riski
kesitler yüksektir.
Aseton, Frozen kesitler, Işık ve Floresan Kültür Hücre yapısı çok

Metanol, Paraformaldehit ile Mikroskobu hücrelerine iyi korunamaz ve
Ethanol Karışımı tespit edilen kesitlere birincil antikor nonspesifik
(1/1) postfiksasyon, kültür girişi çok iyidir. boyama riski
hücreleri yüksektir.

DESAM
45 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Permeabilizasyon
 Hücre içi antijen görünmesi istenir ise yapılır.
 Deterjan ve solventler kullanılır.
 Triton-X-100
 Tween-20
 NP-40
 Saponin
 Digitonin
 Brij-58

DESAM
46 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Primer Antikor ve Dilüsyonu
Dilüe veya Hazır kullanım (Ready to Use)
1:50 1:100 1:200
1:400 1:800

DESAM
47 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
1:50
Langerhans Adacık
Hücreleri
Arka plan boyanma
1:50, Langerhans adacık hücreleri koyu boyanmış, ama

bununla beraber arka planda da hücreler boyanmış.
DESAM
48 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
1:800
1:800, arka planda boyanma yok, fakat langerhans adacık

hücreleride çok az boyanmış.
DESAM
49 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
1:200
1:200, arka plan boyanma yok, langerhans adacık

hücreleride spesifik boyanmış, ideal dilüsyon.
DESAM
50 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antibody Incubation Time
Antikorun İnkübasyon Süresi

DESAM
51 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İnkübasyon Zamanı
 Antikor konsantrasyonuna bağlıdır.
 Yüksek konsantrasyondaki antikor için daha kısa

inkübasyon süresine ihtiyaç vardır.
 Sıcaklık düştükçe inkübasyon süresi artar.

DESAM
52 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antibody Incubation Temperature
Antikor İnkübasyonunda Sıcaklık

DESAM
53 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İnkübasyon Sıcaklığı
 Antikor-antijen reaksiyonu 37C de oda sıcaklığına göre

daha hızlıdır.
 Sıcaklığın artması ile daha yüksek konsantrasyonda
antikora ihtiyaç duyulur.
 Sıcaklığın artması ile ayrıca nemli ortam ihtiyacıda artar.

DESAM
54 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antigen Retrieval
Antijenin Gösterilmesi

DESAM
55 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antijenin Gösterilmesi
 Fiksasyon sırasında birçok antijenik bölge kapanır ve bu

gibi durumlarda antijenin gösterilebilmesi için ek bir
basamağa ihtiyaç vardır.
 Antijen Retrieval örneğin parafin bloklar proteolitik

enzimler ile ve/veya yüksek sıcaklıkta farklı tampon
solüsyonları içinde inkübasyon gerekir.

DESAM
56 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antijen Retrieval
 Heat induced epitope retrieval (HIER)

– Mikrodalga Fırın, düdüklü tencere, buharlı tencere, otoklav
ve su banyosu kullanılabilir.
– 20 dakika ısıtma- 20 dakika soğutma
– Sitrat tampon solüsyonu pH 6.0
– Tris-EDTA pH 10.0
– EDTA pH 8.0
 PIER (Proteolytic Induced Epitope Retrieval)
– Proteinaz K
– Tripsin
– Kemotripsin
– Pepsin
– Pronaz YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ
DESAM
57 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Antigen Retrieval
Sitrate solüsyonu, pH 6.0 No Antijen Retrieval
Tonsilla Palatina, CD3 immunohistokimyası

DESAM
58 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Enzymes and Chromogens
Enzim ve Kromojenler

DESAM
59 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Enzim ve Kromojenler
 Antijen-antikor komplesini görünür hale getirmek için

gereklidir.
 Enzim sıklıkla kullanılanlar

• horseradish peroxidase (HRP)
• alkaline phophatase (AP)
 Kromojen sıklıkla kullanılanlar

• 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)
• 3,3’-diaminobenzidine (DAB)

DESAM
60 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İmmunofloresan
 Bu yöntemde enzim- substrat ilişkisi yerine aynı işlevi göre

fluoresans maddeler kullanılır.
 İdeal florasan madde yüksek oranda kısa dalga ışınlarını
arbsorblayabilmelidir.
 FITC (Fluorescein isothicyanate)
 Rodamin: TRITC (Tetrametilrhodmine isothiyocyanate)
 Fikoeritrin (PE)
 Akridin orange (AO)
 Floresan mikroskopta , antikorlara bağlı bu maddeler için
uygun filtreler kullanılarak işaret yeşil, kırmızı veya mavi
renklerde gözlenir.
DESAM
61 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İmmunogold Yöntemi
 İmmun altın yönteminde işaret maddesi olarak antikora

kolloidal altın partikülleri bağlanır.
 Immun işaret , gümüş tuzlarıyla yapılan bir redüksiyon
işlemiyle altın partiküllerinin gümüş metali ile kaplanarak
alınır.
 Işık mikroskobunda kullanılan immun işaretleme yöntemi
çalışılan doku ve kullanılacak antikora göre seçilir

DESAM
62 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Peroksidaz anti Peroksidaz Yöntemi
 PAP yöntemi indirekt tekniklerin daha gelişmişidir ve PAP

kompleksi oluşturmak için peroksidaz ile birleşmiş,
peroksidaz için tavşan antikoru içeren üçüncü bir basamak
içerir.
 Biotin-Avidin yönteminde ise avidin biotine spesifik olarak
bağlandığından dolayı sekonder antikor olarak hazırlanan
biotinlenmiş antikor üzerine sterptavidin uygulanması ile
reaktivite sağlanır.

DESAM
63 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Alkalen Fosfataz anti alkalen fosfataz
 Enzim: Alkalen fosfataz kullanılması dışında PAP yöntemi

ile hemen hemen aynıdır.
 Sekonder antikora bağlanmış olan alkalen fosfataz-anti
alkalin fosfataz kompleksi mevcuttur.
 Bu yöntemde de substrat enzim reaksiyonu sonucu doku
antijeni belirlenir.

DESAM
64 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Avidin-Biotin Kompleks
 Bu teknik üç basamak içerir.

1- İşaretsiz primer antikor
2- Biotinlenmiş ikincil antikor
3- Avidin-biotin peroksidaz kompleksi
 Peroksidaz DAB yada diğer substrat
tarafından farklı kolorimetrik son
ürünler ile görünür hale getirilir.

DESAM
65 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
AEC ve DAB Boyamaları
AEC kromojen DAB kromojen

Mart-1 Mart-1
Melanoma Melanoma

DESAM
66 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
IHC Staining Methods
Immunohistokimya Protokolü

DESAM
67 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İmmunohistokimya Protokolü
 Direkt Yöntem
 İki-Basamaklı Indirekt Yöntem
 Üç-Basamaklı Indirekt Yöntem
 Peroxidase-Antiperoxidase (PAP) Yöntem
 Alkaline-Antialkaline Phosphatase (APAAP) Yöntem
 Avidin-Biotin Kompleks (ABC) Yöntemi
 İşaretlenmiş Streptavidin-Biotin (LSAB) Yöntemi

DESAM
68 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İmmunohistokimya Protokolü
 Blok Serum Uygulaması

– Non-spesifik boyama normal serum ile azaltılabilir.
– Temel neden: Doku kesitlerinin belirli yerlerinde
hidrofobik ve elektrostatik kuvvetler tarafından
spesifik immun serumun non-immonulojik
bağlanmasıdır.
 Endojen peroksidaz aktivitesinin kaldırılması
– Doku peroksidazını inhibe etmek için kullanılır.
– Hidrojen peroksit
 Endojen alkalen fosfataz aktivitesinin kaldırılması
– Levamizol

DESAM
69 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Direct Method
Direkt Yöntem

DESAM
70 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Direkt Yöntem
 Enzim-işaretli primer antikor kullanılır.

 Horseradish peroxidase (HRP) veya alkaline phosphatase
(AP)
 Spesifikliği daha azdır.

DESAM
71 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Direkt Yöntem
enzyme
primary Ab
antigen
Enzim içeren antikor konur.

DESAM
72 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Direkt Yöntem
substrate-kromojen
Kromojen içeren solüsyon ilavesi yapılır.

DESAM
73 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Two-Step Indirect Method
İki-Basamaklı İndirekt Yöntem

DESAM
74 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İki-Basamaklı İndirekt Yöntem
 Enzim-işaretli ikinci antikor

kullanılır.
 Primer antikor işaretli

değildir.
 Primer antikorun üretildiği

kaynak ile sekonder
antikor uyumlu olmalıdır.
 Direkt yöntemden daha

spesifiktir.
DESAM
75 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İki-basamaklı İndirekt Yöntem
Primer Antikor (mouse)
antijen
İşaretlenmemiş primer antikor uygulanır.

DESAM
76 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İkincil antikor
(rabbit anti-mouse)
enzim
Enzim ile işaretli primere uyumlu ikincil antikor uygulanır.

DESAM
77 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
substrate-kromojen
Son ürünü renk veren kromojen kullanılır.

DESAM
78 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Three-Step Indirect Method
Üç-Basamaklı İndirekt Yöntem

DESAM
79 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Üç-basamaklı İndirekt Yöntem
 İki-basamaklı İndirekt Yöntemden farklı olarak enzim-

işaretli üçüncül antikor kullanımı vardır.
 Spesifite daha güçlüdür.
 Hem ikincil hemde üçüncül antikor aynı enzim ile konjuge

edilmiş olmalıdır.

DESAM
80 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İşaretlenmemiş primer antikor ilave edilir.
Primer Antikor (mouse)
antijen

DESAM
81 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Enzim işaretli ikincil antikor ilave edilir.
Sekonder Antikor
(rabbit anti-mouse)
enzim

DESAM
82 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
İkincil antikora bağlanan enzim işaretli üçüncül antikor ilavesi

edilir.
Üçüncül Antikor
(goat anti-rabbit)

DESAM
83 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Kromojen ilavesi edilir.
substrate-
kromojen
substrate-
kromojen

DESAM
84 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
 Birden fazla sekonder ve ikincil antikor bağlantısı

gerçekleştiğinden elde edilen boyanma daha spesifiktir.

DESAM
85 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Avidin-Biotin Yöntemi
 Avidin (yumurta beyazı glikoproteini) biotin (suda çözünen

vitamin) bağlanma özelliğinden yola çıkılarak
uygulanmıştır.
 Avidin biotin için 4 bağlanma bölgesine sahiptir.
avidin
biotin

DESAM
86 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Avidin-Biotin Yöntemi
 En sık kullanılan iki yöntem vardır

• Avidin-Biotin enzyme Complex (ABC)
• Labeled StreptAvidin-Biotin (LSAB)
 Spesifikliği daha fazla olduğu için PAP veya APAAP

yöntemlerine tercih edilir.
 Streptavidin, bakterial proteindir, daha az nonspesifik

byanma yaptığından avidin yerine kullanır.

DESAM
87 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ABC Yöntemi
 Enzim kompleksi biotinlenmiş enzim (HRP or AP) ve

avidindir.
biotinlenmiş avidin
enzim avidin-biotin-enzim kompleksi
 Avidin-biotin-enzim kompleksi biotinlenmiş ikincil antikor

ile bağlanır.

DESAM
88 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ABC Yöntemi
İşaretlenmemiş birincil antikor ilavesi yapılır.
antijen Primer Antikor

(mouse)

DESAM
89 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ABC - Procedure
Biotinlenmiş ikincil antikor primer antikora

bağlanır.
İkincil Antikor
(rabbit anti-mouse)
biotin

DESAM
90 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ABC Yöntemi
Avidin-biotin-enzim kompleksi ilave edilir ve

biotinlenmiş ikincil antikora bağlanır.
avidin-biotin-enzim kompleksi

DESAM
91 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ABC Yöntemi
Kromojen solusyonu en sonda ilave edilir.
substrate-
kromojen
substrate-
kromojen

DESAM
92 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Step by Step LSAB Staining Procedure
Örnek Protokol

DESAM
93 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol
Deparaffinizasyon ve Rehidrasyon
paraffin wax
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Parafin kesitteki parafin uzaklaştırılmalıdır.
DESAM
94 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol
Deparaffinizasyon ve Rehidrasyon
Kesit
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
DESAM
95 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol
Deparaffinization and Rehydration
Block Endogenous Peroxidase
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
3% hydrogen peroxide solusyonu: 10 dk
endojen peroksidaz aktivite inhibisyonu
DESAM
96 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Distille su ile ve ardından PBS ile yıkama
DESAM
97 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

20:00
Rinse
Antigen Retrieval
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Microdalga: 20 dk
Sitrat Buffer pH 6.0.
DESAM
98 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
PBS ile yıkama.
DESAM
99 Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
% 3 bovine serum albumin (BSA):
Blok nonspesifik boyanma.
DESAM
100 Temel Prensipler

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Birincil Antikor (CEA) 30-120 dk RT
+40 C tüm gece YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ
DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
PBS ile 3x5 yıkama
DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
Biotinylated Secondary Antibody
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Biotinlenmiş ikincil antikor: 10-30 dk RT
DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
PBS ile 3X5 yıkama

DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
HRP konjuge streptavidininkübasyonu:10-30 dk RT

DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
PBS ile 3X5 yıkama

DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
AEC Chromogen
AEC kromojen uygulanması: 5-10 dk RT

DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
AEC Chromogen
Rinse
PBS ile 3x5 yıkama ve ardından distile su

ile yıkama.
DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
AEC Chromogen
Rinse
Hematoxylin Counterstain
Mayer’s Hematoksilen ile 1 dk artalan

boyaması
DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
AEC Chromogen
Rinse
Rinse
Yıkama (distile su veya çeşme suyu)

DESAM

3-4 Haziran 2016
Örnek Protokol

Rinse
Antigen Retrieval
Rinse
Protein Block
Primary Antibody
Rinse
MS-1375 CEA
Colon carcinoma
NM-123
Lab Vision Corp.
SPECIMEN
Rinse
Streptavidin HRP
Rinse
AEC Chromogen
Rinse
Rinse
Aqueous Mount
Kapatma vasatı ile kapama.

DESAM

3-4 Haziran 2016
Kontroller
 Pozitif kontrol
 Negatif Kontrol

DESAM

3-4 Haziran 2016
IHC Staining Patterns
İmmunohistokimya Boyanma Profili

DESAM

3-4 Haziran 2016
Hücre Membranı

DESAM

3-4 Haziran 2016
Çekirdek

DESAM

3-4 Haziran 2016
Sitoplazmik

DESAM

3-4 Haziran 2016
Enfeksiyöz Ajanlar
Hepatitis B Surface Antigen Hepatitis B Core Antigen

(HBsAg) (HBcAg)
Infected Liver Infected Liver
DAB Kromojen AEC Kromojen
DESAM

3-4 Haziran 2016
Enfeksiyöz Ajanlar
Toxoplasma gondii Adenovirus

Infected Brain Infected Appendix
AEC Kromojen DAB Kromojen

DESAM

3-4 Haziran 2016
Protokol
Hücre Kültürü
İşlem Madde Süre
Yıkama PBS 5 dakika
Fiksasyon %4 Paraformaldehit 30 dk
Yıkama PBS 5 dakika
%3’ lük hidrojen peroksit 5 dakika
Yıkama PBS 3x5 dakika
Permeabilizasyon %0.1 Triton-X 100 15 dakika
Bloklama Blok solusyonu 1 saat
Antikor ile inkübasyon Primer Antikor 1 gece, 4˚C de
İkincil antikor 30 dakika
Avidin-biotin kompleksi 30 dakika
Boyama Kromojen (DAB, AEC, vb) 5 dk
Yıkama Distile su 10 dakika
Zıt Boyama Mayer hematoksilen 5 dakika
Yıkama PBS 3x5 dakika DESAM
119
Kapama Kapatma mediumu Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016
ÖRNEĞİMİZ
 COLO-320
IHC

DESAM

3-4 Haziran 2016
ÖRNEK PROTOKOL-HÜCRE KÜLTÜRÜ

DESAM

3-4 Haziran 2016
ÖRNEK PROTOKOL-HÜCRE KÜLTÜRÜ
Yuvarlak lamel
çıkarılır
Lam üzerine 1 damla
kapatma medyumu
konur
Lamel hücre
kapatma mediyumu
üzerinde olacak
şekilde kapatılır.
İnceleme
DESAM

3-4 Haziran 2016
Chamber Slides

DESAM

3-4 Haziran 2016
APOPTOZ

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP nick end labeling
 Parafin Kesitler
 Frozen Kesitler
 Hücre Kültürü Örnekleri
 Whole Mount

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
TUNEL
Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP
transferase-mediated nick end-labeling
•En yaygın kullanılan yöntem
•DNA kırıklarını tespit eder
• TdT enzimi ile tespit edilir
•dUTPs – belirteç

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
TdT ENZİM
FİKSASYON PERMEABİLİZASYON UYGULAMASI İNCELEME
% 4 paraformaldehyde -30 Dk-1 saat Oda sıcaklığında

3 defa PBS ile yıkama

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
TdT ENZİM
Fiksasyon Permebilizasyon UYGULAMASI İnceleme
% 0.1 Triton X-100 ile 10 dk. buz üstünde

3 defa PBSt ile yıkama

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
TdT ENZİM
Fixation Permeabilizasyon UYGULAMASI İnceleme
Tdt reaksiyon karışımı- 37℃ 1 saat

3 defa yıkama

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
TdT ENZİM
Fiksasyon Permeabilizasyon
UYGULAMASI
İnceleme
Işık Mikroskobu
Floresan Mikroskobu

DESAM

3-4 Haziran 2016
TUNEL
İşlem Madde Süre

Yıkama PBS 2x5 dk.
Permeabilizasyon Triton-X 100 15 dk.

Yıkama PBS 2x5 dk.
Primer Antikor Tdt-enzim 1 saat (370C)

Yıkama PBS 3x5 dk.
İnceleme
Dönüştürme 30 dk.
Yıkama PBS 3x5 dk.
Boyama DAB 5 dk.

Yıkama PBS 3x5 dk.
Kapatma Kapatma mediumu

DESAM

3-4 Haziran 2016
TEŞEKKÜRLER
SORULARINIZ….
DESAM
Temel Prensipler
3-4 Haziran 2016

İmmunohistokimya Ve TUNEL

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

İmmunohistokimya Ve TUNEL

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Immunohistochemistry

HÜCREYİ İNCELEME YÖNTEMLERİ

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antijeni görünür hale getirmek

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antijen antikora spesifik olarak bağlanan protein veya

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antijen antikora sfesifik olarak bağlanır

epitope surface of the antigen

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antikor bir antijenle ilişki kurarak antijene karşı cevap

 Antikorlar serumlarda bulunan gammaglobulin

 İmmunohistokimyada kullanılan antikorlar genelde IgG

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Her antikor 4 polipeptid içerir- 2 ağır zincir ve iki hafif

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Klasik Y yapısında antijen-spesifik kısım Fab ve alt kısımda

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Fab kısmı farklı amino asit yapısında olup, farklı antijenlere

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 IF, IHC, IHC (P)

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antikorlar kendi içinde: IgG, IgM, IgA, IgD ve IgE.

 Hafif zincir kısmı ise içerdiği polipeptid yapısına göre kappa

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Tavşana ilk subkutanöz enjeksiyonu takiben uygun bir

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Hidrofobik, iyonik, Van der Waals veya hidrojen bağ

 Antijene karşı yüksek afinitede olmalı

 Yüksek bağlanma kuvveti olmalı

 Yüksek konsantrasyonda olmalı

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Kullanılan tampon solüsyonun pH

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Antikorlar deney hayvanlarının immunizasyonu sonucu

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Tavşanları ( veya kobayları) antijenle immunize ederek

 Dönor hayvanın serumu birçok doğal antikor içerir ve

 O nedenle pozitif görünen bir immunreaksiyon kontroller

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

Poliklonal antikorlar birçok epitopu tanıyabilir

Poliklonal Antikor Üretimi

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

Tavşan (intradermal veya subkutan) saf antijen ile immunize

Tavşan immun sistemi verilen antijene karşı spesifik antikor

Tavşanın kanı alınır.

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

Eritrosit ve pıhtılaşma faktörleri uzaklaştırılarak antiserum

 Poliklonal antikorlar Protein Purifikasyon veya Antijen

 Protein Purifikasyonu serum proteinlerini elimine eder

 Antigen Affiniti Kromotografisi edaha spesifik olup, non-

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Monoklonal antikorlar B hücrelerinden tek tip

 Daha sonra kültür ortamında fare myeloma hücreleri ile

 Bunlar kültürde bölünür ve antikor oluştururlar.

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

 Monoklonal antikorların en büyük avantajı antijene özgün

YAKIN DOĞU ÜNİVERSİTESİ

Monoklonal antikor benzer epitoplara bağlanır.