VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC KC04-06-10

Ứng dụng công nghệ bioreactor

trong công tác giống hoa lan, cà phê và
nuôi cấy tế bào Taxus sp. thu nhận taxol

TRẦN VĂN MINH

PHÒNG THÍ NGHIỆM TRỌNG ĐIỂM PHÍA NAM
VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Đà Lạt 4-2010
 Các phương pháp nhân giống cây trồng kinh tế

Nhân giống vô tính theo phương pháp nông học

Giâm cành
Chiết cành
Ghép cành

Nhân giống qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phục tráng giống cây trồng
Nhân nhanh vô hạn in vitro các dòng sạch bệnh
Công tác nhân giống được thực hiện quanh năm
Hạn chế hiện nay là giá thành sản phẩm cao

Công nghệ bioreactor

Sản xuất protein tái tổ hợp có giá trị y dược
Nhân nhanh sinh khối tế bào động vật, thực vật, vi sinh
Dòng hóa tế bào trong công nghệ phôi soma
Nuôi cấy tế bào sản xuất các chất có hoạt tính sinh học
Vi nhân giống cây trồng qua nhân sinh khối tế bào phôi và protocorm
 Hệ thống bioreactor

Bioflo110 Immersion bioreactor

Máy lắc
công nghiệp
 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Nuôi cấy lớp mỏng tế bào tạo nguồn nguyên liệu

Nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa và Dịch huyền phù tế bào

Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trong bioreactor cánh khuấy

Trải tế bào và Tái sinh phôi soma

Nuôi cấy chồi tái sinh trong bioreactor bán chìm ngập quãng

Vườn ươm
 CYMBIDIUM
1. Nuôi cấy tế bào lớp mỏng tế bào tạo nguồn nguyên liệu

(Den)

(a)
(Pha)
(b)
(c)

(Rhy)

Nuôi cấy tế bào lớp mỏng

(a) Chồi và PLB tái sinh từ bẹ lá (b) Chồi (21 ngày) (c ) Chồi (45 ngày)
 CYMBIDIUM
2. Nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa và Dịch huyền phù tế bào

(Den)

(Pha) (a) (c)

(b) (d)
(Rhy)

Nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa và dhp tế bào

(a) Tế bào mô sẹo phôi hóa từ bẹ lá non (b) Nhân sinh khối mô sẹo phôi hóa
(c ) Dhp tế bào mô sẹo phôi hóa (d) Tế bào dhp (21 ngày)
 CYMBIDIUM
3. Nuôi cấy dhp tế bào trong bioreactor cánh khuấy

Động thái sinh trưởng DHPTB

hoa lan Dendrobium trong bioreactor

16000

14000
Trọng lượng tươi (mg)

12000

10000

8000 TLT (mg)

Động thái sinh trưởng DHPTB
(Den) 6000

4000 hoa lan Cymbidium trong bioreactor

2000

0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 14000
Thời gian nuôi cấy (ngày)

Động thái sinh trưởng DHPTB 12000

(a)
hoa lan Phalaenopsis trong bioreactor

Trọng lượng tươi (mg)

14000 10000
12000
8000
(b)
Trọng lượng tươi (mg)

10000
TLT (mg)

(Pha)
8000
TLT (mg) 6000
6000

4000
4000
2000

0 2000
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Thời gian nuôi cấy (ngày)
0
Động thái sinh trưởng DHPTB
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

9000
hoa lan Ngọc điểm trong bioreactor
(c) Thời gian nuôi cấy (ngày)
8000

(Rhy) 7000
Trọng lượng tươi (mg)

6000

5000
TLT (mg)
4000

Nuôi cấy dhp tế bào trong bioreactor

3000

2000

1000

0
0 3 6 9 12 15 18 21
Thời gian nuôi cấy (ngày)
24 27 (a) Tế bào dhp tạo tế bào thứ cấp (6 ngày)
(b) Tế bào kết cụm (21 ngày)
(c ) Động thái sinh trưởng dhp tế bào
 CYMBIDIUM
4. Trải tế bào và Tái sinh phôi soma

(Den)

(a) (b)

(c) (d)
(Pha)

(Rhy)
Trải tế bào và tái sinh phôi
(a) Trải tế bào mô sẹo phôi hóa
(b) Tái sinh phôi (21 ngày)
(c) Tái sinh phôi (30 ngày)
(d) Chồi tái sinh (60 ngày)
 CYMBIDIUM
5. Nuôi cấy trong bioreactor bán chìm ngập quãng

(Den)

(a)

(c) (b)
(Pha)
(d)

(Rhy)

Nuôi cấy bioreactor bán chìm nổi

(a) Chồi tái sinh từ phôi (b) Nuôi cấy nhân chồi (10 ngày)
(c) Nuôi cấy nhân chồi (30 ngày) (d) Nuôi cấy sinh trưởng (45
ngày)
 CÀ PHÊ
1. Nuôi cấy tế bào lớp mỏng tạo nguồn nguyên liệu

(a)
(b)

(c) (d) (e)

Nuôi cấy tế bào lớp mỏng

(a) Tái sinh từ tế bào lớp mỏng (20 ngày) (b) Tái sinh từ tế bào lớp mỏng (30 ngày)
(c ) Chồi phát sinh từ phiến lá 10 ngày (d) 20 ngày (e) 45 ngày
 CÀ PHÊ
2. Nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa và Dịch huyền phù tế bào

Nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hóa và dhp tế bào

(a) Tạo mô sẹo từ lá non chồi in vitro (b) Nhân sinh khối mô sẹo phôi hóa
(c ) Dhp tế bào mô sẹo phôi hóa (d) Tế bào cà phê có dạng hình que
 CÀ PHÊ
3. Nuôi cấy dhp tế bào trong bioreactor cánh khuấy
Động thái sinh trưởng DHPTB
Cà phê trong bioreactor

14000

(a) 12000

Trọng lượng tươi (mg)

10000

8000
TLT (mg)
6000

4000
(b)
2000

0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Thời gian nuôi cấy (ngày)

Nuôi cấy dhp tế bào trong bioreactor

(c)
(a) Tế bào dhp 9 ngày
(b) Tế bào dhp 15 ngày
(c) Tế bào dhp 21 ngày
(d) Động thái sinh trưởng dhp tế bào
 CÀ PHÊ
4. Trải tế bào và Tái sinh phôi soma

(a)

(b) (e)

(f)
(c)

(d)

Trải tế bào và tái sinh phôi soma

(a) Trải tế bào dhp (b) Phôi biệt hóa tái sinh (14 ngày) (c ) Phôi lá mầm (21 ngày)
(d) Phôi có lá tiền sinh (30 ngày) (e) Tái sinh phôi (37 ngày) (f) (45 ngày)
 CÀ PHÊ
5. Nuôi cấy trong bioreactor bán chìm nổi

Bioreactor bán chìm nổi

(a) Cây tái sinh từ phôi (a)
(c)
(b)(c) Chồi sinh trưởng
(b)
 THÔNG ĐỎ
1. Cây mẹ đầu dòng được sử dụng nuôi cấy mô

(b)
(a)
(c)

(a) Cây mẹ đầu dòng

(b) Cây bầu đất giâm hom ở Đàlạt (6 tháng tuổi)
(c) Cây bầu đất giâm hom TPHCM (2 năm tuổi)
 THÔNG ĐỎ
2. Ảnh hưởng của vị trí mẫu nuôi cấy đến tái sinh chồi

(a) Đỉnh thân chính

(b) Đốt thân chính
(c) Đỉnh cành
(d) Đốt cành
(e) Đốt thân chính (60 ngày)

(a) (b) (e)

(d) (c)
 THÔNG ĐỎ
3. Ảnh hưởng của tính bảo lưu cục bộ

(a) (b)

(c)

(a) Chồi mới được tách đơn thân

(b) Chồi từ đốt thân sinh trưởng
ngang (sau 45 ngày)
(c) Chồi từ đỉnh thân sinh trưởng
thẳng đứng (sau 45 ngày)
 THÔNG ĐỎ
4. Nhân chồi thông đỏ in vitro

(a) (b) BA
(c) (d) BA+kinetin

(a) (b)

(c) (d)
 THÔNG ĐỎ
5. Nuôi cấy phát sinh mô sẹo

(a) (c)

(b) (d)

(a) Tạo mô sẹo từ mẫu thân (b) Tạo mô sẹo từ mẫu lá

(c) Trong tối (có màu đỏ nhạt) (d) Ngòai sáng (có màu vàng chanh, điểm xanh)
 THÔNG ĐỎ
6. Nhân sinh khối mô sẹo trong tối và ngòai sáng

(a) Nhân sinh khối mô sẹo ngòai sáng

(mô sẹo có màu vàng chanh, điểm xanh)

(b) Nhân sinh khối mô sẹo trong tối

(mô sẹo có màu đỏ nhạt, trong mờ)
(a) (c)
(c) Mô sẹo chụp dưới kính hiển vi:
-sinh trưởng nhanh
(b)
-đó là những tế bào có kết cấu chặt chẻ,
-tế bào chất đậm đặc,
-có màu vàng chanh sau 14 ngày nuôi
cấy,
-chuyển sang màu đỏ nhạt sau 30 ngày
nuôi cấy
-dễ dàng tách rời khi đưa vào nuôi cấy
lỏng
 THÔNG ĐỎ
7. Chọn dòng tế bào sinh trưởng nhanh

(a) Dhp tế bào

(b) Trải chọn dòng
(c) Độ đồng đều tăng cao (sau 2 năm)
(d) Trải đều trên mặt thạch (sau 3 năm)
(a) (c)

(b) (d)
 THÔNG ĐỎ
8. Tạo dịch huyền phù tế bào thông đỏ

(a) (c)

(b) (d)

(a) Stock mô sẹo được nhân sinh khối trên agar

(b) Mô sẹo 45 ngày tuổi được đưa vào nuôi cấy tạo dhp tế bào
(c) Dhp tế bào sau 45 ngày nuôi cấy
(d) Dhp tế bào sau 60 ngày nuôi cấy
 THÔNG ĐỎ
9. Nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào thông đỏ sơ cấp

(a) (b) (c)

(d) (e)

(a) Mô sẹo được nuôi cấy trong lỏng (7 ngày) (b) Mô sẹo bắt đầu vỡ (14 ngày)
(c) Phóng thích tế bào sơ cấp (14 ngày) (d) Nhân sinh khối dịch huyền phù tế bào
(20 ngày) – màu cà phê sữa (e) Nhân sinh khối dịch huyền phù tế bào (42 ngày) –
màu nâu sậm
 THÔNG ĐỎ
10. Nuôi cấy dhp tế bào thông đỏ trong bioreactor

% taxol /TLK Động thái sinh trưởng dhp tế bào thân, lá

lá khô thực sinh: 0.02183
lá tươi thực sinh: 0.00405 7000 7000

Trọng lượng tươi lá

6000 6000

Trọng lượng tươi

dòng tb TDL1: 0.03826 5000 5000 Trọng lượng tươi

thân (mg)
4000 4000 thân (mg)

(mg)
dòng tb TDT1: 0.02855 3000 3000 Trọng lượng tươi lá
2000 2000 (mg)
(a) 1000 1000
0 0
7 17 21 28 35 42 49
(b) (c) Thời gian nuôi cấy (ngày)

(a) Tế bào dhp (14 ngày)

(b) Tế bào dhp (21 ngày)
Đặc điểm tế bào mịn và tách rời nhau, có
dạng phôi hóa (pha lõang x10 lần)
(c) Sinh trưởng dhp tế bào thân lá