Projektas

„Gamtos mokslų mokytojų kompetencijų biotechnologijos srityje kėlimo struktūros sukūrimas“

Metodinės mokymo priemonės,

susietos su ugdymo programomis,
išplėstinė bandomoji versija
9-12 klasių mokytojams

Vilnius
2012
 TURINYS
1. Biotechnologijos apibrėžimas, istorija ir vystymasis
1.1. Biotechnologijos srities apibrėžimas ir ryšys su kitais mokslais
1.2. Istorinė biotechnologijos vystymosi perspektyva ir reikšmė žmogaus gyvenimui bei
visuomenės raidai nuo Egipto civilizacijos laikų iki šių dienų
1.4. Selekcijos reikšmė žemdirbystei ir genetinis šio proceso pagrindas
1.5. Mikrobiologijos mokslo raida, antibiotikų atradimas ir reikšmė
1.6. Šiuolaikinės biotechnologijos sritys
1.7. Žinių apie DNR struktūrą ir funkcijas svarba šiuolaikinės biotechnologijos vystymuisi
1.8. Šiuolaikinės biotechnologijos produktai
1.9. Lietuvos biotechnologijos pramonės apžvalga

2. Bendrosios žinios apie ląstelinius procesus ir struktūras

2.1. Ląstelės sandara, genetinė informacija ląstelėse
2.2. Genai ir genomas – organizmų savitumą ir savybes lemiantys veiksniai
2.3. Nukleorūgščių (DNR ir RNR) sandara ir struktūra
2.4. Genų organizacija: eukariotų ir prokariotų genų struktūra
2.5. Replikacijos ir transkripcijos procesai
2.6. Baltymo sintezė – genetinio kodo realizavimo procesas
2.7. Baltymų struktūra ir funkcijos, jų ryšys su cheminėmis aminorūgščių savybėmis

3. Genų inžinerija – šiuolaikinės biotechnologijos pagrindas

3.1. Plačiausiai šiuolaikiniuose biotechnologiniuose procesuose naudojami organizmai, jų
išskirtinės savybės ir pritaikymas
3.2 . Klonavimo procesas ir jo esmė
3.3. DNR modifikuojantys baltymai – įrankiai, leidžiantys manipuliuoti DNR seka ir kurti naujų
savybių turinčius baltymus
3.4. Genų inžinerijos metodai: ląstelių transformacija, polimerazės grandininė reakcija, DNR
sekos kaita ir mutagenezė, konkrečių genų paieška, genų raiškos tyrimai
3.5. Bioinformatika ir jos pasiekimai

4. Biotechnologija ir aplinka
4.1. Biotechnologijos sričių produktai, reikšmingiausiai keičiantys šiuolaikinio žmogaus
gyvenimą
4.2. Žmogaus sveikata ir biotechnologija
4.3. Aplinka ir biotechnologija: biologinė kenkėjų kontrolė, nykstančių ir išnykusių rūšių
išsaugojimas, aplinkos teršalų valymas
4.3. Aplinka ir biotechnologija: biologinė kenkėjų kontrolė, nykstančių ir išnykusių rūšių
išsaugojimas, aplinkos teršalų valymas
4.4. Atsinaujinančių anglies šaltinių panaudojimas įvairių žaliavų ir energijos (etanolio, metano,
vandenilio) gamybai biotechnologijos metodais
4.5. Maisto trūkumo problemų sprendimas biotechnologiniais būdais

5. Biotechnologija: saugumas bei etiniai aspektai

5.1. Transgeniniai organizmai ir produktai. Kūrimo metodai
5.2. Biotechnologijos veiklos sritys, kuriose panaudojami GMO
 5.3. Nauda ar rizika?
5.4. Socialiniai ir etiniai aspektai
5.5. Ar saugūs genetiškai modifikuoti organizmai?

6. Fizikiniai biomolekulių tyrimo metodai

6.1. Erdvinės biomolekulių struktūros ir sąveikos, lemiančios jų susidarymą
6.2. Skenuojančio zondo mikroskopija: biomolekulių vaizdinimas, mechaninės savybės ir
nanomanipuliacija
6.3. Optinis pincetas: veikimo principai ir taikymas molekulinių jėgų tyrimuose
6.4. Molekulinės fizikos metodai
6.5. Proteominiai analizės metodai: elektroforezė ir masės spektrometrija
6.6. Optiniai biomolekulių sąveikos tyrimai
6.7. Spektroskopijos metodai: sugerties, fluorescencijos spektroskopija

7. Nanotechnologijos taikymai biomedicinoje

7.1. Nanobiorobotikos pagrindai
7.2. Molekuliniai mechaniniai komponentai, biomolekulių nanomašinos
7.3. Dirbtinis mechaninis eritrocitas – „respirocitas“
7.4. Nanodalelės, jų fizikinės savybės ir taikymas biomoksluose
7.5. Biomimetika
7.6. Biotechnologinė nanodalelių sintezė
7.7. Biooptoelektroniniai mikro- ir nanojutikliai
7.8. Nanomedicinos pagrindai: apibrėžimas ir idėjos istorija

8. Genai ir genomai
8.1. Organizmai ir jų požymių visuma: genominis požiūris
8.2. Genomikos, transkriptomikos ir proteomikos sąvokos ir šiuolaikinis požiūris į požymius
lemiančius veiksnius
8.3. Genomų struktūros: baltymus koduojančių ir kitų sekų reikšmė
8.4. Genų raiškos reguliacija
8.5 Geno funkcijos nustatymas
8.6. Skirtingų rūšių genomų tarpusavio lyginimas
8.7. Ateities genomikos perspektyvos

9. Genų inžinerijos pagrindiniai metodai

9.1. Pagrindinės raiškos sistemos: prokariotai, grybai, augalai, gyvūnai, audinių kultūros; jų
panaudojimo galimybės ir apribojimai
9.2. Klonavimo vektoriai
9.3. Augalų ir gyvūnų klonavimo vektoriai
9.4. Restrikcijos endonukleazių ir DNR ligazių panaudojimas
9.5. Ląstelių transformacijos ir atrankos metodai
9.6. DNR bibliotekų konstravimas ir tikslinių genų paieška
9.7. Transgeninių organizmų kūrimo metodai, gyvūnų klonavimas
9.8. Ar laboratorijoje įmanoma sukurti gyvą ląstelę?
9.9. Nukleorūgščių gryninimo pricipai
9.10. Elektroforezė
9.11. Restrikcinė (DNR hidrolizės) analizė ir jos taikymas
9.12. Nukleorūgščių hibridizacijos metodai
9.13. Genų raiškos tyrimai
 9.14. Polimerazės grandininė reakcija
9.15. DNR sekoskaita, genomų sekoskaitos strategijos
9.16. Baltymų raiška ir gryninimas kaip valdomo biotechnologinio proceso pavyzdys
9.18. Imunofermentiniai tyrimo metodai ir jų taikymas medicinos diagnostikoje bei moksliniuose
tyrimuose

10. Praktinis genų inžinerijos taikymas

10.1. Paveldimų ligų ankstyva diagnostika, su tuo susijusios bioetinės problemos
10.2. Infekcinių ligų diagnostika ir prevencija, naujų vakcinų kūrimas
10.3. Žmogaus genų terapija ir jos galimybės
10.4. Biofarmacijos pramonė ir farmacinių preparatų kūrimas moderniosios biotechnologijos
metodais
10.5. Transgeninių organizmų panaudojimas žmonių ligų tyrimams
10.6. DNR tyrimo metodų panaudojimas teismo medicinoje
10.7. Aplinkos priežiūra ir biotechnologijos
10.8. Mikroorganizmų panaudojimas mažinant aplinkos taršą ir nustatant teršalus
10.9. Buitinių nuotekų biologinio valymo procesas, biotechnologinis jo patobulinimas
10.10. Nykstančių rūšių apsauga ir išnykusių organizmų atkūrimo galimybės
10.11. Biotechnologija žemės ūkyje ir maisto pramonėje
10.12. Transgeninių gyvūnų panaudojimas žemės ūkyje
10.13. Genetiškai modifikuotų augalų išskirtinės savybės, jų kūrimo istorijos ir naudojimo
problemos
10.14. Ekologinis genetiškai pakeistų organizmų kultivavimo aspektas, nekontroliuojamo plitimo
pavyzdžiai ir apsaugos būdai

11. Biomolekulių chemija

11.1. DNR ir RNR elektrinis krūvis, cheminės savybės
11.2. Baltymų sandara ir cheminės šoninių grandinių savybės. Jų įtaka baltymų struktūrai ir
funkcijai
11.3. Fermentinės reakcijos, jų greitis ir junginių savitoji energija
11.4. Fermentų panaudojimas cheminėms medžiagoms gauti, fermentinių procesų valdymas
11.5. Lipidai, jų struktūros sąsajos su savybėmis ir funkcijomis gyvuosiuose organizmuose
11.6. Angliavandenių, kaip pagrindinio atsinaujinančio anglies šaltinio, struktūra, savybės ir
ištekliai

12. Cheminiai procesai biotechnologijoje

12.1. Fermentacija ir etanolio gamyba
12.2. Pienarūgštis rūgimas, cheminiai terpės pokyčiai, sukeliami mikroorganizmų
12.3. Fermentuoti maisto produktai, jų savybės
12.4. Biotechnologiniai cheminių medžiagų gavimo pavyzdžiai
12.5. Biodegradacija ir mikroorganizmų panaudojimas teršalams valyti
12.6. Anglies dioksido išsiskyrimas fermentacijos proceso metu ir jo įtaka terpei bei aplinkai

13. Alternatyvi energetika

13.1. Biokuro gamyba iš įvairių šaltinių, jo panaudojimas transporto sektoriuje
13.2. Suminės augalinio biokuro gamybos anglies dioksido sąnaudos įvertinimas
13.3. Metano dujų biologinis gavimas ir biodujų gavyba, taikymas energetikoje
13.4. Dumblių panaudojimas biokuro gamyboje
13.5. Kiti energetiškai vertingų cheminių junginių gavybos, panaudojant gyvuosius organizmus,
būdai
 13.6. Biosistemų taikymas saulės elementų gamybai

1. Biotechnologijos apibrėžimas, istorija ir vystymasis

1. 1. Biotechnologijos srities apibrėžimas ir ryšys su kitais mokslais

Biotechnologijos terminą 1919 m. sugalvojo vengras Karlas Ereky. Tuo metu biotechnologija apibrėžė įvairių
technologijų, kai produktams gauti yra naudojimai gyvi organizmai, visumą. Pats terminas biotechnologija yra
sukurtas iš trijų graikų kalbos žodžių: bios – gyvybė, techne – menas, amatas, logos – mokslas. Šiandieninis
biotechnologijos apibrėžimas – tai integruotas gamtos ir technikos mokslų taikymas, kai panaudojant
organizmus, ląsteles, jų dalis ar molekulių analogus, kuriami žmogui naudingi produktai ir paslaugos.

Iš pirmo žvilgsnio, biotechnologijos apibrėžimas gali nuskambėti kaip labai naujo ir šiuolaikinio mokslo
apibūdinimas. Tačiau „biotechnologija“ toli gražu nėra XX a. išradimas – tai viena seniausių žmogaus veiklos
rūšių. Keli tūkstančiai metų prieš Kristų mūsų protėviai, naudodami mieles, pradėjo gaminti alų, vėliau –
rauginti duoną. Senosios technologijos, kurių dauguma paremtos fermentacijos procesu bei selekcija (alaus,
vyno, duonos gamyba, augalų, vedančių daugiau vaisių, atranka), yra vadinamos senąja arba klasikine
biotechnologija – biotechnologija iki genų inžinerijos atsiradimo.

XX a. prasidėjo moderniosios biotechnologijos era. Mokslininkai išsiaiškino, kad galima kurti naudingas
technologijas naudojant mažytes organizmo daleles – molekules. Pirmiausia – kiekvienoje gyvoje ląstelėje
esančią ir genetinę informaciją koduojančią deoksiribonukleorūgštį – DNR. Molekulinės biologijos mokslo
pasiekimai smarkiai pakeitė biotechnologijos sampratą, atsirado daug naujų galimybių jai vystytis. Modernioji
biotechnologija sulaukė didelio susidomėjimo, o jos įtaka pramonei ir žmonėms šiandien milžiniška.
Modernioji biotechnologija – tai technologijos, grindžiamos molekulinės biologijos žiniomis. Vienas iš
moderniosios biotechnologijos pavyzdžių – genų inžinerija. Tai – procesas, kai iš vieno organizmo genai
perkeliami į kitą, modifikuojami ir taip sukuriami naujomis savybėmis pasižymintys organizmai – augalai,
gyvūnai ar mikroorganizmai.

Šiandien biotechnologija yra neatsiejama kasdienio žmogaus gyvenimo dalis. Ji plačiai naudojama maisto
pramonėje (gaminant duoną, sūrius, vyną, alų, actą, jogurtą), medicinoje (gaminant vaistus, vakcinas,
diagnozuojant ligas), žemdirbystėje (kuriant tobulesnius augalus ir gyvūnus, kovojant su bado problema
pasaulyje), aplinkosaugos srityje (valant dirvožemį, vandenį, naikinant naftos teršalus) ir daug kur kitur.

Biotechnologija taikoma daugybėje skirtingų sričių. Todėl nenuostabu, kad ji remiasi daugelio mokslų –
mikrobiologijos, biochemijos, genetikos, chemijos, biologijos, fizikos, informatikos – žiniomis (1.1 lentelė).
Biotechnologijos vystymasis be mokslo pažangos nebūtų buvęs įmanomas.
 Mokslas Ryšys su biotechnologija
Žinios apie mikroorganizmus, jų sandarą, funkcijas, santykius su aplinka ir
Mikrobiologija žmogumi, gyvenimo sąlygas, įtaką gamtai, kultivavimo sąlygas, atsparumą
antibiotikams, sukeliamas ligas.
Genetika Žinios apie genus, jų funkcijas, paveldėjimą, genomus.
Žinios apie molekules, jų funkcijas, tarpusavio ryšį bei technologijas, įvairius
Molekulinė biologija
molekulinius įrankius, skirtus, pvz., darbui su DNR, baltymais.
Žinios apie molekules (baltymus, fermentus), jų sandarą, taip pat reakcijas,
Biochemija, chemija vykstančias ląstelėse ir už jų ribų, reakcijų sąlygas, mechanizmus ir jų
reguliavimą.
Įvairių prietaisų, skirtų biotechnologiniams produktams kurti, panaudojimas
Fizika
(lazerių, tėkmės citometrų, mikroskopų, spektrofotometrų ir kt.)
Duomenų rinkimas, apdorojimas ir analizė, sekų lyginimas, genomų analizė,
Informatika
programinė įranga.

1.1 lentelė. Biotechnologijos ryšys su kitais mokslais

1.2. Istorinė biotechnologijos vystymosi perspektyva ir reikšmė žmogaus gyvenimui bei visuomenės
raidai nuo Egipto civilizacijos laikų iki šių dienų

Tūkstančius metų žmonės naudojo biotechnologiją savo kasdieniame gyvenime apie tai net neįtardami.

Pirmieji žmonės žemėje buvo klajokliai – jie gyveno grupėmis ir nuolat keliavo iš vienos vietos į kitą,
ieškodami naujų, geresnių gyvenimo sąlygų. Taip pat, reikėjo surasti plotų, kur auga valgomi augalai, yra
gyvūnų, kuriuos galima medžioti. Ilgainiui žmonės pastebėjo, kad tam tikruose plotuose kiekvienais metais
būna valgomų augalų ir į tas vietas sugrįždavo. Tuometiniai žmonės grūdus kramtydavo, kiečiausius
pamirkydavo vandenyje. Vienas iš svarbiausių žingsnių žmonijos istorijoje buvo sėslaus gyvenimo pradžia.
Žmonės nustojo klajoti, apsistojo gyventi tam tikrose derlingose vietovėse ir pradėjo auginti augalus maistui.

Atsiradus nuolatiniam maisto šaltiniui, ne visiems žmonėms reikėjo rūpintis maistu. Atsirado darbų
pasidalijimas, o kartu ir daugiau laisvo laiko. Tad žmonės galėjo ilgiau mąstyti, planuoti, gerinti savo gyvenimo
sąlygas. Jie pastebėjo gamtos sezoniškumą, sugalvojo, kad dalį prisirinktų sėklų galima pasilikti kitiems
metams: sėti ir pasidėti atsargoms žiemai. Be to, žmonės ėmė savo reikmėms plačiai naudoti ugnį, kurti
įrankius, prisijaukino gyvūnus. Gyvūnų auginimas dar labiau palengvino gyvenimą. Jie buvo maisto šaltinis,
transportas, darbo jėga. Taip apie 4500 m. prieš Kristų prasidėjo civilizacija.

Biotechnologijos pradžia galima laikyti tuos senus laikus, kai žmonės išmoko auginti grūdus, veisti gyvulius.
Ankstyvosios (klasikinės) biotechnologijos ištakomis dažniausiai yra laikomas fermentacijos procesas, o
šiuolaikinės (moderniosios) – genų inžinerijos sukūrimas.

Iš daugybės didelių gyvūnų žmonės prisijaukino tik keliolika – santykinai nedaug. Tai ožkos, avys, karvės,
kiaulės, arkliai, kupranugariai, lamos, asilai ir dar keli (tiksliau – jų protėviai). Mažesnių gyvūnų rūšių žmonės
prisijaukino daugiau (katės, šunys). Svarbūs gyvūnų prisijaukinimo faktoriai:

 Suėdamas žolės kiekis. Tokių, kurie ėda labai daug arba tik išskirtinius augalus (koalos), auginti
neapsimokėjo.

 Gyvūno augimo greitis. Užsiauginti dramblį užtrunka daug ilgiau nei mažesnius gyvūnus.
  Dauginimosi būdas. Kai kuriems gyvūnams daugintis reikia ypatingų sąlygų – ritualų, didelių
plotų, daug laiko. Todėl šie gyvūnai taip pat netiko.

 Geras elgesys. Vieni gyvūnai yra ramesni, švelnesni – geresnio būdo. Jie prijaukinimui tinka
labiau nei agresyvios, sunkiai sukalbamos ir suvaldomos meškos, begemotai, zebrai.

 Reakcija į pavojų. Kai kurie gyvūnai pavojaus akimirką stovi ir nejuda, o kiti pabėga. Šie
gyvūnai prijaukinimui taip pat netiko (elniai, antilopės, gazelės).

 Tarpusavio bendravimas, hierarchija. Prisijaukinti lengviausia tuos gyvūnus, kurie gyvena

grupėmis, vieni šalia kitų, turi vadą, kurio klauso. Tokius gyvulius galima ganyti.

Gyvendami sėsliai ir turėdami daugiau laiko mąstyti, ilgainiui žmonės pastebėjo, kad kai kurie augalai yra
skanesni, duoda daugiau grūdų, kai kurių gyvulių pienas tinkamas maistui. Todėl dažniau augino būtent juos.
Taip prasidėjo selekcija. Žmonės sodinimui pasilikdavo daugiau ir skanesnės produkcijos duodančių augalų
sėklų, veisdavo labiausiai tam tinkamus gyvūnus. Dėl selekcijos, dauguma maistui naudojamų augalų ir
gyvūnų šiandien atrodo visai kitaip nei jų protėviai. Gamta ir aplinka kinta nuolat. Todėl nėra tokių augalų ir
gyvūnų, kurie nebekistų – jie ir toliau nuolat keičiasi, prisitaiko, nes negyvena idealiomis sąlygomis.

Ankstyvosios biotechnologijos (kaip atskiro mokslo) raida prasidėjo nuo fermentacijos atsiradimo. Nuo senų
laikų mūsų protėviai įvairiems maisto produktams gaminti naudojo fermentacijos procesą, nors apie jo
egzistavimą, kilmę, veikimo principą nieko nežinojo. Viskas buvo paremta tik ilgamete gyvenimiška patirtimi.
Pavyzdžiui, taip gaminamas alus, duona, jogurtas, sūris (1.2 lentelė).

Maisto gaminimo patirtis keliavo iš lūpų į lūpas. Skirtingų gamintojų, šeimų receptai mažai kuo skyrėsi, o jau
esamos gamybos technologijos buvo modifikuojamos retai ir nežymiai. Tais laikais biotechnologija buvo
daugiau menas nei mokslas. Yra duomenų, kad jau ~1600 m. pr. Kr. egiptiečiai alų naudojo kaip vaistą.
Archeologai spėja, kad tokia praktika siekia net 5000–10 000 m. pr. Kr. laikus. Alaus gamybos principas yra
panašus ir šiandien. Pasitelkus mieles, grūduose esantis krakmolas ir cukrus verčiami į alkoholį.

Vėliau buvo pradėta naudoti pienarūgštė fermentacija, kai pieno cukrus (laktozė) yra verčiamas į pieno rūgštį.
Šis procesas buvo naudojamas gaminant maisto produktus, konservuojant (jogurtas, sūris). Fermentacija buvo
naudojama ir gaminant raugintą duoną.

Fermentacijos esmę 1857 m. atskleidė garsus mikrobiologas Louis Pasteuras, kuris parodė, kad fermentacijos
procesus sukelia mikroorganizmai. 1860 m. šis mokslininkas sukūrė pasterizaciją – technologiją, kuri leidžia
sunaikinti mikroorganizmus. XIX amžiuje sparčiai besivystantis mikrobiologijos mokslas suteikė stiprų
impulsą biotechnologijos raidai. 1928 m. Aleksandras Flemingas atrado pirmąjį antibiotiką – peniciliną, kuris
vėliau buvo pradėtas gaminti kaip vaistas. Penicilinas pažabojo daugybę infekcinių ligų, atvertė naują
medicinos, farmacijos, biotechnologijos puslapį.

Metai Įvykis
Priešistorinis periodas Duonos gaminimas su raugu
Priešistorinis periodas Alkoholinių gėrimų gamyba fermentuojant sultis
Priešistorinis periodas Acto gamyba iš fermentuotų sulčių
2000 m. pr. Kr. Vyno gaminimas
III amžius pr. Kr. Alaus gaminimas Babilone ir Egipte
III amžius po Kr. Romos imperatorius Markas Aurelijus skatina vyno gaminimą
1150 m. Etanolio gamyba
XIV amžius Acto gamybos pramonė
 1818 m. Erxlebenas išaiškino mielių fermentacijos savybes
1857 m. Pasteuras aprašė pieno rūgšties fermentaciją
1897 m. Buchneris mielėse rado fermentaciją vykdančius fermentus
1928-1929 m. Flemingas atrado peniciliną
nuo 1945 m. Daugybės kitų antibiotikų atradimas

1.2 lentelė. Ankstyvosios biotechnologijos raida

Šiuolaikinės biotechnologijos mokslo pradžia yra siejama su DNR, jos struktūros nustatymu, technologijų,
skirtų modifikuoti DNR, sukūrimu.

1953 m. mokslininkai J. Watsonas ir F. Crickas pirmą kartą aprašė dvigrandinės DNR molekulės struktūrą.
1960-aisiais metais Werneris Arberis bakterijose surado specifiškai veikiančius restrikcijos fermentus, kurie
karpo DNR grandines tam tikrose tiksliose nukleotidų sekose. 1973-ieji metai yra laikomi genų inžinerijos
pradžia. Mokslininkai Stanley N. Cohenas (darbo su plazmidine DNR pradininkas) ir Herbertas W. Boyeris
(DNR modifikavimo fermentų atradėjas) sujungė savo žinias ir jėgas, sukūrė darbo su rekombinantine DNR
technologiją. Jie pirmieji parodė, kad DNR galima perkelti iš vieno organizmo į kitą. Taip jie inicijavo
moderniosios biotechnologijos pramonės vystymąsi (1.3 lentelė).

Šių mokslininkų atradimai sudarė sąlygas atsirasti naujai – rekombinantinei DNR technologijai, kuri dažnai
vadinama genų inžinerija. Kitas be galo svarbus biotechnologijų raidai žingsnis buvo žengtas 1977 m., kai
bakterijose E.coli buvo susintetintas pirmasis žmogaus baltymas – augimo hormonas somatostatinas. Šios
bakterijos buvo pirmasis genetiškai modifikuotas organizmas (GMO), gaminantis žmogaus baltymą! 1978-
aisiais metais, genų inžinerijos būdu gautose bakterijose sėkmingai buvo susintetintas žmogaus insulino
baltymas. Dar po 5 metų, jis tapo pirmuoju parduodamu biofarmaciniu produktu (GM produktu), skirtu
diabetui gydyti. 1980-aisiais m. Amerikoje buvo patentuotas pirmasis genetiškai modifikuotas organizmas
(GMO) – bakterijos, gebančios naikinti naftą. Tai buvo dar vienas didelis žingsnis į priekį biotechnologijos
vystymosi kelyje. Jis paskatino mokslininkus kurti naujoves! Iki tol gyvi organizmai nebuvo patentuojami.
Apie 2000-uosius m., kai buvo nusekvenuoti pirmieji organizmų genomai (atnešę labai daug naujos
informacijos), biotechnologijos taikymas dar labiau įsibėgėjo. Atsirado daugybė naujų technologijų, metodų,
prietaisų, produktų. Tokie darbai kaip genų karpymas, genomų modifikavimas, naujomis savybėmis
pasižyminčių organizmų kūrimas pasidarė nebe sudėtingi ir ilgai trunkantys darbai, o rutininės kasdienės
laboratorinės procedūros.

Metai Įvykis
Mokslininkai J. Watsonas ir F. Crickas pirmą kartą aprašė dvigrandės DNR molekulės
1953
struktūrą.
Mokslininkai Cohenas ir Boyeris sukūrė genų inžinerijos metodus, leidžiančius
1973 iškirpti ir klijuoti („cut and paste“) DNR molekules bei padauginti naujas DNR
molekules bakterijose.
1977 Bakterijose E.coli buvo pagamintas pirmasis žmogaus baltymas (somatostatinas).
1982 Rinkoje pasirodė pirmasis rekombinantinis baltymas (žmogaus insulinas).
1983 Sukurtas polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas.
Pradėtas žmogaus genomo projektas – didelis tarptautinis projektas, kurio tikslas –
1990
sužinoti žmogaus genomo nukleotidų seką.
1995 Nusekvenuotas pirmasis visas organizmo (Haemophilus influenzae) genomas.
2000 Nusekvenuotas žmogaus genomas.
Tarptautiniame genų banke „GenBank“ sukaupta daugiau kaip 40 milijonų genų sekų,
2005
šimtai prokariotų genomų sekų, dešimtys eukariotų genomų sekų.
 1.3 lentelė. Moderniosios biotechnologijos raida po DNR struktūros nustatymo

1.3. Maisto produktų (sūrių, duonos, fermentuotų gėrimų) klasikiniai gamybos procesai,
fermentacija ir rūgimas lietuvių tradiciniuose receptuose

Nuo seniausiųjų laikų įvairūs biotechnologiniai procesai buvo (ir tebėra) taikomi maisto produktų ir gėrimų
gamybai. Dauguma šių procesų senųjų civilizacijų buvo atrasti visiškai atsitiktinai. Vėliau žmonės sukaupta
patirtimi ir žiniomis dalijosi tarpusavyje. Taip informacija apie įvairius maisto gamybos būdus paplito po visą
pasaulį. Tad šiandien duonos, sūrio, jogurto ar alaus galima nusipirkti beveik kiekviename pasaulio kampelyje.

Senovės žmonės, prisijaukinę gyvulius, pastebėjo, kad žinduolių pienas yra skanus ir maistingas. Ilgainiui
tokius gyvulius jie ėmė laikyti būtent dėl pieno. Kalnuotose vietovėse buvo laikomos ožkos, o lygumose karvės
– jos duoda daugiau pieno. Žmonės pastebėjo, kad primelžtą pieną reikia greitai suvartoti. Jei pienas
nesuvartojamas ir paliekamas stovėti, į jį iš aplinkos patenka bakterijų. Jos pieno cukrų – laktozę paverčia į
pieno rūgštį, todėl pienas tampa rūgštus. Rūgštis denatūruoja pieno baltymus, pakinta pieno konsistencija.
Priklausomai nuo to, kokios bakterijos pateko į pieną, gaunami skirtingi rūgštaus pieno produktai – jogurtas,
sūris (1.1 pav.). Mūsų aplinkoje (ore, vandenyje, dirvoje, ant odos, gyvulių, augalų) gyvena daugybė įvairių
bakterijų. Vienos bakterijos yra nepavojingos, tačiau yra ir tokių, kurios gali išskirti toksinus, sukelti ligas,
užkrėsti maistą. Taip pat yra ir naudingų bakterijų, kurios plačiai naudojamos maistui gaminti. Naudingosios
bakterijos dažniausiai gyvena dirvoje, vandenyje. Jos skaido augalinės ir gyvūninės kilmės medžiagas, taip
išlaisvindamos maisto medžiagas atgal į medžiagų apykaitos ciklus.

1.1 pav. Egipte kape rastas piešinys, kuriame vaizduojamas sūrio gaminimo procesas

Sūris. Jis iš pieno gali būti gaunamas tada, jei į pieną patenka Streptococcus, Lactobacillus ar Leuconostoc
bakterijos. Šios bakterijos fermentuoja pieną: laktozę verčia pieno rūgštimi. Padidėjus pieno rūgštingumui,
pieno baltymai koaguliuoja, gaunamas rūgpienis. Šis vėliau „sutraukiamas“ – gaunama varškė ir išrūgos.
Varškė nusunkiama ir naudojama sūrio gamybai. Iš švelniai nusunktos varškės galima gaminti baltą varškės
sūrį (pasaulyje jis vadinamas minkštu sūriu), o iš labai gerai nusausintos varškės (ją suspaudus ir brandinant)
yra gaunamas kietesnis sūris (dar vadinamas fermentiniu, olandišku ar geltonuoju) (1.2 pav.).

Geltonasis sūris pasaulyje yra daug labiau paplitęs nei baltasis. Jam gaminti naudojamas renetas – fermentų
chimozino ir pepsino mišinys. Šie fermentai sukelia pagrindinio pieno baltymo – kazeino koaguliaciją.
Anksčiau šie fermentai buvo gaunami iš neatjunkytų veršiukų skrandžių. Dabar, pasitelkus genų inžineriją, jie
yra gaminami bakterijų ir naudojami geltonųjų sūrių gamyboje. Senais laikais, kai sūris buvo gaminamas
namuose ir niekas nemokėjo auginti bakterijų, naujam sūriui gaminti žmonės pasilikdavo gabalėlį seno sūrio
– tai būdavo reikiamų bakterijų šaltinis.

Baltas varškės sūris yra vienas iš tradicinių lietuvių patiekalų. Mūsų močiutės sūrį gamindavo iš rūgpienio.
Rūgpienį pakaitindavo, gaudavo varškę, ją nusunkdavo, pridėdavo druskos, kmynų, gautą masę supildavo į
sūrmaišius ir suslėgdavo. Gamindamos saldų sūrį, šeimininkės į rūgpienį įpildavo šviežio saldaus pieno.

Geltonųjų sūrių yra daugybė rūšių, tačiau jie visi gaminami panašiai. Pirmiausia pienas pakaitinamas tam, kad
žūtų visi jame esantys mikroorganizmai. Paskui pridedama bakterijų kultūros, į kurią įeina laktozę
fermentuojančios bakterijos bei renetas. Po šio žingsnio gaunama varškė ir išrūgos. Sūrio gamybai toliau reikia
tik varškės, todėl ji yra nusunkiama – atskiriama nuo išrūgų. Varškė pasūdoma (jei reikia) ir spaudžiama į
specialias formas, kurios suteiks sūriui formą. Sūris padengiamas plastiko plėvele arba vašku – taip
užtikrinama, kad ant sūrio neapsigyventų nepageidaujami mikroorganizmai iš aplinkos. Paruoštas sūris
brandinamas – paliekamas stovėti tam tikromis sąlygomis, kurios yra specifinės skirtingoms sūrių rūšims.
Brendimo metu, dėl esančių mikroorganizmų, sūryje toliau vyksta cheminiai pokyčiai. Jie pagerina ir
sustiprina sūrio skonį: pieno baltymai yra skaldomi į peptidus, riebalai – į riebalų rūgštis, atsipalaiduoja
tioesteriai (kurie suteikia sūriui specifinį aromatą). Gaminant kai kurias sūrių rūšis naudojamos ne tik
bakterijos, bet ir įvairūs grybai, suteikiantys kiekvienam sūriui ypatingą ir išskirtinį skonį bei kvapą. Pvz.,
gaminant Camembert sūrį, jo paviršius yra apipurškiamas Penicillium camemberti sporomis, o gaminant
mėlynąjį pelėsinį rokforą, į varškę specialiomis adatomis įterpiamas Penicillium roqueforti grybas.

Baltasis varškės sūris Geltonasis fermentinis sūris

Camembert sūris Rokforo sūris

1.2 pav. Įvairių rūšių sūriai

Varškė – sutrauktas pienas be dalies išrūgų, yra gaminama iš pasterizuoto, nenugriebto arba lieso karvės pieno.
Tai – baltymingas rauginto karvių ar kitų gyvulių pieno produktas, gautas surauginus pieną. Pienas rauginamas
pridėjus grynų pieno rūgštį gaminančių bakterijų kultūrų arba kartu su grynųjų kultūrų raugu pridėjus pieną
sutraukiančių fermentų, kalcio chlorido ir pašalinus dalį išrūgų.
Nuo senų laikų lietuviai varškę namuose darydavo taip: rūgęs pienas arba rūgusio ir saldaus pieno mišinys
pašildomas, o sutraukti pieno baltymai sudedami į drobinį maišelį arba kiaurasamtį nuvarvėti.

Legenda apie varškę

Seniai seniai, prieš tūkstančius metų, vienas piemuo, pasibaigus namuose mėsai, išsiruošė į mišką
medžioti elnių. Piemens motina, norėdama, kad sūnus turėtų maisto medžioklėje, sugalvojo jam į kelionę
įdėti pieno. Kadangi sandarių indų tais laikais nebuvo, motina pripylė sūnui pieno į krepšį, pagamintą iš
ožkos skrandžio. Medžiodamas piemuo neišalko, tad prasinešiojęs krepšį ant pečių parsinešė jį kartu su
sumedžiotu laimikiu atgal į namus. Piemens motina, atidariusi krepšį, liko maloniai nustebusi. Mat
krepšyje ji rado ne pieną, o varškę, kuri pasirodė esanti naujas ir labai skanus maisto produktas!

Natūralios naminės varškės receptas

Norint pasigaminti natūralios naminės varškės, jums reikės:

 500 ml nenugriebto šviežio pieno,

 50 ml pasukų,
 Pieno miltelių (dėti nebūtina).

Jums taip pat reikės indo kaitinimui, šaukšto maišymui, viryklės, rėčio/sietelio, marlės ar sūrmaišio
(varškei nusunkti), termometro.

Gamybos procesas

Pirmadienis

 Švariai nusiplaukite rankas, išplaukite indus, kuriuos naudosite varškei gaminti.

 Į indą, kuriame gaminsite varškę, supilkite nenugriebtą pieną ir pašildykite iki +37 °C.
 Supilkite pasukas ir gerai viską išmaišykite.
 Šiuo momentu taip pat galite įdėti ir pieno miltelių.
 Uždenkite indą medžiaga (pvz., lininiu rankšluosčiu) ir laikykite šiltai 25–35 °C
temperatūroje, galima ir kambaryje, ~48 valandas – tol, kol susidarys varškė ir išrūgos.

Trečiadienis

 Į sietelį/rėtį įklokite dvigubą marlę ir nusunkite varškę arba panaudokite sūrmaišį.

 Sūrmaišį arba marlę užriškite ir palikite kaboti per naktį (kad visiškai išvarvėtų išrūgos),
geriausia šaldytuve.

Ketvirtadienis

 Į varškę galima pridėti prieskonių, druskos, žolelių, ir vėl laikyti šaldytuve per naktį. Arba
tiesiog toliau palikti šaldytuve.

Penktadienis

 Skanaus!
Rūgpienis – rūgštoko arba saldžiarūgščio skonio, pieniškai baltos (arba kreminės su rausvu atspalviu spalvos),
standžios konsistencijos, be oro purslų surūgęs pienas. Lietuvoje valstiečiai jį valgė nuo seno. Iki XX a.
vidurio, jie pieną raugindavo daugiausia puodynėse, vėliau – fabrikinės gamybos induose. Žemaičiai pasninko
metu į rūgpienį dėdavo keptų silkių. Per gavėnią valstiečiai darydavo piltinį arba sampilinį: nugriebę grietinę
ir nupylę išrūgas, rūgpienį supildavo į kubiliuką, uždengdavo ir laikydavo per žiemą. Iki I Pasaulinio karo,
piltinį pieną valgydavo ankstyvą pavasarį ir per vasaros darbymetį.

Pramoniniu būdu rūgpienis gaminamas iš pasterizuoto (arba sterilizuoto) nenugriebto arba lieso karvės pieno.
Jis surauginamas grynomis pieno rūgšties streptokokų kultūromis. Namų ūkyje, pienas surūgsta laikomas šiltai
(jį suraugina pieno rūgšties ir kitos rūgimą sukeliančios bakterijos, kurių yra piene).

Pasukos – skystis, kuris lieka sumušus sviestą arba gaminant grietinėlę. Pasukos priklauso raugintų pieno
produktų grupei. Apie pasukų naudojimą maistui Mažojoje Lietuvoje rašė lietuvių literatūros pradininkas
Kristijonas Donelaitis. XIX a. pabaigoje – XX a. I pusėje aukštaičiai šviežias pasukas valgydavo su sausai
virtomis ar troškintomis bulvėmis, bulvių koše, pildavo į šaltibarščius, gerdavo vietoj vandens, kartais
supildavo į rauginamą pieną. Žemaičiai pasukomis parūgštindavo bulvienę ir kitas sriubas, dzūkai
užmaišydavo miltines bandas. Dalį pasukų sušerdavo kiaulėms.

Kefyras – rūgštus skystas pieno produktas, gaunamas rauginant karvių pieną natūraliu kefyro grybų raugu,
kuriame yra pieno ir acto rūgšties bakterijų, pieno mielių. Kefyro istorija susijusi su Kaukazu: Kaukazo
gyventojams šio produkto gamybos paslaptį atskleidė pranašas Mahometas. Dažniausiai kefyras būdavo
gaminamas iš karvių ar ožkų pieno. Rauginimo procesas beveik nenutrūkdavo – nupylus pagamintą kefyrą,
odiniai maišai vėl būdavo pripilami šviežio pieno ir gamyba tęsdavosi. Pasak legendos, vienas Kaukazo
kunigaikštis pavogė rusę merginą. Rusijos vyrai stojo ginti savo tėvynainės, pasodino įsimylėjusį kunigaikštį
į kalėjimą ir išleido iš ten tik mainais į belaisvę ir 10 svarų kefyro grybo. Nuo to laiko, kefyras bei kiti rauginto
pieno produktai užima deramą vietą ir ant kitų tautų stalo.

Kefyras nuo rūgpienio skiriasi tuo, kad jo fermentacijos metu veikia ne tik rūgimą skatinančios bakterijos, bet
ir tam tikri pelėsių grybeliai. Jie sukelia alkoholinį pieno cukraus (laktozės) rūgimą. Kefyras gaminamas
naudojant kefyro grybo raugą, kurį sudaro pieno rūgšties bakterijos, pieno mielės ir polisacharidai. Todėl jo
skonis yra šiek tiek aštresnis nei rūgpienio. Kefyro rūgimo procesas trunka apie 24 valandas. Per tą laiką
bakterijos ir mielės paverčia pieną į rūgštų gėrimą. Kefyras populiarus Europos šalyse ir Artimuosiuose
Rytuose. Jis gerai žinomas Švedijoje, Norvegijoje, Suomijoje, Vengrijoje, Lenkijoje, Vokietijoje, Graikijoje,
Austrijoje, Izraelyje ir Brazilijoje.

Jogurtas – puskietis rūgštaus pieno produktas, kuriam būdinga švelni konsistencija ir truputį rūgštokas skonis.
Jogurtas iš šviežio pieno gaunamas tada, kai piene simbiotiškai gyvena dvi bakterijų kultūros – Streptococcus
thermophilus ir Lactobacillus bulgaricus. Pirmiausiai piene pradeda augti S. thermophilus bakterijos, kurios
gamina metano rūgštį ir CO2 – taip sudaroma reikiama aplinka L. bulgaricus bakterijų augimui. L. bulgaricus
išskiriami proteolitiniai fermentai skaldo pieno baltymus į peptidus, kurie skatina S. thermophilus augimą. Dėl
bakterijų veiklos piene vyksta cheminiai pokyčiai – L. bulgaricus pieno cukrų laktozę paverčia į pieno rūgštį,
abejos bakterijos gamina etanolį. Susidarius pieno rūgščiai, pieno pH nukrinta iki 4,2–4,4. Pieno rūgštis sukelia
pieno baltymų koaguliaciją, iš skysto pieno gaunamas tirštos konsistencijos jogurtas. Be to, rūgštinis pH atlieka
ir apsauginę funkciją – neleidžia jogurte apsigyventi kitų rūšių bakterijoms. Etanolis suteikia šviežiam jogurtui
charakteringą skonį.

Jogurto maistinė vertė yra tokia pati kaip pieno, tačiau jis lengviau virškinamas. Tai – baltymų, kalcio, kalio
ir magnio šaltinis. Jogurtas negali būti vadinamas jogurtu, jeigu jis buvo termiškai apdorotas. Be būtinųjų
bakterijų, jogurtui gaminti gali būti naudojamos ir kitos (turi būti nurodoma ant pakuotės).

Natūralaus naminio jogurto receptas

 Norint namuose pasigaminti natūralaus jogurto, jums reikės:

 Šviežio pieno,
 Pieno miltelių (jie suteikia jogurtui tirštesnę konsistenciją, dėti nebūtina),
 Natūralaus jogurto, į kurio sudėtį įeina gyvos bakterijos (pasterizuotas jogurtas netinka).

Pastaba! Paprastai natūralaus jogurto su gyvomis bakterijomis tinkamumo vartoti terminas yra trumpas.
Jei jogurtas tinkamas vartoti mėnesį ar ilgiau – jame gyvų bakterijų neturėtų būti.

 Uogienės, vaisių, cukraus (tuo atveju, jei mėgstate saldų jogurtą). Dėti nebūtina.

Jums taip pat reikės viryklės, šaldytuvo (ar ledo ir vandens vonios), termometro, termoso ar kokio nors
kito indo, kuris palaikytų pastovią temperatūrą.

Gamybos procesas

 Į indą, kuriame gaminsite jogurtą, įpilkite 2 puodelius pieno.

 Pridėkite 60–80 g pieno miltelių (jeigu norite tirštesnio jogurto). Gaminant geriamą jogurtą,
pieno miltelių dėti nereikia. Jeigu mėgstate saldų jogurtą, galite papildomai įdėti cukraus.
Išmaišykite.

 Pakaitinkite pieną iki +85 °C. Jei neturite termometro, pieną kaitinkite tol, kol jo paviršiuje
ims darytis putos. Šio žingsnio metu yra denatūruojami pieno baltymai, sunaikinamos
bakterijos (jei tokių piene buvo), iš pieno pašalinamas jame ištirpęs oras.

 Greitai atšaldykite pieną iki 40–45 °C (šaldytuve ar ledo vonioje).

 Švariu šaukštu įdėkite 1 šaukštą jogurto, kuris turi gyvų bakterijų (1 mažas indelis jogurto
litrui pieno), gerai išmaišykite.

 Supilkite pieną į termosą ar kitą indą. Jame turi būti palaikoma pastovi +42 °C temperatūra.

 Laikykite 3–6 valandas. Per šį laiką jogurtas turi sutirštėti. Laikykite tol, kol gausite norimo
tirštumo ir skonio jogurtą.

 Kai jogurtas sutirštės, atšaldykite jį.

 Į atšaldytą jogurtą (jeigu mėgstate) galite įpjaustyti vaisių, įmaišyti uogienės ar įdėti
cukraus.

Sėkmės ir skanaus!

Pastaba! Jei nei po 6 valandų (nei po 12 ar 24 valandų) pienas nesutirštėjo, vadinasi, jūsų gaminamame
jogurte nėra gyvų bakterijų. Arba nusipirkote pasterizuotą jogurtą, kuriame nebuvo gyvų bakterijų, arba
sudėjote jogurtą į per karštą (>45 °C) pieną ir jogurte buvusios bakterijos žuvo.

Išrūgos – rūgusio pieno skystimas. Išrūgos gaunamos gaminant varškę ir sūrius. Net ir apdorojus nekokybišką
pieną, gaunamos kokybiškos išrūgos, kurias labai gerai pasisavina žmogaus organizmas. Tai mažiausiai
kalorijų turintis pieno produktas, tačiau jo biologinė vertė didžiausia.
Išrūgos yra plačiai naudojamos įvairių maisto produktų gamybai. Jas naudojant gaminama gira, kisielius,
šampanas, kumysas, valgomieji ledai, varškė, sūreliai, rūgštūs gėrimai, vaikų ir dietiniai produktai, įvairūs
pusgaminiai (milteliai, rūgščios kondensuotos išrūgos – pieno desertams gaminti ir konditerijos pramonei,
hidrolizuotos kondensuotos išrūgos – lydytų sūrių gamybai, konditerijos bei duonos kepimo pramonei, išrūgų
ir kiaušinių koncentratas).

Iš išrūgų taip pat gaminami kaitinti bei išrūgų sūriai. Kaitinti sūriai spaudžiami iš išrūgų, suraugintų
specialiomis bakterijomis, veikiant aukštai temperatūrai. Tai – itališka rikota (Ricotta), gaminama iš ožkos,
avies, karvės pieno. Šis sūris labai švelnaus skonio, pastos tirštumo. Graikijoje tokios rūšies sūris (Mitzithra)
gaminamas iš pieno ir išrūgų, vartojamas šviežias arba džiovintas.

Norvegijoje gaminamas pikantiškas rudasis išrūgų sūris „Ekte Geitost“. Kaitinamos išrūgos tirštėja, keičiasi
jų spalva, o mišinys pasidaro salsvai karamelinio skonio (šios rūšies sūriai Norvegijoje gaminami ir iš karvės
pieno) (1.3 pav.).

Išrūgos – Rikota – Norvegiškas rudasis

surūgusio pieno skystimas iš išrūgų gaminamas sūris išrūgų sūris

1.3 pav. Išrūgos – sveikas ir vertingas surūgusio pieno skystimas, iš kurio gaminami visame pasaulyje
žinomi skanūs sūriai – rikota, norvegiškas rudasis išrūgų sūris.

Tofu – sojų pupelių varškė, gaminama iš sojų pieno. Į sojų pieną pridedama koaguliantų, kurie sutraukia pieno
baltymus, ir gaunama varškė. Tofu (priklausomai nuo to, kokie koaguliantai buvo naudojamai) gali būti
minkštas, kietas arba „šilkinis“ (itin minkštas ir švelnus). Kaip koaguliantus naudojant druskas (kalcio sulfatą,
kalcio chloridą, magnio chloridą, kalio chloridą), yra gaunamas kietas tofu. Naudojant įvairias maistines
rūgštis – gaunamas minkštas (želė konsistencijos), o naudojant fermentus (papainą) gaunamas šilkinis tofu.
Tofu valgomas taip pat kaip ir kiti sūriai – jis tinka saldiems desertams, kremams gaminti, gali būti kepamas,
džiovinamas, patiekiamas su salotomis. Tofu yra puikus baltymų šaltinis žmogaus organizmui. Jame mažai
riebalų, yra geležies, kalcio, magnio. Tofu kilo iš Kinijos, tačiau labai greit išpopuliarėjo Azijoje (mat ten daug
budistų, kurie paprastai yra vegetarai), o vėliau ir visame pasaulyje.

Duona. Kepti duoną žmonės išmoko labai seniai. Egipte archeologams pavyko rasti net 3500 m. pr. Kr. keptos
raugintos duonos gabalėlių! Lietuviams žodis „duona“ pirmiausiai asocijuojasi su juoda rugine duona. Tačiau
įvairiose pasaulio šalyse duona yra skirtinga. Lietuviai, rusai, vokiečiai, skandinavai mėgsta juodą ruginę
duoną, amerikiečiai – baltą kvietinę, škotai duoną kepa iš avižinių, miežinių miltų, Indijoje iš sorų miltų,
Azijoje iš ryžių miltų. Vienos tautos kepa storus duonos kepalus, kitos – plonyčius paplotėlius (1.4 pav.).
 1.4 pav. Įvairios duonos rūšys: juoda, šviesi, balta ir indiška duona

Lietuvoje duona vartojama nuo pirmųjų amžių po Kristaus. Lietuvos kaime ruginė duona iki XX a. vid. buvo
pagrindinis valgis, o nuo XIX a. vid. (greta jos) paplito ir bulvės. Baudžiavos laikais, valstiečiai duoną kepdavo
iš nevėtytų grūdų miltų (bėralo), todėl ją vadino bėraline duona. Grynų rugių duoną kepdavo tik šventėms.
Panaikinus baudžiavą, bėralinė duona iš valstiečių buities išnyko. XIX a. antroje pusėje ir per I Pasaulinį karą,
į tešlą būdavo primaišoma kitų javų ar kitų augalų miltų.

Duona buvo kepama paprasta arba plikyta. Duonos miltai išmaišomi duonkubilyje (Aukštaitijoje) ar
mediniame lovyje (Žemaitijoje). Paprastai, miltai duonai būdavo įmaišomi į drungną vandenį, o per naktį
rauginami. Rytojaus dieną, pridėjus miltų, tešla būdavo išminkoma ir kepama. Plikytai duonai, miltus
įmaišydavo į karštą vandenį, o tešlą raugindavo iki 3 dienų. Ši duona buvo saldžiarūgščio skonio ir ne taip
greit sendavo. Tešlą įraugdavo nuo ankstesnio kepimo tešlos palikto raugo gabalėlio. Pirmasis kepimo būdas
buvo senesnis ir labiau paplitęs, antrasis būdas daugelyje vietų paplito XX a. pirmaisiais dešimtmečiais. Į
duoną dėdavo prieskonių, druskos ir kmynų. Kepalus darydavo didelius, pailgus ar apskritus. Duona būdavo
kepama žarijų krosnyse ant ližės paklojus klevo, krienų lapų, ajerų, kopūstlapių ar pabarsčius miltų. Lietuvos
kaime XX a. buvo žinoma ir pikliuota duona. Ji būdavo kepama tik didžiausioms šventėms. Pikliuota duona
kepama iš pikliuotų (labai šviesių, smulkiai maltų) miltų.

Pagrindiniai duonos komponentai yra miltai, vanduo (ar pienas), druska, cukrus ir mielės.

 Miltai. Duonai kepti daugiausiai naudojami kvietiniai miltai, kuriuose gausu gliutenų – baltymų,
suteikiančių tešlai elastingumo. Kai gliutenai yra hidratuojami, įvyksta cheminiai jų pakitimai. Tešla
tampa elastinga, sulaiko mielių išskiriamas CO2 dujas – burbuliukus, iškeliančius tešlą ir darančius
duoną minkštą. Duonos gamybai tinka ir įvairių kitų, mažiau gliutenų turinčių, grūdų miltai.

 Vanduo. Tai skystas duonos komponentas, kuris hidratuoja gliutenus, sujungia visus sausus
komponentus į vieną visumą – tešlą.
  Druska. Druska ne tik suteikia duonai skonio, bet ir sukietina gliutenus. Todėl tešla tampa ne tokia
lipni. Kadangi druska lėtina fermentacijos procesą, dažniausiai jos į tešlą yra pridedama vėliau – jau
po fermentacijos.

 Cukrus. Cukrus suteikia duonai skonio, tačiau pagrindinė jo funkcija – maistas mielėms.

 Mielės. Dėl mielių, iš sausų duonos ingredientų ir vandens gaunama minkšta lipni tešla. Iš jos ir yra
kepama duona. Mielės skaldo tešloje esantį cukrų į etanolį ir CO2 dujas, kurių burbuliukai suminkština
ir iškelia tešlą. Šis procesas vadinamas duonos rauginimu.

 Vitaminas C. Šiais laikais, kepant duoną, dažnai yra dedama ir vitamino C. Jis daro tešlą elastingesnę.
Taip galima sutrumpinti duonos rauginimo laiką.

 Į duoną dedama ir kitų ingredientų, kurie pagerina jos skonį (kmynai, grūdai) ar pailgina vartojimo
terminą. Nugriebto pieno milteliai pagerina duonos maistinę vertę ir skonį. Riebalai (sviestas ar
aliejus) suminkština tešlą, ją tampa lengviau minkyti. Tešloje nelieka trupinių, duona ilgiau išlieka
šviežia. Kepant duoną kepyklose, į tešlą gali būti papildomai dedama medžiagų, minkštinančių duoną,
stiprinančių ir greitinančių rauginimą, slopiklių, neleidžiančių augti pelėsiams. Taip pailginamas
duonos vartojimo terminas. Taip pat gali būti pridedama vitaminų, mineralų – padidinama duonos
maistinė vertė.

Kaip gaminama duona?

Pirmiausia sumaišomi visi sausi ir šlapi duonos komponentai. Miltuose esantys gliutenai yra
hidratuojami, vyksta fizikiniai ir cheminiai gliutenų pokyčiai. Jie sulimpa į gliutenų fibriles,
gaunama minkšta, švelni, elastinga tešla. Tešlą reikia gerai, tolygiai išminkyti, kad ji galėtų gerai
kilti. Paskui tešla paliekama rūgti. Tam palankiausia ~27 °C temperatūros drėgna aplinka. Tuo metu
didžiausias darbas tenka mielių ląstelėms, kurios minta cukrumi, o mielių fermentai katalizuoja
cukraus skilimą į etanolį ir CO2 (fermentacijos procesas). CO2 dujų burbuliukai įstringa lipnioje ir
elastingoje tešloje – tešla iškyla, padidėja jos užimamas tūris. Mielių proteolitiniai fermentai skaldo
gliutenus, todėl tešla tampa minkštesnė, puresnė. Dėl tešlos rauginimo duona tampa skanesnė,
minkštesnė, lengviau virškinama. Pakilusi tešla išminkoma, kad pasišalintų patys didžiausi burbulai
ir iškeptos duonos kepaluose nebūtų didelių skylių. Paskui formuojami tešlos kepalai. Jie dar kartą
paliekami pakilti. Pakartotinai pakilusi tešla yra kepama. Kepimo metu žūsta mielių ląstelės,
išgaruoja etanolis, sustabdomos visos fermentinės reakcijos, duonos komponentai iškepa.
Alus pasaulyje yra gaminamas ir geriamas nuo labai senų laikų. Pirmieji rašytiniai šaltiniai apie šį gėrimą yra
8000 metų senumo, iš Babilono bei Egipto. Alus dažniausiai gaminamas iš miežių, kuriuose yra daug krakmolo
ir baltymų. Miežiai pamerkiami į vandenį ir laukiama, kol jie ims dygti. Dygimo proceso metu, fermentai
skaldo krakmolą ir baltymus. Taip paruošiamos maisto medžiagos mielių ląstelėms, kurios toliau vykdys
fermentaciją. Fermentacijos proceso metu, fermentas maltazė verčia krakmolą į cukrų maltozę, o proteazės –
baltymus į aminorūgštis.

Paskui grūdai pakaitinami tiek, kad būtų sustabdytas dygimas, bet kad nebūtų denatūruojamos amilazės. Taip
gaunamas miežių salyklas. Tada grūdai rupiai sumalami ir užpilami karštu vandeniu. Vanduo yra
nufiltruojamas. Gaunamas maisto medžiagų turtingas grūdų ekstraktas – misa. Į misą pridedama apynių ir
pakaitinama. Apyniai suteikia alui kartų skonį, jie taip pat turi antiseptinių savybių. Kaitinimas ne tik
sterilizuoja skystį, bet ir padeda ekstrahuoti taninus, skonio komponentus. Į gautą skystį pridedama alaus
mielių, kurios vykdo fermentaciją. Po 5–7 dienų, mielių ląstelių nuosėdos pašalinamos, gaunamas skaidrus
skystis. Galiausiai alus pasterizuojamas 60 °C temperatūroje, kad žūtų visos mielių ląstelės (jei tokių dar buvo
likę). Paskui jis atšaldomas ir filtruojamas. Atšaldyti alų reikia tam, kad į nuosėdas iškristų ir filtravimo metu
iš alaus būtų pašalinami baltymai.
Vynas tradiciškai yra gaminamas iš vynuogių sulčių. Raudonasis vynas gaminamas iš tamsių vynuogių su
odele, o baltasis – iš šviesių vynuogių, dažniausiai be odelės. Vynuogių sultys supilamos į talpyklas, kuriose
(veikiant sieros dioksidu) sunaikinami visi sultyse esantys mikroorganizmai. Paskui yra pridedama mielių,
kurios vynuogių sultis fermentuoja – jos virsta vynu. Po fermentacijos vynas nuskaidrinamas, pakaitinamas,
brandinamas ir galiausiai išpilstomas į butelius. Kai kurie vynai toliau brandinami buteliuose.

Vyno gamyba yra tarsi atskira meno rūšis. Kiekvienas vyndarys turi savo paslapčių, kokias vynuoges kur ir
kaip auginti, kaip su jomis elgtis. Sakoma, kad iš uolėtoje dirvoje užaugusių vynuogių gaunami „įdomesni“,
kompleksiško skonio vynai. Kai kurie vyndariai vynuoges skina būtinai prieš saulėlydį (kad sumažintų uogose
esančių fermentų aktyvumą iki kol uogos bus sutraiškytos).

Gira – gėrimas, gaminamas rauginant giros misą mikroorganizmų kultūrų raugu. Po rauginimo pridedama
(arba ne) cukrinių ir kitų maisto žaliavų bei maisto priedų. Giroje alkoholio koncentracija turi neviršyti 1,2
tūrio proc. Giros misa – tai iš duonos džiūvėsių ir/ar kitų grūdinių produktų ekstrakto gaunamas ekstrakcinių
medžiagų tirpalas. Jį taip pat galima gauti iš giros misos koncentrato arba iš vaisių, daržovių. Į šį tirpalą
pridedama cukraus.

Jau gilioje senovėje mūsų protėviai malšindavo troškulį gira. Tai buvo skalsus ir populiarus baltų gėrimas.
Jokia pagoniška šventė, vestuvės ar krikštynos neapsieidavo be gaivinamosios giros moliniame ąsotyje.
Močiučių pagaminta gira iš duonos, džiovintų obuolių, klevo ar beržo sulos būdavo saldesnė už medų!

Gira gaminama iš natūralių žaliavų – duonos džiūvėsėlių, o šie – iš ruginio salyklo. Ruginiai paplotėliai papildo
produktą biologiškai vertingomis medžiagomis – mono- ir disacharidais, aminorūgštimis, fermentais.
Natūralios kvapiosios medžiagos suteikia gėrimui saldžiai rūgštoko skonio bei subtilaus aromato, primenančio
kaime kepamos duonos skonį ir kvapą.

Senovėje lietuviai labiausiai mėgo tradicinę girą iš ruginių miltų. Į puodą su šiltu vandeniu jie įplakdavo
ruginių miltų ir pašaudavo porai valandų į karštą krosnį. Paskui viską supildavo į kubiliuką, įpildavo šilto
vandens (kartais įdėdavo ir raugintų batvinių) ir raugindavo. Įrūgusią girą apdengdavo ir laikydavo porą
savaičių. Tokią girą gerdavo ar naudodavo šaltibarščiams.

Girą raugdavo ir žiemai. Į beržines ar liepines statines sudėdavo vaisius ir, užpylę vandeniu, palikdavo 3–5
dienas įrūgti. Tuomet ant viršaus uždėdavo švarių šiaudų, avižinių pelų, o ant jų – avižų ar rugių grūdų. Šie po
kelių dienų suželdavo. Peraugusius želmenis nupjaudavo. Taip kartodavo kelis kartus, kol grūdai nustodavo
želti. Tuomet sėdavo naujus. Taip prižiūrint, vaisių gira išstovėdavo visus metus. Šiais laikais, gaminant
naminę girą, į puodą dedama džiovintų duonos riekelių, šiek tiek cukraus, mielių ir rauginama.

Sidras – nestiprus putojantis šviesios šiaudų ar gelsvai žalsvos spalvos, skaidrus obuolių (rečiau – kriaušių)
vynas iš fermentuotų sulčių. Manoma, kad putojantis gėrimas iš obuolių buvo pradėtas gaminti 7500 m. prieš
Kristų. Tuomet tradicinis sidras buvo gaminamas tik iš obuolių sulčių, be mielių ir vandens. Pirmą kartą
rašytiniuose šaltiniuose sidras paminėtas 55 m. pr. Kr., kai du Julijaus Cezario vadovaujami romėnų legionai
atvyko į Angliją. Neįprastas gėrimas, populiarus Anglijoje, labai patiko Cezariui. Jo dėka, obuoliai ir sidras
paplito visoje Romos imperijoje. Romėnams užkariavus Angliją, daugelis anglų pabėgo į Normandiją, esančią
Prancūzijos šiaurės vakaruose. Kartu su anglais ten nukeliavo ir sidras.

Tradicinis sidras – alkoholinis gėrimas, gaunamas fermentuojant šviežias rūgščių ir aitrių obuolių sultis.
Sultyse antrinės fermentacijos metu susidaro angliarūgštė. Pagal tradicinį metodą, sidras gaminamas ne tik iš
šviežių obuolių, bet ir iš kriaušių, vanilės ir kitų mišinių. Sidro gamybai naudojamos specialios obuolių rūšys
– obuoliai dažniausiai būna karčiai saldūs arba karčiai rūgštūs. Šių rūšių obuoliai turi didelį kiekį taninų ir yra
panašūs į laukinius obuolius. Taip pat obuoliuose yra daug cukraus. Jis reikalingas, kad vyktų sulčių
fermentacija. Sidro gamintojai dažniausiai naudoja minėtų dviejų obuolių rūšių sulčių mišinį. Kartais į šį mišinį
dar papildomai pridedama laukinių obuolių sulčių, kad būtų išgautas kuo įvairesnis ar netradicinis gėrimo
skonis.
Obuoliai plaunami vandens srove, apliejami šaltinio vandeniu ir džiovinami. Paskui iš jų išspaudžiamos
išspaudos. Natūralus rūgimas trunka penkias savaites, kol gaunamas sidras – silpnas alkoholinis gėrimas (nuo
4 iki 6 % stiprumo). Gaminant sidrą pramoniniu būdu, naudojamos dirbtinės (dažniausiai šampano) mielės.
Gaminant stipresnį sidrą, sultys iš karto pilamos į fermentacijai skirtas talpyklas. Jomis gali būti tiek
nerūdijančio plieno, tiek ąžuolinės statinės. Norint pagaminti sausą sidrą, sulčių fermentacija tęsiama tol, kol
visas ar beveik visas cukrus virsta alkoholiu. Gaminant saldų sidrą, sultys yra filtruojamos dar ankstyvoje
fermentacijos stadijoje. Todėl gėrime lieka daugiau cukraus, nespėjusio virsti alkoholiu. Po brandinimo, kuris
trunka apie 3 mėnesius, sultys filtruojamos – pašalinamos susikaupusios nuosėdos ir gėrimas tampa skaidrus.
Kai kurie tradicinio sidro gamintojai specialiai palieka nuosėdų (kaip natūralumo įrodymą). Galiausiai sidras
prisotinamas anglies dvideginiu. Tradiciniai obuolių sidrai yra gana aukštą koncentraciją fenolių ir
antioksidantų turintys gėrimai. Jie gali būti naudingi siekiant užkirsti kelią širdies, vėžio ir kitoms ligoms.

Actas. Antrą kartą fermentuojant vyną, alų ar sidrą, yra gaunamas actas. Antroji fermentacija yra aerobinė, jai
yra būtinas deguonis ir Acetobacter bakterijos. Jos alkoholį paverčia (oksiduoja) į acto rūgštį:

Alkoholis → acetaldehidas → acto rūgštis

Tradiciškai, actas buvo gaminamas alkoholį laikant pušies induose su beržo šakelėmis ant kurių yra reikiamų
bakterijų. Skirtingo skonio actui gauti yra naudojamas iš skirtingų vaisių gautas alkoholis. Kartais pridedama
įvairių žolelių (taip gaunamas obuolių sidro actas, balzaminis actas, baltojo ar raudonojo vyno actas, aviečių
actas).

Sintetinės acto rūgšties, kurios dažnai dedama į įvairius maisto produktus, gamyba neturi nieko bendro su
fermentacija ar bakterijomis. Pramoniniu būdu gauta acto rūgštis yra daug pigesnė, ji gaunama oksiduojant
acetaldehidą ar kaip pašalinis medienos perdirbimo produktas.

1.4. Selekcijos reikšmė žemdirbystei ir genetinis šio proceso pagrindas

Jei žmogus nebūtų prikišęs rankų prie tų augalų, kuriuos mes valgome dabar, jie šiandien atrodytų gerokai
kitaip. Kukurūzai natūraliai augo tik Meksikoje, Gvatemaloje, Hondūre ir Nikaragvoje. Jų stiebeliai buvo
menki – vos su keliais kietais grūdeliais. Šiandien turime dideles kukurūzų burbuoles su daugybe sultingų bei
maistingų sėklų (1.5 pav.). Taip yra todėl, kad žmonės nuo senų laikų pastebėjo, kad augalai vieni nuo kitų
skiriasi. Todėl buvo atrenkamos (ir kito sezono sėjai paliekamos) tik pačios geriausios sėklas.

1.5 pav. Kukurūzo protėvių ir šiandieninių kukurūzų burbuolių skirtumai

XIX amžiuje Charlesas Darwinas suformulavo natūralios selekcijos teoriją – „išlieka tik stipriausieji“. Ji
paaiškina, kodėl tam tikrose žemės vietose auga tik specifiniai augalai – nes tik jie sugebėjo ten išlikti. Šį
atrankos procesą toliau pratęsė žmonės, atsirinkdami tų augalų sėklas, kurie esamomis sąlygomis geriausiai
auga, yra skanesni, gražesni. Vėliau žmonės sėklas ėmė atrinkinėti pagal tai, kurie augalai veda daugiau ar
kokybiškesnius vaisius. Norint selekcijos būdu atrinkti tam tikra savybe išsiskiriančius augalus, reikia turėti
didelę augalų įvairovę – populiaciją. Augalų populiacija turi būti nevienalytė, kad jie galėtų mainytis genais ir
atsirastų kuo daugiau naujų genų kombinacijų. Didžiausią genų įvairovę galima rasti tose populiacijose, kurios
dar nėra prisitaikiusios prie konkrečių gamtos sąlygų – neatrinktos ir nesupanašėjusios.

Vėliau augintojai pradėjo taikyti augalų kryžmadulką (angl. cross pollinating), skiepijimą. Tam reikia turėti
mažiausiai du augalus, pasižyminčius skirtingomis patraukliomis savybėmis ir juos sukryžminti. Gauti hibridai
turėtų turėti abiem tėviniams augalams būdingų savybių.

Sulaukę derliaus, žmonės matydavo, kurių augalų vaisiai pranašesni už savo protėvius. Tokias sėklas jie
atsirinkdavo ir laukdavo kitų metų. Reikėdavo daugybės kartų (tiek augalų, tiek ir augintojų), kol pavykdavo
gauti akivaizdžiai pranašesnį – didesnį, skanesnį, lengviau auginamą, atsparesnį produktą. Kai kuriais atvejais,
tobulesnių, norimomis savybėmis pasižyminčių augalų visai nepavykdavo gauti. Tik dėl daugybę amžių
vykdytos selekcijos šiandien mes turime daug vertingų maistinių augalų ir gyvūnų.

Šiuo metu kurti pageidaujamomis savybėmis pasižyminčius organizmus yra daug lengviau ir, svarbiausia,
greičiau. Įvairių vertingų augalų reikia ne tik maistui. Jų reikia įvairių cheminių medžiagų gamybai: vaistams,
aliejams, tepalams, lateksui, dažams ir dar daugeliui kitų medžiagų. Augalų poreikis yra labai didelis. Norint
efektyviai ir greitai augalus tobulinti, didinti produkcijos kiekį, pasitelkiamas mokslas.

Natūraliai augalai genus paveldi iš tėvinių augalų, o genų pokyčius gali nulemti selekcija arba genų inžinerija.
Skirtumas yra toks, kad selekcija trunka daug metų, matomi tik išoriniai augalo pakitimai. Nėra žinoma, kas
tiksliai to augalo genome pakito – nei kokie yra pakitę genai, nei kur jie yra genome, nei kiek jų pasikeitė, nei
kaip. Tai – senesnis, primityvesnis ir ne visada laukiamą rezultatą galintis suteikti metodas. Tuo tarpu genų
inžinerijos būdu pageidaujamomis savybėmis pasižymintys augalai sukuriami daug greičiau. Tiksliai žinoma,
kas ir kaip augalo genome yra pakeista.

Mokslininkai yra išanalizavę daugybę genų – jų funkcijas, reguliaciją, koduojamus produktus. Todėl galima
suplanuoti ir sukurti tokius organizmus, kurie turėtų tik mums pageidaujamas charakteristikas, o neturėtų
nepatraukliųjų. Keičiant DNR seką, galima sukurti unikalius organizmus, pasižyminčius išskirtinėmis
savybėmis – anksčiau pradedančius žydėti ryžius ar vėliau žydinčius špinatus. Išmokus perkelti genus tarp
rūšių, galima sukurti tokius augalus, kurie patys apsigina nuo vabzdžių kenkėjų, ligų ar auga esant prastoms
gamtos sąlygoms (esant sausrai, druskingam dirvožemiui). Biotechnologijos būdu gauti produktai vadinami
genetiškai modifikuotais (GM).

Metodai, kuriais gali būti modifikuojami augalų genomai:

 Paprastoji selekcija: augalų, pasižyminčių pageidaujamomis savybėmis, sėklų atranka, saugojimas ir

sodinimas kitais metais.
 Kryžmadulka: žiedadulkių rinkimas nuo vienos augalo veislės ir išbarstymas ant kitos (nuo vienos
veislės obels ant kitos veislės obels). Siekiama, kad augalų genai susimaišytų ir būtų gautas augalas
hibridas.

 Skiepijimas: augalo dalies su pumpuru išpjovimas iš vienos veislės ir įterpimas į kitos veislės augalo
kamieno ar šaknų įpjovą.

 Augalų kultūros: sveiko augalo viršūnėlių nupjovimas ir pasodinimas, kad išaugtų daug naujų sveikų
augalų.

 Gemalo išėmimas: gemalo iš sėklos, gautos po kryžmadulkos, išėmimas ir auginimas laboratorijoje.

  DNR sekvenavimas: DNR sekų nustatymas, jų koduojamų genų, produktų, funkcijų (lemiančių
augalo aukštį, vaisių skonį, žydėjimą ir kt.) išsiaiškinimas.

 Selekcija naudojant žymenis: augalų genomų sekvenavimas ir reikiamų genų atranka. Genų buvimas
nustatymas iš genomo sekos, o ne pagal augalo fenotipą.

 Transgenezė: geno įterpimas iš bet kokios rūšies organizmo kitam, tos pačios (ar kitos) rūšies
organizmui.

Naudodamiesi genų modifikavimo metodais bei kitais biotechnologijos mokslo pasiekimais (augalų
auginimas, dauginimas mėgintuvėliuose laboratorijoje, augalų ląstelių kultūros ir kt.), mokslininkai kuria
naujus vertingus augalus. Perkėlus bakterijos genų į rapsus, buvo sukurti šalčiui atsparūs rapsai. Jie gali augti
mėnesiu ilgiau, nei nemodifikuoti. Kitas pavyzdys – pesticidams ar vabzdžiams atsparūs kukurūzai. Jų
auginimas yra daug pigesnis, nes naudojama mažiau chemikalų, augalų nesunaikina kenkėjai, mažiau teršiama
gamta ir t. t.

Genetiškai modifikuoti augalai vis dar yra naujovė pasaulyje. Daugybėje šalių (ypač vargingesnėse) ir toliau
yra naudojami senesnieji, primityvesni augalų tobulinimo būdai. Tačiau niekas neabejoja, kad modernioji
žemdirbystė be biotechnologijos yra neįmanoma.

1.5. Mikrobiologijos mokslo raida, antibiotikų atradimas ir reikšmė

Biotechnologijos raidoje svarbų vaidmenį atlieka mikrobiologija. Mikrobiologija – tai biologijos mokslo dalis,
nagrinėjanti plika akimi nematomų mikroorganizmų (mielių, bakterijų, virusų) sandarą, jų gyvenimo būdą,
tarpusavio santykius, įtaką gamtai, žmogui, jų panaudojimo pramonėje, žemės ūkyje, medicinoje galimybes.
Pats žodis „mikrobiologija“ yra sudarytas iš trijų graikų kalbos žodelių: mikros – mažas, bios – gyvybė,
logos – mokslas. Tai – platus, daug šakų apimantis mokslas (mikrobiologija apima virusologiją, bakteriologiją,
parazitologiją, imunologiją, mikologiją).

Mikroorganizmai žmogų supa nuo senų laikų. Be jų, mūsų gyvenimas Žemėje būtų neįmanomas. Dažniausiai
išgirdę žodžius „mikroorganizmai“, „mikrobai“ pirmiausia pagalvojame apie jų sukeliamas ligas, epidemijas.
Tačiau mikroorganizmų vaidmuo šiandieniniame pasaulyje yra daug įvairiapusiškesnis. Mikroorganizmai
plačiai naudojami maisto pramonėje – dalyvauja gaminant įvairius maisto produktus (jogurtą, duoną, sūrius,
actą, alkoholinius gėrimus). Mikroorganizmai naudojami antibiotikų gamyboje bei kaip nešikliai,
modifikuojant sudėtingesnių organizmų (augalų) genus.
Įvairūs mikroorganizmai (bakterijos, mielės) labai plačiai naudojami moksle. Jie gali sintetinti biotechnologijai
svarbius fermentus (DNR restrikcijos fermentus, polimerazes) ir kitus baltymus, taip pat – ir vaistinius.
Mikroorganizmai naudojami kuriant naujas technologijas, metodus (mielių dviejų hibridų sistema, skirta
baltymų tarpusavio sąveikų tyrimams). Bakterijos pramoniniais kiekiais gali gaminti aminorūgštis.
Corynebacterium glutamicum gamina L-glutamatą ir L-liziną, kurio poreikis kasmet yra skaičiuojamas keliais
milijonais tonų. Bakterijos sintetina ir įvairius biopolimerus, naudojamus medicinoje vaistams gaminti, audinių
inžinerijai. Labai svarbus vaidmuo mikroorganizmams tenka naikinant organines atliekas. Jie valo dirvožemį,
vandenis, degraduoja nuodingas atliekas, skaido išsiliejusius tepalus, naftą.

Mikroorganizmų egzistavimas pirmą kartą užfiksuotas 1674-aisiais metais, kai buvo sukonstruotas pirmasis
mikroskopas (Antonijaus van Leeuwenhoeko). Ši data yra laikoma mikrobiologijos gimtadieniu. Kiek
anksčiau – 1665 m., Robertas Hookas pareiškė, kad visi gyvi organizmai yra sudaryti iš ląstelių. Apie
mikroorganizmų egzistavimą žmonės įtarė daug anksčiau nei juos pamatė. 1546-aisiais metais Girolamo
Fracastoro spėjo, kad epidemines ligas sukelia kažkas maža ir nematoma ir kad tai tiesiogiai ar netiesiogiai
gali plisti mūsų aplinkoje, būti perduodama tarp žmonių. 1673–1723 m. Antonijus van Leeuwenhoekas aprašė
bakterijas ir kitus mikroorganizmus, kuriuos rado dantų nuograndose, lietaus vandenyje, ant pipirų ir kitur.

1857–1914 m. yra vadinami mikrobiologijos aukso amžiumi. Šiuo laikotarpiu savo darbus atliko Louis
Pasteuras, buvo nustatytas tiesioginis ryšys tarp mikroorganizmų ir ligų, suvoktas imuniteto egzistavimas,
atrasti antimikrobiniai vaistai. L. Pasteuras atskleidė, kad fermentacijos procesą (cukraus virtimą alkoholiu ar
pieno rūgštimi) sukelia mikroorganizmai, kad jie kartais sugadina maisto produktus (vyną paverčia actu), kad
mikroorganizmų pilna ore. Jis taip pat įtarė, kad mikroorganizmai gali sukelti ligas. Pasteuras nustatė, kad
norint mikroorganizmus sunaikinti, reikia juos pakaitinti. Jis sukūrė pasterizacijos procesą (trumpą kaitinimą
aukštoje temperatūroje).

1840 m. Ignazas Semmelwise‘as pranešė, kad ligų perdavimas tarp žmonių gali būti užkirstas švariai
nusiplaunant rankas. 1860 m. Josephas Listeris, susipažinęs su L. Pasteuro darbais, suvokęs, kad
mikroorganizmų pilna ore, kad jie sukelia ligas gyvūnams ir sugadina maistą, pirmą kartą chirurgines žaizdas
išdezinfekavo cheminėmis medžiagomis. 1876 m. Robertas Kochas, atlikęs eksperimentus įrodė, kad
specifines ligas sukelia specifiniai mikroorganizmai (iki jo mokslininkai tik spėjo, kad taip yra, bet jokių
įrodymų nebuvo). Taip pat R. Kochas sukūrė metodą, kaip išgryninti ir ant mitybinės terpės auginti bakterijas.
Be to, jis atrado ir aprašė keletą bakterijų rūšių, tarp jų – ir bakterijas sukeliančias tuberkuliozę. Louis Pasteuras
ir Robertas Kochas yra laikomi mikrobiologijos mokslo tėvais. 1796 m. Edwardas Janneris pirmą kartą
vakcinavo žmogų nuo raupų. Tam jis panaudojo kitą, ne raupus sukeliantį virusą. Tai – pirmosios žinios apie
imunitetą. Vakcinos1 vėliau buvo gaminamos iš nekenksmingų ar susilpnintų (atenuotų) mikroorganizmų,
dabar jos dažniausiai rekombinantinės2.

1928 m. Aleksandras Flemingas atrado pirmąjį antibiotiką. Antibiotikai – tai vienų mikroorganizmų
išskiriamos medžiagos, kurios naikina kitus mikroorganizmus. A. Flemingas pastebėjo, kad Penicillium grybas
išskiria medžiagą, kuri žudo S. aureus bakterijas. Vėliau ši medžiaga buvo pavadinta penicilinu. 1940 m.
penicilinas buvo patikrintas kliniškai ir pradėtas gaminti kaip vaistas žmonėms gydyti. Pasitelkus antibiotikus,
daugybė bakterinių infekcijų sukeliamų ligų tapo gana paprastai pagydomos. Antibiotikai atvėrė naujas
medicinos galimybes: medikams nebereikėjo ieškoti vaistinių augalų, grybų ir jais gydyti žmones, nežinant
gydymo mechanizmo. Suklestėjo farmacijos pramonė.

Antibiotikai turėjo itin didelę reikšmę biotechnologijos mokslo vystymuisi ir pasiekimams. Šiandien jie plačiai
naudojami kaip specifinis bakterijų atrankos žymuo (paveikus antibiotikais, augti gali tik jiems atsparios
bakterijos) moksle bei pramoniniam bakterijų auginimui. Antibiotikai leido sukurti daug labai svarbių darbo
su bakterijomis metodų. Šiandien sunku įsivaizduoti darbą laboratorijose be antibiotikų. Jie plačiai naudojami
genų inžinerijos darbuose, konstruojant rekombinantines plazmidės DNR molekules, atrenkant reikiamus
genus turinčias ląsteles. Antibiotikai yra neatsiejami nuo bakterijų auginimo (taigi ir nuo rekombinantinių
baltymų ar kitų iš bakterijų gaunamų produktų gamybos).

Pasitelkiant biotechnologijos metodus, galima modifikuoti, tobulinti ir gaminti pačius antibiotikus – vaistus.
Šiandien antibiotikai – vieni iš dažniausiai gydytojų skiriamų vaistų. Jie padeda pažaboti tokias bakterines
ligas kaip bakterinis meningitas, neurosifilis, andokarditas, nudegimų žaizdos, odos infekcijos, kvėpavimo,
šlapimo traktų infekcijos, aknė, žarnyno infekcijos, kraujo užkrėtimas, ausų uždegimai. Tačiau dėl nesaikingo
antibiotikų vartojimo ir išsivysčiusio bakterijų atsparumo, jų gydymo galia šiandien smarkiai sumažėjo.
Daugiau informacijos apie antibiotikus rasite kituose skyriuose.

1.6. Šiuolaikinės biotechnologijos sritys

Pagal taikymo sritis, biotechnologija dažnai skirstoma į grupes. Joms suteikti spalvų pavadinimai. Pagrindinės
biotechnologijos sritys yra raudonoji, žalioji, baltoji ir mėlynoji.

Raudonoji – medicinos, sveikatos apsaugos, farmacijos biotechnologija. Jos tikslas – vaistinių medžiagų
paieška, kūrimas ir gamyba, ligų diagnozavimas ir gydymas, ligonių gyvenimo kokybės gerinimas. Jai

1 Vakcinos – tai negyvų ar susilpnintų mikroorganizmų (bakterijų, virusų) suspensijos arba mikroorganizmų
kilmės natūralūs arba sintetiniai antigenai (baltymai ar/ir kitos medžiagos). Vakcinos skirtos infekcijų ir kitų ligų
(tuberkuliozės, gripo, vėžio) prevencijai bei gydymui.
2 Rekombinantinės vakcinos – dirbtinės, sintetinės vakcinos, kurios pamėgdžioja patogenų paviršiaus antigenus.

Jos dažniausiai yra baltyminės kilmės, kuriamos naudojant rekombinantinės DNR technologijas.
priskiriama farmakogenomika, organizmų, gaminančių antibiotikus, vakcinas kūrimas, klinikiniai tyrimai,
molekulinė medicina (genų, ląstelių terapijos), diagnostika.

Raudonojoje biotechnologijoje labai svarbų vaidmenį atlieka genų inžinerija. Ji leidžia manipuliuoti
konkrečiomis DNR molekulėmis. Kartu su genų terapija, ši technologija teikia daug vilčių gydant sunkias
ligas, tokias kaip vėžys. Raudonosios biotechnologijos rūšiai priklauso ir labai svarbią vietą užima
rekombinantinės vakcinos. Jos šiandien leidžia apsisaugoti ir kovoti su infekcijomis, sukeliamomis gripo,
herpes, hepatito ir kitų virusų.

Molekulinės medicinos sričiai priklauso ligų diagnostikos technologijų, produktų kūrimas ir gydymo
technologijos – genų terapija bei vaistų kūrimas. Bioterapiniai vaistai – tai medžiagos, kurios yra gautos genų
inžinerijos būdu arba manipuliuojant baltymais tam tikruose organizmuose. Šie vaistai yra daug specifiškesni
nei dauguma bendrai visą organizmą veikiančių farmacinių preparatų. Kamieninių ląstelių terapija – daug
vilčių teikiantis įvairių ligų gydymo metodas. Kamieninės (nediferencijuotos) ląstelės, esant tam tikroms
biocheminėms sąlygoms, gali diferencijuotis, virsti įvairių audinių ląstelėmis ir pakeisti, atnaujinti sergančius,
sugadintus, sužalotus audinius.

Farmakogenomika (farmacija ir genetika) leidžia kurti molekules, skirtas paveikti specifinius genus ar jų
produktus (konkretiems pacientams). Iš pradžių nustatomi konkretaus paciento specifiniai genetiniai žymenys,
o pagal gautus duomenis yra skiriamas individualus gydymas – parenkami vaistai, jų dozės. Toks individualus
gydymas daug tikslesnis, efektyvesnis ir (tikėkimės) yra medicinos ateitis.

Teismo medicinoje, biotechnologijos metodai ir produktai naudojami siekiant nustatyti žmonių tapatybę,
giminystės ryšius.

Farmacija. Naudojant mikroorganizmus, augalus, gyvūnus, ląstelių kultūras, yra gaminami įvairūs vaistų
komponentai (baltymai ir kt.). Vieni žinomiausių pavyzdžių: bakterijų gaminamas žmogaus insulino baltymas,
įvairūs hormonai, interferonai, citokinai, steroidai, augimo hormonai. Šiai sričiai priklauso ir genų terapija,
vakcinų, vaistinių baltymų kūrimas.

Šiai sričiai priskiriami ir biologiniai ginklai.

Baltoji – pramoninė bei aplinkos apsaugos biotechnologija. Vienas iš pagrindinių jos tikslų – naftą pakeisti
atsinaujinančiomis žaliavomis, biologiniais degalais. Ši biotechnologija taip pat plačiai susijusi su gamtą
teršiančių chemikalų naikinimu.

Pramoninės biotechnologijos ribos labai plačios – nuo duonos iki biodyzelino. Abiejų produktų gamybai yra
naudojami įvairūs mikroorganizmai, fermentai. Baltoji biotechnologija klasikinius gamybos procesus keičia
aplinkai nekenksmingais biologiniais procesais. Daroma didelė įtaka chemijos, tekstilės, popieriaus, maisto,
kasybos, kosmetikos pramonei. Fermentų panaudojimas skalbimui ar tekstilės pramonėje taupo energiją,
vandenį. Baltajai biotechnologijai priskiriamas ir vandens, dirvos, teršalų valymas bakterijomis,
biodegraduojamo plastiko gamyba, fermentų maisto pramonei gamyba, insulino gamyba, etanolio –
alternatyvaus energijos šaltinio gamyba ir kt.

Aplinkos biotechnologija apima pavojų sveikatai keliančių mikroorganizmų tyrimus, aplinkos taršos problemų
sprendimą. Jos tikslas – sumažinti teršalų kiekį gamtoje. Jau yra sukurtos bakterijos, kurios suardo išsiliejusią
naftą, tepalus, valo dirvą, vandens telkinius, pramoninio vandens atliekas, skaldo pesticidus, kitus chemikalus.
Iš įvairių pramonės atliekų (iš kukurūzų stiebų) gaminamos biodujos. Mokslininkai kuria augalus, turinčius
daugiau fermentų, dalyvaujančių fotosintezėje. Taip stengiamasi prisidėti prie CO2 dujų kiekio mažinimo
atmosferoje.

Didelę pramoninės biotechnologijos dalį užima maisto pramonė. Pasitelkus biotechnologiją, galima gauti
didesnius maisto žaliavų derlius, o naudojant įvairius konservavimo būdus – pailginti maisto produktų
tinkamumo vartoti terminą. Be to, biotechnologiniai procesai leidžia pagreitinti, atpiginti maisto gamybą.
Komerciškai laisvai prieinamų fermentų panaudojimas kietojo čederio gamybai sutrumpina šio sūrio
brandinimo/nokimo žingsnį netgi trečdaliu – 2 mėnesiais. Gautas sūris savo kokybe ir skoniu nenusileidžia
natūraliai brandintam sūriui. O pagaminti tokio sūrio galima gerokai didesnius kiekius – tiek, kiek reikia rinkai.
Taip sūrio gamintojai kasmet sutaupo daug pinigų. Be to, gaminant sūrį lieka daug išrūgų. Pagaminus 8 tonas
sūrio, lieka 80 000 tonų išrūgų. Iš jų ekstrahuojama apie 300 tonų baltymų, kurie toliau panaudojami kaip
baltymų šaltinis, įvairūs skonio stiprikliai, pakeičia kiaušinio baltymus kepiniuose. Tuo tarpu, gaminant
čederio sūrį tradiciniu būdu, yra naudojamas iš veršių skrandžių gaunamas reninas. Yodėl toks sūris yra
nepriimtinas vegetarams.

Maisto gamybai naudojami ir įvairūs grybai. Pelėsis Fusarium graminearum yra bekvapis, beskonis, jį sudaro
45 % baltymų ir 13 % riebalų. Šiame pelėsyje gausu naudingų maistinių skaidulų, o aminorūgščių komplektas
yra idealus žmogaus organizmui. Grybų ar iš jų gautų medžiagų panaudojimas yra be galo platus: jų dedama į
sriubas, energetinius gėrimus, sausainius, grybus galima naudoti kaip vištienos, kumpio, veršienos, žuvies
pakaitalus. Tokių grybų augimui reikia angliavandenių, kuriuos grybas paverčia į aukštesnės maistinės ir
komercinės vertės baltymus. Pasitelkus maisto biotechnologiją, kuriami nauji maisto produktai, praturtinti
baltymais ir tinkami vegetarams (tofu).

Žalioji – žemės ūkio biotechnologija daugiausia apima genetiškai modifikuotų augalų (kiek mažiau gyvūnų)
kūrimą ir auginimą. Šiai biotechnologijai taip pat priskiriamas ir trąšų naudojimas – dirvos praturtinimas
maisto elementais, kiek įmanoma mažiau kenkiant gamtai. GM augalai paprastai pasižymi turtingesne maistine
verte, yra skanesni, dažnai didesni, atsparesni ligoms, kenkėjams. Todėl, juos auginant yra sunaudojama
mažiau chemikalų, gaunamas didesnis derlius.

Atliekant mokslinius tyrimus bei kuriant genetiškai modifikuotus augalus, didelis vaidmuo tenka augalų
ląstelių kultūroms. Tai – technologija, leidžianti iš augalo dalių (šaknų, lapų) gauti pavienes ląsteles. Jas galima
auginti laboratorijoje, mėgintuvėliuose (pelningų veislių dauginimas augalininkystėje, gėlininkystėje). Svarbų
vaidmenį atlieka klonavimas, hibridizacija (technologija, leidžianti sukurti individą, pasižymintį dviejų
motininių individų savybėmis). Augalų genų inžinerija leidžia tiksliai modifikuoti augalų genomus. Taip
sukuriami naujomis pageidaujamomis savybėmis pasižymintys augalai. Genetiškai modifikuoti augalai
skirstomi į tris grupes:

 Augalai, galintys augti ypatingomis sąlygomis. Jie gali augti esant šalčiui, sausrai, druskingame
dirvožemyje ir pan. Taip pat jiems priskiriami augalai, atsparūs įvairioms ligoms bei kenkėjams.
Šiems augalams augant, naudojama mažiau herbicidų, pesticidų, insekticidų.

 Pagerintos maistinės vertės augalai (turintys daugiau vitaminų, aminorūgščių), naudojami

maistui. Auksiniai ryžiai turi padidintą provitamino A kiekį, todėl juos valgant sumažėja
tikimybė susirgti kai kuriomis ligomis. Ypač tai svarbu Azijoje, Afrikoje, kur vaikams itin
trūksta vitamino A. Šiai grupei priskiriami ir tie modifikuoti augalai, kurie yra skanesni nei jų
pirmtakai.

 Augalai biofabrikai, kurie gamina reikiamas medžiagas pramonei ar medicinai. Egzistuoja

augalai su modifikuotu riebalų rūgščių biosintezės keliu – iš jų gaminamas aliejus pramonei.
Taip pat, šiai grupei priskiriami augalai, sintetinantys baltymus. Šie baltymai toliau gali būti
naudojami kaip vaistai, vakcinos medicinoje.

Mėlynoji biotechnologija apima jūros ir gėlųjų vandenų resursų panaudojimą įvairių produktų gamybai.
Vandenyse esanti itin didelė augalų, gyvūnų, mikroorganizmų įvairovė turi didelį panaudojimo
biotechnologijoje potencialą. Dauguma mėlynosios biotechnologijos produktų yra naudojami moksliniuose
tyrimuose. Tačiau kai kurie iš jų yra plačiai paplitę ir kasdien naudojami.

Vieni iš geriausiai žinomų pavyzdžių – hidrokoloidai, standikliai. Jie plačiai naudojami maisto, sveikatos
pramonėje. Iš jūrinių organizmų yra gaunamos įvairios medžiagos – baltymai (fermentai, žymenys), naudojami
medicinoje, moksle. Jais domisi farmacijos, kosmetikos pramonė. Mėlynoji biotechnologija taip pat apima
jūros gėrybių, maisto kiekio didinimą, saugumą, kenksmingų vandens mikroorganizmų plitimo kontroliavimą,
naujų vaistų kūrimą ir kt. Lietuvoje ši biotechnologijos sritis beveik nėra vystoma.
Kartais vartojamas ir kitoks – smulkesnis biotechnologijos skirstymas į grupes pagal taikymo sritis (1.4
lentelė).

Spalva Biotechnologijos apimamos sritys

Raudona Sveikata, medicina, diagnostika
Geltona Maisto biotechnologija
Mėlyna Vandens, pakrančių, jūrinė biotechnologija
Žemės ūkio, aplinkos biotechnologija (biokuras, biotrąšos,
Žalia
bioperdirbimas, geomikrobiologija)
Ruda Sausų zonų ir dykumų biotechnologija
Tamsi Bioterorizmas, bionusikaltimai, biokaras
Purpurinė Patentai, publikacijos, išradimai
Balta Genais grindžiama biopramonė
Auksinė Bioinformatika, nanobiotechnologija
Pilka Klasikinė fermentacija, bioprocesų technologijos

1.4 lentelė. Smulkus biotechnologijos skirstymas į grupes

1.7. Žinių apie DNR struktūrą ir funkcijas svarba šiuolaikinės biotechnologijos vystymuisi

Biotechnologijos raidai itin didelę reikšmę turėjo mikrobiologija. Atradus mikroorganizmus, greitai sekė naujų
atradimų banga – sukaupta žinių apie infekcines ligas, atrasti antibiotikai, imunizacija.

Tačiau pats svarbiausias postūmis moderniųjų biotechnologijų link įvyko atradus DNR. Buvo nustatyta jos
struktūra (DNR yra ilga molekulė, sudaryta iš 4 pagrindinių monomerų – A, T, C, G nukleotidų, išsidėsčiusių
molekulėje tam tikra seka) ir išsiaiškinta, kad egzistuoja atskiros DNR dalys – genai. Genai – tai DNR
molekulės dalys, turinčios specifines pradžios ir pabaigos sekas. Dažniausiai genai koduoja tam tikrą produktą
(pvz. baltymą). Vėliau buvo sukurtos genų klonavimo technologijos, leidžiančios mokslininkams manipuliuoti
DNR molekulėmis (o kartu ir baltymais, jų struktūra bei funkcijomis).

 1953 m. mokslininkai Jamesas Watsonas ir Francis Crickas pirmą kartą aprašė dvigrandinės DNR
molekulės struktūrą (vėliau už šį nuopelną jie buvo apdovanoti Nobelio premija).

 1960-aisiais metais, Warneris Arberis bakterijose surado specifiškai veikiančius restrikcijos

fermentus, kurie karpo DNR grandines tam tikrose tiksliose nukleotidų sekose.

 1973 m. yra laikomi genų inžinerijos pradžia. Mokslininkai Stanley N. Cohenas (darbo su plazmidine
DNR pradininkas) ir Herbertas W. Boyeris (DNR modifikavimo fermentų atradėjas) sujungė savo
žinias bei jėgas. Jie kartu sukūrė darbo su rekombinantine DNR technologiją ir pirmieji parodė, kad
DNR galima perkelti iš vieno organizmo į kitą.

Šie mokslininkai inicijavo moderniosios biotechnologijos pramonės vystymąsi. Už sukurtas naujoves

bei nuopelnus mokslui ir medicinai, Stanley N. Cohenas ir Herbertas W. Boyeris 1996 m. buvo
apdovanoti Nobelio premija. Savo eksperimentuose pasinaudodami restrikcijos fermentais, šie
mokslininkai iškirpo norimą DNR fragmentą – geną. Mokslininkų atradimai sudarė sąlygas atsirasti
naujai – rekombinantinei DNR technologijai, kuri dažnai vadinama genų inžinerija. Genų inžinerija –
mokslas, kuris leidžia manipuliuoti genais ir taip sukurti naujomis savybėmis pasižyminčius
organizmus, vadinamus genetiškai modifikuotais organizmais (GMO). Šiuo metu prasidėjo genetiškai
modifikuotų augalų, gyvūnų kūrimo užuomazgos, paskatinusios žemės ūkio biotechnologijos
atsiradimą. Iš genetiškai modifikuotų augalų pagaminti maisto produktai yra vadinami genetiškai
modifikuotu maistu. Genetiškai modifikuoti organizmai, kurie turi įterptų svetimų genų, yra vadinami
transgeniniais organizmais. Tai gali būti augalai, gyvūnai, bakterijos, grybai.
  Kitas be galo svarbus biotechnologijos raidai žingsnis buvo žengtas 1977 m., kai bakterijose E.coli
buvo susintetintas pirmasis žmogaus baltymas – augimo hormonas somatostatinas. Šios bakterijos
buvo pirmasis GMO (genetiškai modifikuotas organizmas), gaminantis žmogaus baltymą.

 1978–aisiais metais, genų inžinerijos būdu gautose bakterijose sėkmingai buvo susintetintas žmogaus
insulino baltymas. Dar po penkerių metų jis tapo pirmuoju parduodamu biofarmaciniu produktu (GM
produktu), skirtu diabetui gydyti. Dabar pasaulyje yra parduodami šimtai GM baltymų – vaistų. Dar
daugiau jų sukurta ir yra įvairiose klinikinių tyrimų stadijose.

 1980-aisiais Amerikoje buvo patentuotas pirmasis GMO – bakterijos, gebančios skaidyti naftą. Tai
buvo didelis žingsnis į priekį biotechnologijos vystymosi kelyje. Iki tol gyvi organizmai nebuvo
patentuojami.

Genetiškai modifikuoti galima augalus, gyvūnus, mikroorganizmus. Genetiškai modifikuoti organizmai

(GMO), organizmai, turintys paveiktus, pakeistus genus, transgeniniai organizmai, biotech-organizmai... Visi
šie žodžių junginiai yra naudojami kaip sinonimai, reiškiantys, kad organizmo genomas buvo pakeistas. Į jį
buvo įterptas vienas ar keli genai iš kitos rūšies organizmo, o toks modifikuotas genomas yra paveldimas –
perduodamas ateities kartoms. Genomai yra modifikuojami iš vienos rūšies organizmų genus perkeliant
kitiems, siekiant kad organizmas gamintų daugiau (ar mažiau) kokio nors konkretaus produkto nei yra
natūraliai.

Žemdirbystės biotechnologijoje, mokslininkai, pasinaudodami bioinžinerija, sukūrė auksinius ryžius, kurie yra
praturtinti provitaminu A, kukurūzus, kurie gamina natūralų insekticidą – Bt toksiną, sojas, atsparias piktžoles
naikinantiems chemikalams. Genetiškai modifikuojami ir gyvūnai. Transgeninės pelės padeda mokslininkams
atsakyti į daugybę biologijos klausimų – suprasti genų funkcijas, ieškoti įvairių ligų gydymo būdų.
Transgeninės avys ir ožkos piene gali gaminti žmogaus ar kitų gyvūnų baltymus. Genetiškai modifikuotų vištų
kiaušiniuose galima sintetinti žmogaus baltymus vaistų, vakcinų gamybai. Transgenines bakterijas galima
naudoti kaip oralinius kontraceptikus laukinėms katėms ir taip humaniškai reguliuoti šių gyvūnų populiacijos
dydį.
Dėl genų modifikavimo, atsirado galimybė išsiaiškinti kai kurių ligų mechanizmus ir su jomis kovoti,
pamaitinti nuolat didėjančią žmonių populiaciją Žemėje ir kt. Galimybė modifikuoti organizmų genomus yra
vienas iš pačių svarbiausių moderniosios biotechnologijos pasiekimų.

 1983 m. Karry Mullis sukūrė polimerazės grandininės reakcijos (PGR) technologiją ir taip dar labiau
paspartino genų inžinerijos vystymąsi, genų modifikavimą. PGR metodu mokslininkai mėgintuvėlyje
gali dauginti specifines DNR molekules (iki tol, norint padauginti DNR, reikėjo naudoti gyvas
ląsteles). Dėl PGR technologijos, šiandien galime ne tik greitai pasidauginti bet kokį DNR fragmentą,
bet ir „išsitraukti“ norimus genus iš genominės DNR. Ši technologija pastūmėjo ligų (ypač infekcinių)
diagnostikos vystymąsi. PGR technologijos pagrindu šiandien turime sukurtą daugybę diagnostinių
testų, kurie kasdien naudojami gydymo įstaigose.

 Dar vienas didelis žingsnis pirmyn buvo žengtas 1995-aisiais metais. Tada buvo nusekvenuotas
(nustatyta tiksli DNR seka) pirmasis visas organizmo (Haemophilus influenzae) genomas. 2000 m.
buvo nusekvenuotas žmogaus genomas. Nusekvenavus genomus, buvo gauta daug naujos, iki tol
nežinomos informacijos. Atsirado galimybė analizuoti genus, jų funkcijas, lyginti genomus
tarpusavyje, ieškoti panašumų, skirtumų ar netgi pranašumų. Tokia informacija yra ypač svarbi ieškant
genų, lemiančių išskirtines, vertingas savybes, kurias būtų galima panaudoti moksle, medicinoje,
pramonėje.

 1996 m. buvo klonuotas pirmasis žinduolis – avis Doli. Klonavimas – tai technologija, kuri leidžia
laboratorijoje iš vienos ląstelės gauti daugybę genetiškai identiškų ląstelių ar organizmų. Visos gautos
kopijos – klonai, gauti iš motininės ląstelės, yra genetiškai identiški. Šiandien mokslininkams yra
pavykę klonuoti ir daugiau gyvūnų. Tikimasi, kad ištobulinus šią technologiją bus galima išsaugoti
 nykstančias rūšis. Genų inžinerija ir klonavimas nėra tas pats. Genų inžinerija leidžia manipuliuoti
genais, kurti naujus, unikalius genus, jų rinkinius, leidžia perkelti genus tarp rūšių (iš žmogaus
bakterijai), ko niekada negalėtų įvykti natūraliai. Klonavimas – procesas, kurio metu gaunamos
identiškos organizmo kopijos, genai dauginami rūšies viduje.

Genetiškai modifikuoti vabzdžiai

Žmogaus gerovei gali pasitarnauti net ir genetiškai modifikuoti vabzdžiai! GM vabzdžiai galėtų padėti
kontroliuoti laukinių vabzdžių, sukeliančių tam tikras žmonių ir gyvūnų ligas, plitimą. Galima būtų
sukurti sterilius arba tik tam tikros lyties vabzdžius, ligoms atsparias bites, šilkaverpius, gaminančius
naujas medžiagas ir kt.

Vieni iš „pikčiausių“ žmogui vabzdžių yra maliariniai uodai. Uodų patelės, norėdamos padėti
kiaušinių, turi atsigerti gyvūnų kraujo, nes su juo gauna kiaušinių dėjimui reikiamą baltymą. Jeigu
patelė prisisiurbia kraujo su maliariją sukeliančiu parazitu, tai įkasdama kitam gyvūnui ji parazitu
pasidalija – gyvūnas užkrečiamas. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, kasmet maliarija
užkrečiami 300–500 milijonų žmonių, apie 1 milijonas jų miršta.

Kontroliuoti maliarinių uodų paplitimą yra sunku. Mokslininkai sugalvojo išeitį – sukurti genetiškai
modifikuotus uodus, kurių gonadose būtų gaminamas žaliai šviečiantis baltymas. Tokiu būdu, pagal
žaliai šviečiančias gonadas, būtų galima lengvai atskirti uodus pagal lytį. Pasinaudojus lazeriniu
prietaisu, per 10 valandų pagal lytį galima išrūšiuoti 180 000 lervų. Patinėlius paskui galima sterilizuoti
ir paleisti į gamtą ten, kur didelės maliarinių uodų populiacijos. Sterilūs GM patinėliai poruosis su
laukinėmis patelėmis, bet uodai neturės palikuonių. Paleidus pakankamai didelį kiekį patinėlių, būtų
galima greitai sureguliuoti pavojingų vabzdžių populiaciją konkrečioje teritorijoje.

Mokslininkai yra sugalvoję ir kitų maliarinių uodų genetinio modifikavimo variantų, kurie nepaveikia
uodų vaisingumo. Sukurti uodai, kurių žarnyne buvo aktyvinta SM1 peptido veikla. Šis peptidas uodo
žarnyne yra atsakingas už maliariją sukeliančio parazito vystymosi sustabdymą. GM uodams
poruojantis su laukiniais uodais, maliarijai atsparių uodų skaičius didėja.

Abu aprašyti kovos su maliariniais uodais būdai dar yra mokslinių tyrimų lygmens. Norint tokį kovos
būdą realiai pritaikyti gamtoje, prieš tai reikia atsakyti į daugybę ekologijos klausimų. Kaip tokie uodai
plis, kokią įtaką turės ekosistemoms (uodai – maistas paukščiams), ar maliariją sukeliantys parazitai
neprisitaikys prie „pakitusių“ uodų, ar nemutuos ir t. t.

1.8. Šiuolaikinės biotechnologijos produktai

Jei reikėtų pasakyti kokio nors biotechnologijos produkto pavyzdį, turbūt daug kam pirmiausia į galvą šautų
„maistas“ arba „vaistai“? Tai tiesa, tačiau šie pavyzdžiai yra tik ledkalnio viršūnė. Biotechnologijos produktai
mus supa kasdien.

 Pradėkime nuo drabužinės. Gaminant blukintus džinsus, yra naudojami net keli biotechnologiniai
žingsniai. Kad siūlai būtų tvirtesni ir neplyštų audžiant, jie padengiami krakmolu. Vėliau krakmolą
reikia pašalinti, nes jis trukdo dažyti audinį. Anksčiau tai buvo daroma naudojant stiprias rūgštis.
Dabar – naudojant fermentą amilazę, kurią pagamina bakterijos.

 Jūsų batų dėžėje turbūt mėtosi pora sportbačių? Juos gaminant taip pat prireikė biotechnologijos. Odos
pramonė yra viena iš plačiausiai naudojančių fermentus. Anksčiau, norint išdirbti odą, kailis buvo
rauginamas. Dabar tam yra naudojami fermentai. Jie šį darbą atlieka greičiau, efektyviau, yra daug
 mažiau teršiama gamta. Fermentai taip pat naudojami siekiant odą padaryti minkštesnę, švelnesnę,
elastingesnę, blizgesnę.

 Vonioje turbūt turite kontaktinių lęšių skysčio, šampūno, plaukų priežiūros priemonių ir kitos
kosmetikos? Į jų sudėtį taip pat įeina baltymai, gauti pasitelkus mikroorganizmus – biotechnologiją.

 Girdite ūžiant skalbimo mašiną? Šiandien daugelyje skalbimo miltelių yra įvairių fermentų (lipazių,
proteazių), pakeitusių gamtą teršiančius fosfatus. Fermentai naudojami ir kituose plovikliuose,
valikliuose, dėmių išėmikliuose. Drabužiai gali būti skalbiami žemesnėje temperatūroje – taip
taupoma energija, švelniau paveikiamas audinys, drabužiai mažiau nusitrina.

 Virtuvėje po kriaukle turite vamzdžius atkemšančio skysčio? Jame taip pat yra įvairių fermentų (ar net
pačių mikroorganizmų), ardančių riebalus, tepalus, baltymus ir taip padedančius atkimšti užsikišusius
vamzdžius.

 Pusryčiams mėgstate sumuštinius? Duona ilgiau išlieka šviežia todėl, kad ją gaminant yra naudojamas
fermentas amilazė. Ji pakeičia krakmolo struktūrą. Visi sūriai taip pat yra biotechnologijos produktai.
Pasaulyje pusei gaminamų sūrių rūšių yra naudojami fermentai. O įvairiems gaiviesiems gėrimams
saldinti naudojamas sirupas yra gaunamas iš kukurūzų, paveikus juos fermentais. Pasitelkus
biotechnologiją, atsirado tokie mažai kalorijų turintys saldikliai kaip aspartamas.

 Biotechnologija naudojama ir vaistų gamyboje. Fermentacija sutrumpina vitaminų C, B2 gamybos

laiką. Fermentai naudojami gaminant vaisių sultis, vyną, alų, aliejus, riebalus, tepalus, popierių ir
celiuliozę, pašarus.

Taigi kiekvienas iš mūsų kasdien susiduria su biotechnologija daugybę kartų! Toliau išvardintos kelios
biotechnologijos produktų grupės:

 Fermentai. Tai – baltymai, pagreitinantys reakcijas. Jų panaudojimas itin platus. Moksle fermentai
dažnai naudojami kaip įvairūs genų inžinerijos įrankiai, kurie karpo, siuva, sintetina įvairias molekules.
Fermentai taip pat naudojami maisto pramonėje, medicinoje, gaminant skalbiklius, minkštiklius ir t. t.

 Monokloniniai antikūnai. Tai – natūraliai mūsų organizme gaminami baltymai, kurie specifiškai
atpažįsta konkrečius antigenus (jungiasi prie jų). Antigenų turi virusai, bakterijos ar tam tikros ląstelės.
Antikūnai yra natūrali mūsų organizmo gynybos sistemos dalis. Jos tikslas – apsaugoti mūsų organizmus
nuo svetimos genetinės informacijos. Antikūnai saugo mūsų organizmus nuo įvairių infekcijų, ligų. Jie
labai plačiai naudojami diagnostikos testuose nustatant tam tikras molekules, įvairias infekcijas
sukeliančius mikroorganizmus (taip pat – ir vėžines ląsteles, savo paviršiuje turinčias tam tikrų
antigenų).

Antikūnai yra plačiai naudojami ir ligoms gydyti. Kadangi tai labai atrankios savo taikiniui molekulės,
turint antikūnų tam tikram baltymui (kurį reikia užblokuoti ir taip išveiklinti), galime organizme valdyti
tam tikrų baltymų veiklumą. Anksčiau antikūnai buvo gaunami tik iš gyvūnų, bet dabar jie gali būti
gaminami ir rekombinantiniai.

 Rekombinantiniai baltymai. Tai – baltymai, dirbtinai sintetinami tokiose ląstelėse, kurioms šie
baltymai yra svetimi. Į bakterijos genomą įterpus geną, koduojantį žmogaus interferono baltymą (kuris
plačiai naudojamas vėžiui, įvairioms virusinėms infekcijoms gydyti), bakterijų ląstelės yra priverstos jį
sintetinti. Tačiau šis baltymas bakterijoms yra svetimas.

Rekombinantiniai baltymai plačiai naudojami moksle, medicinoje ir kt. Rekombinantinis kraujo

krešėjimo faktorius VIII yra naudojamas hemofilijai gydyti (šio baltymo neturintys žmonės susižeidę
gali mirtinai nukraujuoti, nes jų kraujas nekreša). Šis baltymas buvo pagamintas 1986-aisiais metais, o
pradėtas pardavinėti 1992 m.
  Organizmai. Genetiškai modifikuoti augalai ir gyvūnai, kurie naudojami maistui. Populiariausi
pavyzdžiai – auksiniai ryžiai, greitai augančios lašišos.

Ląstelės. Įvairios natūralios arba genetiškai modifikuotos prokariotinės bei eukariotinės ląstelės, kurios
pačios (o ne jų gaminamos medžiagos) yra naudojamos kaip produktai. Tokios ląstelės gali būti
bakterijos, mielės ar žinduolių ląstelės. Šiai produktų grupei priklauso bakterijos, skaidančios naftą,
valančios dirvožemį ir vandens telkinius. Taip pat ląstelės plačiai naudojamos maisto pramonėje. Tai –
jogurto bakterijos, pelėsiniai grybai sūriui, kepimo mielės. Įvairias žinduolių ląstelių kultūras,
kamienines ląsteles bandoma taikyti gydant ligas.

1.9. Lietuvos biotechnologijos pramonės apžvalga

Kai XX a. 7–8 dešimtmečiais tapo įmanoma gyvybinius procesus tirti molekulių lygmeniu, pasaulyje buvo
pradėta sparčiai plėtoti modernioji biotechnologija. Mokslininkai suvokė, kad biotechnologijos mokslo
naujovės suteiks daug naujų galimybių.

Į moderniąją biotechnologiją atkreipė dėmesį ir Sovietų Sąjunga. 1974 m. buvo nuspręsta plėtoti
biotechnologijos mokslus – molekulinę biologiją ir molekulinę genetiką. 1975 m. kovo 1 d. Vilniuje buvo
įsteigtas Taikomosios enzimologijos institutas. Enzimologija – tai biochemijos mokslo kryptis, tyrinėjanti
fermentus, ląstelėse esančius baltymus, kurie tūkstančius kartų paspartina organizme vykstančias reakcijas.
Naujojo instituto užduotis buvo kurti molekulinėje biologijoje analitiniais ir medicinos tikslais naudojamų
išgrynintų fermentų gamybos technologijas, rengti jų panaudojimo rekomendacijas. Taikomosios
enzimologijos instituto įkūrimas Vilniuje 1975 m. yra laikomas moderniosios biotechnologijos pradžia
Lietuvoje.

Prasidėjus Sovietų Sąjungos griūčiai, šio instituto mokslinių tyrimų pagrindu Lietuvoje buvo pradėtos kurti
moderniosios biotechnologijos bendrovės. Didžiausios mūsų šalies biotechnologijos bendrovės „Fermentas“,
„Sicor Biotech“, „Biocentras“ yra minėto instituto pumpurinės įmonės. Taikomosios enzimologijos instituto
mokslinę veiklą šiandien tęsia vienas stipriausių šalies mokslo institutų – Biotechnologijos institutas.

UAB „Fermentas“ (dabar „Thermo Fisher Scientific“ padalinys) – pasaulinis restrikcijos fermentų lyderis.
Trečdalis visų mokslui žinomų restrikcijos endonukleazių yra atrastos Lietuvoje. Jų atradėjai – „Fermento“ ir
Biotechnologijos instituto mokslininkai. Šiandien restrikcijos endonukleazės – įprastas, daugelyje gyvybės
mokslų laboratorijų naudojamas tyrimų įrankis. Mokslininkai iš viso yra atradę ir nuodugniai ištyrę daugiau
kaip 3 tūkstančius restrikcijos fermentų, iš jų apie 600 yra naudojami tyrimuose.

„Fermentas“ yra išskirtinė kompanija, gaminanti per 200 restrikcijos fermentų. Kai kurios iš jų yra unikalios
– jų negamina jokia kita kompanija pasaulyje. Be to, beveik visi „Fermento“ gaminami restrikcijos fermentai
yra surasti, ištirti ir gaminami Lietuvoje. Tuo tarpu, dauguma pasaulio kompanijų superka ir perparduoda kitų
gamintojų produkciją. Be restrikcijos endonukleazių, „Fermentas“ gamina įvairius DNR ir RNR
modifikuojančius fermentus, nukleorūgščių gryninimui ir gausinimui, genų klonavimui, nukleorūgščių ir
baltymų elektroforezei skirtus produktus, transfekcijos agentus.

„Fermentas“ yra laimėjęs geriausio Lietuvos eksportuotojo titulą. 2010 m. “Fermentas” tapo didžiausios
pasaulio bendrovės, siūlančios produktus ir paslaugas mokslui – „Thermo Fisher Scientific“ dalimi.
„Fermento“ pardavimas šiai amerikiečių kompanijai buvo brangiausias iki tol žinomas sandėris Lietuvoje.

„Sicor Biotech“ – vienintelė genų inžinerijos medikamentus kurianti ir gaminanti biotechnologinės farmacijos
įmonė Rytų ir Vidurio Europoje. Nuo 2004-ųjų metų bendrovė priklauso didžiausiai generinių vaistų
gamintojai pasaulyje – korporacijai „Teva“. Gamykloje gaminamos dvi veikliosios medžiagos:
rekombinantinis žmogaus granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (filgrastimas) ir rekombinantinis
žmogaus interferonas alfa-2b. Šių veikliųjų vaistinių medžiagų pagrindu gaminamas vaistas „Tevagrastim“ –
biologinis vaistinis preparatas (registruotas visoje Europos Sąjungoje), vaistiniai preparatai „Grasalva“ ir
„Realdiron“. Šie vaistai gaminami pagal užsakymus kitose „Teva“ įmonėse, tačiau galutinę kokybės kontrolę
ir išleidimą į rinką vykdo „Sicor Biotech“ Kokybės kontrolės ir užtikrinimo padaliniai.

„Biocentras” yra mokslinė gamybinė įmonė, kuri nuolatos vykdo mokslinius tyrimus ir eksperimentus bei
tobulina naujus biologinius produktus ir technologijas. Ši įmonė kuria, gamina ir parduoda įvairius sorbentus
bei bakterinius preparatus. Jie skirti naftos produktams, kurui, tirpikliams ir kitiems organiniams ir
neorganiniams skysčiams, teršalams sugerti, surinkti ar efektyviai suskaidyti bei sunaikinti iki ekologiškai
neutralių produktų. Minėti „Biocentro“ gaminiai yra naudojami visame pasaulyje išsiliejusiai naftai surinkti ir
valyti, užterštiems vandens telkiniams, gruntui, nuotekoms valyti ir kt. „Biocentras“ taip pat gamina ir
farmacinį (fermentų pagrindu sukurtą) preparatą, pasižymintį bakteriolitiniu, bakteriostatiniu poveikiu, skirtą
žaizdoms valyti, bei lipazes, skirtas riebalų rūgščių esterių sintezei.

„Thermo Fisher Scientific“ Vilniaus padalinys, „Sicor Biotech“ ir „Biocentras“ – didžiausios Lietuvos
moderniosios biotechnologijos įmonės. 2001 m. jų pardavimas siekė 44 mln. litų, o 2008 m. išaugo iki beveik
150 mln. litų. 2008 m. šiose trijose įmonėse dirbo daugiau kaip 550 darbuotojų, trečdalis jų vykdė tyrimus.
Nuo 2000 m. moderniosios biotechnologijos įmonių sąrašą Lietuvoje papildė naujos inovatyvios įmonės:
„Sorpo“, „Biotechpharma“, „Imunolita“, „Profarma“, „Mestilla“ ir kt.

Lietuvos biotechnologijos rinka yra viena didžiausių Vidurio ir Rytų Europoje. Šiame regione lietuviški
produktai neturi atitikmenų. Todėl Lietuvoje yra visos prielaidos toliau plėtoti biotechnologijos tyrimus,
veiksmingai juos naudoti šalies pramonės konkurencingumui didinti. Nors Lietuvos biotechnologijos sektorius
nėra didelis įmonių skaičiumi, jame dirba aukščiausios kvalifikacijos specialistai. Įdiegta moderni įranga
užtikrina produktų konkurencingumą pasaulyje.

Didžioji dalis Lietuvos biotechnologijos įmonių atstovauja raudonajai biotechnologijai („Thermo Fisher
Scientific“ Vilniaus padalinys, „Sicor Biotech“). Kiek mažiau šalies įmonių atstovauja baltajai
biotechnologijai. Čia garsiausia įmonė yra „Biocentras“, kuris valo iš aplinkos teršalus, panaudodamas žmogui
ir gamtai nekenksmingus natūralius mikroorganizmus ir iš jų išskirtus fermentus. Dėl žaliosios
biotechnologijos Europos Sąjungoje vyksta diskusijos, o mėlynoji biotechnologija Lietuvoje dar tik įžengusi į
mokslinių tyrimų etapą.

Literatūros šaltiniai:

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh
 http://www.biotechinstitute.org/
 http://www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/Pages/index.aspx
 http://www.bio-entrepreneur.net/Advance-definition-biotech.pdf
 http://www3.lrs.lt/pls/inter3/dokpaieska.showdoc_l?p_id=394259&p_query=gazuotas&p_tr
2=2
 www.fermentas.lt
 www.sicor.lt
 www.biocentras.lt
 Nuo mokslo atradimų iki pasaulinės kompanijos: „Fermento“ istorija. UAB „Fermentas“,
2010 m. ISBN 987-609-95210-0-8.
 Pranė Dundulienė (sud). Duona lietuvių buityje ir papročiuose. Vilnius: Mokslo ir
enciklopedijų leidybos institutas, 2007. 134 p. – ISBN 978-5-420-01622-0.

2. Bendrosios žinios apie ląstelinius procesus ir struktūras

2.1. Ląstelės sandara, genetinė informacija ląstelėse

Ląstelė – gyvųjų organizmų struktūrinis ir funkcinis vienetas. Tai – biologinės membranos atskirta
erdvės dalis, kurioje vykstantys biofizikiniai ir biocheminiai procesai leidžia ląstelei savarankiškai
egzistuoti, vystytis, daugintis, reaguoti į aplinką, veikti ir pan. Ląstelę sudaro selektyviai pralaidi
membrana ir vidinė terpė – citoplazma. Citoplazmoje vyksta daugybė reakcijų, reikalingų ląstelės
gyvybei ir funkcijai palaikyti. Sudėtingesnieji organizmai (eukariotai, turintys ląstelės branduolį)
ląstelės viduje dar turi membranomis atskirtas organeles specializuotoms funkcijoms (svetimkūnių
virškinimui, fotosintezei ir kt.) atlikti.

Įsivaizduokime ląstelę kaip fabriką su pagrindine sale – citoplazma, specializuotais skyriais

(organelėmis) ir daugybe skirtingų sričių kvalifikacijos darbuotojų (fermentų). Jie visi dirba tam, kad
ląstelė išliktų ir atliktų savo funkcijas. Čia bus ir didžiulis skyrius, kur saugoma ir nuskaitoma
informacija apie visą fabrikėlio veiklą. Visą šią informaciją mes vadiname genetine, nes ji yra
paveldima ir užrašyta DNR molekulėje, jos sekose – genuose ir tarpgeninėse reguliacinėse sekose.

Organizmo DNR sekų visuma vadinama genomu. Genomas – tai ne tik genai, bet ir daugybė
tarpgeninių sekų: reguliacinių ar tokių, apie kurių paskirtį dar nieko nežinome. Ilgoje DNR grandinėje
informacija užrašyta kaip tekste. Yra žodžiai (genai) su aiškia pradžia ir pabaiga, tarp jų yra sekos,
atitinkančios tarpelius ir skyrybos (reguliacinius) ženklus.

2.1 pav. Bakterijos ląstelės schema.

Bakterijų ir archėjų ląstelėse DNR išsidėsčiusi tiesiog citoplazmoje (2.1 pav.). Tokie organizmai
vadinami prokariotais – neturinčiais ląstelės branduolio. Jie turi didelę (106–107 bazių porų (bp) ilgio)
žiedinę chromosominę DNR ir mažų (103–106 bp) žiedinių DNR molekulių – plazmidžių. Plazmidės
nebūtinos, bet jos labai praverčia, kai bakterijoms reikia adaptuotis naujoje aplinkoje. Plazmidėse
dažniausiai būna genų, suteikiančių konkurencinį pranašumą prieš gentaines ir kitus
mikroorganizmus tam tikromis aplinkos sąlygomis. Jų genai taip pat gali lemti atsparumą
antibiotikams (koduoti fermentus, skaldančius antibiotikų molekules arba tiesiog išpumpuojančius
antibiotikus iš ląstelės). Plazmidžių genai gali koduoti baltymus, kurie veikia kaip toksinai – padeda
„išsikovoti vietos“ gausiai mikroorganizmų apgyvendintose vietose. Taip pat jie gali koduoti
fermentus, leidžiančius fiksuoti atmosferos azotą ar skaidyti (ir naudoti kaip maistą) neįprastas
organines molekules. Tokiu būdu padedama išgyventi trūkstant maisto medžiagų.

Eukariotų (ląstelių turinčių branduolį) DNR yra atskirta nuo bendrosios citoplazmos terpės (2.2 pav.).

2.2 pav. Eukariotų ląstelės schema. Gyvūninė ląstelė. DNR yra branduolyje ir mitochondrijose.

Eukariotiniai organizmai įvairūs – nuo vienaląsčių eukariotų (tokių, kaip ameba), iki daugialąsčių
grybų, augalų ir gyvūnų. Didžiausia DNR dalis (107–1011 bp) yra atskirų linijinių chromosomų
pavidalo. Ji patalpinta specialia selektyviai pralaidžia membrana atskirtoje organelėje – branduolyje.
Mitochondrijose ir chloroplastuose (atitinkamai ląstelinio kvėpavimo ir fotosintezės specializuotose
organelėse) taip pat yra šiek tiek DNR (104–105 bp). Ji reikalinga šių organelių egzistavimui ir
funkcijai. Chloroplastų DNR koduoja svarbiausio fotosintezės fermento RuBisCo didžiąją
polipeptidinę (baltyminę) grandinę. RuBisCo – didžiulis ir labai sudėtingas fermentas augalų
chloroplastuose. Jis sudarytas iš 4 didžiųjų ir 8 mažųjų polipeptidinių grandinių. Mažosios fermento
grandinės koduojamos branduolyje esančioje DNR. Mitochondrijų DNR koduoja kai kuriuos
kvėpavimo grandinės sandus.

2.2. Genai ir genomas – organizmų savitumą ir savybes lemiantys veiksniai

Genas – tai DNR molekulės dalis su tam tikra seka, koduojančia baltymo arba RNR molekulę, kuri
ląstelėje atliks tam tikrą funkciją. Baltymai gali būti fermentais – katalizuoti tam tikras medžiagų
apykaitos reakcijas. Gali būti ir struktūrinių baltymų: jie sudaro ląstelės vidines atramas – citoskeletą
ar sutvirtina organizmo audinius (kolagenas, lamininas). Baltymų nekoduojančios RNR molekulės
taip pat atlieka savo funkcijas. Transportinė RNR (tRNR) neša baltymų sudedamąsias dalis –
aminorūgštis į baltymų sintezės vietą (ribosomą). Ne visų genų ir ne visų DNR sekų funkcijos yra
žinomos. Netgi tokių intensyviai tiriamų organizmų kaip žmogaus ar geriausiai ištirtos modelinės
bakterijos (žarnyno lazdelės Escherichia coli) daugelio DNR sekų funkcijos dar nėra aiškios.

Akivaizdu viena. Kokių užkoduotų funkcijų rinkinį (genomą) organizmas turi, toks organizmas
susidaro ir gyvuoja. Bakterijos genome surašyta visa instrukcija, kaip turi susidaryti ir funkcionuoti
bakterija. Jei į genomą pridedame papildomų genų (lemiančių atsparumą antibiotikui), gauname
antibiotikui atsparią bakteriją. Augalų genome surašyta viskas, ko reikia augalui augti. Augalų
genome randame genų, koduojančių fotosintezei reikalingus baltymus. Gyvūnų genomuose tokių
genų nėra, todėl jie ir nesugeba vykdyti fotosintezės.

Žmogaus genome surašyta viskas, ko reikia žmogaus ląstelėms funkcionuoti. Kadangi yra funkcijų,
reikalingų visiems organizmams (tokių kaip baltymų sintezė) arba bendrų tam tikroms organizmų
grupėms (augalams būdinga fotosintezė, o visiems šiltakraujams būdingas kūno temperatūros
palaikymas), yra daugybė genų, kurie yra panašūs ir lemia panašias funkcijas daugybėje organizmų
rūšių. Tikriausiai teko girdėti, kad nuo šimpanzių žmonės skiriasi tik maždaug 2 % genomų sekų.
Toks mažas skirtumas vis dėlto lemia nemažą fenotipinį (požymių) skirtumą dėl savotiško mūsų
organizme vykstančio genų interpretavimo ir reguliacijos (sudėtingo informacijos nurašymo, RNR
molekulių brendimo).

2.3. Nukleorūgščių (DNR ir RNR) sandara ir struktūra

DNR informaciją saugo, o RNR ją nurašo ir realizuoja. Abi šios medžiagos yra panašios ir bendrai
vadinamos nukleorūgštimis (lot. nucleus – branduolys). Tai – polinukleotidinės grandinės, sudarytos
iš daugybės nukleotidų, vienas paskui kitą sujungtų į ilgą grandinę.

A G

C U T

A) B)

2.3 pav. A) nukleotido sandara; B) nukleobazės.

Nukleotidą sudaro (2.3 pav.):

1. Heterociklinė azotinė bazė (adeninas, citozinas, guaninas, timinas, uracilas).

2. Penkis anglies atomus turintis angliavandenis ribozė.
3. Fosforo rūgšties liekana.

DNR (deoksiribonukleorūgštis) taip vadinama dėl to, kad jos sudėtyje esanti ribozė 2’ padėtyje neturi
deguonies atomo (deoksiribozė). RNR turi ribozę ir vadinama ribonukleorūgštimi. Abi šios
nukleorūgštys turi po keturis nukleobazių ir nukleotidų tipus. Purinai – adeninas ir guaninas (dviciklės
bazės) bei vienas pirimidinas – citozinas (vienciklė bazė) yra randami tiek DNR, tiek RNR.

Antrasis pirimidinas DNR ir RNR molekulėse skiriasi. DNR turi timiną, o RNR – uracilą. Tačiau
skirtumas tarp šių bazių nėra didelis. Timinas dar turi metilo grupę C-5 padėtyje.

Bazės (ir atitinkami nukleotidai) žymimi jų pavadinimų pirmosiomis raidėmis. DNR sekoje būna A,
G, C ir T, o RNR – A, G, C ir U.

Polinukleotidinė grandinė susidaro jungiantis vieno nukleotido ribozei su kito nukleotido fosfatu. (2.4
pav.) Taip susidaro vadinamasis fosforibozės karkasas. Jis turi kryptį: galas, turintis laisvą fosfato
arba ribozės 5’ grupę, vadinamas 5’ galu, o kitas (kadangi į jį nukreipta ribozės 3’ grupė) vadinamas
3’ galu. Bazės lieka „išsikišusios“ karkaso šone.

Kadangi fosforibozinis karkasas yra vienodas visose nukleotidinėse grandyse (nukleotiduose), DNR
ir RNR informacija užkoduojama bazių sekoje. Ši seka yra labai reikšminga ir priimta rašyti 5’→ 3’
kryptimi. Nukleorūgšties nukleotidų seka laikoma jos pirmine struktūra.

2.4 pav. Dvigrandinę DNR sudaro dvi

antilygiagrečios grandinės, kurias kartu
palaiko sąveika tarp komplementarių
nukleobazių. Citozinas sudaro tris
vandenilines jungtis su guaninu, o adeninas
sudaro dvi vandenilines jungtis su timinu.
Fosforibozės karkasas per visą DNR ilgį yra
vienodas.

Antrinė nukleorūgščių struktūra – tai polinukleotidinių grandinių sudaromos struktūros.

Heterociklinės bazės geba sudaryti vandeniliniais ryšiais susijungusias poras. Įprastai G sudaro porą
su C, o A su T arba U. Tai vadinama komplementarumu. G komplementari C, o A komplementari
T(U). G–C pora turi 3 vandenilinius ryšius, A–T(U) – 2 ryšius. DNR atveju ryšius sudaro
komplementarios bazės, esančios dviejose atskirose grandinėse. Taip susidaro dviguboji spiralė.
Grandinės spiralėje yra antilygiagrečios. Jeigu vienos grandinės seką skaitome 5’→3’ kryptimi, tai
kitos grandinės seka eina 3’→5’ kryptimi.

Kad tarp grandinių susidarytų vandeniliniai ryšiai, jos turi būti komplementarios. Sekos turi atitikti
taip, kad visur susidarytų komplementarios bazių poros (2.4 pav.). Reikia paminėti, kad tarp
heterociklinių bazių egzistuoja ir savita Hungstyno sąveika, kai susidaro šiek tiek kitokie
(netradiciniai) vandeniliniai ryšiai.

Ribozės ir fosfatai yra hidrofiliniai. Fosfatai neutralaus pH sąlygomis papildomai turi ir neigiamą
krūvį. Priešingai, heterociklinės bazės yra hidrofobinės, išskyrus vandenilines jungtis sudarančias
grupes. Susidarant antrinei nukleorūgščių struktūrai, bazių poros hidrofobiškai sąveikauja
tarpusavyje ir „slepiasi“ struktūros viduje. Hidrofilinis karkasas lieka išorėje. Heterociklinės bazės
dėl konjugacijos yra plokščios. Jų poros išsidėsto statmenai fosforiboziniam karkasui. Gauname tarsi
besisukančius laiptus, kur šoninės kraštinės ir turėklai yra fosforibozinis karkasas, o laipteliai – bazių
poros. Spiralė apsisuka (susidaro viena apvija) maždaug kas 10 bazių porų (2.5 pav.). Skirtingų formų
DNR (DNR gali būti A, B ar Z formų) šis parametras skiriasi.

2.5 pav. DNR spiralė

Kodėl dvigrandinė DNR molekulė yra spiralė, o ne paprastesnė struktūra – tiesios kopėtėlės?

Pagrindinė priežastis yra ta, kad heterociklines bazes jungiančios fosfato–ribozės grandies ilgis apie
2 kartus viršija heterociklinių bazių žiedo storį. Tiesioje kopėtėlių tipo struktūroje tarp heterociklinių
bazių liktų ~3 Å pločio tarpai. Hidrofobinėms bazėms tokia struktūra būtų nepalanki, nes prie jų
galėtų laisvai prieiti vandens molekulės. Tad tarpai dėl bazių hidrofobinės sąveikos susispaudžia, o
karkasas (kad tilptų) pasisuka įstrižai.

Svarbi komplementarių bazių porų savybė yra tai, kad A–T ir G–C bazių porų plotis yra vienodas.
Tai reiškia, kad kiekviena grandis, susidedanti iš dviejų komplementarių nukleotidų, yra erdviškai
tapati kitai ir nepriklauso nuo konkrečių nukleotidų. DNR, sudaryta iš komplementarių grandinių,
pasižymi geometriniu periodiškumu nepriklausomai nuo nukleotidų sekos. Genetinės informacijos
nešiklio struktūra nepriklauso nuo konkrečios genetinės informacijos. Kitokios bazių kombinacijos
neleidžia susidaryti stabilioms ar erdviškai ekvivalentiškoms poroms. Todėl nekomplementarios
bazių poros sekoje lemia žymius lokalius DNR struktūros pokyčius. Jie ląstelėje yra lengvai
atpažįstami ir ištaisomi.

Skirtingai nuo DNR, kurią sudaro dvi komplementarios polinukleotidinės grandinės, gamtoje RNR
dažniausiai yra viengrandinė molekulė. Tačiau ir RNR atveju pagrindinis antrinės struktūros
elementas yra dviguba spiralė. Ilgose RNR molekulėse susidaro vidumolekulinės dvigubos spiralės
tarp komplementarių tos pačios polinukleotidinės grandinės fragmentų. Čia būna ir nestandartinių
bazių porų sąveikų (G–U), lieka ir nesuporuotų fragmentų. Dėl to, priklausomai nuo RNR sekos,
struktūroje susidaro įvairios kilpos, linkiai ir kt. Tad RNR būna ne ilgos dvigrandinės spiralės, o daug
sudėtingesnių pavidalų molekulės (2.6 pav.). Tokios struktūros leidžia skirtingoms RNR molekulėms
atlikti skirtingas funkcijas – pernešti informaciją apie baltymo seką (iRNR), vykdyti baltymų sintezę
(rRNR), pernešti aminorūgštis ir atpažinti genetinį kodą (tRNR).

2.6 pav. Iš kairės: tRNR, 5S bei 23S rRNR erdvinės struktūros

2.4. Genų organizacija: eukariotų ir prokariotų genų struktūra

DNR sekoje užkoduota ne tik funkcija (baltymo, RNR seka), bet ir tai informacijai nuskaityti
reikalingos pagalbinės sekos. Tad pilną geną sudaro transkribuojamoji dalis (dalis, nuo kurios
sintetinama geno iRNR) ir reguliacinės dalys. Geno 5‘ gale (pradžioje) yra promotorius. Jis nurodo
ir reguliuoja transkripcijos (iRNR sintezės) pradžią. Čia dar gali būti įvairių reguliacinių baltymų
(transkripciją skatinančių arba slopinančių baltymų) jungimosi sekos.

Įvairių genų promotoriuose išskiriami kanoniniai motyvai. Bakterijose dažnai naudojama vadinamoji
TATAAT seka (dar vadinama „-10“ seka). Ji išsidėsto maždaug 10 bp prieš „+1“ nukleotidą, nuo
kurio pradedama iRNR sintezė. Ši seka nėra visur griežtai tokia pati (ji nėra konservatyvi). Tačiau
bendrą tendenciją galima įžvelgti. Apibendrintoji (angl. consensus) „-10“ seka būtų tokia:
T80A95T45A60A50T96. Čia skaičiai žymi parašyto nukleotido buvimo šioje vietoje dažnį procentais.

Eukariotų promotorinės genų sekos daug sudėtingesnės už prokariotų. Eukariotuose

transkribuojamoji geno dalis turi sekų, kurios nėra tiesiogiai išreikštos baltymo sekoje, bet yra būtinos
sėkmingai baltymo sintezei. Tai yra 5’ ir 3’ netransliuojami RNR regionai (angl. UTR regions).

Galiausiai, geno pabaigoje yra seka terminatorius. Jis nurodo, kur geno iRNR sintezę reikia pabaigti
(2.7 pav.).
 2.7 pav. Bakterijos geno sandara

2.8 pav. E. coli lac operono schema

Prokariotų genai dažnai sudaro operonus – genų blokus, kur už vieno promotoriaus sekos išdėstyta
ilga transkribuojamoji dalis. Joje užkoduotos dviejų ar daugiau baltymų sekos (2.8 pav.). Šie baltymai
dažnai būna susiję savo funkcija. E. coli lac operone koduojami 3 baltymai, reikalingi laktozės
pasisavinimui („valgymui“). Operone išsidėsčiusių genų raiška yra valdoma suderintai.

Be to, operonus (kaip tam tikrą savybę koduojančius genetinės informacijos blokus) bakterijos gali
efektyviai perduoti viena kitai. Tai jos padaryti gali konjugacijos metu: dvi ląstelės laikinai susijungia
sudarydamos kanalėlį, per kurį gali būti pernešama DNR grandinė. Taip pat, žuvus kai kurioms
ląstelėms, pasklidusi jų DNR kitų bakterijų gali būti paimama iš terpės. Abiejų šių procesų metu
paimama ne visa ląstelėje buvusi DNR, o tik jos fragmentas. Taigi, funkciškai susijusius genus geriau
laikyti šalia – tada didesnė tikimybė, kad perdavimo metu visas reikalingas rinkinys pateks į kitą
ląstelę. Tai pasiekti būtų sudėtingiau, jei tam tikrai funkcijai reikalingi keli genai būtų išbarstyti po
visą genomą.

Eukariotų genai transkribuojamoje koduojančioje dalyje dažnai turi sekų intarpus – intronus. Tokių
genų kiekis priklauso nuo organizmo rūšies. Intronai prieš transliaciją (baltymo sekos sintezę nuo
iRNR sekos) yra iškerpami – vyksta iRNR splaisingas. Jo metu baltymą koduojantys fragmentai –
egzonai – sujungiami (2.9 pav.). Bendrai visi šie procesai vadinami iRNR brendimu.
 A)

B)

2.9 pav. A) egzoninė–introninė eukariotų geno sandara; B) alternatyvusis splaisingas.

Kartais intronuose koduojamos mažos reguliacinės RNR. Jos susidaro iš intronų, kai šie pašalinami
iš ilgojo transkripto. Taip pat labai svarbus reiškinys yra alternatyvusis splaisingas. Tai – galimybė
įvairiai iškarpyti ir vėl sujungti tos pačios iRNR molekulės egzonus (2.9 pav.). Alternatyvusis
splaisingas leidžia iš vieno geno iRNR gauti keletą skirtingų baltymų. Tai labai svarbu evoliucijai.
Žmogaus ląstelėse ~95 % egzoninę–introninę sandarą turinčių genų iRNR dalyvauja splaisinge. Nors,
palyginus su kitais organizmais, turime palyginti nedaug baltymus koduojančių genų (tik apie 20
000), alternatyvusis splaisingas mūsų baltymų įvairovės (o kartu ir ląstelių funkcijų, organizmo
sudėtingumo) galimybes išplečia daugybę kartų.

2.5. Replikacijos ir transkripcijos procesai

Kaip informacija, užkoduota DNR, perduodama iš kartos į kartą? Kaip ji „perskaitoma“ ląstelėje, kai
ją reikia realizuoti?
Replikacija – tai visos DNR sekos nurašymas padvigubinant DNR molekulių kiekį. Tokia procedūra
reikalinga prieš ląstelei dalijantis, kad kiekviena nauja ląstelė gautų po pilną ir tikslią genomo kopiją.
Kadangi dvi grandinės DNR spiralėje yra susietos tik bazių porų vandeniliniais ryšiais, jas galima
atskirti nesuardant kovalentinių jungčių tarp nukleotidų (prisiminkite: jų seka yra nešanti
informaciją). Bazių poravimosi specifiškumas (G poruojasi tik su C, o A tik su T) leidžia tiksliai
nukopijuoti po trūkstamą grandinę. Naujos DNR sintezei naudojamos abi atskirtosios DNR
grandinės. Jos vadinamos „pirmaujančiaja“ ir „atsiliekančiaja“ DNR grandinėmis. Kitaip tariant,
DNR spiralės grandinės atskiriamos viena nuo kitos ir kiekviena tampa matricomis vienos naujos
dukterinės grandinės sintezei (2.10 pav.).

Kadangi DNR „mėgsta“ būti dvigrandinė, replikacijos metu matricinių grandinių atskyrimas ir naujų
grandinių sintezė vyksta kartu. Pirmiausiai DNR spiralė išsukama ir išskiriama kaip užtrauktukas.
Tada prie viengrandinės DNR prisijungia fermentų kompleksas ir sintetina naujas DNR grandines.
Jos iš karto sukasi į dvigubą spiralę. Vieta, kur išsiskiria senosios grandinės ir sintetinamos naujos,
vadinama replikacine šakute. Proceso metu replikacinė šakutė juda išilgai DNR molekulės.

Kiekviena nauja DNR spiralė yra identiška senajai. Ji turi vieną grandinę iš senos molekulės, o vieną
susintetintą naujai. Replikaciją vykdo specialūs fermentai (susijungę į kompleksą). DNR helikazė
išsuka spiralę ir atskirai senąsias grandines, kad DNR polimerazės galėtų naudoti jas kaip matricas.
DNR praimazė susintetina reikalingus trumpus RNR pradmenis (Okazakio fragmentus)
atsiliekančiosios grandinės sintezei. DNR polimerazė slenka matricine DNR grandine ir jungia
laisvus deoksinukleotidus į naują polinukleotidinę grandinę būtent tokia seka, kuri atitinka teisingas
(komplementarias) bazių poras su senąja grandine. Kiti baltymai stabilizuoja viengrandinės DNR
regionus, padeda DNR polimerazei slinkti DNR molekule, taiso susidariusias klaidas ir kt. (2.10
pav.). DNR replikacijos greitis yra maždaug 800 bazių porų/sek.

2.10 pav. DNR replikacija

(filmukas: http://www.dnalc.org/resources/3d/DNAReplicationBasic_w_FX.html).

Transkripcija – tai DNR molekulėje užkoduotos informacijos nurašymas į RNR molekules (iRNR,
tRNR, rRNR). Šiuo atveju nurašoma ne visa DNR seka, o tik jos dalis, kuri koduoja tam tikrą geną
ar genų grupę – operoną. Gaunama RNR molekulė, kurios seka identiška vienos iš DNR grandžių
fragmentui. Šioje RNR molekulėje T nukleotidai yra pakeisti į U, vietoj deoksiribozės yra ribozė.
Ta DNR grandinė, kurios seka tiesiogiai atsikartoja RNR molekulėje, vadinama koduojančiaja
grandine (arba prasmine). Kita DNR grandinė yra komplementari RNR (ir vadinama matricine,
nekoduojančiaja arba priešprasmine). Ji naudojama kaip matrica RNR sintezei. Nuo jos, kaip ir
replikacijoje, seka nukopijuojama pasinaudojant specifiniu komplementaraus bazių poravimosi
principu. Nuo DNR priklausomą RNR sintezę atlieka RNR polimerazės. Tai – didžiuliai fermentai,
sudaryti iš keleto subvienetų. Įvairūs fermento subvienetai atlieka skirtingas funkcijas.

Transkripcija prasideda, kai RNR polimerazė prisijungia prie geno promotoriaus – specialios DNR
sekos. Jis nurodo, kad nuo čia reikia pradėti minėto geno RNR sintezę. Tada RNR polimerazė atskiria
DNR grandines apie 20 DNR bazių porų atkarpoje, susidaro „transkripcijos burbulas“. Šiame
„burbule“ ir vyksta RNR sintezė: laisvi nukleotidai jungiami į polinukleotidinę grandinę
komplementariai pagal matricinės nekoduojančios DNR seką. RNR polimerazė slenka per visą geno
ilgį, kartu slinkdama transkripcijos burbulą ir sintetindama RNR (2.11 pav.).

RNR sintezė vyksta ~40 nt/sek greičiu. Kai pasiekiamas terminatorius (specifinė DNR seka,
nurodanti, kad čia geno nurašymą reikia baigti), daugiau nukleotidų į RNR seką nebejungiama.
Susintetinta viengrandinė RNR ir fermentas RNR polimerazė atsiskiria nuo DNR grandinės.

Susintetintos RNR molekulės dažnai yra „brandinamos“. Prie jų prijungiama „kepurė“, poli(A) seka,
RNR yra hidrolizuojamos specialių fermentų. Eukariotų ląstelėse dar įvykdomas splaisingas – iš RNR
molekulės iškerpami baltymo nekoduojantys fragmentai (intronai) ir į ištisinę seką susiuvami tik
baltymą koduojantys fragmentai (egzonai). Galiausiai susidaro teisinga RNR molekulės antrinė
struktūra. Jeigu gene buvo užkoduotas baltymas, prireiks dar vienos stadijos – baltymo sintezės pagal
iRNR molekulėje užkoduotą jo seką (transliacijos).

2.11 pav. Transkripcija

(filmukas http://www.dnalc.org/resources/3d/12-transcription-basic.html)

2.6. Baltymo sintezė – genetinio kodo realizavimo procesas

Transliacija – tai iRNR molekulės nukleotidų sekos perkodavimas į aminorūgščių seką. Jos metu
susidaro baltymo polipeptidinė grandinė. Transliacijai reikia trijų rūšių RNR: informacinės RNR
(iRNR), transportinių RNR (tRNR) ir ribosominių RNR (rRNR). iRNR koduoja baltymo seką, tRNR
„atneša“ baltymo sintezei būtinas aminorūgštis į ribosomas, o rRNR (kartu su ribosominiais
baltymais) yra pagrindinė ribosomų sudedamoji dalis, turintį katalizinį aktyvumą.

Ne visa iRNR seka tiesiogiai koduoja baltymą: jos 5’ ir 3’ galuose yra netransliuojami regionai. Jie
svarbūs transliacijos reguliacijai. 5’ netransliuojamame regione yra seka, nurodanti, kur turi
prisijungti ribosoma ir nuo kur tiksliai reikia pradėti skaityti baltymo sekos kodą.

iRNR koduojantis regionas – tai jos sekos dalis, kurioje genetiniu kodu užrašyta baltymo seka.
Kadangi skirtingų standartinių aminorūgščių yra 20, o papildomai reikalingas bent vienas pabaigos
ženklas, iš viso reikia bent 21 skirtingo simbolio. DNR nukleotidų yra tik 4, todėl reikia trijų paeiliui
einančių nukleotidų (tripleto) kaip atskiro simbolio (kodono).

Kodonas – tarsi žodis, pasakantis, kokia vienoje ar kitoje vietoje turi būti aminorūgštis. Kodą rašant
nukleotidų tripletais gaunami net 64 skirtingi kodonai. Visi jie naudojami ląstelėse skirtingu dažniu.
Kai kurioms aminorūgštims tenka po kelis skirtingus kodonus. Tik dvi aminorūgštys turi po vieną
unikalų joms skirtą kodoną. Kitoms aminorūgštims skirta po du ar daugiau kodonų (dėl to sakoma,
kad genetinis kodas yra „išsigimęs“). Baltymo sekos pabaigą žymintys „stop“ kodonai yra trys (2.1
lentelė). Polinkis naudoti vieną ar kitą kodoną tai pačiai aminorūgščiai ar „stop“ simboliui užrašyti
priklauso nuo organizmo rūšies ir konkretaus geno. Ypač skiriasi prokariotų ir eukariotų naudojamas
kodonų „žodynas“. Mitochondrijų ar chloroplastų genome tie patys kodonai taip pat dažnai koduoja
kitas aminorūgštis.

2.1 lentelė. Genetinis kodas, aminorūgštys pažymėtos standartiniais trijų raidžių sutrumpinimais,
pilnus aminorūgščių pavadinimus rasite 2.14 pav.

Standartiškai baltymo seka prasideda aminorūgštimi metioninu. Atitinkamai, transliuojamoje iRNR

sekoje pirmasis kodonas būna AUG. Tolesni nukleotidų tripletai paeiliui nurodo kitas aminorūgštis,
kol ribosomos pasiekia „stop“ kodoną. Seka nuo pirmojo AUG iki „stop“ kodono vadinama atviru
skaitymo rėmeliu (angl. open reading frame, ORF). Juos nesunku aptikti genome naudojant
bioinformatines programas. Taip randami hipotetiniai baltymų genai. ORF sekos palyginamos su
žinomos funkcijos baltymų sekomis ir taip spėjama galima šių genų koduojamų baltymų funkcija.
Žinoma, spėjimui galutinai patvirtinti reikalingi laboratoriniai tyrimai. Genai, koduojantys kitas RNR
(rRNR, tRNR, siRNR ir kt.), tokių aiškių koduojamos sekos pradžios ir pabaigos simbolių neturi
(arba kol kas mokslas dar jų neišsiaiškino). Todėl naudojant bioinformatines programas tokius genus
aptikti daug sunkiau nei tuos, kurie koduoja baltymus.

Dar viena svarbi atviro skaitymo rėmelio (o kartu ir genetinio kodo) ypatybė – tarp kodonų nėra jokių
tarpinių ženklų, kurie žymėtų vieno kodono pabaigą ir kito pradžią. Todėl, jei dėl mutacijos iš sekos
„iškrenta“ (įvyksta nukleotido delecija) ar įsiterpia papildomas nukleotidas (insercija), pasikeičia
visos už mutacijos vietos einančios sekos prasmė. Tokios mutacijos visiškai „sugadina“ baltymą. Jos
yra vadinamos rėmelio poslinkio mutacijomis.

Pradinė seka AUG GAG CCA Įsiterpia papildomas nt: AUU GGA GCC A
Aminorūgštys Met Glu Pro Ile Gly Ala

Jei mutacijos metu sekoje nukleotidas tik pasikeičia (A į T, C arba G), bet jų skaičius nekinta,
pasikeičia tik viena aminorūgštis. Tai įvyksta ne visada, nes naujasis kodonas gali koduoti tą pačią
aminorūgštį.

Pradinė seka AUG GAG CCA Įsiterpia papildomas nt: AUG GAA CCA
Aminorūgštys Met Glu Pro Met Glu Pro

Tokios mutacijos vadinamos tyliosiomis ir dažnai naudojamos biotechnologijose, norint pakeisti

DNR nukleotidų seką nepakeičiant koduojamo baltymo sekos. Deja, kartais pasikeitus aminorūgščiai,
baltymas gali prarasti ar pakeisti savo funkciją. Todėl gali išsivystyti genetinės ligos – siklemija,
Epidermolysis bullosa ir kt. Be to, yra ir daug kitų mutacijų tipų.

Grįžkime prie transliacijos. iRNR sekoje užkoduota baltymo seka. Priešais šią seką dar yra
reguliacinė seka. Ji nurodo, nuo kur reikės pradėti skaityti kodonus. Tokia seka vadinama ribosomos
prisijungimo vieta (RBS). Nesant šios sekos, transliacija negali prasidėti. Seką atpažįsta, prie jos
jungiasi ir vėliau vykdo baltymo sintezę transliacijos aparatas, vadinamas ribosoma. Šį didžiulį
makromolekulių kompleksą sudaro ribosominė RNR (rRNR) ir ribosominiai baltymai. Ribosoma,
atpažinusi prisijungimo vietą, apglėbia iRNR ir pirmasis kodonas patenka į jos aktyvųjį centrą.

Kitas svarbus veikėjas transliacijoje – tai transportinės RNR (tRNR). Jos turi dvi genetinio kodo
realizavimui reikalingas ypatybes:

1) Prie tam tikros tRNR kovalentiškai prijungiama tik viena savita aminorūgštis;

2) tRNR turi trijų nukleotidų seką – antikodoną, kuris yra komplementarus kodonui,
reiškiančiam būtent tą aminorūgštį.

Visos tRNR turi ir bendrų savybių, panašią antrinę struktūrą. Ribosoma turi dvi vietas transportinėms
RNR (tRNR) surišti. Jos vadinamos A ir P vietomis. Čia išsidėsto ir du iRNR paeiliui einantys
kodonai. tRNR antikodonai komplementarumo principu atpažįsta atitinkamus kodonus, o tRNR
atneštos aminorūgštys (katalizuojant ribosomai) sujungiamos peptidine jungtimi į polipeptidinę
grandinę. Tada ribosoma pasislenka per vieną kodoną, atkeliauja kitą kodoną atitinkanti tRNR, į
polipeptidinę grandinę įjungiama jos atnešta aminorūgštis (2.12 pav.).
 2.12 pav. Transliacija – baltymo sintezė 2.13 pav. tRNR su mutantiniu
(filmukas: http://www.dnalc.org/resources/3d/15- antikodonu gali atpažinti „stop“ kodoną.
translation-basic.html) Tada baltymo sintezė nesustoja iki
kitokio „stop“ kodono

Genetinio kodo skaitymas ir polipeptidinės grandinės ilginimas tęsiasi tol, kol pasiekiamas „stop“
kodonas. Nėra tRNR, kuri šį kodoną atpažintų ir pateiktų aminorūgštį. „Stop“ kodonus atpažįsta saviti
baltymai, vadinami paleidimo veiksniais (angl. release factors). Dėl jų polipeptidinė grandinė
užbaigiama ir atpalaiduojama iš ribosomos, o ribosoma atsikabina nuo iRNR. Jeigu turime iRNR su
paeiliui užkoduotais keliais baltymais (taip gali būti operone), ribosomos prisijungimo seka reikalinga
prieš kiekvieną iš jų. Yra žinomos tRNR mutacijos, kai pakitusi antikodono seka sugeba atpažinti
vieną iš „stop“ kodonų. Tuomet baltymo sintezė pratęsiama įjungiant mutantinės tRNR atneštą
aminorūgštį ir vyksta toliau, kol pasiekiamas kitoks „stop“ kodonas (2.13 pav.).

2.7. Baltymų struktūra ir funkcijos, jų ryšys su cheminėmis aminorūgščių savybėmis

Baltymai sudaryti iš aminorūgščių, sujungtų į ilgas polipeptidines grandines. Į baltymų sudėtį įeina
20 skirtingų standartinių aminorūgščių. Visos jos turi karboksilinę grupę (-COOH) ir amino grupę (-
NH2) prijungtas prie Cα atomo. Prie Cα atomo visada yra prijungtas ir vienas vandenilio atomas.
Aminorūgštys skiriasi savo šoninėmis grupėmis – tuo, kas prijungta prie Cα atomo (2.14 pav.).
 A)

B)

2.14 pav. A) bendra baltymus sudarančių aminorūgščių sandara;

B) baltymus sudarančios aminorūgštys.
Baltymuose gali būti mažiausiai 20 skirtingų šoninių grupių. Jos labai įvairios pagal savo struktūrą,
chemines grupes ir hidrofiliškumą. Galima išskirti tris šoninių grupių tipus:

1. Joninės. Turi krūvius. Yra hidrofilinės, turi papildomų karboksilo ir amino grupių;
2. Polinės. Krūvio neturi, bet yra hidrofilinės;
3. Hidrofobinės.

Tiesą sakant, skaičius 20 tinkamas tik pradinei baltymų sintezės „medžiagai“ apibūdinti. Baltymuose
dar yra pora retai sutinkamų aminorūgščių: selenocisteinas ir pirolizinas.

Susintetinti ir vėliau ląstelės procesuose dalyvaujantys baltymai gali būti modifikuojami.

Aminorūgščių šoninės grandinės gali būti metilinamos, fosforilinamos, acetilinamos. Todėl jų
įvairovė vėliau dar padidėja. Ribosomose vienos aminorūgšties aminogrupei susijungus su kitos
karboksilo grupe susidaro peptidinė jungtis. Polipeptidinėje grandinėje gaunamas karkasas, sudarytas
iš visose aminorūgštyse esančių vienodų grupių, o nuo jo „styro“ šoninės grandinės (2.15 pav.).

2.15 pav. Polipeptidinė grandinė

Kadangi susidarant peptidinei jungčiai nuo aminorūgščių atskyla vanduo, į grandinę įjungtos
aminorūgštys vadinamos aminorūgščių liekanomis. Aminorūgščių liekanų seka grandinėje vadinama
pirmine baltymo seka. Ji taip pat turi kryptį. Viename sekos gale lieka laisva amino grupė (N–galas),
kitame – karboksilo grupė (C–galas). Tokia kryptimi grandinė sintetinama ribosomose ir taip priimta
ją užrašyti. Visos baltymo savybės priklauso nuo jo sekos. Sekoje slypi galimybės polipeptidinei
grandinei susisukti į antrinę, tretinę (erdvines) struktūras ir atlikti savo funkciją. Baltymas tampa
funkciškai aktyvus tik įgavęs (susisukęs į) erdvinę struktūrą.

Antrinė struktūra susidaro vandenilinėmis jungtimis sąveikaujant karkaso amino- ir karboksilo

grupėms. Kurių aminorūgščių šios grupės sąveikaus, priklauso nuo grandinės atkarpos aminorūgščių
liekanų. Vienos grandinės atkarpos paprastai susirango netaisyklingai, kitos – taisyklingai.
Taisyklingo susisukimo variantai yra du (2.16 pav.):

 α-spiralė. Kiekviena >C=O grupė sudaro vandenilinę jungtį su ketvirtąja nuo jos >N-H grupe.
Spiralė apsisuka kas 3,6 aminorūgšties. Šoninės grupės styro į šalis nuo spiralės.

 β-struktūros (klostės, plokštės, lakštai). Tai – tarsi banguota plokštė iš lygiagrečiai einančių
grandinės fragmentų, sukabintų per amino- ir karboksigrupes. Šoninės grandinės išsidėsto
abipus plokštės.

B)

A) C)

2.16 pav. A) antrinės baltymo struktūros; B) įvairios sąveikos tarp aminorūgščių šoninių grupių;
C) baltymo tretinė struktūra.

Tos pačios baltymo polipeptidinės grandinės fragmentai sudaro α spirales ir  lakštus. Ilgoje
grandinėje paprastai galima aptikti kelias α spirales ar kelis  lakštus. Tarp α spirales ir  lakštus
sudarančių sekų lieka griežtai nestruktūruotos polipeptidinės grandinės dalys – kilpos. Erdvėje
išsidėsčiusios spiralės, lakštai ir kilpos sudaro tretinę baltymo struktūrą. Jos susidarymą lemia šoninių
grandinių įvairios tarpusavio sąveikos ir jungtys: vandenilinės, joninės, hidrofobinės ir netgi
kovalentinės (disulfidiniai tilteliai). Susidariusi tretinė baltymo struktūra dažnai būna panaši į
kamuoliuką ir vadinama globule (2.16 pav. B, C). Tačiau reikia paminėti, kad egzistuoja ir fibrilinių
baltymų klasė. Jie nėra tokie kompaktiški.

Kadangi ląstelėje yra vandeninė terpė, baltymų molekulės susisuka taip, kad globulių paviršiuje
išsidėsto daugiausia hidrofilinės grupės, o viduje susitelkia hidrofobinės. Dalies baltymų molekulių
paviršiuje lieka ir hidrofobinių grupių. Jos svarbios susidarant ketvirtinei struktūrai, o taip pat
membraniniams baltymams įsitvirtinant membranoje. Kartais susidaryti funkcionaliam baltymui
reikia, kad į tam tikrą struktūrą susijungtų kelios tretinę struktūrą jau įgavusios polipeptidinės
grandinės. Taip gaunama ketvirtinė baltymo struktūra. Ją sudarančios globulės vadinamos
subvienetais. Hemoglobiną sudaro 4 subvienetai (2.17 pav.).

2.17 pav. Hemoglobino ketvirtinė struktūra.

Taip pat jis prisijungęs geležį surišančią
molekulę hemą ir geležies jonus.

Paprastai baltymo polipeptidinę grandinę sudaro >40 aminorūgščių liekanų. Stambūs baltymai gali
būti iš 1000 aminorūgščių ir daugiau. Baltymą sudaro daug aminorūgščių, tačiau vienai ar kelioms iš
jų pasikeitus gaunamas kitoks baltymas. Ląstelėse yra tūkstančius ar dešimtis tūkstančių skirtingų
sekų, dydžių bei erdvinių struktūrų turinčių baltymų. Tai jiems suteikia skirtingas funkcijas. Baltymai
dalyvauja beveik visuose ląstelėje ir organizme vykstančiuose procesuose. Kaip gi jie veikia?

Kad galėtų atlikti kokią nors funkciją, baltymai turi su kuo nors sąveikauti. Medžiagų apykaitos
reakcijas katalizuojantys baltymai (fermentai) turi sąveikauti su substratais. Antikūnas turi sąveikauti
su antigenu, kad sukeltų imuninį atsaką. Augimo hormonas turi prisijungti prie ląstelės paviršiuje
esančio receptoriaus (taip pat baltymo), kad aktyvintų ląstelės atsaką. Transkripcijos veiksnys turi
jungtis prie tam tikros DNR sekos, kad valdytų geno raišką ir panašiai.

Visos šios sąveikos tarp molekulių vyksta susidarant nekovalentinėms jungtims. Kad jos susidarytų,
sąveikai skirtos molekulių paviršiaus sritys turi viena kitą struktūriškai atitikti pagal formą ir pagal
galimų sudaryti jungčių „žemėlapį“. Turi būti tam tikras komplementarumas. Seniau sakyta, kad
molekulės sąveikauja „panašiai kaip raktas atitinka spyną“. Tačiau kadangi molekulės
sąveikaudamos šiek tiek pakeičia viena kitos formą, dabar tiksliau būtų sakyti „kaip ranka atitinka
pirštinę“.

Baltymo prisijungiama molekulė vadinama ligandu. Baltymui ir ligandui sąveikaujant susidaro daug
įvairių nekovalentinių jungčių (2.18 pav.). Jos gali būti:

 Joninės sąveikos (jas sudarys rūgštinės ir bazinės aminorūgščių liekanų grupės);

 Vandenilinės sąveikos;
 Van der Valso sąveikos (silpnos sąveikos, susidarančios dviem atomams esant labai arti);
 Joms susirišant, nuo dviejų molekulių sąveikos paviršiaus gali būti išstumiamas vanduo. Dėl
to gali vykti ir hidrofobinė sąveika.
 2.18 pav. Baltymo ir ligando (substrato) sąveika

Kuo daugiau jungčių susidaro tarp baltymo ir ligando, tuo jų susirišimas (giminingumas) stipresnis.
Tai taip pat atitinka baltymo funkciją. Augimo hormonas prie receptoriaus prisiriša labai stipriai. O
štai fermentai substratus suriša ne taip stipriai. Įvykus katalizei (substratui virtus produktu), gautasis
produktas blogiau atitinka aktyvaus centro struktūrą ir galimų jungčių „žemėlapį“ Todėl fermento ir
produkto molekulių sąveika dar labiau susilpnėja ir produktas paleidžiamas.

Struktūriniais vadinami baltymai jungiasi tarpusavyje ir sudaro ilgus filamentus. Suformuojami

vamzdeliai, kurių tinklas ląstelę sutvirtina tarsi skeletas, padeda jai judėti ir dalytis (2.19 pav.).

2.19 pav. Ląstelėse matomos fluorescuojančiais dažais pažymėtos struktūrinių baltymų gijos
Fermentuose vieta, kur surišamas ligandas ir vykdoma reakcija, vadinama aktyviuoju centru. Katalizę
vykdo aktyviajame centre išsidėsčiusios aminorūgščių liekanos. Šoninių grupių cheminė įvairovė
leidžia gauti didelę įvairovę fermentų, galinčių katalizuoti skirtingas ląstelei reikalingas reakcijas.
Fermentų veiklos pagrindinė idėja – sumažinti aktyvacijos energiją, reikalingą katalizuojamai
reakcijai įvykti (2.20 pav.).

2.20 pav. Katalizė sumažina reakcijos aktyvacijos barjerą

Taip fermentai chemines reakcijas pagreitina 106–1014 kartų. Pradinė medžiaga, su kuria sąveikauja
fermentas, vadinama substratu. Fermentas substratą specifiškai atpažįsta įvairiomis nekovalentinėmis
jungtimis (2.21 pav.). Dėl šių jungčių fermentas gali energetiškai stabilizuoti reakcijos tarpines
būsenas. Fermentai įvairius substratus gali skaidyti (baltymus skaldantys fermentai perkerpa
peptidinę jungtį), sujungti (jungti nukleotidus į grandinę), prijungti papildomą cheminę grupę (metilo,
fosfato grupes).

2.21 pav. Polipeptidinės grandinės fragmentas baltymus

skaidančio fermento aktyviajame centre

Skaidantys fermentai paprastai su substratu jungtis sudaro taip, kad jį šiek tiek deformuoja ir taip
paskatina suskilti (2.22 pav.). Sujungiantys fermentai prisijungia du substratus ir taip juos smarkiai
suartina erdvėje vienas kito atžvilgiu reakcijai palankiomis orientacijomis (2.22 pav.). Būna fermentų,
kurie katalizės metu su substratu sudaro laikinas kovalentines jungtis. Taip sudaromos reakcijai
palankios tarpinės būsenos, kurios neįmanomos nesant fermento (2.23 pav.). Atpalaidavęs produktą
fermentas vėl gali imtis naujos substrato molekulės. Per sekundę fermentai katalizę gali atlikti
maždaug 1–10 000 kartų.
Fermentai skirstomi į 6 grupes pagal katalizuojamų reakcijų pobūdį ir vadinami pagal katalizuojamą
reakciją, pridedant galūnę -azė. Lipazės skaido riebalus, DNR polimerazės sintetina DNR,
metiltransferazės perneša metilo grupę nuo vienos molekulės ant kitos ir panašiai.

A) B)

2.22 pav. A) skaidymo; B) sintezės reakcijos

2.23 pav. DNR topoizomerazė

veikia sudarydama kovalentinį
ryšį su substratu. Fermento
tirozinas sudaro jungtį su
fosforibozinio karkaso fosfatu.
Taip sudaromas laikinas
viengrandinis DNR trūkis. Šis
trūkis leidžia išsisukti įtemptai,
per daug susisukusiai DNR. Per
daug susisukusi DNR susidaro
replikacijos metu, judant
replikacinei šakutei. Kai DNR
grįžta į normalaus susisukimo
būseną, topoizomerazė grąžina
fosfato jungtis į vietą (sujungia
atgal, panaikina trūkį).

Kadangi fermento veikimui labai svarbus jo aktyviojo centro ir substrato atitikimas, fermentai yra
labai specifiški savo substratui ir (kartu) katalizuojamai cheminei reakcijai. Jei biocheminiam
procesui įvykti reikia kelių reakcijų, reikia ir kelių fermentų, veikiančių vienas po kito. Tokiu atveju,
vieno fermento reakcijos produktas tampa kito substratu, kol gaunamas galutinis produktas. Kelių
vienas po kito einančių reakcijų pavyzdys – glikolizė. Tai – gliukozės skaidymo kelio reakcijų seka
(2.24 pav.).
2.24 pav. Glikolizės metabolinis kelias. Dalyvaujantys fermentai užrašyti mėlynai.
Literatūros sąrašas:

 Saulius Klimašauskas „Nukleorūgščių chemija“. Vilniaus universitetas. Technologija,

Kaunas. 2008
 Vytautas Rančelis „Genetika“. Lietuvos mokslų akademijos leidykla, Vilnius. 2000
 Benjamin Lewin “Genes VII”. Oxford university press, New York. 2000
 http://www.biologyreference.com/Po-Re/Protein-Structure.html
 http://www.unifr.ch/biochem/assets/files/schneiter/cours/Voet_Pratt/Voet_chapt_11.pdf
 http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_detail.php?id=1c2w
 http://www.dnalc.org/resources/3d/DNAReplicationBasic_w_FX.html
 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908406002471
3. Genų inžinerija – šiuolaikinės biotechnologijos pagrindas
Įvadas

Biotechnologijos pagrindas – gyvieji organizmai, jų vykdomi biocheminiai procesai ir šių procesų

metu pagaminti produktai. Kaip aprašyta anksčiau, kai kurie biotechnologiniai procesai (rauginimas,
fermentacija) buvo žinomi ir sėkmingai taikomi tūkstančius metų. Tačiau mūsų laikais įvairių žmogui
svarbių produktų gamyba yra nepalyginamai efektyvesnė, jų įvairovė padidėjo. Šiuolaikiniuose
biotechnologijos procesuose dažnai naudojami kitokie gyvieji organizmai, dažnai jie pakeičiami
fermentais.

Daugumos organizmų savybės yra patobulintos taikant pastaraisiais dešimtmečiais sparčiai

besivystančias technologijas – manipuliuojant gyvųjų organizmų DNR. Gyvųjų organizmų DNR
molekulėse koduojamos genetinės informacijos atnaujinimas yra natūralus procesas, vykstantis
lytinio dauginimosi metu. Tačiau lytinis dauginimasis įmanomas tik tarp tos pačios rūšies organizmų.
Nuo 1970 m. mokslininkai išmoko išgryninti DNR, „atrasti“ jos molekulėje tarp daugybės kitų
rūpimą geną (kurio produktas lemia naudingą požymį) ir klonuoti (įterpti) jį į kitą organizmą. Šis
procesas vadinamas genų inžinerija, sukonstruota nauja DNR – rekombinantine DNR, o jos
koduojamas produktas baltymas – rekombinantiniu baltymu. Teoriškai, bet koks pageidaujamas
genas gali būti perkeltas į kitą organizmą ir šis taps transgeninis.

Pastaraisiais dešimtmečiais kai kurie biotechnologiniai procesai perkelti į didelės apimties pramoninę
gamybą. Ji tiekia produktus (dažniausiai fermentus ir baltymus) buitinėms reikmėms, medicinai,
žemės ūkiui, moksliniams tyrimams.

3.1. Plačiausiai šiuolaikiniuose biotechnologiniuose procesuose naudojami organizmai, jų

išskirtinės savybės ir pritaikymas

Šiuolaikiniuose biotechnologiniuose procesuose dažniausiai naudojamos bakterijos, mielės, augalai

(tiek visi organizmai, tiek jų ląstelių kultūros), gyvūnai (ląstelių kultūros arba visi organizmai – avys,
ožkos, karvės, pelės).

Biotechnologiam procesui organizmą naudoti patogu, jei jis lengvai auginamas, į jį nesunku įterpti
svetimą DNR. Bakterija Escherichia coli (žarnyno lazdelė) visiškai atitinka šiuos reikalavimus. E.
coli – grambakterija, kurios vienintelė 4,6x106 bazių porų (bp) ilgio chromosoma yra supakuota į
kompaktišką nukleoidą. Tai yra geriausiai ištirtas organizmas planetoje. Jo molekulinė biologija per
pastaruosius 60 metų yra detaliai išanalizuota. Vitaminų, aminorūgščių, mineralinių druskų ir anglies
šaltinių turtingoje mitybinėje terpėje ši bakterija pasidalija kas ~20 minučių.

E. coli ląstelės naudojamos nesudėtingų baltymų gamybai. Jose buvo sintetinamas diabeto gydymui
reikalingas insulinas. Baltymas insulinas yra sudarytas iš dviejų aminorūgščių grandinių A (21
aminorūgštis) ir B (30 aminorūgščių, 3.1 pav.). Žmogaus organizme pirmiausia yra susintetinamas
neaktyvus preinsulinas, kuriame A ir B grandines jungia C grandinė. Proteazei hidrolizavus ir
pašalinus C grandinę, susidarius disulfidiniams tilteliams tarp cisteinų A ir B grandinėse gaunamas
aktyvus hormonas. 1982 metais JAV gydymui buvo leista naudoti rekombinantinį insuliną,
susintetintą bakterijose. Praėjus 60 metų nuo insulino atradimo (1921 metais kanadietis gydytojas F.
Bantingas panaudojo naudoti kepenų ekstraktą diabetui gydyti), pagaliau hormono buvo galima gauti
daug ir patenkinti pacientų poreikius.

Pirmųjų bandymų metu, insulino A ir B grandinės buvo sintetinamos atskirai dviejuose bakterijų
kamienuose. Išgrynintos grandinės buvo sujungiamos cheminės reakcijos metu. Vėliau metodas buvo
patobulintas ir sintetinamas visas preinsulinas. Į aktyvų hormoną jis buvo paverčiamas naudojant
fermentus. 3.1 pav. pateikta rekombinantinio preinsulino gamybos schema.

3.1 pav. Rekombinantinio insulino sintezė naudojant E. coli bakterijas

E. coli pagrindinis trūkumas – ši bakterija yra prokariotas. Vadinasi, ji neturi branduolio ir organelių,
būdingų eukariotinėms ląstelėms. Todėl kai kurie klonuoti eukariotų genų produktai gali neveikti E.
coli ląstelėje taip, kaip jie funkcionuoja natūralioje aplinkoje. Jie gali būti netranskribuojami, nes E.
coli RNR polimerazė neatpažins eukariotinio geno promotoriaus. Jie taip pat gali būti neaktyvūs, nes
geno iRNR nebuvo modifikuota taip, kaip tai atliekama eukariotinėje ląstelėje (nebuvo pašalinti
intronai). Arba, susintetintas baltymas nėra aktyvus dėl to, kad prokariotinėje ląstelėje nėra fermentų,
galinčių prie baltymų prijungti angliavandenius (glikozilinti).
Tokiais atvejais, problemų galima išvengti naudojant vienaląsčius eukariotus – mieles, dumblius. Jie
– organizmai, kuriais irgi paprasta manipuliuoti. Dažniausiai naudojamas tokio tipo eukariotas –
mielių Saccharomyces cerevisae, Kluyveromyces lactis ar Pichia pastoris ląstelės. 1981 m. JAV buvo
pradėtas naudoti rekombinantinis chimozinas (sūrių gamyboje reikalingas fermentas), susintetintas ir
išgrynintas iš mielių Kluyveromyces lactis, grybelio Aspergillus niger. Chimozinas yra proteazė, kuri
dalyvauja pieno „sutraukimo“ reakcijoje (kazeino koaguliacijoje). Manoma, kad šiomis dienomis
apie 90 % kietųjų sūrių yra pagaminti naudojant rekombinantinį chimoziną.

Sudėtingų baltymų sintezei naudojamos žinduolių (žiurkėnų, pelių, žmogaus) ląstelių kultūros.
Darbai su eukariotinėmis ląstelėmis yra neišvengiamai susiję su sudėtingesnių metodų naudojimu ir
didesnėmis sąnaudomis. 1982 metais buvo sukurta pirma transgeninė pelytė, kuri sintetino žmogaus
augimo hormoną. Nuo to laiko buvo sukurta apie 100 transgeninių gyvūnų. Jų ląstelės rekombinantinį
baltymą ( antitripsiną,  interferoną, eritropoetiną, cistinės fibrozės laidumo reguliatorių ir daugybę
kitų) sekretavo į organizmo skysčius, dažniausiai – į pieną. Vienas sėkmingiausių transgeninių
gyvūnų buvo avytė Treisė (1990–1997). Jos piene buvo sekretuojamas  antitripsinas (30 g/l),
naudojamas šio baltymo stokojantiems pacientams gydyti. Iki šiol iš transgeninių ožkų pieno
gryninamas rekombinantinis antitrombinas naudojamas kraujo krešėjimui mažinti. Ateityje tikimasi
sukurti veiksmingas rekombinantinių baltymų sekrecijos vištų kiaušiniuose ir šilkverpių lervų
kokonuose technologijas. Jos leistų pritaikyti paprastas rekombinantinių baltymų gryninimo
procedūras.

1990 metais buvo sukurti transgeniniai augalai, sintetinantys žmogaus kraujo serumo albuminą.
Tyrimų pradžioje dažniau buvo naudojamas tabakas (Nicotiana tabacum), nes DNR įterpimo
technologijos į šį augalą buvo labiau išvystytos. Tačiau pamažu siekiama pereiti prie kitų rūšių: javų,
vaisių, daržovių, nes šie augalai gali būti tiesiogiai vartojami maistui. Plėtojami transgeninių augalų,
sintetinančių žmogaus antikūnus, kūrimo metodai. Į šių augalų genomą yra įterpiami žmogaus
imunoglobulinų genai. Suvalgius augalo, turinčio antikūnų prieš tam tikrą patogeną, aktyvuojamas
vadinamasis pasyvusis imuniškumas. Šis apsaugos būdas funkcionuoja trumpai, tačiau yra tinkamas
tuomet, kai pacientui reikia skubios pagalbos (įgėlus gyvatei) ar paciento imuninė sistema pati negali
gaminti antikūnų.

Taigi biotechnologijos procesai žinomi ir taikomi praktiškai nuo seniausių laikų. Jos istorija yra ilga.
Tačiau rekombinantinės DNR kūrimo metodai paspartino moderniosios biotechnologijos vystymąsi
tokiomis kryptimis, kurios klasikinei biotechnologijai buvo neįmanomos.

3.2 . Klonavimo procesas ir jo esmė

Klonavimas – tai visuma nelytinio dauginimo metodų, kuriuos taikant gaunami organizmai,
genetiškai identiški vienas kitam arba tėviniam organizmui. Visi besidomintys sodininkyste žino, kad
augalus galima padauginti nupjovus ir pasodinus auginius. Jie bus klonai.

Terminas „genų klonavimas“ vartojamas panašiam kontekste, tačiau dauginamas yra genas. Jeigu į
bakteriją įterpiama svetimą geną koduojanti DNR seka ir ji (kaip ir chromosominė DNR) gali
pasidauginti besidalijant ląstelėms (bus perduota dukterinėms ląstelėms) – gausime daug ląstelių,
turinčių vienodą DNR molekulę. Vadinasi, klonuojame geną. Auginant ląsteles, padauginamas ir
genas. Dabar galima nustatyti jo DNR seką, tirti iRNR sintezę, galima aktyvinti geno koduojamo
produkto sintezę (raišką) ir išgryninti baltymą. Galima įterpti gene mutaciją ir tirti, kaip pasikeičia
mutantinio baltymo veikla. Galima išgryninti DNR iš bakterijų ląstelių ir ją įterpti į kito organizmo
ląsteles (varlės oocitus) ir juose tirti geno raišką. Tyrimų priemonės, tikslai ir galimybės gali būti
įvairūs. Tačiau visi tyrimai prasideda nuo pirmojo etapo – geno klonavimo.

Į kai kuriuos organizmus (kai kurias bakterijas) DNR įterpti galima nesunkiai. Šis procesas vadinamas
transformacija, o ląstelės, į kurias siekiama įterpti DNR – ląstelėmis šeimininkėmis. Tačiau daugumą
ląstelių reikia paveikti cheminiais reagentais ar fiziniais veiksniais, kad DNR prasiskverbtų per
ląstelės membraną. Be to, įterpta DNR molekulė gali būti greit hidrolizuota viduląstelinių fermentų
(vadinamų nukleazėmis). Taip pat ji gali „prasiskiesti“, būti „pamesta“ dalijimosi metu, jei ji nebus
padauginta (replikuojama) prieš pasidalijant ląstelei.

Kad to nenutiktų, naudojami vektoriai – specialios DNR molekulės, į kuriuos klonavimo metu ir
įterpiamas pageidaujamas genas. Ypač svarbi šių vektorių savybė yra ta, kad jie gali replikuotis
ląstelėje šeimininkėje į kurią yra transformuojami. Jie turi tam tikras DNR sekas, vadinamas ori (nuo
angl. origin of replication). Šias sekas atpažįsta, prie jų jungiasi ir čia replikaciją pradeda ląstelės
šeimininkės baltymai, atsakingi už DNR replikaciją – DNR polimerazės.

Klonavimui yra sukurta ir naudojama daug klonavimo vektorių. Paprasčiausi jų – plazmidės. Tai yra
žiedinės DNR molekulės, dažnai aptinkamos gamtoje – bakterijų ląstelėse. Jos replikuojasi
nepriklausomai nuo bakterijų chromosomos ir dalijimosi metu visada yra paskirstomos į abi
dukterines ląsteles.

Geno klonavimo schema yra pateikta 3.2 pav. Norint DNR fragmentą, turintį rūpimą geną, įterpti į
klonavimo vektorių, reikalingi specialūs metodai. Jie leidžia:

1. Iškirpti rūpimą geną iš didelės DNR molekulės;

2. Įkirpti žiedinį plazmidinį klonavimo vektorių;
3. Vėl sujungti dviejų DNR molekulių galus.

Didžiulį postūmį klonavimo eksperimentams padarė DNR modifikuojančių fermentų atradimai ir jų

pritaikymas. Šie fermentai – restrikcijos endonukleazės, kerpančios (hidrolizuojančios) DNR tam
tikrose srityse bei DNR ligazės, sujungiančios DNR galus. Galiausiai, įterpus pageidaujamą geną į
klonavimo vektorių, sukurtoji nauja DNR molekulė (vadinama rekombinantine DNR)
transformuojama į ląsteles šeimininkes. Klonavimo vektorius taip pat koduoja geną, kurio produktas
lemią atsparumą antibiotikui. Tada nesunkiai galima atrinkti transformuotas ląsteles, turinčias
rekombinantinę DNR. Transformacijos mišinys išsėjamas ant mitybinės terpės su antibiotiku. Tokioje
terpėje auga tik transformuotos ląstelės – ląstelės, turinčios klonavimo vektorių.
3.2 pav. Geno klonavimo schema
3.3. DNR modifikuojantys baltymai – įrankiai, leidžiantys manipuliuoti DNR seka ir kurti
naujų savybių turinčius baltymus

Konstruojant rekombinantinę DNR, svarbu turėti gerus įrankius, leidžiančius manipuliuoti DNR
molekulėmis. Jas reikia hidrolizuoti ir vėl sujungti in vitro – mėgintuvėlyje. Taip susintetinama nauja
DNR molekulė. Sintezei panaudojami fermentai. Šie fermentai dažniausiai perkami iš tiekėjų –
biotechnologinių kompanijų, kurios juos išgrynina iš įvairių organizmų.

Restrikcijos endonukleazės

Vieni iš svarbiausių genų inžinerijos įrankių yra „molekulinės žirklės“ – restrikcijos endonukleazės
(trumpiau vadinamos restriktazėmis). Jos hidrolizuoja fosfodiesterinę DNR jungtį. Dažnai ši reakcija
vadinama restrikcija. Restrikcijos endonukleazės dažnai yra aptinkamos gamtoje – bakterijose. Pagal
tai, kokioje bakterijoje fermentas buvo aptiktas, jam suteikiamas pavadinimas. Panaudojami bakterijų
genties ir rūšies pavadinimai. Restriktazė PstI buvo atrasta bakterijoje Providencia stuartii. Trys
skirtingo savitumo restriktazės HaeI, HaeII ir HaeIII, atpažįstančios skirtingus DNR taikinius,
atrastos bakterijoje Haemofilus aegyptius. Reikšminga tai, kad kiekvienam fermentui yra būdingas
savitumas – jis atpažįsta ir hidrolizuoja tik tam tikrą DNR seką (taikinį). 3.3 pav. yra pateikta DNR
hidrolizės schema restrikcijos endonukleaze EcoRI.

3.3 pav. DNR hidrolizė restrikcijos endonukleaze EcoRI

Kai kurios dažniausiai vartojamos restrikcijos endonukleazės bei jų taikiniai pateikti 3.1 lentelėje.
Nuo to, kurią fosfodiesterinę jungtį taikinyje hidrolizuoja fermentas, priklauso, kokie bus po reakcijos
susidariusių DNR fragmentų galai. Po restrikcijos DNR fragmentai gali būti buki arba lipnūs:
išsikišęs 3‘ galas arba išsikišęs 5‘ galas. Yra atrasta restriktazių, kurios atpažįsta tą patį taikinį – SmaI
ir XmaI (3.1 lentelė), tačiau skelia skirtingą jo fosfodiesterinę jungtį. Todėl vienu atveju susidaro
buki, o kitu – lipnūs, 5‘ išsikišę DNR galai.
 DNR galų
Restriktazė Taikinys Hidrolizės vieta* Hidrolizės produktų galai
tipas
5‘-G/GATCC-3‘ 5‘-G-3‘ 5‘ GATCC-3‘
BamHI 5‘-GGATCC-3‘
3‘-CCTAG/G-5‘ 3‘-CCTAG-5‘ 3‘-G-5‘
5‘ išsikišę
5‘-G/AATTC-3‘ 5‘-G-3‘ 5‘-AATTC-3‘
EcoRI 5‘-GAATTC-3‘
3‘-CTTAA/G-5‘ 3‘-CTTAA-5‘ 3‘-G-5‘
5‘ išsikišę
5‘-CTGCA/G-3‘ 5‘-CTGCA-3‘ 5‘-G-3‘
PstI 5‘-CTGCAG-3‘
3‘-G/ACGTC-5‘ 3‘-G-5‘ 3‘-ACGTC-5‘
3‘ išsikišę
5‘-GAGCT/C-3‘ 5‘-GAGCT-3‘ 5‘-C-3‘
SstI 5‘-GAGCTC-3‘
3‘-C/TCGAG-5‘ 3‘-C-5‘ 3‘-TCGAG-5‘
3‘ išsikišę
5‘-GG/CC-3‘ 5‘-GG-3‘ 5‘-CC-3‘
HaeIII 5‘-GGCC-3‘ buki
3‘-CC/GG-5‘ 3‘-CC-5‘ 3‘-GG-5‘
5‘-CCC/GGG-3‘ 5‘-CCC-3‘ 5‘-GGG-3‘
SmaI 5‘-CCCGGG-3‘ buki
3‘-GGG/CCC-5‘ 3‘-GGG-5‘ 3‘-CCC-5‘
5‘-C/CCGGG-3‘ 5‘-C-3‘ 5‘-CCGGG-3‘
XmaI 5‘-CCCGGG-3‘
3‘-GGGCC/C-5‘ 3‘-GGGCC-5‘ 3‘-C-5‘
5‘ išsikišę
*hidrolizuojama fosfodiesterinė jungtis pažymėta pasviruoju brūkšniu

3.1 lentelė. Restrikcijos endonukleazių atpažinimo sekos ir hidrolizės vietos

Dviejų skirtingų DNR molekulių lipnūs galai, susidarę hidrolizuojant ta pačia restriktaze, yra
komplementarūs vienas kitam ir gali vėl sulipti. Ši sąveika yra silpna. Tad norint sujungti DNR
molekules, reikia vėl suformuoti fosfodiesterinę jungtį. Tam naudojami kiti fermentai – DNR ligazės.

DNR ligazės

DNR ligazės taip pat yra svarbus genų inžinerijos įrankis. Šie fermentai – tai molekuliniai klijai,
sujungiantys dvi skirtingas DNR molekules (klonavimo vektorių ir įterpiamą geną). Tarp nukleotidų
suformuojamas cheminis ryšys – fosfodiesterinė jungtis.

Organizmų ląstelėse ligazės funkcija yra užtaisyti viengrandinės DNR trūkius DNR molekulėje.
Trūkiai atsiranda dėl įvairių DNR pažaidų arba lieka natūraliai tarp gretimų DNR fragmentų
(vadinamųjų Okazakio fragmentų), vykstant DNR replikacijai. Fermentinės reakcijos metu, DNR
ligazė katalizuoja cheminio ryšio susidarymą tarp vienos grandinės 3‘ gale esančios hidroksilo grupės
(–OH) ir kitos grandinės 5‘ gale esančios fosfato liekanos (3.4 pav.). Svarbu tai, kad DNR hidrolizės
restrikcijos endonukleazėmis metu būtent tokie DNR galai ir lieka – 3‘ gale lieka hidroksilo grupė, o
5‘ gale – fosfato liekana.
 3.4 pav. DNR ligazės katalizuojama DNR sujungimo reakcija

DNR polimerazės

DNR polimerazės katalizuoja reakciją, kurios metu prie DNR molekulės 3’ galo hidroksilo grupės
pagal matricos seką jungiami komplementarūs nukleotidai. Suformuoja fosfodiesterinė jungtis ir
ilginama DNR grandinė (3.5 pav.). DNR molekulė sintezės metu ilgėja 5’→3’ kryptimi.

3.5 pav. DNR polimerazės katalizuojama DNR sintezė

Taq DNR polimerazė, aptikta ir išgryninta iš termofilinių (gyvenančių karštosiose versmėse)

bakterijų Thermofilus aqauticus, naudojama polimerazės grandinei reakcijai (PGR). PGR metodas
yra skirtas padauginti DNR molekules mėgintuvėlyje in vitro. Iš nedidelio pradinės medžiagos kiekio
gaunami milijardai DNR molekulių. Šio metodo sukūrimas ir pritaikymas sukėlė didžiulį perversmą
moderniojoje biotechnologijoje. Polimerazės grandininės reakcijos metodą panagrinėsime 3.4
skyriuje. Svarbu yra tai, kad šios reakcijos metu galima ne tik padauginti DNR molekules, bet ir į jas
įterpti mutacijas. Tokiu būdu, galima modifikuoti geną. Jo koduojamo baltymo aminorūgščių seka
bus kitokia. Vadinasi, galime sukurti mutantinį baltymą su pakeistomis savybėmis.
Išskirtinių savybių turi atvirkštinės transkriptazės, kurios funkcionuoja kaip nuo RNR priklausomos
DNR polimerazės (3.6 pav.). Jų yra retrovirusuose (virusuose, kurių genome informacija yra
koduojama RNR molekulėse). Infekcijos į šeimininko ląsteles metu, šie fermentai nuo viruso genomo
– RNR molekulės sintetina DNR. Ši DNR vadinama cDNR (kopijinė DNR). Tokiu būdu, viruso
genomas (perkoduotas iš RNR į DNR) įterpiamas į šeimininko genomą. Laboratorijoje šis fermentas
gali būti sėkmingai naudojamas cDNR sintezei nuo iRNR. Susintetinta cDNR vėliau gali būti
įklonuojama į klonavimo vektorių ir įterpiama į ląsteles.

3.6 pav. cDNR sintezė nuo iRNR dalyvaujant atvirkštinei transkriptazei

Nukleazės

Nukleazės dažnai yra laikomos pikčiausiais tyrėjo, kuris stengiasi išsaugoti nepažeistus RNR ir DNR
preparatus, priešais. Tačiau kartais deoksiribonukleazės (DNazės) ir ribonukleazės (RNazės) yra ir
nepamainomi pagalbininkai genų inžinerijos laboratorijose. Šiuo metu plačiausiai naudojamos
nukleazės – DNazėI (rekombinantinė – išgryninta iš E. coli ląstelių) ir RNazėA (natyvi – išgryninta
iš jaučio kasos ląstelių). DNazėI hidrolizuoja viengrandinės ar dvigrandinės DNR fosfodiesterines
jungtis (3.7 pav.). Praktiškai DNazėI naudojama pašalinti DNR priemaišoms iš RNR preparatų.
RNazėA yra endoribonukleazė, hidrolizuojanti viengrandinę RNR. Dažniausiai ji yra naudojama
pašalinti RNR priemaišoms iš DNR preparatų.

3.7 pav. DNR hidrolizė DnazeI

3.4. Genų inžinerijos metodai: ląstelių transformacija, polimerazės grandininė reakcija, DNR
sekos kaita ir mutagenezė, konkrečių genų paieška, genų raiškos tyrimai

Ląstelių transformacija

Manipuliacija klonuojamais DNR fragmentais bei klonavimo vektoriais (restrikcija, ligavimas)

vyksta mėgintuvėlyje. Vėliau susiduriama su kita užduotimi – reikia įterpti sukurtą rekombinantinę
molekulę į ląsteles šeimininkes.

Bakterijų transformaciją pirmą kartą 1928 m. pademonstravo F. Griffithas. Jis pastebėjo, kad
nepatogeniški pneumokokai (Streptococcus pneumoniae), sumaišyti su kaitinant inaktyvuotais
patogeniškais pneumokokais, taip pat tampa patogeniški. Jie sukelia pneumoniją tyrimui naudotoms
pelėms (3.8 pav.).

3.8. pav. Bakterijų transformacija (1928 m., F. Griffithas)

Tada dar nebuvo suprantama šios transformacijos priežastis – DNR ir jos patekimas į ląsteles. Šis
eksperimentas nesunkiai pavyko, nes pneumokokai yra imlūs (kitaip: kompetentiški, nuo angl.
competent) svetimai DNR. Gamtoje yra daugybė tokių imliųjų bakterijų. Tačiau genų inžinerijoje
labai dažnai naudojama E. coli bakterija anaiptol nepasižymi šia klonavimui naudinga savybe. Todėl
laboratorijoje E. coli ląsteles tenka auginti ir paveikti tam tikrais tirpalais, kad jos pasidarytų
kompetentiškos. Paskui ląstelės sumaišomos su DNR tirpalu ir galiausiai išsėjamos ant atrankios
terpės (dažniausiai turinčios antibiotiko). Tokioje terpėje auga tik transformuotos ląstelės.
Transformacija nėra labai veiksmingas procesas. Sėkminga galima laikyti transformaciją, jei 10 9
bakterijų transformavus 0,1 g plazmidinės DNR, gaunama 1000 transformuotų bakterijų kolonijų.
Jeigu transformuojamas ligavimo mišinys – transformantų būna dar mažiau. Todėl buvo kuriami kiti
transformacijos metodai. Nauji DNR įterpimo metodai: elektroporacija ir mikroinjekcija (žr. 9.5 sk.).

Polimerazės grandininė reakcija

Polimerazės grandinės reakcijos (PGR) metodo sukūrimas (1983 m.) ir pritaikymas sukėlė didžiulį
perversmą moderniojoje biotechnologijoje. Šis metodas taikomas įvairiose srityse: nuo klinikinės
diagnostikos (kai staiga tapo įmanoma nustatyti ligos diagnozę per keletą valandų) iki teismo
ekspertizės, kai tapo įmanoma gauti patikimos informacijos iš smulkių įkalčių.

Jo autoriui amerikiečių biochemikui K. Mullisui 1993 m. paskirta Nobelio premija. Iš esmės, PGR
metodas yra skirtas padauginti DNR molekules mėgintuvėlyje (in vitro). Iš nedidelio pradinės
medžiagos kiekio gaunami milijardai DNR molekulių. DNR sintezei naudojama Taq DNR
polimerazė, išskirta iš termofilinių bakterijų. Ji katalizuoja reakciją esant aukštai temperatūrai (> 70
°C).

Padaugintas DNR fragmentas kartais dar vadinamas amplikonu (nuo angl. to amplify – padauginti).
Dauginamo DNR fragmento ilgį apsprendžia du trumpi (17–25 nt ilgio) sintetiniai oligonukleotidai,
kurie yra komplementarūs dvigrandinei DNR, vadinamai matrica. Vienas oligonukleotidas yra
komplementarus prasminei (geną koduojančiai) grandinei, o kitas – priešprasmei grandinei (3.9 pav.).
Jie tarnauja kaip pradmenys DNR sintezės pradžiai: prie pradmenų 3‘ galo hidroksigrupės DNR
polimerazė pagal matricos seką prijungia komplementarius nukleotidus – suformuoja fosfodiesterinę
jungtį ir ilgina DNR grandinę (3.9 pav.). Prieš dauginant DNR fragmentą, reikia parinkti pradmenų
sekas ir susintetinti savitus oligonukleotidus. Tai yra pagrindinis PGR metodo trūkumas: reikia žinoti
DNR fragmento, kurį norima padauginti, seką.
 3.9 pav. DNR polimerazės katalizuojama DNR sintezė

Atliekant PGR, mišinyje turi būti šių komponentų: DNR (matrica), pradmenų pora, DNR
polimerazės ir deoksinukleotidų trifosfatų (dNTP), Mg2+ ir kitų jonų, palaikomas tinkamas pH.
Reakcijos mišinys laikomas programuojamuose termocikleriuose, kurie 25–30 kartų kartoja
temperatūrinius ciklus.

Vieno ciklo metu vyksta DNR denatūracija, pradmenų prilipimas ir DNR sintezė (3.10 pav.).
Pirmiausia mišinys trumpai pakaitinamas (1 min., 95 °C) – DNR matrica denatūruojama. Vėliau
mišinys trumpam (~30 s) atvėsinamas iki tokios temperatūros, kuri yra optimali pradmenims
komplementariai prilipti prie denatūruotos DNR grandinių. Ši temperatūra priklauso nuo
pradmenų ilgio bei sekos. Įprastai jos vertė svyruoja tarp 45 °C – 60 °C. Ją galima suskaičiuoti
teoriškai ar nustatyti eksperimentiškai. Svarbu parinkti tinkamą pradmenų prilipinimo
temperatūrą. Jei temperatūra per aukšta – pradmenys gali nelipti, tada laukiamas produktas nebus
susintetintas. Jei temperatūra per žema – pradmenys gali prilipti prie kitų (nevisiškai
komplementarių) DNR matricos sričių. Dėl to bus susintetinti netinkami DNR fragmentai.

Galiausiai mišinio temperatūra pakeliama iki 72 °C – tai yra optimali temperatūra DNR sintezei.
Taq DNR polimerazė pagal matricos seką jungia komplementarius nukleotidus ir ilgina DNR
grandines ~1000 bazių/min greičiu. Svarbu pastebėti, kad pirmame cikle naujų DNR grandinių
sintezė vyks tol, kol prasidės kito ciklo denatūracija. Ciklo pabaigoje turėsime dvigrandinių DNR
molekulių, kurių viena grandinė yra iš matricos, o kita – naujai susintetinta, prasidedanti
pradmeniu ir besitęsianti tiek, kiek DNR polimerazė suspėjo susintetinti.

Antrojo ciklo denatūracijos metu šių molekulių grandinės atskiriamos, „prilipinimo stadijos“
metu prie jų prilimpa pradmenys. Kai temperatūra padidinama iki 72 °C, vėl sintetinamos naujos
DNR grandinės. Po trečio ciklo reakcijos mišinyje jau bus pageidaujamo amplikono molekulių,
o vėlesniuose PGR cikluose prasideda eksponentinis jų kiekio didėjimas.

PGR temperatūrinis režimas padeda tinkamai manipuliuoti DNR molekulėmis (dvigrandinių

molekulių denatūracija, pradmenų prilipinimas). Sintezei naudojama Taq DNR polimerazė iš
termofilinių bakterijų puikiai išlaiko savo aktyvumą. Palyginimui, dauguma DNR polimerazių iš
įprastų organizmų būtų denatūravusios ir negrįžtamai praradusios savo katalizinį aktyvumą
kaitinant reakcijos mišinį tokioje aukštoje temperatūroje.

3.10 pav. PGR schema

Pasibaigus PGR, susidarę produktai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu.
Pastaraisiais metais sukurta įvairių PGR metodo variantų, skirtų įvairioms genų inžinerijos
procedūroms palengvinti. PGR metodu galima padauginti DNR fragmentą ir klonuoti jį į vektorių.
Be to, klonavimo procedūrą galima palengvinti į oligonukleotidinius pradmenis įterpus restrikcijos
endonukleazės taikinius. Tada PGR produktą reikia hidrolizuoti ta restrikcijos endonukleaze ir įterpti
į paruoštą klonavimo vektorių (žr. 9.10 sk.). PGR metodu galima įterpti mutacijų į klonuotą geną.

Mutagenezė

DNR mutagenezė yra svarbus etapas genų inžinerijos darbuose. Pakeitus geno DNR seką, pakeičiama
geno koduojamo baltymo aminorūgščių seka. Mutagenezės būdu buvo sukurta daug naujų
biotechnologijos produktų. Jų savybės (fermentų katalizuojamos reakcijos greitis, atrankumas
reakcijos substratams, stabilumas esant įvairioms aplinkos temperatūroms) buvo pagerintos. Taip
žymiai padidintas jų efektyvumas.

Pirmieji DNR mutagenezės bandymai buvo atliekami in vivo – veikiant visą organizmą cheminiais
reagentais (alkilinančiais DNR, įsiterpiančiais į DNR ar bazių analogais) ir fiziniais veiksniais (UV,
radioaktyviaja spinduliuote). Tačiau tokia mutagenezė turėjo daug trūkumų. Rūpimo geno mutacijų
dažnis būdavo mažas. Todėl reikėjo atlikti daug tyrimų, kol būdavo surandama ląstelė, turinti
mutaciją rūpimame gene. Be to, nebuvo įmanoma prognozuoti, kokia mutacija (nukleotido įterpimas,
iškrita ar pakeitimas) įvyks.

DNR mutagenezė palengvėjo pritaikius polimerazės grandininės reakcijos metodą. Naudojant šį

metodą, mutagenezę galima suplanuoti. Galima pakeisti tik vieną bazių porą (ar keletą bazių porų)
gene – tokiu atveju bus pakeista aminorūgštis. Galima įterpti ar pašalinti nukleotidų tripletą – tada
bus įterpta ar pašalinta tripleto koduojama aminorūgštis. Mutagenezei naudojami oligonukleotidiniai
pradmenys, kuriuose yra įterpta pageidaujama mutacija. PGR metu susintetinami šią mutaciją turintys
linijiniai DNR fragmentai (3.11 pav.). Jie suliguojami ir transformuojami į ląsteles.
 3.11 pav. Klonuoto geno mutagenezė PGR metodu

Mutagenezės metodais galima keisti geno seką ir gauti kitokį jo koduojamą produktą – baltymą. Šis
principas dar dažnai vadinamas baltymų inžinerija. Šiuolaikiniai metodai leidžia kurti naujus
baltymus pakankamai greitai. Tačiau jokios žinios ar bioinformatiniai įrankiai dar nepadeda tiksliai
nuspėti, kokia bus sukonstruoto baltymo erdvinė struktūra ir kokios savybės jam bus būdingos. Todėl
naujo baltymo savybes tenka ištirti ir, palyginus su „natūralaus“ baltymo savybėmis, įvertinti, ar
pakeitimai davė laukiamos naudos.

DNR sekoskaita

DNR sekoskaitos metodo (1977 m.) kūrėju galima laikyti britų mokslininką Fredericką Sangerį. Šiais
laikais yra ištobulinti nauji DNR sekoskaitos metodai, vadinami naujos (antrosios, trečiosios) kartos
DNR sekoskaita. Tačiau Sangerio metodas yra vis dar plačiai naudojamas klonuotų ir PGR metu
padaugintų DNR fragmentų sekai nustatyti. Sangerio metodo, dar dažnai vadinamo
dideoksisekoskaita, principas yra pavaizduotas 3.12 pav. Kad suprastume šį principą, reikia prisiminti
du kertinius faktus apie DNR sintezę.

 Pirma, DNR sintezė neprasideda „tuščioje vietoje“. Jai reikalinga matrica ir oligonukleotidinis
pradmuo, prie kurio DNR polimerazė prijungia naujus matricai komplementarius nukleotidus.

 Antra, prie sintetinamos grandinės prijungiami deoksinukleotidai (dNTP) sudaro

fosfodiesterinį ryšį tarp prijungiamo nukleotido fosfato ir sintetinamos grandinės 3‘ galo
hidroksilo liekanos (–OH) (žr. 3.12 pav).
 3.12 pav. DNR sintezės stabdymas dideoksinukleotidais

DNR sekoskaitai vietoj natūralių dNTP yra panaudojami ddNTP (dideoksinukleotidai). Jie neturi
deoksiribozės žiedo 3‘ padėtyje hidroksilo grupės. dNTP ir ddNTP struktūra yra palyginta 3.13 pav.
Kadangi ddNTP turi fosfatą, sintezės metu susidaro fosfodiesterinis ryšys tarp fosfato ir sintetinamos
grandinės 3‘–OH. Tačiau po šios reakcijos, grandinės 3‘ gale nėra hidroksilo. Todėl kitas nukleotidas
nebegali prisijungti. DNR sintezė nutrūksta (3.12 pav.).

3.13 pav. dNTP ir ddNTP

Jei pakeisime vieną iš keturių DNR sintezei būtinų deoksinukleotidų dideoksinukleotidu

(dATPddATP), DNR sintezė vyks tol, kol pirmas ddATP bus įjungtas į sintetinamą grandinę. Tada
sintezė sustos. Jei skirtinguose mėgintuvėliuose vykdysime keturias tokias reakcijas, kuriose vienas
iš dNTP bus pakeistas analogišku ddNTP, DNR polimerazė susintetins keturias skirtingo ilgio DNR
grandines. Kiekvienos iš jų sintezė nutrūks įjungus ddNTP. O jeigu reakcijos mišinyje panaudosime
šių dviejų nukleotidų mišinį (dATP ir ddATP), tada DNR sintezė vyks beveik normaliai ir tik
retkarčiais (įjungus ddATP) nutrūks. Tuomet susidarys įvairaus ilgio matricos kopijų mišinys (3.14
pav.). Gautus keturių reakcijų mišinius galima išfrakcionuoti elektroforezės metu. Kuo trumpesnė
bus molekulė, tuo ji greičiau judės gelyje. Po elektroforezės, gelyje gausime fragmentų paveikslą. Jį
perskaitę pagal įvairių fragmentų išsidėstymą galime iššifruoti DNR matricos seką (3.14 pav.).
Vienintelis nepatogumas – DNR fragmentai gelyje plika akimi nematomi. Kaip juos pamatyti? Vienas
paprasčiausių vaizdinimo būdų – panaudoti radioaktyvia žyme pažymėtą pradmenį. Tada po
elektroforezės atliekama autoradiografija. Gelis uždengiamas rentgeno juosta, eksponuojamas ir,
išryškinus nuotrauką, iššifruojama DNR seka (3.14 pav.).

3.14 pav. Sangerio dideoksinukleotidinė sekoskaita

Automatizavus Sangerio dideoksinukleotidinės sekoskaitos metodą (žr. 9.15 sk.) 2001 m. buvo
nustatyta žmogaus genomo DNR seka. Ką sužinojome, kai žmogaus genomo seka tapo žinoma?
Pirmiausia buvo suprasta, kad genų yra kur kas mažiau, nei manyta anksčiau. 1990-aisiais metais
buvo spėjama, kad žmogus turi apie 50 000 genų (kai kurių mokslininkų manymu – apie 150 000).
Tačiau paaiškėjo, kad jų yra tik apie 23 000. Mažiau nei 2 % žmogaus DNR koduoja genus. Visa kita
– pasikartojančios nekoduojančios sekos. Apie 50 % genų funkcija dar nėra žinoma. Rasta daug genų,
kurių sekos ir koduojami baltymai yra labai panašūs į bakterijų genus ir baltymus. Taip pat nustatyta
daug genų, iš kurių iRNR brendimo metu iškerpant intronus gali susidaryti daug alternatyvių iRNR
molekulių. Pagal jas susintetinami skirtingi baltymai. Paaiškėjo, kad dviejų skirtingų žmonių DNR
seka skiriasi tik ~0,2 % (1 nukleotidas iš 500). Šie skirtumai vadinami vieno nukleotido pakitimais
(angl. single nucleotide polymorphism, SNP). Įdomūs faktai apie žmogaus genomą pateikti 3.2
lentelėje.

Išspausdinta žmogaus genomo DNR seka tilptų į du šimtus knygų, kuri kiekviena turėtų 500 puslapių.
DNR knygos skaitymas (24 val. per parą 1 raidės/s greičiu) užtruktų šimtą metų.
Stenografistas, dirbantis 8 val. per parą, užtruktų 50 metų, kol užrašytų DNR seką.
Dviejų žmonių DNR skiriasi 0,2 % (arba 1 iš 500 bazių).
Jei du žmonės kartu pradėtų skaityti savo DNR knygas, po 8,5 minutės jie aptiktų pirmąjį DNR sekų
nesutapimą.
Žmogaus ir šimpanzės DNR yra 98 % identiška.
Didžioji dalis žmogaus genomo (~97 %) nekoduoja genų.
22 chromosoma buvo nusekvenuota pirmiausia. Tai atliko Sangerio institutas (Didžioji Britanija) 1999
m. gruodį.
Kiekvienoje ląstelėje 1,8 m ilgio DNR yra kompaktiškai supakuota į 0,01 mm ilgio struktūrą.
Jei visų žmogaus kūno ląstelių DNR išdėliotume vieną šalia kitos, tuo „siūlu“ iki Saulės ir atgal
nukeliautume 600 kartų.

3.2 lentelė. Įdomūs faktai apie žmogaus genomą

Konkrečių genų paieška

Įsivaizduokime, kad mokslininkas aptiko bakterijas, kurios labai efektyviai hidrolizuoja riebalus.
Galima spėti, kad bakterijos sintetina ir į aplinką sekretuoja baltymą, greičiausiai fermentą lipazę. Ji
vykdo riebalų hidrolizės reakciją. Būtų naudinga klonuoti šios lipazės geną, ištirti fermento savybes.
Gal įmanoma jį sintetinti didesniais kiekiais ir panaudoti buitinių valymo priemonių gamybai?
Tyrėjas neturi jokios informacijos, kokia tai lipazė ir kokia jos geno seka.

Tokiu atveju, tenka išgryninti bakterijos genominę DNR, ją hidrolizuoti ir klonuoti visus fragmentus.
Gaunama didžiulė transformantų, turinčių rekombinantinę DNR, kolekcija. Ji vadinama DNR
biblioteka. Joje tenka ieškoti tos vienos (ar kelių) bakterijų kolonijų, turinčių lipazės geną. Šiuo
atveju, surasti koloniją gal ir nebus sudėtinga. Reikės patikrinti transformantų gebėjimą hidrolizuoti
riebalus. Sukūrus biocheminį bakterijų lipazės aktyvumo testą, teks tikrinti tūkstančius transformantų
ir ieškoti ląstelių, kuriose šis aktyvumas padidėjęs dėl klonuoto geno raiškos.

Tikslinių genų paieška genų bibliotekoje gali būti sudėtingiausias darbo etapas. Ypač jei duomenų
apie baltymo funkciją ir jo geną nėra daug. Šiuo sparčiu biotechnologijos metodų vystymosi
laikotarpiu (kai praeito šimtmečio pabaigoje prasidėjo DNR sekoskaitos era) yra sukaupta daug
duomenų apie įvairių organizmų genų DNR seką,baltymų pirminę (aminorūgščių seka) ir antrinę
(sekos išsidėstymas erdvėje) struktūrą.

Atlikus bioinformatinę paiešką duomenų bazėse, nesunku pastebėti, kad tą pačią funkciją atliekantys
baltymai dažnai turi panašius aminorūgščių sekos motyvus. Ypač tai pastebima baltymo srityse,
kurios yra atsakingos už tam tikrą funkciją – fermento aktyviajame centre, porą membranoje
sudarančioje ar su DNR sąveikaujančioje baltymo dalyje. Duomenų bazėse suradę kitų
mikroorganizmų lipazių genų sekas, turėsime pradinę informaciją, kokia galėtų būti klonuotos lipazės
DNR seka. Ją žinant, galima pritaikyti įvairius metodus lipazės geno paieškai DNR bibliotekoje.
Pavyzdžiui, galime naudoti DNR hibridizaciją.

Hibridizacijos principas yra paremtas tuo, kad dvigrandinės DNR molekulės grandines, esant tam
tikrai temperatūrai (~70–90 °C), galima atskirti vieną nuo kitos. Šis procesas vadinamas denatūracija.
Tirpalui vėstant, grandinės vėl susijungia, nes vėl susidaro vandenilinės jungtys tarp skirtingų
grandinių komplementarių bazių. Šis grįžtamasis procesas vadinamas renatūracija (3.15 pav.).
Panašūs fiziniai DNR molekulių virsmai vyksta ir hibridizacijos metu. Tiriami DNR fragmentai
denatūruojami, o rūpimos konkrečios molekulės aptinkamos naudojant zondą. Zondas yra ieškomai
DNR ar RNR komplementari molekulė. Zondai sintetinami in vitro, naudojant nukleotidus, prie kurių
kovalentine jungtimi yra prijungta radioaktyvi ar fluorescencinė žymė.

Veikiant tiriamąjį DNR ar RNR mišinį šiuo zondu, jis prisijungia (hibridizuojasi) prie
komplementarios sekos, kuri ir yra ieškomoji DNR molekulė. Zondo prisijungimo vieta, o kartu ir
taikinys, prie kurio jis prisijungė (ieškomos DNR ar RNR molekulės), nustatomos atlikus
autoradiografiją (jei zondas pažymėtas radioaktyvia žyme) ar matuojant mišinio fluorescenciją (jei
zondas pažymėtas fluorescuojančia žyme).

3.15 pav. DNR denatūracija ir renatūracija

Jei DNR bibliotekoje norime aptikti rekombinantinę DNR, turinčią lipazės geną, galime panaudoti
kolonijų hibridizacijos metodą (3.16 pav.). Pirmiausia šios bibliotekos transformantų kolonijos
perkeliamos ant nitroceliuliozinės (ar nailoninės membranos) ir lizuojamos. Ląstelių nuolaužos
nuplaunamos, išlaisvinta DNR imobilizuojama membranos paviršiuje ir hibridizuojama su zondu.

Zondui paruošti, galima panaudoti žinomos lipazės iš kitų bakterijų (S. enterica) geną. Reikia in vitro
susintetinti geno kopiją naudojant nukleotidus su radioaktyvia žyme. Toks zondas hibridizacijos metu
prisijungs prie sau komplementarių sekų. Po autoradiografijos, nustatomos radioaktyvaus zondo
sankaupos vietos ant membranos. Ten, kur zondas prisijungė prie rekombinantinės DNR, bus matoma
„radioaktyvi kolonija“. Ji koduoja nežinomos lipazės geną. Sulyginus signalo vietą membranoje ir
suradus koloniją lėkštelėje, atrenkama transformanto kolonija, kurios DNR šioje vietoje buvo
imobilizuota.
 3.16 pav. Kolonijų hibridizacija

Kitas DNR hibridizacijos pavyzdys yra Southerno hibridizacija. Jos metu tiriama ne bakterijų
kolonijų DNR, o DNR fragmentų mišinys, išfrakcionuotas agaroziniame gelyje. DNR fragmentai
pernešami ant membranos ir (panašiai kaip ir kolonijų hibridizacijos atveju) jie hibridizuojami su
žymėtu zondu (žr. sk. 9.13). Taigi, užuot konstravus DNR biblioteką ir klonavus visus hidrolizuotus
bakterijos genomo fragmentus, pirmiausia būtų galima aptikti lipazę koduojantį DNR fragmentą
Southerno hibridizacijos metu ir atrankiai jį klonuoti.

Genų raiškos tyrimai

Panagrinėsime ir kitokį hibridizacijos variantą – Northerno hibridizacijos metodą. Šis metodas yra
labai panašus į kolonijų ir Southerno hibridizacijos metodus. Skiriasi tik tiriamas nukleorūgščių tipas.
Kolonijų ir Southerno hibridizacijos metu analizuojama DNR, o Northerno hibridizacijos metu –
RNR. Iš ląstelių išgryninta RNR yra išfrakcionuojama gelyje ir hibridizuojama su žymėtu zondu. Šio
tyrimo metu gaunama informacija apie geno raišką – ar nuo rūpimo geno yra sintetinama iRNR. Todėl
Northerno hibridizacija dar vadinama geno raiškos tyrimų metodu. Naudojant šį metodą, galima
analizuoti, kaip keičiasi konkretaus geno raiška (iRNR sintezė) esant įvairioms organizmo augimo ar
streso sąlygoms. Prisijungusio zondo kiekis (todėl ir signalo – radioaktyvaus ar fluorescencinio –
stiprumas) priklauso nuo konkretaus geno iRNR kiekio.

Tarkime, kad klonavus nežinomos lipazės geną, eksperimentatoriui kilo įtarimas, kad lipazės geno
raiška (jo iRNR sintezė ar baltymo sintezė) priklauso nuo mitybinės terpės, kurioje auga bakterijos,
sudėties. Todėl jis nusprendė patikrinti, kokia yra lipazės geno raiška, jei bakterijos auginamos
skirtingose mitybinėse terpėse. Jis augino bakterijas terpėse, turinčiose skirtingų priedų: vienoje
terpėje pripilta triacilgliceridų, kitoje – diacilgliceridų, trečioje – monoacilgliceridų, ketvirtoje –
riebalų rūgščių, o penktoje (kontrolinėje) nebuvo pripilta jokių priedų. Iš šiose skirtingose terpėse
išaugintų ląstelių, eksperimentatorius išgrynino RNR ir atliko Northerno analizę (3.17 pav.).
Rezultatai rodo, kad lipazės geno iRNR raiška yra didžiausia, jei bakterijos auga mitybinėje terpėje,
turinčioje triacilgliceridų.
 3.17 pav. Northerno analizė

3.5. Bioinformatika ir jos pasiekimai

Bioinformatika – tai informacinių technologijų panaudojimas biologinių duomenų analizei. Ši

disciplina jungia dvi mokslo sritis: gyvybės mokslus bei kompiuterines technologijas. Ji, pritaikius
įvairius įrankius (kompiuterines programas), leidžia analizuoti genus ir baltymus in silico.

Bioinformatika prasidėjo kartu su automatinės DNR sekoskaitos metodais. Iki tol biologinių
duomenų kaupimo greitis buvo ribotas. Todėl nebuvo poreikio steigti centralizuotas duomenų
saugyklas ir kurti įvairius tų duomenų analizės įrankius (programas). Besivystant DNR sekoskaitos
technologijoms, duomenų kiekis ėmė nepaliaujamai didėti. Tada iškilo koordinuotos duomenų bazės
poreikis. Šiuolaikinėse duomenų bazėse sukaupti milijardai DNR sekų. Todėl būtina jas kataloguoti,
lyginti tarpusavyje ir paaiškinti (anotuoti). Duomenų bazių plėtrą iliustruosime dviejų pagrindinių
duomenų saugyklų – nukleorūgščių ir baltymų sekų – pavyzdžiais.
Nukleorūgščių duomenų bazės

Pirmoji nukleorūgščių duomenų bazė – EMBL bankas (angl. European Molecular Biology
Laboratory nucleotide sequence Database, www.ebi.ac.uk) buvo įkurta 1980 m. Netrukus JAV buvo
įkurtas analogiškas „GenBank“ (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). 1986 m. informaciją kaupti
pradėjo Japonijos DNR duomenų bankas (www.ddbj.nig.ac.jp). Ir šiandien šios duomenų bazės yra
pagrindinės nukleorūgščių sekų saugyklos. Jos – atviros (viešai prieinamos), bendradarbiaujančios
tarpusavyje ir besikeičiančios sukaupta informacija. 3.18 pav. yra pateiktas tipiškas „GenBank“
duomenų bazėje saugomos DNR sekos pavyzdys.

LOCUS AF405542 541 bp DNA linear BCT 02-APR-2003

DEFINITION Enterobacter cloacae acid shock protein (asr) gene, complete cds.
ACCESSION AF405542
VERSION AF405542.1 GI:15212485
KEYWORDS .
SOURCE Enterobacter cloacae
ORGANISM Enterobacter cloacae
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;
Enterobacteriaceae; Enterobacter; Enterobacter cloacae complex.
REFERENCE 1 (bases 1 to 541)
AUTHORS Seputiene,V., Motiejunas,D., Suziedelis,K., Tomenius,H.,
Normark,S., Melefors,O. and Suziedeliene,E.
TITLE Molecular characterization of the acid-inducible asr gene of
Escherichia coli and its role in acid stress response
JOURNAL J. Bacteriol. 185 (8), 2475-2484 (2003)
PUBMED 12670971
REFERENCE 2 (bases 1 to 541)
AUTHORS Seputiene,V.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (06-AUG-2001) Department of Biochemistry & Biophysics,
Vilnius University, Ciurlionio 21, Vilnius LT 2009, Lithuania
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..541
/organism="Enterobacter cloacae"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:550"
gene 191..502
/gene="asr"
CDS 191..502
/gene="asr"
/note="Asr; similar to Escherichia coli acid shock (asr)
gene"
/codon_start=1
/transl_table=11
/product="acid shock protein"
/protein_id="AAK92015.1"
/db_xref="GI:15212486"
/translation="MKMKKVLALVVAAAMGLSSAAFAAETTATAAPAASTAAPAKTVH
HKKHHKAAKPAAEQKAQAAKKHHKKAAKPAVEQKAQAAKKHHKKAAKHEAAKPAAQPA
A"
misc_feature 197..199
/gene="asr"
/note="potential translation start site"
ORIGIN
1 tgaatatccg ctacttccgc gaacacctga cgtcccgcta cctgtaaccg aacgcgccgg
61 ggggccgccc cggcgttgta catatggtta cacgccgata ccaatcactc acggaaaccc
121 cgaatttaca gggatatagt tatttcaacg gccccgcagt ggggttaaat gaaaaaccaa
181 attcgagggt atgaaaatga aaaaagtatt agctctggtt gttgccgctg ctatgggtct
241 gtcttccgct gcattcgcgg ctgaaactac cgccaccgca gcgcctgcgg catccaccgc
301 tgctccggcc aaaacggttc accataaaaa acatcacaaa gcggctaaac cagcggcaga
361 acagaaagcg caggccgcga aaaagcacca taaaaaagcg gcaaaacctg cggtagagca
421 gaaagcccag gcggctaaaa agcatcacaa aaaagcagca aaacacgaag cggctaaacc
481 tgctgcacag ccagcagcgt aagagtacaa gcttaaccgt gccttcgggg cacgttggta
541 a

3.18. pav. Bakterijos Enterobacter cloacae rūgštinio aplinkos streso aktyvuojamo asr geno ir jo
koduojamo baltymo seka

Viena iš stulbinčių DNR duomenų bazių ypatybių yra informacijos didėjimo tempai nuo to laiko, kai
pirmoji DNR seka buvo rankiniu būdu įvesta ir išsaugota 1980 m.

1990-ųjų metų pabaigoje, jose buvo sukaupta ~250 Mb (bazių). Tuo metu prasidėjo didieji DNR
sekoskaitos projektai, todėl informacijos kiekis duomenų bazėse smarkiai išaugo ir nepaliaujamai
auga. 3.19 pav. matyti, kokiu tempu didėja duomenų kiekis „GenBank“ duomenų bazėje. Vidutiniškai
kas 18 mėn. informacijos kiekis šioje duomenų bazėje padvigubėja. 2012 metų rugpjūtį informacijos
kiekis siekė ~140 Gb (bazių).

3.19 pav. Duomenų kiekis (sekos ilgis bazėmis) „GenBank“ duomenų bazėje 1980–2012 m.

Baltymų duomenų bazės

Baltymų aminorūgščių sekos nustatymas Edmano degradacijos metodu buvo sukurtas 1950 m. –
anksčiau nei DNR sekoskaitos metodas. Tačiau informacija apie baltymų sekas nebuvo kaupiama
tokiais įspūdingais tempais kaip DNR sekos. Tokią situaciją lėmė tyrimų sunkumai: baltymo
aminorūgščių sekos nebuvo įmanoma padauginti jokiais metodais, tuo tarpu DNR buvo padauginama
klonavimo metodais. Tiesa, pastaruoju metu ir baltymų sekoskaitos metodai ištobulėjo. Sukurtos
masių spektroskopijos technologijos, todėl baltymų duomenų bazės tapo vertingu žinių šaltiniu
mokslinei visuomenei.

Pagrindinė ir didžiausia baltymų duomenų bazė yra „UniProt“ (angl. Universal Protein Resource,
www.expasy.uniprot.org), įkurta 2002 m. Nors informacijos kiekis joje gerokai mažesnis, palyginus
su DNR duomenų bazėmis, tačiau sukauptų sekų kiekis 2012 metais buvo įspūdingas – 550 000.
Duomenų bazėje PDB (angl. Protein Data Bank, http://www.rcsb.org) kaupiami duomenys apie
erdvinę baltymų struktūrą. Joje sukaupta informacija apie įvairiais eksperimentiniais tyrimais
(branduolio magnetinio rezonanso spektroskopija, rentgeno struktūrine analize) ištirtų baltymų
erdvinę struktūrą.

Minėtos DNR ir baltymų sekų bei baltymų erdvinės struktūros duomenų bazės nėra vieninteliai
duomenų bazių pavyzdžiai. Daug naudingos informacijos sukaupta ir kitokio tipo duomenų bazėse:
metabolizmo kelių – KEGG (www.genome.jp/kegg/pathway.html), sąveikaujančių baltymų – DIP
(http://dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi), žmogaus genų ir fenotipinių požymių vadove OMIM
(www.omim.org) ir daugelyje kitų.

Bioinformatikos įrankiai

DNR ir baltymų duomenų bazėse sukaupti milžiniški informacijos kiekiai. Kyla klausimas, kam
galima panaudoti šią informaciją. Įvairūs bioinformatiniai įrankiai, sukurtos programos leidžia atlikti
įvairiausią sekų analizę. Iliustruosime tai keliais pavyzdžiais.

Tarkime, kad eksperimentatorius DNR sekoskaitos metodais nustatė nežinomo DNR fragmento iš
bakterijos seką. Ji pateikta 3.20 pav.

tgatcccgggttataataacacgtaagcctgacaacaagaatttatcgctgaagtgacta
atgattgtaagaaaatgccgtggtcgccggacgttgtgttgtctggcgggccttatggcc
tgctcgttttttatcaataccacgtatgcctggcaacaagaatatatcgctgaagcggct
ccggggcatacgacggaacgctatacctgggacagcgatcaccaaccgaattacaacgac
atactggccgaacgtattcagtctacgcaaaatacagtggggccggtgcttagcctggcg
gatgaaaccccgcttgatgcgaccagcggtatcagtatgggctggaattttccgctttcc
cgacgcgtgaccactgggccggtcgcggcgctgcattacgacggttcgacgtcatcaatg
tataacgaatatggcgatagcgcgacgacattagcgtttaccgatccgttatggcacgcc
agcgtcagtacgttaggctggcgggtaaactcgcagttcggcgatgtccgtccctgggcg
caaatcagctataaccaacagtttggggagaatatctggaaagcgcagtccgggttgagt
cgtatgaccgcaggaaatcaggcgggaaactggctggatgtcaccgtaggcgcggacgtg
ttacttaacccgcacctggcggcgtatgcggcgttttcccaggcggaaaatagcgctacg
gatagcgattatttgtataccctgggggtgagcgccaggttttaagaattcatg

3.20 pav. Bakterijos DNR fragmento seka

Naudodami įrankį, leidžiantį iššifruoti DNR koduojamą baltymo seką (http://web.expasy.org/cgi-

bin/translate), aptinkame, kad šiame DNR fragmente yra genas, koduojantis 234 aminorūgščių
baltymą (3.21 pav.).
tgatcccgggttataataacacgtaagcctgacaacaagaatttatcgctgaagtgacta
- S L F I I T R K P D N K N L S L K - L
atgattgtaagaaaatgccgtggtcgccggacgttgtgttgtctggcgggccttatggcc
M I V R K C R G R R T L C C L A G L M A
tgctcgttttttatcaataccacgtatgcctggcaacaagaatatatcgctgaagcggct
C S F F I N T T Y A W Q Q E Y I A E A A
ccggggcatacgacggaacgctatacctgggacagcgatcaccaaccgaattacaacgac
P G H T T E R Y T W D S D H Q P N Y N D
atactggccgaacgtattcagtctacgcaaaatacagtggggccggtgcttagcctggcg
I L A E R I Q S T Q N T V G P V L S L A
gatgaaaccccgcttgatgcgaccagcggtatcagtatgggctggaattttccgctttcc
D E T P L D A T S G I S M G W N F P L S
cgacgcgtgaccactgggccggtcgcggcgctgcattacgacggttcgacgtcatcaatg
R R V T T G P V A A L H Y D G S T S S M
tataacgaatatggcgatagcgcgacgacattagcgtttaccgatccgttatggcacgcc
Y N E Y G D S A T T L A F T D P L W H A
agcgtcagtacgttaggctggcgggtaaactcgcagttcggcgatgtccgtccctgggcg
S V S T L G W R V N S Q F G D V R P W A
caaatcagctataaccaacagtttggggagaatatctggaaagcgcagtccgggttgagt
Q I S Y N Q Q F G E N I W K A Q S G L S
cgtatgaccgcaggaaatcaggcgggaaactggctggatgtcaccgtaggcgcggacgtg
R M T A G N Q A G N W L D V T V G A D V
ttacttaacccgcacctggcggcgtatgcggcgttttcccaggcggaaaatagcgctacg
L L N P H L A A Y A A F S Q A E N S A T
gatagcgattatttgtataccctgggggtgagcgccaggttttaaggaattcatg
D S D Y L Y T L G V S A R F - W I P

Gauta nežinomo baltymo aminorūgščių seka:

MIVRKCRGRRTLCCLAGLMACSFFINTTYAWQQEYIAEAAPGHTTERYTWDSDHQPNYNDILAERIQST
QNTVGPVLSLADETPLDATSGISMGWNFPLSRRVTTGPVAALHYDGSTSSMYNEYGDSATTLAFTDPLW
HASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLSRMTAGNQAGNWLDVTVGADVLLNPH
LAAYAAFSQAENSATDSDYLYTLGVSARF

3.21 pav. Baltymo aminorūgščių sekos iššifravimas

Išsiaiškinus šio DNR fragmento koduojamo baltymo seką, kyla kitas klausimas – koks tai baltymas,
kokia šio baltymo funkcija? Baltymų duomenų bazėse galima paieškoti duomenų. Gal jau yra žinoma
baltymų, kurių aminorūgščių seka būtų panaši, o funkcija būtų ištirta eksperimentiškai.

Atlikus į tiriamąją seką panašių sekų paiešką, buvo aptikti keli baltymai. Jų sekos, palyginus su
tiriamuoju baltymu, yra gana panašios. 3.22 pav. yra pateiktas šių baltymų ir mūsų tiriamojo
nežinomo baltymo aminorūgščių sekų palyginys. Jis gautas naudojant „ClustalW“ programą
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Iš anksčiau atliktų eksperimentų yra žinoma, kad šių
panašių baltymų taip pat randama bakterijose.

Panašūs baltymai buvo detaliai ištirti. Nustatyta, kad tai yra bakterijų fermentai, hidrolizuojantys
riebalus – lipazės. Palyginyje matyti, kad kai kurios šių baltymų aminorūgštys yra konservatyvios
(pažymėta žvaigždute pilkame fone). Gali būti, kad jos suformuoja fermento aktyvų centrą. Taigi
galime padaryti prielaidą, kad mūsų nežinomas baltymas taip pat yra lipazė.
 nežinomas MIVRKCRGRRTLCCLAGLMACSFFINTTYAWQQEYIAEAAPGHTTERYTWDSDHQPNYND 60
S.enterica MIVKKRRGRRALRCLACLMACSFFINAAYAWQQEYIAEAAPGHTTERYTWDSDHQPNYND 60
C.youngae MIIRNSSGRQRLT-LASVVVCALSINTAYGWQQEYIVDAMSGHTAERYTWDSDHQPRYND 59
E.coli MIIKKSGGRWQLSLLASVVISAFFLNTAYAWQQEYIVDTQPGHSTERYTWDSDHQPDYND 60
E.fergusonii MIIKICSGRRALRVMASVMICPFFCTTAHAWQQEYIVDAQPGHNSERYTWDSDHQPDYDE 60
** ** * * ****** ** *********** *

nežinomas ILAERIQSTQNTVGPVLSLADETPLDATSGISMGWNFPLSRRVTTGPVAALHYDGSTSSM 120

S.enterica ILAERIQSTQNAAGPVLNLAVETPLDATSGISMGWNFPVSSYVTTGPVAALHYDGSTSSM 120
C.youngae ILEERIRSTQNVAGPVVNLADRSPMDTTSGMSMGWNFPLSRQVTTGPVAALHYDGSTTST 119
E.coli ILSQRIQSSQRALGLEVNLAEETPVDVTSSMSMGWNFPLYEQVTTGPVAALHYDGTTTSM 120
E.fergusonii ILAQRIHHSQNVPGLSVSLAEDSPLDDTHGVTLGWNFPLYGQVTTGPVAALHYDGTSAAV 120
** ** * * ** * * * ***** *************

nežinomas YNEYGDSATTLAFTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 180

S.enterica YNEYGDSATVLAFTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 180
C.youngae YNEFGDSATSITPTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 179
E.coli YNEFGDSTTTL--TDPLWHASVSTLGWRVDSRLGDLRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 178
E.fergusonii YNEFGDSAIVQ--TDPLWHASVSTLGWRVNSQYGDLRPWAQISYNQQFGDNLWKAQSGLN 178
*** *** **************** * ** ************* * *******

nežinomas RMTAGNQAGNWLDVTVGADVLLNPHLAAYAAFSQAENSATDSDYLYTLGVSARF 234

S.enterica RMTAASQEGNWLDVTVGADMLLNPHLAAYAAFSQAENSATDSDYLYTMGVSAKF 234
C.youngae RMTTAGQDGNWLDVTVGADMLLNSHMAAYAALSQAENSANSSDYMYTMGVSAKF 233
E.coli RMTATNQNGNWLDVTVGADMLLNQNIAAYAALSQAENTTNNSDYLYTMGVSARF 232
E.fergusonii RIIATTQNGNWLDVTVGADMLLNTNIAAYAALSQAENSTNNSDYLYTMGVSAKF 232
* * *********** *** ***** ***** *** ** **** *

* – žymi tokią pat amino rūgštį, pilkame fone – konservatyvios sritys

3.22 pav. Bakterijų lipazių ir nežinomo baltymo aminorūgščių sekos palyginimas

Naudojant specialias programas, galima analizuoti baltymo aminorūgščių seką. Gaunami

preliminarūs duomenys, kokia galėtų būti baltymo erdvinė struktūra. Šios hipotetinės lipazės tyrimo
(PS)2 įrankiu (http://ps2.life.nctu.edu.tw/) rezultatai leidžia manyti, kad baltymui yra būdingos 
klostės, jos išsidėsto viena šalia kitos ir suformuoja cilindrinę struktūrą (3.23 pav.), kuri randasi
ląstelės membranoje sudarydama porą.

3.23 pav. Lipazės hipotetinė erdvinė (tretinė) struktūra

Galiausiai, atlikus DNR sekos analizę įrankiu (http://rna.lundberg.gu.se/cgi-bin/cutter2), kuris
aptinka restrikcijos endonukleazių atpažįstamus taikinius, galima suplanuoti šios hipotetinės lipazės
geno klonavimo procedūrą (rezultatai pateikti 3.24 pav.). Klonavimui galima panaudoti restrikcijos
endonukleazes SmaI ir EcoRI, kurios hidrolizuoja DNR priešais geną (SmaI) ir iškart už jo (EcoRI).
Įterpus geną į klonavimo vektorių ir transformavus juo bakterijas, galima detaliau ištirti šio baltymo
savybes. Anksčiau atliktos bioinformatinės analizės rezultatai pateikia idėjų, kokius tyrimus
pirmiausia reikėtų atlikti: patikrinti, ar šio geno koduojamas baltymas iš tikrųjų yra lipazė.

START
tgatcccgggttataataacacgtaagcctgacaacaagaatttatcgctgaagtgactaatgattgtaagaaaa base pairs
actagggcccaatattattgtgcattcggactgttgttcttaaatagcgacttcactgattactaacattctttt 1 to 75
SmaI

DsaI BsaAI
tgccgtggtcgccggacgttgtgttgtctggcgggccttatggcctgctcgttttttatcaataccacgtatgcc base pairs
acggcaccagcggcctgcaacacaacagaccgcccggaataccggacgagcaaaaaatagttatggtgcatacgg 76 to 150
BstDSI

Eco57I BsmFI
tggcaacaagaatatatcgctgaagcggctccggggcatacgacggaacgctatacctgggacagcgatcaccaa base pairs
accgttgttcttatatagcgacttcgccgaggccccgtatgctgccttgcgatatggaccctgtcgctagtggtt 151 to 225
NlaIV

CfrI Asp700I AccI TspRI Cfr10I CelII

ccgaattacaacgacatactggccgaacgtattcagtctacgcaaaatacagtggggccggtgcttagcctggcg base pairs
ggcttaatgttgctgtatgaccggcttgcataagtcagatgcgttttatgtcaccccggccacgaatcggaccgc 226 to 300
EaeI XmnI NlaIV Bpu1102I

BstF5I SfaNI NspBII MluI

gatgaaaccccgcttgatgcgaccagcggtatcagtatgggctggaattttccgctttcccgacgcgtgaccact base pairs
ctactttggggcgaactacgctggtcgccatagtcatacccgaccttaaaaggcgaaagggctgcgcactggtga 301 to 375
FokI MspA1I HgaI

Cfr10I AcyI AatII

gggccggtcgcggcgctgcattacgacggttcgacgtcatcaatgtataacgaatatggcgatagcgcgacgaca base pairs
cccggccagcgccgcgacgtaatgctgccaagctgcagtagttacatattgcttataccgctatcgcgctgctgt 376 to 450
Bse118I Msp17I

AclWI HgaI
ttagcgtttaccgatccgttatggcacgccagcgtcagtacgttaggctggcgggtaaactcgcagttcggcgat base pairs
aatcgcaaatggctaggcaataccgtgcggtcgcagtcatgcaatccgaccgcccatttgagcgtcaagccgcta 451 to 525
AlwI Csp6I

BslI
gtccgtccctgggcgcaaatcagctataaccaacagtttggggagaatatctggaaagcgcagtccgggttgagt base pairs
caggcagggacccgcgtttagtcgatattggttgtcaaacccctcttatagacctttcgcgtcaggcccaactca 526 to 600
BsmFI

Tru9I
cgtatgaccgcaggaaatcaggcgggaaactggctggatgtcaccgtaggcgcggacgtgttacttaacccgcac base pairs
gcatactggcgtcctttagtccgccctttgaccgacctacagtggcatccgcgcctgcacaatgaattgggcgtg 601 to 675
PleI FokI MseI

Aor51HI AccI
ctggcggcgtatgcggcgttttcccaggcggaaaatagcgctacggatagcgattatttgtataccctgggggtg base pairs
gaccgccgcatacgccgcaaaagggtccgccttttatcgcgatgcctatcgctaataaacatatgggacccccac 676 to 750
BsiYI AfeI Bst1107I

STOP
agcgccaggttttaagaattcatg base pairs
tcgcggtccaaaattcttaagtac 751 to 774
EcoRI

Baltymo transliacijos pradžios (ATG) ir pabaigos (TAA) kodonai pažymėti pilkame fone.
Base pairs – bp.

3.24 pav. Restrikcijos endonukleazių taikiniai DNR sekoje

Bioinformatikos įrankiai naudojami sekų lyginimui, genų identifikavimui, baltymų sekų iššifravimui,
restrikcijos endonukleazių taikinių aptikimui – sekų analizei in silico. Bioinformatinė analizė yra
greita, dažnai leidžia suformuluoti tinkamas prielaidas. Tačiau svarbu akcentuoti, kad daugeliu atveju
rezultatai turi būti patikrinti ir patvirtinti biologinių eksperimentų metu.

Literatūros šaltiniai:

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
 http://expasy.org/tools/
 Lewin, B. Genes IX ed. 2008 Jones & Bartlett publ.
 Griffiths, A. et al. Introduction to genetic analysis IX ed. 2008 New York: W. H. Freeman
 Hyde, D. R. Introduction to genetic principles 2009 New York: McGraw-Hill
 Nicholl D.S.T. An introduction to genetic engineering. 3rd. ed. 2008 Cambridge univ. Press
 Watson et al. Molecular Biolgy of the Gene. VI ed. 2008 Cold Spring Harbour Lab Press
 S.B. Primrose R.M. Twyman R.W. Old. Principles of Gene Manipulation and Genomics 8th
ed., 2011. Wiley
4. Biotechnologija ir aplinka
4.1. Biotechnologijos sričių produktai, reikšmingiausiai keičiantys šiuolaikinio žmogaus
gyvenimą
Biotechnologijos produktai jau yra tapę neatsiejama mūsų gyvenimo dalimi. Kartais net
nesusimąstome, kad didžiosios dalies produktų (kuriuos mes jau kasdien vartojame) neturėtume, jei
ne biotechnologijos mokslas. Tai – drabužiai, maistas ir gėrimai, vaistai, higienos priemonės, kuras
ir kt. Toliau pateikiami reikšmingiausiai mūsų gyvenimą pakeitusių ar keičiančių biotechnologijos
produktų pavyzdžiai (4.1 pav.).

Vaistai. 1982 metais buvo sukurtas pirmasis „biotechnologinis“ vaistas humulinas – žmogaus
insulinas, skirtas cukriniam diabetui (cukraligei) gydyti. Mokslininkai modifikavo bakterijas taip, kad
jos ėmė gaminti žmogaus insulino baltymą! Dabar jau yra sukurta ir naudojama šimtai vaistų,
vakcinų, diagnostinių priemonių, skirtų žmonėms. Didžioji dalis šių vaistų yra skirti kovai su vėžiu.
Visame pasaulyje plačiai naudojamos vakcinos nuo hepatito B, papilomos virusų, vaistai nuo
sklerozės, augimo veiksniai ir kt.

Didžioji dalis biotechnologinių vaistų yra rekombinantiniai baltymai – tokie baltymai, kurių natūraliai
mikroorganizmai ar ląstelės sau negamina. Tačiau modifikavus ląstelių genomus tokios ląstelės ima
gaminti reikiamus baltymus (insuliną). Kai bioreaktoriuose užauginama daug ląstelių, iš jų reikiami
baltymai – vaistai – yra išgryninami ir naudojami gydymui. Vienas pirmųjų (ir labai svarbus)
genetinės inžinerijos produktas yra audinių plazminogeno aktyvatorius – fermentas, kuris tirpina
kraujo krešulius. Jis plačiai naudojamas kraujagyslėms išvalyti, jas atkimšti įvykus insultui ar širdies
priepuoliui.

Medicinoje be gydymo labai svarbią vietą užima ligų diagnostika. Pasitelkus biotechnologiją buvo
sukurta daug diagnostikos sistemų – nėštumo, įvairių infekcijų nustatymo testų, kurių gamybai
naudojami antikūnai.

Maistas ir gėrimai. Būtent dėl bakterijų ir mielių (ir juose esančių fermentų) mes valgome ne kietus
papločius, o minkštą duoną ir pyragus. Geriame girą, alų, vyną, sidrą. Naudojame actą, sojų padažą,
sūrį, sojas, sojų varškę, jogurtus ir daugybę kitų maistų produktų. Iš kukurūzų, kviečių gaminami
sirupai, saldikliai, kurie plačiai naudojami maisto pramonėje. Tai pigiau, nei naudoti cukrų.
Be mikroorganizmų tokių maisto produktų mes neturėtume. Fermentai, naudojami maisto gamyboje,
yra nuolat tobulinami. Tai leidžia maisto produktus gaminti greičiau, jie ilgiau išlieka švieži,
pagerinamas jų skonis, maisto gamyba tampa pigesnė. Be to, pasitelkiant biotechnologiją norimus
fermentus galima pasigaminti dideliais (pramoniniais) kiekiais. Tai leidžia idealiai atkartoti receptūrą,
kontroliuoti gamybos procesą, o visos pagaminamų produktų partijos gaunamos identiškos.

Svarbų vaidmenį maisto pramonėje atlieka genetiškai modifikuoti augalai ir gyvūnai – ligoms
atsparios sojos, šalčiui ir pelėsiams atsparios braškės, auksiniai ryžiai ir kt. Jei ne GMO, šiandien
neturėtume nektarinų, mandarinų, kitų skanių vaisių ir daržovių, didelių lašišų.

Fermentuotų maisto produktų pavyzdžiai: jogurtas, sūris, varškė, kefyras, sojų padažas, rauginti
kopūstai (gaminami naudojant pieno rūgšties bakterijas), kimchi (korėjietiški marinuoti kopūstai),
kombucha – fermentuota arbata, gaminama iš vadinamojo arbatos grybo (tai acetobakterijų ir mielių
simbiozinė kultūra), miso (japoniškas gaminys iš fermentuotų ryžių, miežių, sojų, grybų), natto
(tradicinis japoniškas patiekalas, garsus visame pasaulyje, gaminamas iš sojų pupelių, fermentuotų
naudojant bakterijas Bacillus subtilis), yacult (visame pasaulyje populiarus japoniškas probiotinis
pienas, gaunamas fermentuojant liesą pieną su specialiomis bakterijomis), lasis (indiškas jogurtinis
gėrimas) ir kt.

Skalbikliai. Tradiciškai į įvairių skalbiklių sudėtį įeina detergentai, kurie padeda išskalbti drabužius.
Tačiau pačios efektyviausios yra tos skalbimo priemonės, į kurias įdėta ir fermentų – lipazių ir
proteazių. Tokios skalbimo priemonės skaldo baltymus, riebalus. Todėl puikai išskalbiamos žolės,
vyno, dirvos, riebalų, tepalo ir kitokios dėmės.

Mokslininkai nuolat tobulina ir kuria efektyvesnius, veiksmingesnius, aukštesnėje (ar atvirkščiai,

žemesnėje) temperatūroje veikiančius fermentus. Jie leidžia geriau išskalbti drabužius, sutrumpinti
skalbimo laiką, reikia mažesnių skalbiklių kiekių, taupomas vanduo, elektra.

Tekstilė. Gaminant audinius, juos dažant, skalbiant, cheminius metodus išstumia nauji būdai. Juose
naudojami įvairūs fermentai. Taip mažėja gamybos toksiškumas, saugoma gamta, gaunami geresnės
kokybės audiniai. Jie lengviau lyginami, gamybos metu taupomas vanduo, elektra, degalai.

Anksčiau, gaminant vadinamuosius nutrintus džinsus, džinsinis audinys būdavo mechaniškai

trinamas pemzos akmeniu. Dabar šis efektas išgaunamas naudojant fermentus amilazę ir celiulazę.

Oda. Anksčiau odai išdirbti rauginant buvo naudojami chemikalai, dabar – fermentai. Jie veikia
greitai ir efektyviai, o svarbiausia – neteršdami gamtos. Jie pašalina nuo odos šerius: keratiną,
pigmentą, riebalus. Gaunama minkšta, švelni oda, kuri naudojama kuriant įvairius gaminius.

Popierius. Gaminant popierių iš medienos reikia išgryninti tik celiuliozę. Ją surišantis lipnus ligninas
nereikalingas. Ligninui pašalinti naudojami cheminiai metodai (veikiama stipriu šarmu aukštoje
temperatūroje). Tai brangu, teršia gamtą, orą. Sunaudojama labai daug vandens. Tad mažinamas
švaraus vandens kiekis Žemėje, kenkiama žuvims ir kitiems vandens telkinių gyviams.
Dabar šalinant lipnias medžiagas naudojami fermentai esterazės. Veikiant fermentams lipnios
medžiagos susmulkinamos iki mažų, vandenyje tirpių medžiagų, o šios lengvai pašalinamos. Taip
pagerinama popieriaus kokybė, palengvinamas jo perdirbimas.

Taip pat kuriami GMO medžiai, kurie turi daugiau celiuliozės, mažiau lignino ir greičiau auga.
Auginant tokius medžius popieriaus gamybai būtų išsaugomi dabartiniai miškai.
Biodegraduojantis plastikas. Tradiciniais būdais pagamintas plastikas yra sudarytas iš ilgų,
tarpusavyje stipriomis jungtimis sujungtų polimerų molekulių. Todėl mikroorganizmai jų negali
lengvai suardyti. Biodegraduojantis plastikas gaminamas iš augalinės kilmės polimerų (gautų iš
kviečių, kukurūzų, bulvių). Šie polimerai yra trumpesni ir lengviau degraduojami. Biodegraduojantis
plastikas pasižymi tokiomis pat savybėmis kaip ir tradicinis plastikas.

Bioetanolis – biokuras, gaminamas iš daug krakmolo turinčių augalų (kukurūzų, bambukų, kviečių),
naudojant specialius fermentus. Šiuo metu gaminti biokurą iš atsinaujinančių medžiagų dar yra
brangu. Augalus reikia užauginti, transportuoti, perdirbti, gamybai naudojami ir neatsinaujinantys
energijos šaltiniai. Tačiau naftos ir kitų neatsinaujinančių energijos šaltinių kiekis Žemėje yra
baigtinis. Todėl būtina tobulinti biokuro gamybos procesą – jį pagreitinti, didinti gamybos
efektyvumą, mažinti pradinės žaliavos kiekį, atpiginti gamybos procesą.
 4.1 pav. Įvairūs biotechnologijos produktai mūsų gyvenime

4.2. Žmogaus sveikata ir biotechnologija

Pagrindiniai šiuolaikinės medicinos mokslo uždaviniai yra ligų prevencija, diagnostika ir gydymas.
Deja, dažnai vyrauja nuomonė, kad svarbiausia yra ligonių gydymas. Tačiau ligų prevencija
(išankstinė apsauga nuo susirgimo) ir ankstyvoji diagnostika yra ne mažiau svarbūs. Iš anksto
apsisaugojus nuo galimos ligos (ar anksti nustačius atsiradusią ligą, jos priežastis), brangaus ligonių
gydymo reikėtų daug rečiau. Laiku suteikta pagalba būtų daug efektyvesnė, būtų sutaupoma daug
lėšų.

Užkrečiamų ligų kontrolė ir prevencija. Šiandien mums netenka išgirsti, kad kas nors iš pažįstamų
žmonių užsikrėtė raupais ir nuo to mirė. Tačiau mūsų seneliai ar proseneliai gyveno tais laikais, kai
įvairių infekcijų sukelta žmogaus mirtis buvo gana dažnas reiškinys. Dauguma ligų, kurios anksčiau
kankino žmones, šiandien yra išnykę. Taip yra todėl, kad turime vakcinas – preparatus, kurie leidžia
iš anksto apsisaugoti nuo tam tikrų užkrečiamų ligų. Vakcinos iš anksto paruošia organizmą kovai su
galimu patogenu (bakterija, virusu). Todėl organizmui susidūrus su tikru ligos sukėlėju jis sukėlėją
sunaikina ir mes nesusergame. Imunologijos, mikrobiologijos, biochemijos, molekulinės biologijos,
genetikos, biotechnologijos mokslai padėjo sukurti daugybę vakcinų. Jos mus iš anksto apsaugo nuo
įvairių galimų infekcijų – gripo, hepatito, tymų, raupų, raudonukės ir kt. Visuomenėje, kurios didžioji
dalis populiacijos yra paskiepyta nuo pavojingų infekcijų, infekcijų sukėlėjai išnyksta, nes neturi
galimybės plisti. Išradus skiepus išnyko tokios ligos kaip raupai, maras, poliomielitas ir kt.

Infekcijos sukėlėjui patekus į žmogaus organizmą prasideda mūšis tarp sukėlėjo ir žmogaus imuninės
sistemos. Imuninės sistemos ląstelės pagal ląstelių paviršiaus žymenis – antigenus – sugeba atskirti
savas sveikas ląsteles nuo infekuotų ir pastarąsias sunaikina. Pirmąjį apsaugos nuo sukėlėjų lygmenį
sudaro makrofagai ir antigenus pateikiančios ląstelės (APC). Jos patogenus sugauna, praryja,
sunaikina, o patogenų antigenus savo paviršiuje pateikia kitoms imuninės sistemos ląstelėms. Taip
šios perspėjamos, kad organizme yra patogenas bei aktyvinamos (4.2 pav.).

Terminas „antigenas“ kilo nuo žodžių junginio „antikūnų generavimas“. Svetimam antigenui patekus
į organizmą, imuninės sistemos B ląstelės ima gaminti antikūnus (baltymų molekules). Jie specifiškai
atpažįsta ir prisijungia prie antigeno. Ši sąveika yra specifinė, kiekvienas antikūnas atpažįsta tik savo
antigeną. Kai antikūnas prisijungia prie specifinio antigeno, pastarasis yra nukenksminamas.
Patogeną, prie kurio antigenų prisijungė antikūnai, pagauna kitos imuninės sistemos ląstelės (T
ląstelės) ir jis sunaikinamas. Imuninė sistema turi dar vieną labai svarbią savybę – imuninę atmintį.
Dėl imuninės atminties, į organizmą antrą kartą patekus tam pačiam patogenui, imuninė sistema su
patogenu susidoroja daug greičiau ir efektyviau. Organizme yra likę antigenui specifinių antikūnų ir
atminties ląstelių. Jos greitai atpažįsta patogeną ir ima sparčiai daugintis.
Todėl pakartotinai į organizmą patekęs patogenas neturi galimybės daugintis ir plisti – jis nedelsiant
sunaikinamas. Būtent dėl imuninės atminties mechanizmo dauguma infekcinių ligų mes sergame tik
vieną kartą gyvenime (raudoniuke, vėjaraupiais). Deja, tokiomis kaip gripo ar slogos virusų
infekcijomis sergame gana dažnai. Taip yra todėl, kad kai kurie virusai linkę nuolat kisti ir egzistuoja
daug jų variantų.

4.2 pav. Imuninė sistema

Vakcinos – preparatai, kurie imituoja patogenus ir dirbtinai sužadina žmogaus imuninę sistemą prieš
tam tikrą antigeną. Tuo atveju, kai antigenas pakartotinai patenka į organizmą, imuninė sistema
nedelsiant su juo susidoroja. Yra dvi pagrindinės vakcinų grupės – prevencinės, skirtos
apsisaugojimui nuo ligų ir terapinės, skirtos ligoms (vėžiui) gydyti.
Vakcinų gamybai gali būti naudojami gyvi, tačiau susilpninti (atenuoti) patogenai. Jie puikiai
aktyvina imuninę sistemą, bet yra per silpni, kad sukeltų infekcijas. Tokios buvo pačios pirmosios
vakcinos (raupų). Dabar jos naudojamos itin retai, nes visada yra tikimybė, kad vakcina sukels
infekciją ir žmogus susirgs. Vakcinų gamybai gali būti naudojami ir negyvi patogenai. Tokios
vakcinos taip pat yra efektyvios ir, palyginus su anksčiau aprašytomis, saugesnės. Vakcinos pavyzdys
– per Pirmąjį pasaulinį karą panaudota gripo vakcina. Tada kilusi gripo epidemija pasiglemžė apie 20
milijonų žmonių gyvybių.
Dauguma vakcinų, kurios gaminamos ir naudojamos šiandien, yra rekombinantinės. Kadangi
gaminant tokias vakcinas nenaudojami patys patogenai, o tik jų genų sekos, šios vakcinos yra pačios
saugiausios žmonėms – jos negali sukelti jokių infekcijų. Rekombinantinės vakcinos dažnai
vadinamos subvienetų vakcinomis. Jų gamybai naudojami tik tam tikri patogenų subvienetai – viruso
paviršiaus baltymai. Įsivaizduokite, kad esate alergiški braškių sėkloms. Bet jei turėtumėte besėklių
braškių, drąsiai galėtumėte jomis mėgautis. Analogiškai, gaminant vakciną yra naudojamos tik tos
patogeno dalys, į kurias reaguoja žmogaus imuninė sistema.
Pirmoji rekombinantinė, genų inžinerijos būdu sukurta vakcina buvo skirta apsisaugoti nuo hepatito B
viruso. Ją sudaro tik viruso kapsidės baltymai, vakcinoje nėra viruso genetinės informacijos – DNR.
Viruso kapsidės baltymai sintetinami mielių ląstelėse, čia jie susijungia vienas su kitu.
Suformuojamos į virusus panašios dalelės, kurios išgrynintos naudojamos kaip vakcina. Dar viena
labai plačiai pasaulyje paplitusi rekombinantinė vakcina – tai vakcina nuo papilomos virusų, kurie
gali sukelti gimdos kaklelio vėžį. Šia vakcina šiandien išsivysčiusiose šalyse skiepijamos paauglės.
Be jau minėtų hepatito, papilomos virusų vakcinų plačiai žinomos ir naudojamos vakcinos nuo roto,
gripo ir kitų plačiai paplitusių virusų bei bakterijų. Šiais laikais, kai didelių infekcinių ligų pandemijų
iš esmės nebūna, vakcinos nėra privalomos. Todėl skiepytis ar ne turime nuspręsti mes patys. Reikia
nepamiršti, kad būtent dėl vakcinų dauguma infekcinių ligų (pvz. raupai) beveik visiškai išnyko.
Nustojus skiepytis, kai kurios ligos (turbekuliozė) vėl ima plisti.

Diagnostika – ligos, jos priežasties nustatymas. Tai itin svarbus žingsnis kiekvieno mediko darbe.
Kai teisingai ir laiku pastebima ligos pradžia, nustatomos jos priežastys, daug lengviau ir greičiau ją
sustabdyti, pagydyti pacientą.
Įsivaizduokime, kad jums prasidėjo sloga, truputį kosite. Kas tai galėtų būti – alergija, virusinė
infekcija, bakterinė plaučių infekcija ar paprastas peršalimas? Jeigu jums alergija – išgėrus vaistų nuo
alergijos turėtų palengvėti. Jei jums bakterinė plaučių infekcija – būtina skubiai pradėti vartoti
antibiotikus, kol infekcija neišplito ir nepradėjote jaustis dar blogiau. O jei tai peršalimas – užtenka
išgerti šiltos arbatos ir pailsėti. Tokius „detektyvus“ gydytojai sprendžia kiekvieną dieną. Jie stebi
pacientus, tiria simptomus ir bando nustatyti, kuris iš galimų teorinių variantų tinka konkrečiam
pacientui.
Kad gydytojams reikėtų kuo mažiau spėlioti, diagnozuojant ligas ir jų sukėlėjus atliekami įvairūs
tyrimai. Deja, ne visi egzistuojantys diagnostikos metodai gana informatyvūs. Turint plaučių rentgeno
nuotrauką galima pamatyti plaučiuose esančius pakitimus. Tačiau nieko negalima pasakyti apie tai,
kas tuos pakitimus sukėlė. Čia medikams į pagalbą ateina modernioji biotechnologija. Ji kuria
naujausiais mokslo laimėjimais paremtus diagnostikos įrankius, metodus, leidžiančius ligas
diagnozuoti greitai ir tiksliai.
Imunodiagnostika – tai diagnostikos sritis, paremta antigeno ir antikūno sąveika. Antikūnai –
baltymai, kuriuos žmogaus imuninė sistema sintetina prieš („anti“) svetimus į mūsų organizmą
patekusius organizmus („kūnus“). Antigenai – medžiagos (dažniausiai taip pat baltymai), kurios
mūsų organizme sukelia antikūnų sintezę. Jais gali būti įvairūs virusų, bakterijų komponentai. Kai
organizme susidaro antikūnai, jie specifiškai prisijungia prie antigenų. Tada atpažinti antigenai yra
sunaikinami. Kiekvienas antikūnas atpažįsta ir sąveikauja tik su tuo antigenu, prieš kurį jis susidarė
(4.3 pav). Tai labai stipri (nekovalentinė) specifinė tarpmolekulinė sąveika.
 4.3 pav. Antikūnų ir antigenų, kuriuos turi patogenai, sąveikos schema

Taikant įvairius imunodiagnostikos metodus galima nustatyti, ar mėginyje (kraujyje, šlapime, seilėse,
gleivių tepinėliuose ir pan.) yra tam tikrų molekulių, ląstelių, patogenų (ir kokių tiksliai). Mėginyje
ieškoma arba antikūnų, arba antigenų.
Kaip nustatoma, ar žmogus yra užsikrėtęs tam tikru virusu (pvz. ŽIV)?
Pirmiausia iš žmogaus paimama kraujo. Imunodiagnostiniai patogenų identifikavimo testai
dažniausiai atliekami specialiose plokštelėse, kurios turi daug šulinėlių. Jei kraujyje yra ieškoma
paties viruso, šulinėlio dugnas yra padengtas konkrečiam virusui (pagal šį pavyzdį – ŽIV) būdingais
antikūnais. Kai į tokį šulinėlį įpilama kraujo, jame esantys virusai prisijungia prie dugne esančių
antikūnų (vadinamų pirminiais antikūnais), likęs kraujas išpilamas (4.4 pav.). Paskui ant šulinėlio
dugne susidariusio antikūno–viruso komplekso užpilama kitų virusui specifinių antikūnų (vadinamų
antriniais). Jie pažymėti tam tikra žyme. Žymė gali būti fermentinė (pabaigoje šulinėlis nusidažys
tam tikra spalva), fluorescuojanti ar kt. Ši žymė atrankiai prisijungia tik prie antikūno–viruso
komplekso. Tyrimo pabaigoje visa plokštelė nuskenuojama specialiu prietaisu. Jei šulinėliuose yra
aptinkamas ieškomas signalas (pakinta spalva, fluorescencija), vadinasi kraujyje buvo ŽIV virusų.
Keičiant pirminius antikūnus šulinėlyje analogiškai nustatomi kiti antigenai ar patogenai (virusai,
bakterijos).
Jeigu mėginyje reikia nustatyti ne antigenus, o antikūnus, tada atliekamas labai panašus diagnostinis
tyrimas. Plokštelių dugnas būna padengtas ne antikūnais, o antigenais. Tokiu atveju mėginyje
ieškoma antikūnų. Toliau viskas atliekama analogiškai: užpilama antrinių antikūnų, registruojamas
signalas. Aprašytu principu veikia ir greitieji juosteliniai testai – nėštumo (ar kt.) testai. Jie atsakymą
į rūpimą klausimą pateikia itin greitai – per kelias minutes.
Pasitelkus imunodiagnostinius testus galima identifikuoti ne tik atskiras ląsteles, bet ir atskiras
molekules – pavienius ląstelių paviršiaus baltymus. Taip nustatomi įvairūs vėžinių ląstelių žymenys.
Visi imunodiagnostiniai testai yra itin specifiški, patikimi, greitai atliekami, pateikia medikams tikslų
atsakymą.
 4.4 pav. Viruso nustatymas mėginyje imunodiagnostikos būdu

Genetinė diagnostika – tai diagnostikos sritis, kai identifikuojamos ne pačios ląstelės ar ant jų
paviršiaus esantys baltymai, o ląstelės viduje esanti genetinė medžiaga – DNR, RNR. DNR molekulės
yra dvigrandinės, o jų grandinės laikosi kartu dėl nukleotidų komplementarumo principo (A poruojasi
su T, o C – su G). Ši savybė ir sudaro visų genetinės diagnostikos metodų, testų pagrindą. Žmogaus
ir daugelio ligų sukėlėjų genomų sekos yra žinomos: duomenų bazėse nuolat kaupiama informacija
apie įvairias mutacijas, genetinius pakitimus, susijusius su konkrečiomis ligomis. Daugumos testų
pagrindinė idėja yra tokia, kad į mėginį (ar tik į išgrynintą iš mėginio DNR, RNR) pridedama
specifinių viengrandinių oligonukleotidų.
Oligonukleotidai yra parenkami tokie, kad jų nukleotidų seka būtų komplementari ieškomai (tai, kurią
norime nustatyti) DNR ar RNR molekulei. Jei norime nustatyti, ar mėginyje yra konkretaus viruso,
tai parenkami tokie oligonukleotidai, kurie yra komplementarūs šio viruso specifiniams genams. Jei
norime nustatyti kokią nors žmogaus genomo mutaciją, parenkami būtent tai genomo vietai
specifiniai oligonukleotidai.
Vieni diagnostikos metodai naudoja įvairius molekulinės biologijos įrankius, fermentus (DNR
polimerazes). Šiais metodais ieškomos DNR molekulės padauginamos ir paskui nustatomas jų
buvimas (ar nebuvimas). Kitiems metodams yra naudojami oligonukleotidai iš karto turintys tam tikrą
žymę (dažniausiai fluorescuojančią). Todėl šių oligonukleotidų prisijungimą prie taikinio genetinės
medžiagos galima stebėti tiesiogiai. Taip mėginiuose (kraujyje, kituose skysčiuose, biopsijos
audiniuose ir kt.) galima surasti mus dominančias DNR ar RNR sekas, patogenų genomų dalis.
Galima tirti savas chromosomas, jas suskaičiuoti, surasti konkrečius mus dominančius savus genus,
nustatyti, ar jie turi ligoms būdingų pakitimų (mutacijų, iškritų, intarpų, kopijų skaičių).
Genetiniai diagnostikos metodai yra itin tikslūs, labai greitai atliekami, patikimi. Juos pritaikę
medikai tiksliai nustato ligą ar jos priežastį ir gali efektyviai parinkti tinkamiausią paciento gydymo
būdą. Plačiau apie diagnostikos metodus skaitykite skyrelyje 10.2 Infekcinių ligų diagnostika ir
prevencija, naujų vakcinų kūrimas.
Antibiotikai – tai vienų mikroorganizmų išskiriamos medžiagos, kurios naikina kitus
mikroorganizmus. Šiandien antibiotikai – vieni dažniausiai gydytojų išrašomų vaistų. Jie padeda
pažaboti įvairias bakterines ligas.
Antibiotikų vartojimas bakterijų sukeliamoms įvairioms infekcijoms gydyti turi ir trūkumą. Ilgainiui
susiformuoja antibiotikams atsparūs bakterijų kamienai. Bakterijos sugeba prisitaikyti prie konkrečių
antibiotikų buvimo jų aplinkoje ir tampa jiems atsparios – nežūva. Tai lemia netinkamas antibiotikų
vartojimas gydymo metu – jis skatina atsparių bakterijų vystymąsi, naikina gerąsias organizmo
bakterijas, gali sukelti pašalinius poveikius.
Norint to išvengti, pirmiausia (jei įmanoma) reikėtų išvengti infekcijų skiepijantis. Jei gydytojas
paskiria antibiotikus, juos privalu vartoti tiksliai pagal nurodymus. Būtina suvartoti visą vaistų dozę,
o ne nustoti juos vartoti pasijutus šiek tiek geriau. Antraip jūs tik prislopinate infekciją, bet visos
bakterijos nėra sunaikinamos. Negalima susirgus vartoti ne jums gydytojo išrašytų, o bet kokių
antibiotikų. Antibiotikai veikia tik tam tikras bakterijas, o ne visas. Taigi, labai svarbu, kad
antibiotikus gydytojai ligoniams skirtų tik esant reikalui. Iš pradžių, jei tik įmanoma, reikia nustatyti
ligos sukėlėją ir jo jautrumą/atsparumą antibiotikams ir tik tada skirti pacientui vaistus. Deja, bet
identifikuoti ligos sukėlėjus ne visada pavyksta. Tada aklai skiriami tie antibiotikai, kurių veikiamų
bakterijų spektras labai platus. Tai leidžia susiformuoti antibiotikams atspariems mikroorganizmų
kamienams.
Siekiant racionalaus antibiotikų vartojimo itin svarbu ligoninių laboratorijas aprūpinti naujomis
patikimomis greitos diagnostikos priemonėmis. To reikia, kad būtų galima ne tik užtikrinti ankstyvą
infekcinių ligų diagnostiką, kaupti antibiotikams atsparių sukėlėjų bankus, analizuoti jų atsparumo
vystymosi priežastis. Moderniosios technologijos, efektyvi, greita diagnostika leidžia padidinti
infekcijų kontrolės efektyvumą ir sumažinti gydymui skirtas išlaidas. Sukauptus duomenis galima
panaudoti rengiant gydymo rekomendacijas. Dėl skirtingo atsparių kamienų paplitimo dažnio
įvairiose šalyse, negalima vadovautis kitų šalių parengtomis rekomendacijomis.
Antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų ligų protrūkiai lemia grėsmingus socialinius ir ekonominius
nuostolius. Tampa neefektyvi antibiotikų terapija, ilgėja ligonių hospitalizacijos laikas, didėja
sergamumas, mirštamumas. O neturint efektyvių antibiotikų, tokie šiuolaikiniai gydymo metodai kaip
operacijos, onkologinė chemoterapija ar intensyvi terapija gali tapti nebeįmanomi. Atsparūs
antibiotikams mikroorganizmų kamienai ir jų kontrolė turėtų būti viena iš prioritetinių infekcijų
valdymo sričių.

Genų terapija – tai toks gydymo būdas (dažniausiai eksperimentinis), kai į ląsteles yra įvedami nauji
genai. Siekiama atkurti neteisingo, blogai veikiančio (ar įjungti visai neveikiančio) tam tikro geno
raišką. Genų terapija kaip atskiras ligų gydymo metodas pradėjo plėtotis tuomet, kai buvo baigtas
Žmogaus genomo projektas. Projekto rezultatas – pirmą kartą nustatyta žmogaus genomo seka,
sudarytas genolapis. Sužymėti visi genai ir jų buvimo vietos konkrečiose chromosomose. Šis
projektas suteikė daug naujos, itin vertingos informacijos ir atvėrė naujas galimybes medicinos
mokslo pažangai.
Žmogus turi apie 25 000 genų. Net vienintelio geno pakitimas gali lemti sunkias genetines ligas.
Moksliniais tyrimais yra identifikuota daugiau nei 4000 genetinių ligų, kurias sukelia vienintelio geno
pakitimas ar nebuvimas. Genetinės ligos gali sutrikdyti bet kurios žmogaus kūno dalies ar organo
veiklą. Vienos genetinės ligos yra paveldimos iš tėvų, kitos atsiranda ilgainiui pakitus (mutavus) DNR
molekulėms. Vienos genetinės ligos yra itin retos, o nuo kitų kenčia daugybė žmonių visame
pasaulyje. Iki šiol efektyvių genetinių ligų gydymo (kitaip, nei infekcinių ligų) būdų nėra. Genų
terapija tinka gydyti tas ligas, kai yra sutrikusi vieno konkretaus fermento (ar kito baltymo) veikla –
neveikia jį koduojantis genas.
Norimiems genams įterpti į ląsteles naudojamos įvairios technologijos: retrovirusinių vektorių
įterpimas, transfekcijos3, homologinė rekombinacija, genų injekcijos į ląstelės branduolį. Nauji genai
gali būti įterpti į ląsteles in vivo (organizme) arba ex vivo (už organizmo ribų – laboratorijoje). Taip
modifikuotos ląstelės gali būti perkeliamos ten, kur yra reikalinga geno raiška.
Plačiausiai žinomos genetinės ligos: hemofilija (VIII kraujo krešėjimo veiksnio trūkumas, mirtino
nukraujavimo galimybė), pjautuvinė anemija (ne apvalūs, o pjautuvo formos eritrocitai, kurie lengvai
pažeidžiami), cistinė fibrozė (kanalus formuojančio baltymo defektas, kuris lemia plaučių sekreto
kaupimąsi, dusimą), SCID (angl. severe combined immunodeficiency). SCID – liga, kurią sukelia
fermento adenino deaminazės nebuvimas. Tai lemia pagrindinių imuniteto ląstelių (baltųjų kraujo
ląstelių) žūtį, todėl žmogaus imuninė sistema nesugeba kovoti su jokiu patogenu.
Dauguma genetinių ligų (ypač tos, kurias lemia keleto genų sutrikimai) negali būti pagydomos genų
terapijos būdu. Tačiau mokslo pažanga ir tyrimai teikia vilties, kad ateityje bus galima pažaboti ir
tokias ligas.

Hemofilija – tai viena garsiausių genetinių ligų. Ši liga, kai nekreša kraujas, o susižeidus
nukraujuojama iki mirties, yra žinoma nuo biblinių laikų. Iš istorijos tikriausiai prisimenate Rusijos
caro Nikolajaus II šeimą, kuri 1917-aisiais metais buvo nužudyta (4.5 pav.). Kartais pasigirsdavo
kalbų, kad galbūt kai kurios caro dukterys išgyveno. Tačiau tokių kalbų nebuvo apie caraitį Aleksejų.
Jis sirgo hemofilija. Hemofilija sergančių žmonių kraujyje nėra baltymo, kuris skatina krešulių
susidarymą. Caraitis galėjo nukraujuoti ir numirti nuo menkiausios žaizdos, nes tada nebuvo
efektyvaus būdo, kaip sustabdyti kraujavimą. Aleksejus paveldėjo šią ligą iš savo mamos
Aleksandros. Aleksandra ir jos močiutė (Anglijos karalienė Viktorija) vienoje iš savo X chromosomų
turėjo recesyvinį hemofilijos geną.
Tačiau jos hemofilija nesirgo, nes antrojoje savo X chromosomoje turėjo sveiką, funkcionuojantį
geną. Tad reikiamą baltymą – kraujo krešėjimo veiksnį, kitaip nei Aleksejus, jos turėjo. Kadangi vyrai
savo ląstelėse turi vieną X chromosomą, tikimybė, kad sūnus, kurio motina turi vieną recesyvinį
hemofilijos geną, sirgs šia liga, yra 50 %.

3
Transfekcija – išgrynintos DNR patekimas į eukariotines ląsteles. Tai bakterijų
transformacijai analogiškas procesas.
 4.5 pav. Rusijos caro Nikolajaus II šeimos nuotrauka. Caras turėjo žmoną, keturias dukras ir sūnų
Aleksejų, kuris sirgo hemofilija – genetine liga (kraujo nekrešėjimu)

Ilgą laiką hemofilija sergantys asmenys buvo gydomi vieninteliu būdu – perpilant kito žmogaus
kraują. Kartu su svetimu krauju ligonis gaudavo ir jame esančio kraujo krešėjimo veiksnio, kuris
sustabdydavo kraujavimą. Toks kraujo papildymas turėdavo būti nuolat kartojamas, nes svetimas
krešėjimo veiksnys ilgai kraujyje neišlikdavo. Iki 1980-ųjų metų tūkstančiai hemofilija sergančių
žmonių nuo tokio gydymo mirė, nes jiems buvo įpilta kraujo, infekuoto ŽIV virusu. Situacija
pasikeitė tik 1980 m., kai buvo tiksliai nustatyta, kad hemofiliją sukelia VIII kraujo krešėjimo
veiksnio trūkumas. Buvo nustatyta šį baltymą koduojančio geno seka ir pasitelkus rekombinantinę
DNR technologiją bakterijose buvo pagamintas rekombinantinis kraujo krešėjimo veiksnys VIII. Šis
baltymas iki šiol yra naudojamas kaip efektyvus hemofilijos gydymo būdas. Jei caro Nikolajaus II
sūnus Aleksejus būtų gimęs mūsų dienomis, jį būtų galima bandyti gydyti genų terapijos būdu. Tam
reikėtų į jo ląsteles įvesti teisingą krešėjimo veiksnio VIII geno kopiją.
Norimiems genams įvesti į ląsteles yra naudojami įvairūs vektoriai (virusai ar kt.). Gamindami
virusinį vektorių, mokslininkai iš viruso genomo pašalina visus žmogui pavojingus viruso genus.
Todėl virusas nesukelia ligos, negali daugintis ir plisti. Į viruso genomą yra įterpiamas reikiamas
terapinis genas (4.6 pav.). Gautas modifikuotas virusas laboratorijoje yra padauginamas ir
suleidžiamas pacientui į raumenis. Virusai patenka į žmogaus ląsteles, įneša į ją savo genetinę
informaciją. Todėl šeimininko ląstelėse yra gaminami virusiniai baltymai, tarp jų reikiamas ir kraujo
krešėjimo veiksnys VIII.
 4.6 pav. Genų terapijos eksperimento, skirto hemofilijos gydymui, schema. (1) iš viruso
pašalinami ligas sukeliantys genai; (2) įterpiamas terapinis genas – tas, kurio funkciją ląstelėse
reikia atkurti; (3) gauti nauji virusai laboratorijoje padauginami;
(4) virusai suleidžiami žmogui į raumenis.

Genų terapija vis dar yra mokslinių tyrimų lygio. Jos taikymas susiduria su daugybe sunkumų. Vienas
jų – reikiamo baltymo kiekio ląstelėje reguliavimas. Hemofilijos gydyme nėra itin svarbu, kokius
kiekius veiksnio VIII susintetins ląstelės. Svarbiausia tai, kad šio baltymo organizme atsirastų. To
pakanka, kad kraujas imtų krešėti. Pjautuvinės anemijos atveju, jei organizme bus pagaminta per
mažai funkcionalaus hemoglobino, gydymas bus neveiksmingas. Tačiau jei šio baltymo bus per daug,
atsiras audinių pažeidimų ar net ištiks insultas.
Šiuo atveju yra itin svarbu griežtai reguliuoti reikiamo geno raišką ir susintetinamo baltymo kiekį.
Kitas iššūkis – taikinio ląstelės. Hemofilijos gydyme nesvarbu, kurios ląstelės pagamins krešėjimo
veiksnį. Gydant cistinę fibrozę, genų terapijos taikinys yra griežtai tik plaučių ląstelės. Todėl šiuo
atveju būtina naudoti konkrečioms ląstelėms, jų receptoriams selektyvius vektorius. Dar vienas
didelis „trukdis“ efektyviai genų terapijai yra žmogaus imuninė sistema. Jos tikslas – sunaikinti visas
organizmui svetimas ląsteles ir organizmus. Į organizmą patekus virusui nešikliui su norimu genu,
imuninė sistema atpažįsta, kad tai yra organizmui svetima medžiaga. Visos ląstelės turinčios virusą
yra sunaikinamos. Kartu sunaikinami ir terapiniai genai. Šią problemą bandoma spręsti mutuojant
virusą nešiklį. Modifikuojami jo paviršiaus baltymai, antigenai, kad virusas liktų imuninės sistemos
neatpažintas ir nesunaikintas.
Genų terapija – technologija, kurią pasitelkiant galima įterpti į ląsteles reikiamus sveikus genus.
Gydyti galima ne tik genetines ligas, bet ir vėžį, širdies ligas, AIDS. Deja, dauguma genetinių ligų
(ypač tos, kurias lemia ne vieno, o keleto genų defektai) dar negali būti pagydomos genų terapijos
būdu. Tačiau sparti medicinos pažanga, nuolatos tobulėjančios naujos technologijos, didėjantys
informacijos kiekiai, nuolat atliekami moksliniai tyrimai teikia daug vilties.

Pagalbinis apvaisinimas (angl. in vitro fertilization, IVF) – technologija, leidžianti poroms,

negalinčioms pastoti natūraliais būdais, susilaukti vaikų. Tokių porų pasaulyje yra daugiau nei 10 %.
Per šią procedūrą kiaušialąstė su spermatozoidu susitinka ne gimdoje, o mėgintuvėlyje. Vėliau
embrionas įdedamas į gimdą. Už tai, kad sukūrė pagalbinio apvaisinimo mėgintuvėlyje procedūrą,
2010-aisiais metais Robertas Edwardsas buvo apdovanotas Nobelio premija. Mokslinius darbus jis
pradėjo maždaug 1950 metais, o 1978 metų liepos 25-ąją, pasitelkus pagalbinį apvaisinimą, Anglijoje
gimė pirmasis kūdikis – Louis Brown. Skaičiuojama, kad šiuo būdu jau yra gimę daugiau nei 4 mln.
žmonių. Šio mokslininko darbai fundamentalūs, jie svariai pagelbėjo moderniajai medicinai. Dabar
poroms, negalinčioms ir norinčioms susilaukti vaikų, pagalbinis apvaisinimas yra vienas
efektyviausių pagalbos būdų. Tiesa, jis brangus. Lietuvoje šis gydymas valstybės
nekompensuojamas, 1 ciklas kainuoja 10–15 000 litų. Metodo efektyvumas yra 20–30 %.
Pagalbinio apvaisinimo procedūra pradedama kelioms savaitėms vaistais sustabdant kiaušidžių
veiklą. Vėliau kitais vaistais kiaušidės yra stipriai stimuliuojamos, kad jose subręstų kuo daugiau
kiaušialąsčių (4.7 pav.). Kiaušialąstėms subrendus, stebint ultragarso prietaisu į kiaušides įduriama
adata ir surenkama 5–15 kiaušialąsčių vienetų. Tuomet mėgintuvėlyje kiaušinėliai yra apvaisinami,
vienam kiaušinėliui pridedant 100 000 judrių spermatozoidų. Jei apvaisinimas neįvyksta, tada galima
spermatozoidą į kiaušinėlio citoplazmą įterpti pasitelkiant adatą ir mikroskopą. Kitas 3–6 paras
ląstelės yra laikomos inkubatoriuje, kur palaikomos reikiamos aplinkos sąlygos.
Kartkartėmis ląstelės tikrinamos mikroskopu – stebima, ar embrionai pradeda augti. Trečią dieną po
apvaisinimo embrionai būna 3–8 ląstelių dydžio. Paimami keli embrionai (paprastai ne daugiau kaip
3 vienetai). Naudojant kateterį jie įdedami į gimdą. Laukiama, kad jie implantuotųsi. Nepanaudoti
embrionai gali būti užšaldomi ir panaudojami vėliau (užšaldytų embrionų panaudojimas yra daug
pigesnis, nei naujas apvaisinimo mėgintuvėlyje ciklas). Praėjus 2 savaitėms nuo dirbtinio apvaisinimo
jau galima atlikti nėštumo testą.

4.7 pav. Pagalbinio apvaisinimo proceso schema

Transplantacija (lot. transplantare – pernešti). Tai – gydymo metodas, kai pažeistos ar sergančios
ląstelės, audiniai arba organai yra pakeičiami sveikais. Dažniausiai transplantuojami organai: inkstai,
kepenys, širdis, plaučiai, kasa, čiobrialiaukė. Transplantuojami audiniai – ragena, kaulai, sausgyslės,
oda, širdies vožtuvai, venos. Žmogus, kurio audinių, ląstelių ir (ar) organų paimama transplantacijai
(jam esant gyvam arba po jo mirties), yra vadinamas donoru (lot. donare – dovanoti, aukoti). Žmogus,
kuriam gydymo tikslais persodinami audiniai, ląstelės ar (ir) organai vadinamas recipientu. Procesas,
kai transplantacija yra atliekama naudojant to paties žmogaus organus ar audinius yra vadinama
autotransplantacija, o kai kito donoro – alotransplantacija.

Šiandien mokslininkai, pasinaudodami biotechnologijos laimėjimais, technologijomis ir mokslo

žiniomis, mokosi įvairius audinius ir organus auginti laboratorijose. Sparčiai besivystanti
regeneracinė medicina yra daugelio sunkiomis ligomis sergančių ir donorų laukiančių pacientų viltis.
Išmokus greitai ir efektyviai auginti audinius ar organus dirbtinėmis sąlygomis nereikėtų kiekvienam
pacientui ieškoti donoro. Transplantacijas būtų galima atlikti daug didesniam pacientų skaičiui.

Didžiausia alotransplantacijos problema – imuninis svetimų audinių atmetimas. Imunitetas –

organizmo atsparumas genetiškai svetimoms medžiagoms, vadinamomis antigenais. Imuninė sistema
kovoja su antigenais (virusais, bakterijomis) ir stengiasi juos sunaikinti. Deja, imuninė sistema lygiai
taip pat kovoja ir su persodintais svetimais organais ir audiniais – vyksta audinių atmetimo reakcija.
Po transplantacijos pacientams skiriama vaistų, kurie slopina imunitetą.

Transplantuojant svarbu, kad donoro ir recipiento audiniai būtų kuo panašesni. Todėl prieš
transplantaciją atliekami audinių tapatumo testai. Kiekvieno žmogaus ląstelės savo paviršiuje turi
MHC (angl. major histocompability complex) molekulių. Pagal jas imuninė sistema atskiria savas
ląsteles nuo svetimų. Kiekvieno žmogaus MHC molekulės yra unikalios. Tikimybė, kad Žemėje
gyvena kitas žmogus, turintis identiškas MHC molekules, minimali (išimtis yra identiški dvyniai).
Artimų giminaičių (tėvų, brolių, seserų ir kt.) MHC molekulės yra artimos, panašios, tačiau ne
identiškos. Ieškant donoro, MHC molekulės yra tikrinamos pagal tam tikrus pagrindinius kriterijus.
Ieškoma ne idealiai identiškų (nes tai iš esmės neįmanoma), o kuo panašesnių MHC molekulių.
Didžiausia tikimybė tokių donorų yra rasti šeimoje (1 iš 5). Jei nepavyksta šeimoje, tada ieškoma viso
pasaulio donorų banke.

Kamieninės ląstelės. Žmogaus kūnas yra sudarytas iš įvairių specializuotų ląstelių tipų: odos, kaulų,
raumenų ir kt. Visos šios skirtingos ląstelės turi bendrą savybę – jos yra kilusios iš tų pačių
nespecializuotų, galinčių atsinaujinti kamieninių ląstelių. Kamieninės ląstelės gali specializuotis
(diferencijuotis) ir tapti bet kurio audinio ląstelėmis. Tam reikia specifinių biocheminių sąlygų.
Kamieninės ląstelės yra skirstomos į embrionines ir suaugusiųjų (arba somatines). Embrioninės
kamieninės ląstelės randamos ankstyviausiose žmogaus vystymosi stadijose – embrione, virkštelėje.
„Suaugusiųjų“ kamieninės ląstelės yra randamos įvairiuose vaisiaus, vaiko, suaugusio žmogaus
organuose. Pagrindinė jų funkcija – atkurti, regeneruoti, užtikrinti pažeistų audinių vientisumą. Ilgai
buvo manyta, kad suaugusiųjų kamieninės ląstelės yra „prastesnės“ už embrionines, nes jos gali
diferencijuotis tik į to audinio, iš kurio jos yra kilusios, ląsteles. Palyginimui, embrioninės kamieninės
ląstelės diferencijuojasi į bet kurio tipo ląsteles.
Tačiau pastarųjų metų moksliniai darbai rodo, kad suaugusiųjų (somatinės) kamieninės ląstelės yra
daug plastiškesnės, nei buvo manyta iki šiol. Jos gali diferencijuotis ir į kito audinio ląsteles. Kraujo
kamieninės ląstelės gali diferencijuotis į kepenų ląsteles. Deja, dar nepavyko įrodyti, kad suaugusiųjų
kamieninės ląstelės yra tokios pat universalios, kaip embrioninės. Tačiau jos turi kitų pranašumų.
Embrioninių kamieninių ląstelių naudojimas yra laikomas neetišku, nehumanišku ir draudžiamas
daugelyje pasaulio šalių. Kai konkretaus žmogaus kamieninės ląstelės panaudojamos jam pačiam
gydyti, nesusiduriama su jokiomis etikos problemomis. Svarbiausia, yra užtikrinamas imuninis
suderinamumas. Šiuo metu suaugusiųjų kamieninės ląstelės yra labai intensyviai tiriamos ir tikimasi,
kad jų pagrindu bus gydoma daugybė ligų.
Kamieninių ląstelių terapija medicinoje turi labai didelį potencialą, bet realiame gyvenime šiandien
ji taikoma dar labai retai. Dauguma gydymo būdų, paremtų kamieninėmis ląstelėmis, yra dar tik
mokslinių tyrimų lygio. Labiausiai žinomas ir realiai naudojamas yra kraujo vėžinių ligų gydymas
kamieninėmis donoro ląstelėmis iš kaulų čiulpų (kaulų čiulpų transplantacija). Tačiau čia susiduriama
su imuninio nesuderinamumo problema, nes rasti tinkamą donorą ne visada pavyksta. Tokiu atveju
naudojamos identiškų dvynių, giminaičių arba negiminingų donorų ląstelės. Paciento kaulų čiulpų
ląstelės yra sunaikinamos veikiant radiacijai, o paskui suleidžiamos donoro kamieninės ląstelės ir
tikimasi, kad jos nebus atmestos.
Prieš suleidžiant kamienines ląsteles žmogui jas galima patobulinti, genetiškai modifikuoti. Galima
priversti jas gaminti tam tikrus baltymus (receptorius) ar kurti kamienines ląsteles atsparias ŽIV.
Tačiau dažniausiai jos panaudojamos atkurti pažeistus audinius, ląsteles ir gydyti su tuo susijusias
ligas. Gydomos neurodegeneratyvinės Alzheimerio, Parkinsono ligos, įvairios vėžinės ligos diabetas,
po pažeidimų atkūriamos stuburo smegenys. Mokslinių tyrimų, atliktų su gyvūnais, rezultatai
džiugina. Deja, ne visada gydymas, kuris tiko gyvūnams, pasiteisina gydant žmones. Kamienines
ląsteles bandoma panaudoti ir audinių inžinerijai – audiniams, organams (širdžiai, kepenims,
inkstams ir kt.) auginti laboratorijoje (regeneratyvinė medicina).
Ligoms gydyti yra bandoma naudoti ir kitas, ne tik kamienines žmogaus ląsteles. Naudojamos
dendritinių, T ląstelių terapijos. Dendritinės ląstelės – tai tokios imuninės sistemos ląstelės, kurios
atpažįsta antigenus (virusais ar bakterijomis infekuotas žmogaus ląsteles, vėžines ląsteles) ir paskui
aktyvina tiems antigenams specifines T ląsteles žudikes. Šios ląstelės sugeba atpažinti antigenus
turinčias ląsteles ir jas sunaikinti. Diagnozavus, kad pacientas serga vėžiu ir nustačius, kokius
baltymus–žymenis turi jo vėžinės ląstelės, galima dirbtinai aktyvinti paciento imunitetą prieš tuos
žymenis. Tada paties paciento imuninė sistema vėžines ląsteles sunaikins.
Tokio gydymo procedūra gana nesudėtinga. Pacientas yra prijungiamas prie aferezės aparato. Jis
filtruoja paciento kraują ir atrenka reikiamas dendritines ląsteles, o išfiltruotą kraują iškart leidžia
atgal pacientui. Paskui laboratorijoje dendritinės ląstelės auginamos paveikiant tuo baltymu–
žymeniu, kurį turėjo paciento vėžinės ląstelės. Vėliau dendritinės ląstelės suleidžiamos atgal
pacientui, jos aktyvina paciento imunines T ląsteles žudikes, o pastarosios suranda ir sunaikina
vėžines ląsteles. Toks gydymo būdas yra itin patrauklus ir perspektyvus, nes čia naudojamos paties
paciento ląstelės. Nekyla jokių problemų dėl imuninio nesuderinamumo.
Neabejojama, kad gydymas ląstelėmis yra medicinos ateitis. Žinoma, šiandien toks individualus
gydymas yra be galo brangus. Daug paprasčiau ligas gydyti paprastais vaistais, kai tuos pačius vaistus
galima naudoti visiems pacientams. Tačiau tai dažnai nepasiteisina. Individualus gydymas yra daug
tikslesnis, efektyvesnis. Tačiau tokiu būdu paruoštas vaistas – ląstelės yra tinkamos tik tam vienam
pacientui, kurio ląstelės buvo paimtos iš kraujo. Už dendritinių ląstelių atradimą, jų funkcijų
išaiškinimą ir sukurtus gydymo metodus 2011-aisiais metais Ralphas Steinmanas buvo apdovanotas
Nobelio premija.
Pasitelkdama šiuolaikines biotechnologijas ir kitus mokslus medicina sparčiai žengia pirmyn. Turime
būdų, kaip išvengti kai kurių ligų, kaip greitai diagnozuoti ligas, nustatyti jų priežastis. Žmogui
susirgus (be klasikinių vaistų) jau yra daug naujų gydymo būdų. Jie teikia daug vilčių, ypač gydant
tas ligas, kurios dažniausiai dar nėra pagydomos (vėžys).
4.3. Aplinka ir biotechnologija: biologinė kenkėjų kontrolė, nykstančių ir išnykusių rūšių
išsaugojimas, aplinkos teršalų valymas

Vienas būdų žemės ūkio produktų gamybos efektyvumui padidinti – gerinti kovą su kenkėjais. Šiuo
metu žinoma apie 67 000 skirtingų pasėlių kenkėjų – augalų patogenų, piktžolių, bestuburių ir keletas
stuburinių. Visi šie kenkėjai lemia apie 40 % mažesnį pasaulinį derlių. Dabar pagrindinė kovos su
žemės ūkio kultūrų kenkėjais priemonė – cheminiai pesticidai. Pasaulyje jų kasmet sunaudojama 2,5
mln. tonų. Šie milžiniški kiekiai daro neabejotiną žalą aplinkai, o kartais – žmonių ir gyvūnų
sveikatai. Biopesticidai4 yra saugesnė kenkėjų kontrolės priemonė, tačiau jie nepopuliarūs, nes yra
brangesni ir dažnai mažiau efektyvūs. Dar vienas kovos su kenkėjais būdas – kenkėjams atsparūs
transgeniniai augalai. 2011 metais komercinės transgeninės kultūros, atsparios kenkėjams, buvo
auginamos 29 pasaulio šalyse.

Kova su piktžolėmis. Herbicidai – tai pesticidai, naudojami nepageidaujamiems augalams naikinti.

Jų veikimo mechanizmas paremtas esminių fermentų ar augimui būtinų baltymų slopinimu.
Herbicidas glifosatas augalus naikina slopindamas fermentą, būtiną aromatinių aminorūgščių
sintezei. Herbicidai naikina ne tik piktžoles, bet ir žemės ūkio augalus. Selektyvius herbicidus,
nekenkiančius komercinėms kultūroms, sukurti labai sudėtinga. Veiksmingesnis, pigesnis ir
ekologiškesnis piktžolių kontrolės būdas – auginti herbicidams atsparius transgeninius augalus. Genų
inžinerijos metodais kuriami herbicidams atsparūs augalai:

 Pakeičiamas herbicido taikinys taip, kad jis nebegalėtų prisijungti;

 Įkeliamas vienas ar keli genai, koduojantys herbicidą modifikuojančius arba skaidančius

fermentus;

 Įkeliami papildomi genai, kurių produktai nesąveikauja su herbicidais ir kompensuoja

nuslopintų baltymų funkciją;

 Augalas modifikuojamas taip, kad herbicidas negalėtų pasiekti molekulinio taikinio.

Pasaulyje sėkmingai auginami genetiškai modifikuoti herbicidams atsparūs kukurūzai, kviečiai,

ryžiai, medvilnė, soja, cukriniai runkeliai, rapsai. Herbicidams atspari soja yra populiariausia
pasaulyje auginama transgeninė kultūra. Daugiau nei 90 % JAV ir Argentinoje auginamos sojos yra
transgeninė. Ji yra atspari glifosatui. Glifozatui atsparūs augalai kuriami įkeliant bakterinį geną,
koduojantį aromatinių aminorūgščių sintezei svarbų fermentą. Pasirodo, šis fermentas nesąveikauja
su glifosatu ir nepraranda aktyvumo net esant didelėms herbicido koncentracijoms. Kai laukai
nupurškiami glifosatu, įprastiniai augalai žūva, o transgeniniai lieka nepažeisti dėl funkcionalaus
bakterinio fermento.

Transgeniniai augalai labai tinka kovai su piktžolėmis. Jų savybės įgalina naudoti paprastus, pigius,
gamtai mažai kenkiančius herbicidus. Be to, auginant herbicidams atsparius augalus gaunamas
didesnis derlius. Tačiau kultivuojant transgeninius herbicidams atsparius augalus neišsprendžiama
herbicidų naudojimo problema: laikui bėgant piktžolės tampa atsparios herbicidams.
Kova su vabzdžiais. Kovai su vabzdžiais kenkėjais naudojami pesticidai, vadinami insekticidais.
Nors žemės ūkyje naudojami cheminiai insekticidai gerokai padidina pasėlių derlių, jie stipriai teršia
aplinką. 1950–1980 metais insekticido DDT pasaulyje būdavo sunaudojama 40 000 tonų kasmet.

4
Biopesticidai – biologinės kilmės kovos su kenkėjais priemonė.
Gamtoje DDT labai stabilus: jo pusamžis, priklausomai nuo klimato sąlygų, varijuoja nuo 22 dienų
iki 30 metų. DTT kaupėsi aplinkoje, gyvūnų organizmuose. Jau praėjo 40 metų nuo to laiko, kai DDT
uždraustas naudoti žemės ūkyje, tačiau jo žala gamtai ryški iki šiol.
Kitas svarbus cheminių insekticidų trūkumas yra tas, kad jų pėdsakai maiste žmonėms gali sukelti
rimtų sveikatos sutrikimų. Dėl šių priežasčių žemės ūkyje ieškoma alternatyvių apsisaugojimo nuo
vabzdžių kenkėjų būdų. Vienas tokių būdų – kurti transgeninius augalus, pasižyminčius atsparumu
kenkėjams.
Šiuo metu visi komerciškai auginami vabzdžiams atsparūs transgeniniai augalai turi bakterijos
Bacillus thuringiensis toksino genų. Šie genai koduoja baltymų kristalus – Bt toksinus, nuodingus
vabzdžiams. Patekę į vabzdžio žarnyną, šie kristalai ištirpsta. Tuomet jie įsiterpia į vidurinės žarnos
epitelio ląstelių membraną, sukelia osmosinį šoką. Ląsteles ištinka lizė ir galiausiai vabzdys žūva (4.8
pav.). Taigi, kai vabzdžiai suėda transgeninių augalų su Bt toksinais (Bt augalų), jie žūva.
2011 metais pasaulyje komerciniais tikslais buvo auginama 66 milijonai hektarų 5 Bt kukurūzų
(daugiausia JAV) ir Bt medvilnės. Bt kukurūzai naudojami gyvulių pašarams ir biokurui gaminti, o
Bt medvilnė – žaliava pluoštui. 1996 metais pradėjus auginti Bt kukurūzus žemdirbių pelnas išaugo
daugiau nei 8 mlrd. JAV dolerių. Bt kukurūzai dabar sudaro apie 85 % visų JAV auginamų kukurūzų.
1996 metais pradėta auginti Bt bulves, atsparias kolorado vabalui. Vis dėlto, jos buvo nepopuliarios
tarp pirkėjų: visuomenėje kilo baimė vartoti genetiškai modifikuotas kultūras. Dėl šios priežasties,
2001 metais Bt bulvės buvo pašalintos iš prekybos.

4.8 pav. Bt toksino veikimo mechanizmas vabzdžių virškinimo sistemoje

5
Palyginimui, Lietuvos teritorija užima 6,52 milijono hektarų
Transgeninės kultūros su Bt toksino genais lėmė geresnę apsaugą nuo vabzdžių kenkėjų ir pelno
augimą. Be to, sutaupoma žemdirbių darbo ir laiko. Nebereikia insekticidais purkšti laukų, o
svarbiausia – mažiau teršiama aplinka. Antra vertus, Bt augalai pražūtingi ne tik kenkėjams, bet ir
naudingoms vabzdžių rūšims. Baiminamasi, kad ilgainiui vabzdžiai kenkėjai įgis atsparumą Bt
toksinui.
Kyla klausimas, kokią įtaką Bt augalai turi žmonių ir gyvulių sveikatai. Reikia žinoti, kad bakterijų
B. thuringiensis preparatu – biopesticidu – laukai purškiami jau 60 metų ir jis laikomas saugiu.
Moksliniais tyrimais įrodyta, kad toksino kiekiai, kuriais purškiami laukai, žinduolių sveikatai neturi
įtakos. Bt augaluose sintetinami gerokai didesni toksino kiekiai, tačiau jais maitinami gyvuliai savo
sveikatos būkle nesiskiria nuo tų, kurie maitinami įprastais pašarais. Žmonės Bt augalų tiesiogiai dar
nevartoja.

Kova su virusais. Cheminėmis priemonėmis su virusais kovoti neefektyvu: jie labai atsparūs. Dėl to
ypač daug dėmesio skiriama virusams atspariems transgeniniams augalams kurti. Tokie augalai
kuriami viruso genomo seką, koduojančią kapsidės ar replikacijos baltymus (pagrindinius virusų
komponentus) transformuojant į augalą. Augalas sintetina patogeno elementus ir taip sugeba
apsisaugoti nuo virusų atakų iš aplinkos. Į tabako augalą transformavus geną, koduojantį tabako
mozaikos viruso (TMV) kapsidę, augalas tapo atsparus TMV. Yra keletas šį apsisaugojimą bandančių
paaiškinti hipotezių, tačiau tikslus gynybos mechanizmas vis dar nėra nustatytas. Virusams atsparūs
transgeniniai augalai (papajos, moliūgai, bulvės, slyvos) komerciniais tikslais kultivuojami jau ilgiau
nei dešimtmetį.

Kova su grybelinėmis infekcijomis. Visame pasaulyje vienu pagrindinių veiksnių, mažinančių

pasėlių derlingumą, išlieka mikroskopinių grybų sukeliamos ligos. Dar viena pesticidų rūšis, kuri šiuo
metu naudojama pasėlių apsaugai nuo grybelinių infekcijų, yra fungicidai. Siekiant padidinti kovos
su grybeliais efektyvumą kuriami transgeniniai augalai:

 Genai, kurie bakterijose ar augaluose koduoja chitinazės ir gliukanazės sintezę, įkeliami į

žemės ūkio kultūras. Gauti transgeniniai augalai skaido chitiną ir gliukaną – būtinus grybų
ląstelių sienelių komponentus. Taip jie apsisaugo nuo mikroskopinių grybų sukeliamų ligų.

 Augalų atsparumas mikroskopiniams grybams didinamas įterpiant genus, kurie natūralius

augalų gynybos mechanizmus daro efektyvesnius. Pavyzdžiui, konstruojami transgeniniai
augalai, sintetinantys didelius toksinų kiekius.

Vis dėlto, komerciškai prieinamų kultūrų, sukurtų pagal šias atsparumo grybams strategijas dar nėra.

Nykstančių ir išnykusių rūšių išsaugojimas

Vienos rūšies išnykimas gali sutrikdyti pasaulinę ekosistemą. Dėl to nykstančių rūšių populiacijas
bandoma atkurti taikant įvairius išsaugojimo metodus. Natūralių buveinių išsaugojimas yra
efektyviausias bioįvairovės tausojimo būdas. In situ rūšių išsaugojimo strategija paremta gyvos
populiacijos palaikymu jai pritaikytoje aplinkoje. Deja, šių pastangų kartais nepakanka (ypač
propaguojant mažas populiacijas). Naujesnė ex situ rūšių išsaugojimo strategija remiasi rūšių
išsaugojimu joms nebūdingoje aplinkoje. Genetinė medžiaga (gametos, embrionai, ląstelių, audinių
pavyzdžiai ar DNR) užšaldomi skystame azote. In situ ir ex situ rūšių išsaugojimo programose
taikomi įvairūs reprodukcinės biotechnologijos metodai: dirbtinis apsėklinimas, embriono
perkėlimas, gametų ir embrionų mikromanipuliavimas, genomų bankų kūrimas ir klonavimas.

Biotechnologijos metodai, naudojami žinduolių rūšims išsaugoti. Žinduolių rūšių nykimas yra
natūralus ir negrįžtamas procesas. Dabar gyvūnai nyksta gerokai sparčiau dėl žmonių veiklos.
Naikinamos natūralios gyvūnų buveinės, intensyvi jų medžioklė, stipri konkurencija su dirbtinai
užveistomis žolėdžių rūšimis. Kai kurios naminių gyvulių rūšys išnyko dėl rinkos skatinamos
intensyvios kelių rūšių atrankos. 2006 metais pasauliniame nykstančių rūšių sąraše buvo 1528 gyvūnų
rūšys, iš jų 162 – žinduolių rūšys (4.9 pav.).

4.9 pav. Stumbrų pasaulyje likę vos keli tūkstančiai

Dirbtinis apsėklinimas. Dažniausiai dirbtinis apvaisinimas taikomas siekiant išsaugoti genetiškai
sveikas rūšis. Kai kurių rūšių gyvūnai dauginasi nedidelėse bendruomenėse, tai lemia išsigimusius
(neatsparius gamtiniam spaudimui) palikuonis. Išsaugant tokias rūšis, patelės apvaisinamos sperma,
paimta iš sveikų patinų, laikomų zoologijos soduose arba pagautų laisvėje. Dirbtinai apsėklintos
patelės natūralioje aplinkoje atsiveda genetiškai sveikus palikuonis. Dirbtinis apsėklinimas taip pat
taikomas rūšims, kurios nelinkusios poruotis (didžiosioms pandoms).
Nors dirbtinio apsėklinimo potencialas išsaugant rūšis yra didelis, šios technologijos pritaikymui
laukinėje gamtoje yra keletas apribojimų. Vienas iš jų – netinkami tradiciniai spermos paėmimo
metodai iš kai kurių rūšių patinų (raganosių). Kitas iššūkis yra menkos žinios apie daugelio laukinių
rūšių patelių reprodukcinę fiziologiją ir anatomiją. Kad dirbtinis apsėklinimas būtų sėkmingas, būtina
visapusiškai suprasti patelės reprodukcinį ciklą ir nustatyti tinkamiausią vietą spermai patalpinti
patelės trakte.
Reikšmingiausi dirbtinio apsėklinimo, davusio palikuonis, pavyzdžiai yra Afrikos liūtas, jaguaras,
Azijos ir Afrikos drambliai, didžioji panda.

Embriono perkėlimas. Šio metodo principas yra paimti embrioną iš patelės, priklausančios
nykstančiai rūšiai, jį išsaugoti užšaldžius ir perkelti į tos pačios (ar kitos, labiau paplitusios) rūšies
surogatinę patelę. Embrioną galima gauti ir in vitro apvaisinimo būdu, kai kiaušinėlis dirbtinai
apvaisinamas spermatozoidais ne patelės gimdoje, o mėgintuvėlyje. Dabar šie metodai taikomi tik
ekonomiškai naudingų žinduolių (jaučių ir avių) populiacijai didinti. Nykstančių rūšių populiacijai
kontroliuoti šie metodai kol kas netaikomi.

Klonavimas. Gyvūnų klonavimu vadinamas procesas, kurio metu gyvūnas „nukopijuojamas“ iš

vienos ląstelės (4.10 pav.). Subrendusi patelė naudojama kaip kiaušinėlių donorė, kiaušinėlių
branduoliai atsargiai pašalinami. Iš klonuojamo gyvūno paimama ląstelių, jos suliejamos panaudojus
elektrinį impulsą. Galiausiai besidalijančios ląstelės implantuojamos į surogatinės motinos gimdą,
kur vystosi klonuotas gyvūnas. Gautas klonas savo genų rinkiniu yra identiškas gyvūnui, kurio
ląstelės su branduoliais naudotos per suliejimą. Mokslininkai tikisi ateityje klonavimą pritaikyti
atkuriant išnykusias rūšis. Didelis šio metodo trūkumas – labai mažas sėkmės procentas. Iš šimtų
klonuotų embrionų išgyvena vienetai. Be to, aktyviai svarstomi tokio klonavimo etiniai aspektai.

4.10 pav. Gyvūnų klonavimo schema

Nykstančių augalų rūšių išsaugojimo būdai. Dėl pagreitėjusios klimato kaitos, netinkamos
žemdirbystės, urbanizacijos, užterštumo, dirbtinai išplatintų kultūrų labiausiai kenčia augalai.
Siekiant išsaugoti nykstančias augalų rūšis, taikomos in situ ir ex situ programos, augalų genetinė
medžiaga konservuojama in vitro.
In vitro kultūra vadinama augalo genetinė medžiaga (ūglių viršūnės, meristemos, somatiniai gemalai
ar gemalinis kalius), kuri steriliomis sąlygomis auginama ant dirbtinės kultivavimo terpės (4.11 pav.).
Kuriant in vitro nykstančių augalų rūšių kolekcijas svarbu turėti geras kultūrų sėjimo, palaikymo,
padauginimo ir ilgo laikymo metodikas. Jauni, greitai augantys ūgliai, lapai, žiedų dalys, nesubrendę
gemalai, daigai yra dažniausiai naudojami donorinių augalų audiniai in vitro kultivacijai. Augalų
audiniai pirmiausia sterilinami, tada pasėjami ant sterilios kultivavimo terpės, praturtintos mineralais,
vitaminais, angliavandeniais ir augalų augimo reguliatoriais. Pastarieji lemia tolesnį augalo ląstelių
dalijimąsi ir vystymąsi. Kuriant nykstančių augalų kolekcijas turi būti naudojami tik normalūs,
nesergantys augalai. Dėl to pirmiausia vizualiai įvertinama augalų–donorų morfologija. Tada
atliekama tikslesnė jų analizė biocheminiais ir molekuliniais metodais.

4.11 pav. Augalo in vitro kultūra, auginama ant agarizuotos kultivavimo terpės
In vitro kultūros gali būti laikomos nuo kelių mėnesių iki kelerių metų (taikant lėto auginimo
strategiją). Ilgai laikant augalų kultūras jose gali įvykti genetiniai pokyčiai. Siekiant to išvengti,
genetinė medžiaga užšaldoma skystame azote. Tokiomis sąlygomis slopinamas metabolinis
aktyvumas, todėl sumažinama mutacijų rizika. In vitro augalų kolekcijos yra vertinga medžiaga
laukinėms populiacijoms atkurti, molekulinei analizei ir ekologiniams tyrinėjimams.

Biologinis valymas
Staigus chemijos pramonės augimas paskutiniajame šimtmetyje gerokai pakeitė mūsų gyvenimo būdą
ir palengvino buitį. Antra vertus, chemijos amžius pateikė ir problemų. Labai aktuali problema yra
didelė aplinkos tarša. Anksčiau padarytos ekologinės klaidos, lėmusios didelę oro, vandens ir
dirvožemio taršą, pastebimos iki šių dienų. Aplinkoje besikaupiančias atliekas galime vadinti
vartojimo ir gamybos šalutiniu produktu. Tad nemaža atsakomybė tenka ir mums.
Pavojingiems chemikalams valyti iš aplinkos gali būti panaudojama daug įvairių cheminių ar fizikinių
metodų. Chemikalai gali būti surenkami koncentruojant ir saugiai laikomi (arba padaromi
nekenksmingi sudeginant). Tačiau kyla oro taršos problema. Potencialūs teršalai iš atliekų gali būti
koncentruojami adsorbuojant juos ant kietos fazės (pavyzdžiui, aktyvintos anglies) paviršiaus. Yra ir
kitokių prieinamų aplinką teršiančių medžiagų atskyrimo metodų, tačiau dažniausiai tokie procesai
yra labai brangūs arba sunkiai pritaikomi. Gerokai efektyvesnis aplinkos teršalų valymo metodas yra
biologinis valymas.

Biologinis teršalų valymas – tai procesas, kai aplinkos teršalams naikinti panaudojami gyvi
organizmai. Dažniausiai biologinio valymo procesuose naudojami mikroorganizmai. Jų įvairovė
didžiulė, o skirtingos jų šeimos gali gyventi įvairiomis kritinėmis sąlygomis. Mikroorganizmai gali
toleruoti karštį, šaltį, žemas pH vertes, aerobinę ar bedeguonę (anaerobinę) aplinką. Teršalus
skaidančių mikroorganizmų tikslinga paieška atliekama vietovėse, kurios užterštos specifiniais
cheminiais junginiais. Mikrobai iš tokios aplinkos gali išgyventi ir daugintis, panaudodami toksiškus
junginius savo reikmėms. Plačiau apie biologinį teršalų valymą skaitykite skyrelyje 12.5
Biodegradacija ir mikroorganizmų panaudojimas teršalams valyti.
Dažniausias cheminių medžiagų utilizavimo būdas – skaidymas bioreaktoriuose. Jis atitinka visus
pagrindinius pramoninės fermentacijos principus. Teršalų skaidymas bioreaktoriuose vyksta užteršto
dirvožemio suspensiją arba vandenį veikiant specialiai paruoštu bakterijų mišiniu. Proceso sąlygos
gali būti lengvai kontroliuojamos.
Užterštiems gruntiniams vandenims valyti taikoma pumpavimo ir biodegradacijos procedūra.
Gruntiniai vandenys pumpuojami į paviršių, papildomi maisto medžiagomis ir grąžinami atgal į
užterštą zoną (4.12 pav.). Norint iš gruntinių vandenų išvalyti trichloreteną, vanduo papildomas
metanu ir deguonimi. Šio teršalo skaidymą vykdo metanotrofinės bakterijos. Bakterijų sintetinama
metano monooksigenazė (fermentas) katalizuoja chloro atskėlimą nuo trichloreteno, o metanas
naudojamas kaip anglies šaltinis.

4.12 pav. Trichloretenu užterštų gruntinių vandenų biologinis valymas

Biologinio teršalų valymo pranašumai ir problemos

Palyginus su kitais aplinkos valymo procesais, biologinis valymas yra pranašesnis dėl didelio proceso
pritaikomumo ir mažos kainos. Norint taikyti atliekų deginimo metodą svarbiausia, kad toksiškos
medžiagos būtų degios. Tačiau deginant atliekas dažnai susidaro toksiški dūmai. Šios problemos
neaktualios naudojant biologinį valymą.
Nors didžiąją dalį chemiškai susintetintų junginių mikroorganizmai sugeba skaidyti, biodegradacijų
greičiai dažniausiai yra labai maži. Biologinio valymo greičiai padidinami užterštą regioną papildžius
maisto medžiagomis (azoto, fosforo ar papildomais anglies šaltiniais) ir jį pritaikius (tinkamas pH ir
kt.) specifiniams mikroorganizmams augti. Pagrindinis biologinio valymo uždavinys – teršalus
suskaidyti iki CO2. Deja, taip vyksta retai. Toksiški junginiai dažniausiai skaidomi iki antrinių
produktų. Procesai naudingi tik tada, jei gautas metabolitas yra mažiau toksiškas nei pradinis
junginys.

4.4. Atsinaujinančių anglies šaltinių panaudojimas įvairių žaliavų ir energijos (etanolio,

metano, vandenilio) gamybai biotechnologijos metodais

Pramonine biotechnologija vadinami tradiciniai pramoniniai procesai, kurie vykdomi naudojant

biotechnologinius metodus kuro, chemikalų ir plastikų gamybai iš atsinaujinančių žaliavų. Celiuliozė,
krakmolas, aliejai, baltymai, ligninas yra žaliavos gaminant didesnės pridėtinės vertės produktus.

Bioetanolis yra skystasis biokuras, kuris gaminamas iš atsinaujinančių anglies šaltinių (krakmolingų
ar cukringų kultūrų) fermentacijos proceso metu. Bioetanolis laikomas benzino ir dyzelino
alternatyva. Gaminant bioetanolį, augalinės kilmės žaliavos veikiamos fermentais amilazėmis tam,
kad būtų išlaisvinti angliavandeniai. Tuomet pridedama mielių, kurios angliavandenius fermentuoja
į etanolį ir anglies dioksidą. Bioetanolio gamybai naudojami augalai priklauso nuo gamybos vietovės.
Brazilijoje naudojamos cukranendrės, JAV pirmenybę teikia šalyje auginamiems kukurūzams, o
visoje Europoje daugiausia naudojami kviečiai ir miežiai.

Metanas yra pagrindinė gamtinių dujų sudedamoji dalis. Jis yra labai svarbus kuras dujų turbinoms
ar garo katilams. Suslėgtos metano dujos gali būti naudojamos transporto priemonėse. NASA siekia
metaną naudoti kaip raketinį kurą. Palyginus su kitais angliavandeniliais, deginamas metanas
pagamina mažiau anglies dioksido dujų vienam šilumos vienetui. Labai svarbu, kad metanas gali būti
gaunamas iš atsinaujinančių žaliavų. Metanas sintetinamas iš biodujų, kurios anaerobinėmis
sąlygomis fermentuojamos iš organinių medžiagų: mėšlo, nuotekų dumblo, komunalinių kietųjų
atliekų ar kitų biologiškai skaidomų žaliavų.

Vandenilis yra laikomas iškastinio kuro alternatyva. Pagrindinis jo pranašumas, palyginus su

biodujomis ir metanu, yra tas, kad vandenilis chemiškai nesurištas su anglimi. Todėl jo degimas
nesukuria šiltnamio efekto dujų ar rūgščių lietų. Vis dėlto, vandenilis dažniausiai gaunamas iš
gamtinių dujų, o gamybos metu susidaro dideli CO2 kiekiai. Šią problemą galima išspręsti vandenilį
gaminant iš atsinaujinančių anglies šaltinių mikrobiologinės fermentacijos metu. Tam naudojamos
cianobakterijos ir dumbliai. Vandenilis gali būti gaminamas iš įvairių atliekų: ryžių ir kviečių sėlenų,
melasos, aktyvinto dumblo, kietųjų komunalinių atliekų. Šias dujas galima gauti ir iš lignoceliuliozės
turinčių žaliavų – šiaudų ar cukranendrių išspaudų.
4.13 paveiksle pavaizduota mokslininkų sukurta mikrobinė elektrolizės celė. Joje bakterijoms
skaidant acto rūgštį ir naudojant silpną išorinį elektros šaltinį gaminamos vandenilio dujos.
Naudojama acto rūgštis, gauta iš augalų atliekų jų fermentacijos metu. Plačiau apie biokurą skaitykite
13 skyriuje.
 4.13 pav. Vandenilį gaminantis mikrobinis elektrolizės elementas
Iš angliavandenių biomasės gali būti fermentuojama apie 30 monomerų. Jie yra potencialūs substratai
naujų produktų sintezei arba tiesioginė naftos produktų alternatyva. Dvylika iš jų yra pagrindiniai
pramoninės biotechnologijos taikiniai ir tyrimų objektai (4.1 lentelė).

Statybiniai elementai Molekulinė formulė Potencialus panaudojimas

1,4-dirūgštys
(skruzdžių, fumaro, malono)
2,5-Furano dikarboksirūgštis
3-Hidroksipropano rūgštis
Asparto rūgštis
Gliukaro rūgštis
Gliutamo rūgštis
Itakono rūgštis
Levulino rūgštis
3-Hidroksibutirolaktono rūgštis
Glicerolis
Sorbitolis
Ksilitolis/arabinitolis
C4H6O4 Tirpikliai, pluoštai.
PET analogai su potencialiai naujomis
C6H6O3
savybėmis (buteliai, plėvelės, talpyklos)
Kontaktiniai lęšiai, superabsorbuojantys
C3H6O3
pluoštai sauskelnėms, kilimų pluoštai
C4H7NO4 Chelatinės druskos, saldikliai
C6H10O8 Tirpikliai, nailonai
C5H9NO4 Poliamidų ir poliesterių monomerai
Kopolimeras stireno ir butadieno polimeruose
C5H6O4
(pagerina pluošto dažymąsi), nitrilo lateksas
Kuro oksigenatoriai, tirpikliai, bisfenolio A
C5H8O3
pakaitalas polikarbonatų sintezėje
Tarpinis produktas aukštos vertės
C4H6O3
farmaciniams junginiams
Asmeninės higienos ir priežiūros produktai,
C3H8O3 vaistai, maisto produktai, gėrimai ir poliesterių
poliakoholiai (poliuretanams)
Vandens užšalimo temperatūros žeminimas,
PET tipo polimerai, kaip polietenizosorbido
C6H14O6
tereftalatas (buteliai skirti karštiems
skysčiams)
Nepasisavinami saldikliai, nesočiųjų
C5H12O5
poliesterių dervos

4.1 lentelė. Iš biomasės gaunami junginiai – potenciali pramoninės biotechnologijos žaliava

Šiandienos pramonėje vis dar dominuoja nafta, tačiau vis labiau domimasi pigių biologinių medžiagų
konversijos į naudingus produktus galimybėmis. Mikroorganizmų ir fermentų genų inžinerija yra
naujų technologijų ir procesų pagrindas.
Kovojant su globaliniu atšilimu labai svarbu pramonėje taikyti bioprocesus. Gaminant bioproduktus
iš atsinaujinančių žaliavų CO2 yra sunaudojamas (priešingai nei naftos žaliavų atveju). Todėl
sumažėja šiltnamio efekto dujų emisija.
Biologinės kilmės junginių komercinę sėkmę lemia ekonominiai, funkciniai ir ekologiniai veiksniai.
Bioproduktų pardavimo kaina labiausiai priklauso nuo žaliavų kainos ir gamybos technologijos
kainos. Atsinaujinančius anglies šaltinius pramoninei gamybai pradėta intensyviau naudoti ieškant
alternatyvų iškastinėms žaliavoms. Pramoninė biologinės kilmės produktų gamyba daugeliu atvejų
buvo subsidijuojama. Šiandien dėl didelių technologijos kainų tik maža prieinamos biomasės dalis
naudojama biomedžiagų gamybai.
Tam, kad bioproduktai būtų priimti prekybininkų ir vartotojų, jie privalo pasižymėti tomis pačiomis
(jei ne geresnėmis) savybėmis, kaip ir produktai, gauti iš naftos žaliavų.

Sėkmingi biotechnologijos pramonės produktų pavyzdžiai

Biologinės kilmės 1,3-propandiolis fermentuojamas iš kukurūzų angliavandenių. Šis junginys
naudojamas polimerų sintezėje (4.14 pav.). Zemea® ir Susterra® yra dvi komercinės biopropandiolio
rūšys, gaminamos vien iš atsinaujinančių anglies šaltinių. Zemea® propandiolis yra labai grynas. Jis
skirtas kosmetikos, asmens higienos ir namų priežiūros priemonių gamybai. Susterra® propandiolis
skirtas orlaivių atitirpinimo skysčių, antifrizo gamybai bei nesočiųjų poliesterinių dervų ir poliuretanų
sintezei. Palyginus su propandiolio gamyba iš naftos žaliavų, biologinės kilmės propandiolio gamybai
sunaudojama 38 % mažiau energijos ir išmetama 42 % mažiau šiltnamio efekto dujų.

4.14 pav. 1,3-propandiolio panaudojimas polimerų sintezėje

Polilaktatas (4.15 pav. A), gaminamas iš atsinaujinančių anglies šaltinių, yra populiariausias
biopolimeras iš visų biodegraduojamų poliesterių. Šis produktas lengvai sintetinamas, yra pigus. Šiuo
metu tai vienintelis biopolimeras savo kaina galintis konkuruoti su tradiciniais plastikais. Be to, tai
ekologiškas junginys.

A) B)
4.15 pav. A) Polilaktato; B) polihidroksialkanoato struktūros

Polihidroksialkanoatas (4.15 pav. B) yra kitas pasisekimo sulaukęs poliesteris. Tai –

biodegraduojamas plastikas, gaminamas iš atsinaujinančių žaliavų. Dėl jo aukšto temperatūrinio
stabilumo ir puikios biodegradacijos šio polimero panaudojimas labai įvairus. Polihidroksialkanoatas
naudojamas gaminant plėveles, putas ir pluoštus.
Daugelio biologinės kilmės produktų gamyba paremta mikrobiologine angliavandenių fermentacija.
Metabolinių kelių inžinerijos metodai leidžia sukonstruoti organizmus, gaminančius ypač grynas,
didelės ekonominės vertės medžiagas iš atsinaujinančių žaliavų.
Sukcinatas (gintaro rūgštis) yra naudojamas chemijos, farmacijos, maisto produktų ir žemės ūkio
pramonėje (4.16 pav.). Ilgą laiką visas sukcinatas buvo gaminamas tik iš iškastinių žaliavų. „Myriant“
ir „BioAmber“ kompanijos sukūrė komercines gamybos technologijas, kur sukcinatas sintetinamas
iš gliukozės naudojant genetiškai modifikuotą organizmą. Taip gaminamas biosukcinatas yra pigus,
funkcionalus ir „draugiškas“ aplinkai.
 Agroplėvelės Lengvai biodegraduojamas Pigmentai iš polibutileno
plastikas sukcinato

Vaistai Maisto kvapikliai Įvairūs pluoštai, paralonas

4.16 pav. Sukcinatas ir iš jo gaminami produktai

Kelios įmonės sukūrė bioizopreno (4.17 pav. A) sintezės technologiją. Izopreno sintazė – fermentas,
aptinkamas tik augaluose. Genų inžinerijos būdu sukonstruotuose mikroorganizmuose šio geno raiška
neefektyvi. Dėl to buvo sukurtas sintetinis genas, koduojantis aminorūgščių seką, identišką augalų
izopreno sintazei. Bioizopreną planuojama naudoti kaip žaliavą gumos, klijų ir kuro gamyboje.

A) B)

4.17 pav. A) izopreno; B) izobutanolio struktūros

Izobutanolis (4.17 pav. B) gali būti naudojamas tirpikliams, gumai ir degalams gaminti.
Bioizobutanolis gaminamas iš angliavandenių. Fermentacijai naudojamos genetiškai modifikuotos
mielės. Šiose mielėse išaktyvinti etanolio ir acto rūgšties metaboliniai keliai. Todėl angliavandeniai
efektyviai panaudojami izobutanolio sintezei. Bioizobutanolis yra pigesnis nei įprastas transporto
kuras, todėl ateityje jį tikimasi pritaikyti biodegalų sektoriuje.

4.5. Maisto trūkumo problemų sprendimas biotechnologiniais būdais

Mūsų Žemė be galo įvairi: yra labai miškingų vietų, vietų, kur medžiai visai neauga. Vienur drėgna
ar šlapia, o kai kur labai sausa. Žemdirbystei tinkamų žemės plotų nėra tiek daug, kiek norėtųsi. Todėl
esamus plotus reikia labai saugoti ir branginti. Prognozuojama, kad 2050-aisiais metais Žemėje bus
9 milijardai žmonių. Savaime suprantama, visi jie norės valgyti. Jau dabar yra daugybė šalių, kuriose
žmonės nuolat jaučia alkį, dauguma iš jų Afrikoje. Daugiau nei pusė ten gyvenančių vaisingo amžiaus
moterų serga mažakraujyste, dešimtys milijonų vaikų yra per liesi pagal savo amžių, jiems trūksta
vitamino A. Etiopijoje, Mozambike apie pusė gyventojų gauna nepakankamą dienos kalorijų kiekį.
Bangladeše, Pakistane, Bolivijoje tokių žmonių dar daugiau.
Iš esmės, visa derlinga žemė, tinkama žemdirbystei, jau dabar yra naudojama pagal paskirtį.
Akivaizdu, kad augant žmonių populiacijai maisto visiems neužteks. Todėl jau dabar reikia ieškoti
būdų, kaip užtikrinti reikiamą maisto kiekį pasaulyje. Tam kuriami GMO augalai. Jie yra atsparesni
ligoms, užaugina daugiau derliaus. Auginant GMO iš to paties žemės ploto galima gauti daugiau
produkcijos. Jeigu 2007-aisiais metais nebūtų buvę auginama GMO augalų, tam pačiam produkcijos
kiekiui pagaminti būtų reikėję papildomai pasodinti 6 milijonus hektarų sojų pupelių, 3 milijonus
hektarų kukurūzų, 2,5 milijono hektarų medvilnės ir 0,3 milijono hektarų rapsų.
Dėl biotechnologijų žemdirbiai ne tik gauna daugiau derliaus, bet gali dirbti bei gyventi sveikesnėje
aplinkoje, saugoti, tausoti dirvą, vandenį. Išskiriama mažiau šiltnamio efektą skatinančių dujų.
Žemdirbiams paprasčiau, lengviau dirbti (reikia mažiau važinėti po laukus purškiant insekticidus,
pesticidus), o gaunamas didesnis derlius.
Biotechnologija žemdirbiams padeda spręsti pesticidų problemą. Visame pasaulyje yra garsūs Bt
augalai, turintys Bacillus thuringiensis (Bt) toksiną. Bt yra natūralus, žinduoliams, paukščiams,
žuvims nekenkiantis toksinas. Auginant GMO augalus turinčius šį toksiną sunaudojami gerokai
mažesni insekticidų kiekiai. Taip auginti maistinius augalus yra daug pigiau.
Auginant virusams atsparius aguročius iš tokio pat žemės ploto yra gaunamas daug didesnis derlius.
Yra sukurtos virusams atsparios papajos, kurios leidžia žemdirbiams padidinti šių vaisių derlių
(papajų viruso protrūkiai yra pražūtingi – jie sunaikina visą derlių).
Kova su piktžolėmis yra viena iš didžiausių žemdirbių problemų, nes piktžolės mažina maisto
medžiagų kiekį dirvoje. Šioje srityje labai pagelbėjo herbicidams atsparūs augalai. Paveikus dirvą
herbicidais visos piktžolės išnyksta, o GMO augalai lieka.
Visi minėti augalų patobulinimai (atsparumas ligoms, kenkėjams, chemikalams, gebėjimas augti
atšiauresnėmis sąlygomis) leidžia pigiau užauginti didesnį derlių. Taip pat jie padeda kovoti su maisto
trūkumo problemomis tuose kraštuose, kur žmonės jaučia didžiausią nepriteklių – Afrikoje, Azijoje.
Kurdami pirmosios kartos GMO augalus mokslininkai kreipė dėmesį į tokias augalų savybes, kurios
padėtų žemdirbiams padidinti produkcijos išeigas ir sumažinti auginimo išlaidas. Tai – atsparumas
ligoms, chemikalams, vabzdžiams. Pirmiausia mokslininkai modifikavo kukurūzus, medvilnę,
rapsus, sojų pupeles, vėliau aguročius, cukrinius runkelius, papajas, saldžiąsias paprikas, pomidorus.
Kai kurie augalai buvo tobulinami taip, kad pasižymėtų net keletu naudingų savybių –kartu būtų
atsparūs vabzdžiams ir herbicidams.
Vėliau sekė antroji GMO augalų karta. Mokslininkų tikslas buvo padidinti augalų teikiamos
produkcijos kiekius, sukurti augalus, gebančius gyventi ir vesti vaisius atšiauriomis gamtos sąlygomis
(sausra, druskingas dirvožemis). Norėta sukurti augalus, kurie geriau pasisavintų dirvos azotą, vestų
sveikesnius, maistingesnius vaisius (papildytus omega–3 riebiosiomis rūgštimis ir kt.). Mokslininkai
sukūrė „auksinius“ ryžius, kurie yra papildyti provitaminu A, vitaminu E, geležimi, cinku, baltymais.
Jų maistinė vertė daug didesnė, tad jie itin tinka vargingų šalių žmonėms kaip geresnio maisto šaltinis.
Taip pat yra kuriami augalai, vedantys vitaminų A ir E turinčius bananus ir maniokus – vienus
pagrindinių afrikiečių maisto produktų. Kartu stengiamasi padidinti jų derlių ir sumažinti ligas. Toliau
yra kuriamos naujos kukurūzų, rapsų, sojų pupelių, pomidorų, papajų, obuolių, bulvių, lapinių salotų,
ryžių, braškių, kopūstų, žiedinių kopūstų, garstyčių, hibiskų, melionų ir kitų vaisių bei daržovių rūšys.
Dr. Normanas Borlaugas – mokslininkas, išgelbėjęs daugiau žmonių gyvybių pasaulyje nei bet kas
kitas. N. Borlaugas buvo fermerio sūnus. Studijuodamas dirbo iš karto keliuose darbuose, kad tik
gautų išsilavinimą. 1937-aisiais metais jis gavo miškininkystės bakalauro laipsnį, 1940 m. – augalų
patologijos magistro, o dar po poros metų – ir daktaro laipsnį. 1944-aisiais metais jis buvo pakviestas
dirbti projekte, skirtame padėti Meksikos žemdirbiams užsiauginti pakankamai maisto. Tuo metu
Meksikoje kviečius nuolat sunaikindavo grybelis. N. Borlaugui pavyko išvesti tokią kviečių veislę,
kuri buvo atspari grybeliui ir buvo žemaūgė. Žemaūgiai augalai mažiau energijos sunaudoja stiebui
užauginti, o daugiau – grūdams auginti. 1960-aisiais metais tokius kviečius ėmė auginti Indijoje,
Pakistane, o 1970-aisiais metais N. Borlaugas buvo apdovanotas Nobelio premija. Šio mokslininko
nuomone, dabar atėjo nauja kovos su alkiu karta. Ji yra paremta moderniąja biotechnologija.
Pasitelkiant biotechnologiją maisto galima užsiauginti daugiau, esant prastesnėms gamtos sąlygomis.
Galima užauginti didesnės maistinės vertės produktus, naudojant mažiau pesticidų, saugant dirvą ir
vandenį. Žemdirbiai taip gali sumažinti savo išlaidas, padidinti derlių ir darbo efektyvumą, gauti
švaresnę produkciją, gyventi švaresnėje aplinkoje. Apibendrinant – biotechnologija leidžia
mažesniame žemės plote užauginti daugiau maisto ir taip padeda kovoti su didėjančiu maisto
poreikiu.
Literatūros šaltiniai:

 Liese A, Seelbach K, Wandrey Ch, editors. Industrial Biotransformations. 2nd ed.

Weinheim: Wiley-VCH; 2006.
 Staley JT, Gunsalus RP, Lory S, Perry JJ. Microbial life. 2nd ed. Sinauer Associates; 2007.
 Smith JE. Biotechnology. 5th ed. Cambridge University Press; 2009.
 Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 10th ed. Benjamin
Cummings; 2008.
 Altman A, Hasegawa PM, editors. Plant Biotechnology and Agriculture. Academic Press;
2011.
 Alyokhin A, Vincent C, Giordanengo P, editors. Insect Pests of Potato: Global Perspectives
on Biology and Management. Academic Press; 2012.
 Chen GQ, Patel MK. Plastics Derived from Biological Sources: Present and Future: A
Technical and Environmental Review. Chev Rev 2012, 112, 2082–99.
5. Biotechnologija: saugumas bei etiniai aspektai
Įvadas

Genų inžinerija – gana nauja biotechnologijos sritis, kuri pasaulyje vertinama nevienareikšmiškai.
Dabar jau nebediskutuojama apie genetiškai modifikuotų mikroorganizmų naudojimą ir svarbą
kuriant vaistus, vakcinas, hormonus. Lietuvos bendrovėje „Sicor Biotech“ genų inžinerijos būdu
sukurti keturi vaistai yra patentuoti visame pasaulyje. Tai – žmogaus rekombinacinis interferonas
alfa-2b (Realdiron), gama interferonas (Inflagen), rekombinacinis žmogaus augimo hormonas
(Biosoma) ir žmogaus granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (Grasalva). Bendrovėje iš
genetiškai modifikuotų organizmų (GMO) sėkmingai gryninami ir kuriami nauji baltyminiai vaistai,
skirti hepatitų, vėžio terapijai. Daugybė kitų pasaulyje gerai žinomų medikamentų sukurti naudojant
transgeninius organizmus.

Biotechnologijos – prioritetinės naujojo amžiaus mokslo šakos. Jos atskleidė naujas galimybes
medicinos, farmacijos, veterinarijos, maisto pramonės, aplinkosaugos, žemės ūkio, lengvosios ir
sunkiosios pramonės sritims. Biotechnologijos, pagrįstos manipuliacijomis su DNR ir RNR, atvėrė
kelią naujų genetiškai modifikuotų organizmų sukūrimui. Tai reiškia, kad genetiškai modifikuoti
organizmai yra ir bus naudojami įvairiose srityse ir įvairiais mastais.

Natūraliai gamtoje egzistuoja didžiulė įvairovė organizmų. Organizmus suprantame kaip bet kokį
biologinį objektą, galintį daugintis ir perduoti genetinę medžiagą palikuonims. Genetiškai
modifikuoti organizmai (kitaip – transgeniniai organizmai) yra organizmai, kuriuose genetinė
medžiaga yra dirbtinai pakeista tokiu būdu, kuris natūraliai nepasitaiko nei poruojantis, nei natūralios
rekombinacijos būdu. Genetiškai modifikuoti gali būti mikroorganizmai, augalai, gyvūnai ir iš jų
gaminami maisto produktai, pašarai, vaistai.

Genų inžinerijos pradžia – eilė nuoseklių mokslinių atradimų, pradedant DNR molekulės atradimu,
baigiant pirmąja rekombinantine bakterija (Escherichia coli), ekspresuojančia varlės geną. 1953 m.
Jamesas Watsonas ir Francis Crickas pateikė pasauliui sensaciją – išaiškino DNR sandarą. Syanley
Cohenas ir Herbert Boyeris, panaudoję sukauptą molekulinės biologijos informaciją ir pritaikę genų
inžineriją, 1973 m. augalų bei gyvūnų genus įterpė į žarnyno bakteriją E.coli. Tokia genetiškai
modifikuota bakterija buvo pirmasis transgeninis organizmas, kuriame bakterija (E. coli) gavo kitos
rūšies (varlės) geną. Tai sukėlė mokslinės visuomenės susirūpinimą dėl galimo tarprūšinio genų
maišymosi rizikos konstruojant transgeninius organizmus.

Pasaulyje 1973 metai laikytini biotechnologijos ir genų inžinerijos mokslų atsiradimo pradžia. 1982
m. buvo parduoti pirmieji genetiškai modifikuoti (GM) produktai: insulinas, interferonas bei vakcina
gyvulių diarėjai gydyti. Aštuntojo dešimtmečio pabaigoje kilo ypatingas susidomėjimas GM augalais.
Norėta išvesti tokias maistinių kultūrų veisles, kurios duotų gausų derlių be didesnių trąšų, pesticidų
sąnaudų ir reikalautų mažiau priežiūros. 1995 m. JAV ūkininkai užaugino pirmuosius GM kukurūzus
(atsparius vabzdžiams) ir GM sojas (atsparias herbicidui glifosatui).

Biotechnologijos suteikia galimybes konstruoti organizmus su norimais požymiais peržengiant rūšies

barjerus ir pageidaujamus genus renkantis iš įvairių rūšių. Rūšių giminingumas tampa nesvarbus.
Deja, dėl to genų inžinerija vertinama nevienareikšmiškai. Daugelis svarbių vaistų gaunami iš
rekombinantinių mikroorganizmų. Insulinas, skatinantis gliukozės įsisavinimą, naudojamas diabeto
kontrolei, krešėjimo faktorius – hemofilijos gydymui, renino slopiklis mažina kraujo spaudimą ir
rekomenduojamas hipertenzijos gydymui. Minėti ir daugybė kitų pasaulyje gerai žinomų
medikamentų sukurti naudojant transgeninius organizmus.

Jeigu tikslingas GMO naudojimas medicinos ir farmacijos srityse yra tarsi savaime suprantamas
dalykas, tai šių organizmų naudojimas maisto pramonėje, žemės ūkio srityse susilaukia aštrios
kritikos. Galingas GMO priešininkų judėjimas, išplitęs 1990 metais daugelyje šalių, įgavo masinį
pobūdį Europoje. Pasaulio biotechnologų darbai iki šiol susiduria su rimta priešprieša ir kritika.

5.1. Transgeniniai organizmai ir produktai. Organizmų kūrimo metodai

Tipinis transgenas susideda iš nukleotidų sekų, atitinkančių įterpiamą geną ir jo reguliatorines sritis,
užtikrinančias geno funkcionavimą naujame organizme. Transgeno sukūrimui naudojamos tradicinės
rekombinantinės DNR technologijos, kurių dėka norimas geno produktas sintetinamas norimoje
ląstelėje. Genetinei modifikacijai naudojami rekombinantinės DNR metodai, naudojantys vektorines
sistemas, kurios padeda į norimą organizmą įterpti savą ar svetimą rūšiai geną ar jų rinkinį. Taip pat
naudojami metodai, kurių metu mikroinjekcijomis ar makroinjekcijomis į ląsteles tiesiogiai įvedama
paveldima medžiaga, ląstelių suliejimai. Šie metodai natūraliai gamtoje neegzistuoja.

Genų perkėlimui iš vienos ląstelės į kitą reikalingi efektyvūs vektoriai, galintys pernešti norimą geną
į ląstelę–šeimininkę ir joje sukelti geno raišką. Genų perkėlimui populiariausi yra virusiniai ir
plazmidiniai vektoriai. Jie skiriasi savo savybėmis: įterpiamo DNR fragmento dydžiu, specifiškumu
tam tikroms ląstelėms, patekimo į ląsteles efektyvumu, sukeliamu imuniniu atsaku. Plazmidiniai
vektoriai paprasčiau sukonstruojami ir lengviau kontroliuojami. Jie – talpesni, atsparesni aplinkos
veiksniams, padeda išvengti replikacijos problemų. Vienas pagrindinių rizikos veiksnių naudojant
virusinius vektorius – galimybė, kad susiformuos nekontroliuojamai replikuotis sugebantys virusiniai
vektoriai.

Vieni pirmųjų eukariotinių organizmų pradėtų naudoti genų inžinerijoje buvo augalai. Įterpus į juos
bakterijų toksino (Bt) geną, augalai tapo atsparūs kenkėjams. Įterpus specifinį geną lemiantį
atsparumą herbicidams, sukurtos herbicidams atsparios augalų veislės. Genetinės modifikacijos
suteikia augalams naujų maistinių savybių, padidina aminorūgščių, vitaminų, baltymų kiekius, gerina
technologines savybes bei derlių.

GM gyvūnų konstravimas yra daug sudėtingesnis už GM mikroorganizmų ar GM augalų. Dažniausiai

genetiškai modifikuotų gyvūnų kūrimui (genų pernašai) naudojamos DNR mikroinjekcijos,
embrioninių kamieninių ląstelių ar retrovirusų vektoriai. Palyginus su įprastiniais selekcijos metodais,
genetinės inžinerijos metodai labai stipriai sutrumpina kūrimo laiką, sumažina kainą ir darbų apimtį,
reikalingą sukurti norimų savybių organizmus.

5.2. Biotechnologijos veiklos sritys, kuriose panaudojami GMO

Biotechnologijos atveria naują mikroorganizmų, augalų ir ūkinių gyvūnų genetinių patobulinimų erą.
Dera skirti selekciją nuo genų inžinerijos. Bendras tikslas yra pasiekiamas skirtingomis priemonėmis.

Tradiciniai baltyminių vaistų ir vakcinų (dideliais kiekiais) gaminimo būdai užima daug laiko ir yra
brangūs. Genų inžinerijos mokslas leidžia išspręsti šią problemą. Genų inžinerija plačiai naudojama
medicinoje: naujų vaistų gamyboje, sunkių ligų gydyme, taikant genų terapiją, atliekant organų
ksenotransplantacinius tyrimus (gyvų ląstelių, audinių ar organų transplantacija iš vienos rūšies
organizmo į kitos rūšies organizmą). Dėl organų nepakankamumo klinikinėms transplantacijoms
visame pasaulyje taip ir nesulaukę transplanto miršta apie 60 % pacientų. Pagilinus žinias apie
transplantų atmetimo mechanizmus keliama idėja, kad galimas tarprūšinis organų perkėlimas
naudojant genetiškai modifikuotus organizmus. Tai galėtų panaikinti organų trūkumo problemą.
Šiandien biotechnologijų planuose – vaistų ir vakcinų kūrimas augaluose.

Žemės ūkiui genetiškai modifikuotus organizmus (augalus) kuria žaliosios biotechnologijos. 1996 m.
pirmosios komerciniais tikslais sukurtos GM sėklos buvo išbarstytos JAV. Po dešimties metų GM
žemės ūkio kultūros visame pasaulyje jau užėmė 102 milijonų hektarų plotą. Genų inžinerijos
metodais siekiama padidinti grūdinių kultūrų derlių, mėginama išvesti augalų rūšis, atsparias
herbicidams, vabzdžiams ar sausrai.

Genetiškai modifikuoti organizmai maistui pradėti naudoti nuo 1990-ųjų metų. Pirmasis į rinką
pateiktas GMO buvo puviniui atsparus pomidoras. Jis turėjo storesnę odelę ir buvo mažiau
pažeidžiamas transportavimo metu. Daržovę modifikavusiai Kalifornijos kompanijai „Calgene“ 1994
m. buvo leista pateikti ją visuomenei be jokio ženklinimo. Kompanija „Zeneca“ naudojo šiuos
genetiškai modifikuotus pomidorus padažo gamybai. Visa produkcija buvo realizuota Europoje 1996
metų vasarą. Kitos genetiškai modifikuotos kultūros, įskaitant vabzdžiams atsparią medvilnę bei
herbicidams atsparią soją, pateiktos rinkai 1996-aisiais metais. Šie GMO pradėti plačiai naudoti
Jungtinėse Amerikos Valstijose.

Norėdamas ryžius praturtinti vitaminu A, švedas I. Potrykus sukūrė „auksinius ryžius“. Į juos buvo
įterpti trys genai: du – iš gelsvojo narcizo, vienas – iš mikroorganizmo. Transgeniniai ryžiai gamino
β-karoteno pirmtaką (provitaminą A). Tokiu būdu buvo kompensuotas provitamino A trūkumas
ryžiuose, plačiai vartojančiuose Azijos regionuose. Įterpus į ryžius genų, atsakingų už aktyvesnį
geležies pasisavinimą ir jos kaupimą žmonių organizme, buvo gauti ryžiai su 2–4 kartus didesniu
geležies kiekiu nei laukinio tipo ryžiuose. Tokiu būdu siekiama išspręsti Afrikoje ir Azijoje paplitusią
vaikų ir nėščiųjų anemijos problemą, sumažinti naujagimių mirtingumą.

Šalyse, kuriose žemės ūkis sudaro didžiąją dalį ekonomikos (Argentinoje, Brazilijoje, Pietų Afrikoje,
Indijoje ir Kinijoje), GMO sėklos lengvai randa kelią į sėjamus laukus. Nereikėtų pamiršti
modifikuotų kukurūzų, kviečių, rapsų, cukrinių runkelių, graikinių riešutų, bulvių, žemės riešutų,
moliūgų, tabako, saldžiųjų pipirų, salotų, svogūnų ir kt. .

Miškininkystei yra išvestos naujos medžių veislės, kurios greičiau auga, yra atsparios ligoms ir
kenkėjams. Siekiama, kad GM medžiai įgytų įvairių savybių: mažesnis lignino kiekis medienoje
naudingas popieriaus pramonei, didesnis – svarbus naudojant medieną baldų pramonei, kurui.
Estetiniais tikslais siekiama išvesti naujas spalvingesnes dekoratyvinių gėlių ir krūmų veisles.

Kitaip nei naudojant vabzdžiams atsparius transgeninius augalus, ekologinėje žemdirbystėje taikomi
saviti metodai. Tai – natūralūs gamtos priešai kenkėjams naikinti, rotacijos principas (sėjomaina)
nenualina dirvožemio, organinės trąšos ir humusas natūraliai atstato dirvožemio derlingumą,
ekosistema puikiai palaiko bioįvairovę. Šie metodai pasiskolinti iš pačios gamtos.

Dideles GMO perspektyvos atsiveria pramonės šakoms. Odos perdirbimo pramonei sukurti
fermentai, galintys pakeisti odos ir kailio valyme naudojamus kenksmingus chemikalus. Augantis
fermentų panaudojimas medienos ir popieriaus pramonėje sąlygoja mažėjantį chloro suvartojimą.
Riebalus ir baltymus skaidantys skalbimo miltelių sudėtyje esantys fermentai mažina ploviklių
kiekius, bet užtikrina skalbimo kokybę įvairiose temperatūrose. Taip sumažinamos suvartojamos
energijos sąnaudos.
Šiandien sūrių brandinimui naudojami genų inžinerijos būdu gauti fermentai, į galvijų pašarus dedami
genų inžinerijos būdu gauti hormonai, kuriamos produktyvesnės ir atsparios ligoms žuvys. Žaliosios
technologijos sėkmingai kuria produktus gamtos apsaugai. Konstruojami GMO naudojami grunto
teršalų valymui, naujų energijos šaltinių panaudojimui.

5.3. Nauda ar rizika?

GMO rizika nėra tiesiogiai apčiuopiama ir racionaliai įvardijama sąvoka. Ji yra sąlygojama politinių,
kultūrinių ir socialinių veiksnių. Kultūriniai įsitikinimai, vyraujančios pasaulėžiūros, vertybės,
socialinės normos ir prioritetai formuoja GMO rizikos suvokimą visuomenėje. Todėl įvairūs
visuomenės nariai GMO vertina skirtingai ir suvokia prieštaringai. Viena vertus, tikimasi naudingų
GMO pritaikymų ir ekonominės naudos. Kita vertus, nerimaujama dėl šių organizmų rizikos ir
nenumatytų šalutinių padarinių. Todėl vieni pasisako už GMO uždraudimą dėl galimos rizikos –
laikosi atsargumo principo. Kiti mano, kad būtų galima su GMO susijusią riziką valdyti, jei būtų
priimami racionalūs įstatymai. Be to, GMO naudojimas iškelia daug bioetinių problemų.

Dažniausiai terminas „rizika“ tapatinamas su terminu „galimybė“. Rizika apibrėžiama kaip tam tikro
galinčio nutikti įvykio tikimybė. Tačiau dėl didelės GMO komercializacijos dažnai negalima
numatyti nei atsitiktinių įvykių, nei jų padarinių. Atsargumo principo šalininkai teigia, kad
atsakomybė už ateinančias kartas ir aplinką yra susieta su šiandieniniais antropocentriniais poreikiais.
Aplinkos ir sveikatos priežiūros politika turi nuspėti, užkirsti kelią ir įveikti visas prielaidas bei
priežastis, keliančias pavojų aplinkai ir žmonių sveikatai.

Vertinant GMO svarbu išsiaiškinti, kokiu tikslu jie kuriami, kokios naudojamos technologijos GMO
kūrimui, koks šių organizmų poveikis aplinkai ir žmonių sveikatai. Pagrindinis kriterijus turi remtis
GMO naudos ir rizikos palyginimu. Sukurti genetiškai modifikuoti organizmai ir jų produktai gali
turėti geresnes maistines savybes, pasižymėti didesniu produktyvumu. Be to, panaudojant
modifikuotus organizmus atsirado galimybių efektyviai mažinti aplinkos taršą, išplėsti prekybą
žemės ūkio produktais, pagerinti ūkininkavimo praktiką, gydyti ligas. Šiandien kuriami GMO siūlomi
kaip galimas kelias, sprendžiant ateities maisto krizę.

Žinoma virš 500 paraiškų (priskirtų 55 skirtingų grupių patentams), kuriuose užpatentuota daugybė
genų, kontroliuojančių organizmų atsparumą klimato pokyčiams. Didžioji šių genų dalis įterpta į
pačius įvairiausius augalus. Daugybė GM kultūrų, kurios šiandien pateiktos į rinką buvo ir yra
kuriamos didžiųjų kompanijų, tokių kaip MONSANTO, AgrEvo, Aventis, Novartis, AstraZeneca ir
kt. Didžiausia sėklų kompanija MONSANTO ir agrochemijos lyderis BASF šiandien kontroliuoja 27
iš 55 patentų grupes. Abi šios milžinės (kaip ir jų partnerės) dalyvauja 1,5 milijardų vertės
bioinžineriniuose projektuose. 2011 m. žurnale „The Economist“ paskelbta, kad įvairiausi GM
augalai auginami 29 pasaulio valstybėse ir užima 148 mln hektarų plotą. Amerikoje GMO laukai nuo
2009 m. iki 2011 m. padidėjo 2,8 mln hektarų. Brazilija GM augalų plotus padidino 10 mln hektarų.
Pagal genetiškai modifikuotų augalų auginimą, antra po JAV yra Argentina. Ją sparčiai vejasi Indija.

Europos Sąjunga labai skeptiškai vertina GM kultūras ir jų galimybes įsitvirtinti Europos rinkoje.
Europoje iki šiol auginami tik Bt kukurūzai atsparūs kenkėjams. Palyginimui, 46 pasaulio valstybėse
auginamos 206 biotechnologinės kultūros. Kodėl šiose valstybėse tokios paklausios GM kultūros?
Pirmiausia, akivaizdi jų ekonominė nauda. Gaunamas didesnis derlius, sutaupoma pinigų
pesticidams, kurui. Be to, žemesnė šių kultūrų kaina. Tačiau, įskaitant šalių išlaidas saugumo ir
rizikos vertinimams, paraiškų tvarkymą, kainos susilygina. Atsparumas aplinkos sąlygoms didina
GM augalų konkurencingumą, mažina neigiamą poveikį aplinkai (klimato kaitos ir kt. prasmėmis).
Be to, sukuriamas geresnių maistinių savybių turintis produktas – auksiniai ryžiai, daugiau/mažiau
lignino turintys augalai ir kt.

Tačiau kas verčia žmones sunerimti? Yra daugybė įvairiausių argumentų. Pirmiausia – galimas
pavojus sveikatai (GMO toksiškumas, alergiškumas), pavojus bioįvairovei. Be to – padidintas GMO
gebėjimas išgyventi ir išplisti, išstumiant tradicines kultūras. Gali vykti nepageidaujama genų
pernaša, netiesioginis ar nenumatytas poveikis aplinkai ir žmogui.

Kalbėdami apie kuriamų GMO žalingą poveikį žmonių sveikatai ir aplinkai, oponentai dažniausiai
visuomenės dėmesį atkreipia į tai, kad horizontalaus genų dreifo metu kartu su plazmidėmis iš GMO
kitoms organizmų rūšims perduodamos naujos, nepageidaujamos genų kombinacijos. Jos gali sukelti
naujas gyvūnų ir augalų ligas, naujas vėžio formas, padidinti patogenų atsparumą įvairiems
abiotiniams veiksniams.

Atskirų rūšių viduje vykstančiais natūralaus kryžminimosi atvejais sakoma, kad vyksta genų vertikali
pernaša. Modernios biotechnologijos metodai leidžia atlikti horizontalią genų pernašą tarp atskirų
rūšių. Ar tokia horizontali tarprūšinė genų pernaša nenatūrali, nesaugi ir neetiška? Horizontali
tarprūšinė genų pernaša natūraliai egzistuoja tūkstantmečius. Tai natūralus procesas.

Labai svarbu suvokti GMO technologijos mokslinį pagrindą. Be jo vaisinga diskusija GMO tematika
yra neįmanoma. Pirmiausia reikėtų atsisakyti kategoriškumo. Dėl didelio nepasitikėjimo kontrolės
institucijomis bei visuomenės etika kai kuriose ES visuomeninėse organizacijose netgi įsigalėjo
baimė GMO technologijoms. Per pastaruosius 15 metų nebuvo užregistruota jokių rinkoje esančio
GMP sukeltų pavojų, buvo publikuota apie 150 tokio maisto saugumą patvirtinančių studijų.

Tačiau vartotojų teises ginančios organizacijos, ekologinės žemdirbystės asociacijos, Greenpeace

akcentuoja galimą ilgalaikį GMP poveikį žmogaus sveikatai arba tvirtina, kad tokio GMP pobūdžio
rizika dar nėra pakankamai ištirta. Yra daugybė žmonių (pradedant žaliųjų aktyvistais, baigiant
mokslininkais), kurie skeptiškai vertina GMO. Praktiškai neegzistuoja tarpinių nuomonių – arba už,
arba prieš. Didžiosios Britanijos Karališkoji draugija palaiko GM kultūrų kūrimą ir augimą. Tuo tarpu
Britanijos Karališkosios šeimos narys viename interviu pareiškė, kad „GMO vartojimas bus tikra
katastrofa“.

Šiuo metu pastebimas padidėjęs infekcinių ligų sukėlėjų atsparumas antibiotikams. GMO dėl kūrimo
metu naudojamų genų–žymenų įgyja atsparumą antibiotikams. Jie gali šią savybę perduoti recipientų
ir motininių organizmų natūralioms formoms. Be to, šie genai gali būti pernešti iš GMO į natūralias
mikroorganizmų bendrijas. Antibiotikai gelbsti daugelio žmonių gyvybes, apsaugo maisto produktus
nuo gedimo. Tačiau daugybė svarbių medicinai mikroorganizmų kamienų šiandien pasižymi
atsparumu įvairiems antibiotikams. Vėl grįžta kokybiškai pakitusios „senosios“ ligos, tokios kaip
tuberkuliozė. Jų sukėlėjai, laisvai gyvendami įvairiose ekosistemose, įgijo platų atsparumą
antibiotikams.

Nepaisant kompanijų ir ekspertų tvirtinimų apie genetiškai modifikuotų organizmų ir produktų

saugumą (ir žalos nebuvimą) žmonių sveikatai bei aplinkai, visuomenė neatsisako abejonių apie
galimą transgenų poveikį. Šiandien daugybė žmonių GM maistą įsivaizduoja kaip kažką nenatūralaus
ir keliančio pavojų. Apklausų metu prieš genetiškai modifikuotų produktų vartojimą pasisako
dauguma ES valstybių piliečių. Sunku apibendrinti įvairių statistinių apklausų rezultatus, nes skiriasi
klausimų formuluotės, apklausų terminai, respondentų pasirinkimas ir panašiai. Tačiau dažnai
respondentų atsakymai nėra paremti jokiais argumentais ar žiniomis.

Rizikos suvokimas negali būti apibrėžtas remiantis vien tik mokslinių tyrimų duomenimis, kadangi
egzistuoja tam tikros jų metodologinės ribos. Kaip mes pasirenkame ir apibrėžiame riziką priklauso
nuo tam tikro normatyvinio pagrindo. Tačiau kaip mes suvokiame naudą ar žalą, priklauso nuo mūsų
(kartais subjektyvaus) teigiamo ar neigiamo požiūrio į pačius reiškinius. Naudos ar žalos suvokimas
neretai prieštarauja mokslinėms išvadoms. Dėl šių priežasčių trūksta sutarimo tarp paraiškas
teikiančių, vertinančių ir reglamentuojančių kompetentingų įstaigų. Praktiškai rizikos vertinimo
procesai remiasi ne tik moksliniais tyrimais. Stipri ir etinių vertybių, politinių, socialinių ir
ekonominių veiksnių įtaka.

Norint objektyviai įvertinti GMO riziką aplinkai pirmiausia reikia tiksliai žinoti, kokiais atskaitos
taškais remtis, kokius vertinimo kriterijus pasirinkti, kokie tyrimų objektai laikytini tiksliniais ir pan.
Sąvokos ir apibrėžimai turėtų būti griežtai reglamentuoti GMO kūrimą ir valdymą apibrėžiančių
įstatymų.

Pirmasis apie genetiškai pakeistų organizmų pramonės negeroves garsiai prabilo „Rowett“ instituto
Škotijoje tyrimų projekto vadovas daktaras A. Pusztai. Ištyręs keletą genetiškai pakeistų augalų 1998
m. A. Pusztai parodė savo bandymų rezultatus. Žiurkėms, kurios šimtą dienų laboratorijoje buvo
šeriamos genetiškai pakeistomis bulvėmis (atspariomis kenkėjams), prasidėjo skrandžio uždegimai.
Jis teigė, kad genetiškai pakeisti augalai silpnina imuninę sistemą ir stabdo augimą, taip pat kenkia
vidaus organams. Daktaras savo tyrimo duomenis paskelbė britų medicinos žurnale „Lancet“. Jis
sulaukė aršios kritikos, o jo tyrimo duomenys buvo vadinami „netiksliais“. Panašius rezultatus gavo
rusų mokslininkė I. Jermakova. Naujausiomis žiniomis (2012 m.), apie GMO keliamą pavojų
paskelbė prancūzų mokslininkai, kurie tyrė herbicidams atsparių kukurūzų poveikį žiurkėms. Visi be
išimties tokio pobūdžio tyrimų rezultatai susilaukė mokslo visuomenės kritikos dėl nekorektiškai
atliktų eksperimentų, netinkamai parinktų kontrolių. Be to, šių rezultatų niekam nepavyksta pakartoti.

Mokslininkai iki šiol nesutaria dėl genetiškai pakeistų augalų įtakos sveikatai. Didžiosios genų
inžinerijos kompanijos ir JAV bei Didžiosios Britanijos valdžia skelbia, kad bandymai su genetiškai
pakeistais augalais visiškai nereikalingi. Anot jų, šie augalai „iš esmės prilygsta natūraliems
produktams“. Tuo tarpu, daugelis ES mokslininkų tvirtina, kad genetiškai pakeistų augalų jokiu būdu
negalima prilyginti natūraliems ir jie mūsų sveikatai yra pavojingi.

Augalų ir gyvūnų domestikavimas tęsiasi 10 000 metų. Biotechnologinių mokslų progresui vos 30
metų. Todėl trūksta ilgamečių tyrimų GMO įtakos žmonių sveikatai, kurie patvirtintų GMO saugumą.
Prieš genetiškai modifikuotus organizmus kuriančias kompanijas vienijasi nevyriausybinės
organizacijos, siekiančios uždrausti GMO patentavimą. Kartais tokia kova įgauna netgi aršų pobūdį
ir kelia grėsmę ne tik kompanijų turtui, bet ir žmonių gyvybėms.

Sunku teigti, kad genų inžinerijos naudojimas, norint pagerinti natūralius gamtos išteklius, yra
amoralus. Lygiai taip pat sunku teigti, kad selektyvus kryžminimas, kuris jau seniai yra naudojamas
siekiant rezultatų (kurių niekada nebūtų be žmogaus įsikišimo) yra moralus. Aišku tai, kad genų
modifikacijos technologijos suteikia didesnes galimybes modifikuojant genus nei selektyvus
kryžminimas. Tačiau kol vartotojo teisės yra pakankamai gerai saugomos, potenciali GMO nauda yra
prieinama tiems, kurie ją įžvelgia ir nori ja naudotis.
Šiandieninė ekonominė krizė iš ūkinės veiklos eliminuoja daugybę smulkių ir vidutinių įmonių,
kurios aprūpindavo žemės ūkį technika, sėklomis, pesticidais ar trąšomis. Atsirandanti laisva erdvė
gali būti užpildyta didžiųjų kompanijų. Tarp jų bus ir tos, kurios teikia į rinką GMO.

5.4. Socialiniai ir etiniai aspektai

Visuomenės požiūrį ir nuomonę apie GMO lemia kelios pagrindinės vidinės ir išorinės racionalios
nuostatos. Vidinės nuostatos siejamos su moralės klausimais. Dėl vienų ar kitų priežasčių žmonės
mano, jog GMO kūrimas yra nenatūralus, religines nuostatas pažeidžiantis procesas. Nagrinėjant
vidines priežastis, išorinės nebetenka prasmės.

Kalbėdamos apie etinius dalykus, kai kurios žmonių grupės argumentuoja, kad transgeninių
organizmų kūrėjai „žaidžia Dievą“. Toks požiūris kartais pagrįstas tikėjimu, kad žmonės pažeidžia
ribas, nustatytas Dievo. Bet koks panašaus pobūdžio „dizainas“ įterpiant naujų genų, vadovaujantis
šiuo argumentu, yra moraliai nepriimtinas. Pagrindinis argumentas yra tas, kad Dievas nubrėžė
nematomas ribas tarp Dievo karalystės ir žmonių karalystės. Tie, kurie peržengia šias ribas kurdami
transgeninius organizmus, yra kaltinami didžiausia nuodėme – puikybe. Akivaizdu, kad bet koks toks
argumentas priklauso nuo specifinių religinių prielaidų apie Dievo santykį su žmonėmis ir gyvūnais.
Deja, tuose argumentuose nėra aišku, kur nubrėžta ta nematoma riba tarp dviejų karalysčių.

Požiūris į GMO skiriasi atskirose valstybėse, socialinėse grupėse. Jis priklauso nuo respondentų
lyties, amžiaus, išsilavinimo, socialinio, profesinio statuso. Europiečiai pasižymi dideliu skepticizmu,
o amerikiečiai pasisako už platų GMO išleidimą rinką. Pastarąjį faktą matyt lemia didžiųjų JAV
biotechnologinių kompanijų autoritetas, dideli GM augalų plotai šalies teritorijoje, žiniasklaidos
įtaka. Už GMO vis dažniau pasisako Kinija, GM augalų pasėlių plotai didinami Brazilijoje.
Ekonominiai ir politiniai valstybių sprendimai dėl GMO pirmiausiai remiasi tuo, kiek šių valstybių
žemės ūkis yra priklausomas nuo GM žemės ūkio kultūrų. Europoje žemės ūkis nėra svarbiausia
ekonomikos dalis. Be to, istoriškai joje nusistovėjusios ūkininkavimo tradicijos, susiformavę
ilgamečiai konservatyvūs, tvarkingi ir patikimi ryšiai tarp ūkio subjektų. Todėl Europa nėra linkusi
(išskyrus keletą valstybių) keisti įprastų ūkininkavimo tradicijų, įsileisti naujų konkuruojančių ūkio
subjektų.

GMO rizikos vertinimas yra pakankamai sudėtingas procesas, apimantis žemės ūkio, ekologinius,
socialinius, religinius aspektus. Tai reikalauja kiekvieno atvejo detalaus tyrimo ir analizės. Vertinant
riziką atsižvelgiama į visą turimą informaciją, į kiekvieną atskirą atvejį, į ilgalaikį organizmo poveikį.
Apie gautus rezultatus informuojama visuomenė. Iš vyriausybės reikalaujama juridinių apibrėžimų,
reglamentuojančių GMO kūrimą, pateikimą į rinką, ženklinimą ir kt.

Pasikeitus socialinėms bei ekonominėms sąlygoms keičiasi žmonių gerovė. Paprastai GMO auginimo
sektoriuje dominuoja smulkieji ūkiai. Mažesnės išlaidos agrochemikalams, stabilus derlius ir
samdomojo darbo lėšų taupymas – dažnai minimi privalumai, skatinantys imtis GM pasėlių
auginimo. Tai suteikia didesnes pajamas bei geresnį gyvenimo lygį smulkiesiems ūkininkams. GM
pasėliams reikia mažiau (arba visai nereikia pesticidų), todėl dirbančiųjų sąlytis su jais mažesnis.
Pasitaiko mažiau apsinuodijimų, alergijų – tai naudinga dirbančiųjų sveikatai.

GM produktai svarbūs ir skurstančių žmonių mitybai. Auksiniai ryžiai turi didesnį beta karoteno
kiekį. Jis padeda įveikti vitamino A trūkumą nekokybiškai besimaitinantiems nepasiturintiems
žmonėms. Taip pat GM augalai yra puiki tradicinių augalų alternatyva farmacijoje ar fermentų
gamyboje. Tai reiškia, kad žmonės galės įsigyti pigesnės farmacijos produkcijos, pagerės sveikatos
rodikliai.

Lietuvoje plečiasi GM pašarų vartojimas. Pašarais, kurių sudėtyje yra genetiškai modifikuotų
kukurūzų ar sojos yra šeriami galvijai, paukščiai, pramoniniu būdu auginamos žuvys. Atsisakymas
naudoti GM pašarus ūkininkams reikštų produkcijos supirkimo kainų didėjimą. Dėl šios priežasties
gali sumažėti maisto produktų, pavyzdžiui mėsos, vartojimas. Neabejotina, kad mažiausias pajamas
turintiems gyventojams šis kainų pokytis būtų juntamas labiausiai. Vartojant tą patį kiekį mėsos
sumažėtų pajamos, kurios užtikrina kitą pragyvenimui reikiamą vartojimą – būsto sąnaudas, švietimą,
sveikatos priežiūrą ir kt.

Taigi, GMO naudojimas iškelia daug naujų bioetinių problemų. Kalbama, kad tai – potencialus
pavojus, nes horizontalaus genų dreifo metu kartu su plazmidėmis iš GMO kitoms organizmų rūšims
bus perduotos naujos, nepageidaujamos genų kombinacijos. Jos galėtų sukelti naujas gyvūnų ir
augalų ligas, naujas vėžio formas, naujas epidemijas. Genai, atsakingi už atsparumą antibiotikams
(naudoti kaip žymenys perkeliant genus į GMO) buvo pernešti iš GM augalų į negiminingus
dirvožemio organizmus. GMO endotoksinai naikina ne tik kenkėjus, bet ir naudingus vabzdžius. Šie
endotoksinai gana ilgai išsilaiko dirvožemyje nesuirę.

GM sojos pupelių (skirtų žemės riešutų baltymų gamybai) sukelta alergija yra analogiška alergijai,
kurią sukelia amerikietiškas riešutas (Bertholletia excelsa). GM augalai yra žymiai produktyvesni,
turi daugiau baltymų, yra mažiau reiklūs auginimo sąlygoms (bet gali turėti ir minėtų neigiamų
savybių). Todėl jie dažniausiai skirti besivystančių šalių augintojams ir vartotojams. Čia iškyla dar
viena svarbi bioetikos problema – „prastesnės rasės“ (trečiųjų šalių) žmonių grupių diskriminacija.

Gamtosaugininkų nuomone, badas trečiojo pasaulio šalyse yra daugiau socialinė ir politinė problema.
Šiandien pasaulyje maisto yra kur kas daugiau, nei jo reikia. Deja, jo paskirstymas nėra teisingai
sutvarkytas. Teigiama, kad genų inžinerija gali sukelti tik dar didesnes maisto ir bado problemas. Ji
skatina sėti monokultūras, o šios yra labiau pažeidžiamos ligų ir kenkėjų nei kelių kultūrų mišinys.
Biotechnologija tik padidintų ūkininkų priklausomybę nuo tarptautinių kompanijų. Dėl intensyvios
genų inžinerija pagrįsto ūkininkavimo plėtros gali būti visiškai sunaikinta biologinė įvairovė, švari
dirva ir tyras vanduo – sveikam maistui reikalingi gamtos ištekliai

Eksperimentuojant įvairių žmogaus genų įterpiama į kitus organizmus, norint sukurti naujas gyvybės
formas. Kyla klausimas, kiek žmogaus genų gali turėti organizmas? Kinų mokslininkai jau perkėlė
žmogaus genus į pomidorus ir pipirus. Ar galime teigti, kad esame vegetarai jei valgome tokias
daržoves? Tokie ir panašūs klausimai kyla diskutuojant apie GMO naudojimo etiką.

Kai kurie žmonės nevalgo mėsos, kai kurių žmonių tikėjimas neleidžia vartoti savyje gyvūnų genus
turinčių transgeninių augalų. Iki šiol nėra sukurtas ar įsteigtas mokslinis komitetas, kuris galėtų
paneigti vidinius – dvasinius argumentus. Mokslininkai ir visuomenė naudoja skirtingus vertinimo
kriterijus. Mokslininkai biotechnologai naujų atradimų įgyvendinimą priima kaip logiškai pagrįstą ir
priimtiną, tuo tarpu visus, prieštaraujančius jų nuomonei, traktuoja kaip neracionalius. Dažnai
besiskiriančios visuomenės ir mokslininkų nuomonės dėl galimos rizikos gali pasireikšti
demonstruojamu tarpusavio nepasitenkinimu.

Svarbu pažymėti ir tai, kad šiuolaikinių biotechnologijų panaudojimas nutrina aiškią ribą tarp
žmogaus bioetikos ir augalų bei gyvūnų bioetikos. Pagalvokime apie kuriamus eksperimentinius
gyvūnus, kuriems perkeliami žmogaus genai norint išsiaiškinti įvairių žmogaus ligų mechanizmus.
Moksliniai darbai vykdomi ir avies vaisiui sušvirkščiant žmogaus kamieninių ląstelių. Siekiama
gyvūnuose išauginti imunologiškai suderinamus ir transplantacijai tinkančius žmogaus organus.

Vengiant nenumatytų ksenotransplantacijos pasekmių siekiama sukurti tarptautinę ksenotransplantų

recipientų viso gyvenimo trukmės priežiūros programą. Tai – atsargumo priemonė visuomenės
sveikatos labui. Ši priežiūra gali būti išplėsta net iki recipientų seksualinių partnerių, draugų ir šeimos
narių stebėjimo. Todėl ji yra etiškai kontroversiška – pažeidžia žmogaus privatumo teises.
Ksenotransplantacija verčia susimąstyti ir apie recipientų psichosocialinę būseną. Galimas dalykas,
kad ksenotransplantų recipientai jaustųsi atstumti arba pažeminti turėdami savo kūne gyvūno
ląstelių/audinių.

Negalima pamiršti ir gyvūnų naudojimo tyrimuose kontroversiškumo. Vertinant

ksenotransplantacijos riziką ir problemas dažnai pamirštama, jog gyvūnai taip pat geba jausti ir turi
tam tikras teises. Svarbu tai, kad ksenotransplantacija šiuo metu pasaulyje yra griežtai
reglamentuojama eksperimentų sritis, galinti sukelti daug pašalinių poveikių. Ksenotransplantacija
kol kas nėra pripažintas gydymo metodas. Europos Tarybos Rekomendacija aiškiai nurodo, kad
ksenotransplantacija yra laikoma tik eksperimentinės stadijos tyrinėjimais. Jie turi būti atliekami
laikantis griežčiausių reikalavimų (turi būti gautas atitinkamos valstybinės institucijos leidimas ir kt.).

Kokios etinės paradigmos siūlomos visų šių sudėtingų ir prieštaringų technologijų taikymo
vertinimui? Gerokai supaprastindami etinio vertinimo paveikslą, bioetikos tyrinėtojai išskiria tris
svarbiausias etines paradigmas: a) utilitarinę, b) pagarbos asmeniui, c) pagarbos tradicijai ir
bendruomenės vertybėms.

Viena iš Europos šalių įstatymuose sutinkama problema yra socialiniai ir etiniai kriterijai. Šalis gali
uždrausti GMO naudojimą savo viduje, tačiau jo importo priėmimas išliks priklausomas nuo ES
direktyvų. Kai kurios vyriausybės gali motyvuoti, kad tai pažeidžia nacionalinį suverenumą ir
neleidžia jų reprezentuoti visuomenės interesų ir norų.

5.5. Ar saugūs genetiškai modifikuoti organizmai?

Saugumas – reliatyvi sąvoka. Nėra nulinės rizikos. Visos taikomos technologijos pasižymi tam tikra
rizika. Ar genetiškai modifikuoti organizmai yra labiau pavojingi dėl to, kad gaminami nenatūraliu
būdu? Svarbu suprasti, kad tam tikra prasme viskas dabartiniame žemės ūkyje yra „nenatūralu“. Jeigu
mums reikėtų auginti tik laukines bulves, kukurūzus ar pupeles, mes visi badautume. Jos atneštų
gerokai mažiau derliaus. Visa rašytinė žmonijos istorija pažymėta nenatūraliais pasiekimais žemės
ūkyje, kuomet buvo dirbtinai kišamasi į augalų ir gyvūnų DNR.

Iš esmės, joks poveikis žmogaus sveikatai ar aplinkai negali būti nepavojingas. Galima paminėti
medicininį gydymą, miškų kirtimą, miestų aprūpinimą energija ir kt. Visais šiais atvejais galimi
pavojai sumažinami iki saugai priimtinų ribų. Tačiau visiškai nepavojinga veikla tiesiog neįmanoma.
Reikia kelti klausimą, ar šiuo metu žinome kokius nors pavojaus ar žalos įrodymus, išskyrus tuos
tradicinės žemdirbystės metodu užaugintus ir pagamintus produktus?

Net ir taikant tradicinius genetinio kryžminimo metodus gali išryškėti kai kurios organizmų
nepageidaujamos savybės. Nėra tvirtų įrodymų, kad toks maistas ar aplinka yra nors kiek saugesni už
tradiciniu būdu išaugintus augalus ar pagamintą maistą. Daug žmonių yra alergiški kviečiams. Vis
dėlto, daugiau kaip per 10 000 metų žmonija pasiekė svarių biologijos laimėjimų žemdirbystėje.
Žinant, kad daugelis transgenų turi galimybę padidinti laukinių augalų atsparumą, didelis dėmesys
turi būti sutelktas į genų sulaikymo strategijų plėtojimą. Turėtų būti sukurtas tinkamas barjeras,
neleidžiantis transgenams patekti į laukines rūšis. Keletas tokių strategijų yra apomiksinių (negalinčių
daugintis) ar kleistogaminių (savidulkių) kultūrų gamyba, izoliuotos teritorijos. Kita logiška strategija
būtų nukreipti transgeną į chloroplastų ar mitochondrijų genomus. Šio tipo strategija padėtų išvengti
transgeno pernašos žiedadulkėmis. Sukliudyti tokio transgeno pernašą galėtų geno įterpimas į vyrišką
sterilią liniją. Bet ši strategija niekaip neapsaugo nuo geno pernašos per sėklas – netgi jei gaunamas
besėklis derlius.

Norint įvertinti potencialią konkretaus transgeno riziką, susijusią su jo išplitimu, reikėtų atlikti
kokybinę kaštų (naudos) analizę konkretaus transgeno atveju. Be to, reikia įvertinti ir riziką, kurią
gali pateikti organizmai–recipientai su nenumatytomis (pleotropinėmis) savybėmis.
Rekomenduojama laikytis tiriamųjų darbų atsikartojimo principo, vertinti genetinės modifikacijos
riziką ir naudą kiekvienu atveju atskirai. Tokiame darbe privaloma prisitaikymą vertinti tiesiogiai,
nes netiesioginiai veiksniai gali būti nepatikimi. Tiriamąjį darbą apsunkina faktas, kad prisitaikymo
kaina ir gauta nauda kinta. Ji priklauso nuo aplinkos pokyčių, taksonų, pačių genų ir netgi insercijų.
Dabartiniai mokslo tiriamieji darbai rodo, kad transgenų veikla gali būti labai skirtinga.

ES sukurta daugybė GMO reglamentuojančių dokumentų. Pagrindinis principas, kuriuo

vadovaujamasi ES ir Lietuvoje, yra atsargumo principas. Kartachenos biosaugos protokolas numato,
kad žmonės turi teisę žinoti apie galimą GMO riziką, besikeičiančią naudą. Šalys skatina visuomenės
narių supratimą, švietimą ir dalyvavimą transportuojant, perdirbant ir naudojant gyvus pakitusius
organizmus. Visuomenės supratimas didinamas, kad būtų išsaugota ir tolydžiai naudojama biologinė
įvairovė, atsižvelgiama į galimą GMO pavojų žmogaus sveikatai. Žmonės, kurie bus vienaip ar kitaip
paveikti, turėtų prisidėti vertinant riziką. Apie gautus rizikos vertinimo rezultatus informuojama
visuomenė. Iš vyriausybės reikalaujama juridinių apibrėžimų reglamentuojančių GMO kūrimą,
pateikimą į rinką, ženklinimą ir t.t.

GMO ir GMP rizikos aplinkai vertinimas atliekamas keliais etapais:

 Charakteristikų, dėl kurių gali pasireikšti neigiamas poveikis, nustatymas;

 GMO naudojimo ir kiekvieno pasireiškusio neigiamo poveikio galimų pasekmių įvertinimas;
 Kiekvieno galimo neigiamo poveikio pasireiškimo tikimybės įvertinimas;
 Kiekvienos GMO ištirtos charakteristikos keliamo pavojaus nustatymas.

Rizikos vertinimas yra kompleksiškas ir pakankamai sunkiai apibrėžiamas procesas. Jam įtaką daro
teisiniai, socialiniai, kultūriniai, etiniai veiksniai. Egzistuoja daugybė problemų vertinant galimą
GMO riziką prieš apgalvotą išleidimą į aplinką, stebint jų poveikį aplinkai ir žmonių sveikatai po
patekimo į rinką. Į vertinimo problemų ratą patenka nedetalizuotas ilgalaikio poveikio ir trukmės
apibrėžimas. Yra neapibrėžtas tiesioginio ir netiesioginio poveikio objektų ir kriterijų sąrašas,
neapibūdinti rizikos vertinimo pradiniai atskaitos taškai, nesuderintos aplinkos monitoringo schemos
prieš ir po GMO patekimo į aplinką. Taip pat egzistuoja daugybė kitų problemų.

Pakankamai sunku nedviprasmiškai apibrėžti pačią žalą aplinkai. Europos teisės aktai reikalauja
įvertinti galimą kultivuojamų GMO žalą aplinkai per tam tikrą priimtiną laiką. Tačiau tokie
reikalavimai praktiškai yra sunkiai įgyvendinami ir dažnai susilaukia kritinių pastabų. ES direktyvose
numatytas GM pasėlių rizikos aplinkai ir bioįvairovei įvertinimas yra sunkiai įgyvendinamas.
Pirmiausia – todėl, kad kyla diskusijos dėl neaiškiai suformuluotų apibrėžimų „rizika aplinkai“ ir
„bioįvairovė“ interpretacijų. Antra – dėl tam tikrų metodologinių trūkumų skirtingai vertinami patys
moksliniai duomenys. Tam tikrų metodų trūkumas renkant ir analizuojant duomenis sukelia
kontroversiškus debatus, kuriuose (kartais net labai aršiai) dalyvauja ne tik mokslo, bet įvairių
visuomenės grupių atstovai.
Literatūros sąrašas:
 Al-Babili S, Ye X, Lucca P, Potrykus I, Beyer P (2001) Biosynthesis of beta-carotene
(provitamin A) in rice endosperm achieved by genetic engineering. Novartis Found Symp.
236: 219-28
 GMO Compass (2009) Rising trend: genetically modified crops worldwide on 125 million
hectares.http://www.gmo-compass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/
 Grinius L., D. Matulis, S.Serva, D. Misiūnas, R. Valiokas. (2007) Modernios
biotechnologijos saugaus naudojimo ir vystymo perspektyvos Lietuvoje. Vilnius, UAB Petro
ofsetas.
 von Götz F. (2010) See what you eat—broad GMO screening with microarrays. Anal
Bioanal Chem. 396: 1961–1967
 Hug K. (2008) Genetiškai modifikuoti organizmai. Ar nauda nusveria riziką? Medicina 44
(2): 87-99
 Lazutka R. , D. Skučienė. 2010. Genetiškai modifikuotų organizmų poveikio socialinei-
ekonominei aplinkai Lietuvoje įvertinimas. UAB „Petro ofsetas“, Vilnius.
 Lygis D. (2004) GMO Valstybinis valdymas Lietuvoje, Aplinkos ministerija, Vilnius.
 Parekh S.R. (2004) The GMO handbook – genetically modified animals, microbes, and
plants in biotechnology. Humana Press.
 Paulauskas A.(2004) Genetiškai modifikuoti organizmai, Vilnius.
 Pusztai A., Bardocz S., Ewen S.W.B. (2003) Genetically Modified Foods: Potential Human
Health Effects. In: Food Safety: Contaminants and Toxins (ed. JPF D’Mello). CAB
International, Wallingford Oxon, UK. : 347-372
 Séralini G-E., E. Clair, R. Mesnage, S. Gress, N.Defarge, M. Malatesta , D. Hennequin, J.
Spiroux de Vendômois. Long term toxicity of a Roundup herbicide and a Roundup-tolerant
genetically modified maize. Food and Chemical Toxicology, 2012 Vol. 50, Issue 11: 4221–
4231
 Smith J.M. (2004) Are Genetically Engineered Foods Dangerous. Food Quality. (11) 1:22-
23.
 Stanys V. Genetiškai modifikuotų augalų rizikos aplinkai ir žemės ūkiui vertinimo bei rizikos
valdymo metodinės rekomendacijos, Vilnius, 2008.
 Valstybės žinios. 2001, Nr. 56-1976
 Valstybės žinios. 2003, Nr.80-367
 Valstybės žinios. 2004, Nr.154-5620
 http://www.efsa.europa.eu
 http://www.am.gmo.lt
 http://www.gmo-compass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/
6. Fizikiniai biomolekulių tyrimo metodai
6.1. Erdvinės biomolekulių struktūros ir sąveikos, lemiančios jų susidarymą

Kiekvienas gyvas organizmas yra sudarytas iš ląstelių. Kiekviena ląstelė yra tarsi „mikrovalstybė“ su
gausybe organelių. Organelės atlieka savo funkcijas ir tarpusavyje yra harmoningai suderintos. Tik
tokia sudėtinga sistema užtikrina, kad visa ląstelė geba augti, daugintis, prisitaikyti prie aplinkos ir
atlikti savo funkciją organizme. Norint suprasti, kaip gyvuoja tokia kompleksiška „mikrovalstybė“,
svarbu suvokti, iš ko ji sudaryta ir kaip tos sudedamosios dalys sąveikauja tarpusavyje. Šiame
skyrelyje nagrinėsime molekulių sandarą ir sąveikas, lemiančias jų susidarymą.

Fizikocheminu požiūriu, visos ląstelės yra sudarytos iš neorganinių medžiagų (vandens, druskų, jonų)
ir organinių molekulių. Yra skiriami pagrindiniai keturi organinių makromolekulių tipai (6.1 pav.):

 Nukleorūgštys: deoksiribonukleorūgštis (DNR), ribonukleorūgštis (RNR);

 Baltymai: hemoglobinas, insulinas, keratinas ir kt.;
 Angliavandeniai: gliukozė, celiuliozė, krakmolas ir kt.;
 Lipidai: riebalai, cholesterolis, steroidai ir kt.

Visos minėtos makromolekulės yra polimerai – jos yra sudarytos iš mažesnių, tarpusavyje
kovalentiniais ryšiais sujungtų molekulių (monomerų). Nukleorūgštys sudarytos iš nukleotidų,
baltymai – iš aminorūgščių ir pan.
 6.1 pav. Daugiapakopė ląstelės organizacija

Kovalentinės jungtys yra pačios stipriausios – jų sąveikos energija yra didžiausia (6.2 pav.). Vis dėlto,
į polimerinę grandinę sujungti monomerai (tokia grandinė vadinama pirmine struktūra) dar
nesuformuoja makromolekulės, kuri galėtų atlikti biologinę funkciją. Molekulė turi įgyti savitą
erdvinę struktūrą. DNR susisuka į spiralę, baltymai suformuoja kanalus, domenus, aktyvius centrus,
kuriais vykdo fermentines reakcijas. Erdvinę molekulių struktūrą lemia silpnesnės – nekovalentinės
sąveikos:

 Hidrofobinė sąveika. Hidrofobinės medžiagos (riebalai) neturi polinių grupių, kurios poliniame
tirpiklyje (vandenyje) galėtų sąveikauti su tirpiklio molekulėmis. Todėl hidrofobinės molekulės
yra sustumiamos, kad jų paviršius būtų mažiausiai prieinamas tirpiklio molekulėms.
Hidrofobinės molekulės sulimpa, tokia padėtis yra energetiškai stabiliausia. Hidrofobinė
sąveikos jėga priklauso nuo molekulių dydžio (dažniausiai tai lemia anglies atomų skaičius),
molekulių formos ir temperatūros. Hidrofobinė sąveika yra stipresnė už vandenilinę jėgą. Ji
labai svarbi biologijoje ir lemia visų ląstelių fosfolipidinių membranų vientisumą, baltymų
struktūrą ir pan.

 Vandenilinė sąveika. Susidarant kovalentiniam ryšiui (C=O arba O-H), elektronų pora yra
stipriau traukiama elektroneigiamesnio elemento branduolio link (dažniausiai link O). Todėl
prie jo susidaro dalinis neigiamas krūvis. Prie kito elemento susidaro dalinis teigiamas krūvis ir
tarp šių dviejų dalinių priešingų polių pasireiškia elektrostatinė traukos jėga. Vandenilinis ryšys
susidaro vandens molekulėse tarp gretimų O ir H atomų, aminorūgštyse tarp karboksi- ir
aminogrupių bei kitose biomolekulėse.

 Elektrostatinė sąveika. Aminorūgštys ir kitų makromolekulių monomerai turi daug polinių

grupių. Jos, priklausomai nuo pH, gali įgyti krūvį (COO–, NH3+). Priešingo krūvio grupės lemia
trauką tarp makromolekulės fragmentų, kuriuose šios grupės yra (6.4 pav.). Vienarūšiai krūviai
sukuria stūmos jėgą.

 Van der Valso sąveika. Ji aiškinama laikinais ar pastoviais elektronų tankio netolygumais
atomuose (atsirandančiais dėl elektronų judėjimo) ir dėl to susidarančiais elektriniais dipoliais.
Tarp atskirose molekulėse dipoliais virtusių atomų atsiranda traukos jėgos. Ši sąveika atsiranda
tarp polinių molekulių (dipolinės jėgos), tarp polinių ir nepolinių (indukcinės jėgos) ir tarp
nepolinių molekulių (dispersinės jėgos). Vienoje medžiagoje gali veikti vienos rūšies arba
kelios skirtingos Van der Valso traukos jėgos. Svarbu tai, kad sąveikos jėga labai priklauso nuo
atstumo tarp atomų (F ~ r-6).
 6.2 pav. Pagrindinės kovalentinės ir nekovalentinės sąveikos,
formuojančios biomolekulių erdvinę struktūrą

Panagrinėsime, kaip susidaro baltymų erdvinė struktūra ir kuo ji svarbi. Antrinę struktūrą baltymuose
formuoja vandenilinės jungtys tarp vandenilio atomų aminogrupėse ir deguonies atomų
karboksigrupėse (6.3 pav.). Dėl šių jungčių polimerinė grandinė gali susisukti į α spiralę arba
suformuoti β klostes („vingiuotą ploštumą“).
 6.3 pav. Baltymo organizacijos lygmenys

Susidarius baltymo antrinei struktūrai aminorūgštys suartėja ir gali sąveikauti. Polinės grupės gali
sąveikauti elektrostatiškai, sudaryti vandenilinius ryšius. Nepolinės grupės sąveikauja hidrofobiškai.
Taip pat gali susidaryti kovalentinės disulfidinės jungtys tarp įvairių cisteino sieros atomų. Dėl visų
minėtų sąveikų polimeras įgauna erdvinę – tretinę struktūrą. Dvi (ar daugiau) tokių susisukusių
polimerinių grandinių gali sąveikauti tarpusavyje ir suformuoti ketvirtinę struktūrą. Toks kompleksas
sudaro „vientisą“ baltymą, atliekantį biologinę funkciją. Tačiau biologinė funkcija nebūdinga
atskiriems subvienetams. Ketvirtinę struktūrą stabilizuoja vandeniliniai ryšiai ir hidrofobinė sąveika
tarp subvienetinių polipeptidinių grandinių.

Erdvinė molekulės struktūra yra labai svarbi sąveikaujant su kitomis molekulėmis (6.4 pav.). Kadangi
tarpmolekulinės sąveikos dažniausiai vyksta dėl silpnų – nekovalentinių jėgų, būtina tam tikra
molekulių erdvinė orientacija. Jos reikia, kad susidarytų pakankamas silpnų jungčių kiekis. Šios
silpnos jungtys taip pat turi būti savitos. Reikia, kad traukos ir stūmos jėgos būtų pakankamos ir
veiktų tik tam tikrose erdvinės struktūros vietose. Minėto savitumo reikia tam, kad erdvinis baltymo
kompleksas turėtų biologinę prasmę.
Keli biologinių struktūrų pavyzdžiai:

 Susidarius stabiliam fermento ir substrato kompleksui vyksta fermentinės reakcijos

(virškinamas maistas);
 Prie imuninės ląstelės membranos receptoriaus prisijungus bakterijai (ar jos baltymui)
sukeliamas imuninis atsakas;
 Prie uoslės neurono receptoriaus prisijungus specifinei molekulei generuojamas nervinis
impulsas. Jis, nukeliavęs į smegenis, sukelia kvapo pojūtį.

Kaip matome, erdvinė struktūra lemia savitą sąveiką tarp molekulių, jų atpažinimą. Menkiausi
erdvinės struktūros pokyčiai gali nutraukti silpnas sąveikas ir sutrikdyti baltymo biologinę funkciją.
Todėl šiuolaikiniuose biomoksluose labai daug dėmesio skiriama molekulių struktūros, jų sintezės ir
tarpusavio sąveikos tyrimams. Jiems reikia glaudaus bendradarbiavimo tarp skirtingų mokslo sričių.

6.4 pav. Stabilaus ir nestabilaus baltymų komplekso susidarymas

6.2. Skenuojančio zondo mikroskopija: biomolekulių vaizdinimas, mechaninės savybės ir

nanomanipuliacija

Įvadas

Mikroskopija jau ilgą laiką yra vienas svarbiausių mokslinių instrumentų tiriant biologinius objektus.
Šiuo metu, priklausomai nuo tiriamo biologinio objekto, yra naudojami labai įvairūs mikroskopai.
Juose įdiegtos ir sujungtos kelios (ar net kelios dešimtys) modernių technologijų. Viena iš tokių
mikroskopijos rūšių – skenuojančio zondo mikroskopija. Šių mikroskopų veikimo principas –
paviršiaus skenavimas plonu zondu, kuris tam tikru būdu sąveikauja su paviršiumi.

Egzistuoja trys pagrindinės skenuojančių mikroskopų rūšys:

 Tuneliniai (angl. STM – scaning tunelling microscope);

 Optiniai artimojo lauko (angl. SNOM – scaning near optical field microscope);
 Atominės jėgos mikroskopai (angl. AFM – atomic force microscope).
Pirmasis skenuojantis tunelinis mikroskopas 1981 m. buvo sukurtas IBM kompanijos mokslininkų
(G. Binningas, H. Rohreris, Ch. Gerberis ir Weibel). 1986 metais G. Binningas ir H. Rohreris už STM
sukūrimą gavo Nobelio premiją. Tais pačiais metais šiems mokslininkams bendradarbiaujant su
Stanfordo universitetu buvo sukurtas atomo jėgos mikroskopas (AJM). Skenuojantis optinis artimojo
lauko mikroskopas buvo sukurtas tik 1994 m. (mokslininkai E. Betzigas ir D. Pohlas). Atominė skyra
su STM ir AJM pasiekta apie 1995 m.

Skenuojančio zondo mikroskopas

Bendra skenuojančio zondo mikroskopo schema pateikta 6.5 paveiksle:

6.5 pav. Skenuojančio zondo mikroskopo schema

Bandinys pjezomechanikos yra judinamas x ir y kryptimis horizontalioje plokštumoje taip, kad

mikroskopo zondas po eilutę nuskenuotų tiriamą bandinį. Mikroskopo zondas sąveikauja su bandiniu
(sąveikos tipas priklauso nuo mikroskopo tipo). Valdymo elektronika pagal gaunamą iš detektoriaus
signalą valdo zondo z ašies (aukštyn–žemyn) postūmį (taip pat veikia pjezomechanika). Taip
užtikrinamas grįžtamasis ryšys. Pagal detektoriaus signalą atstumas tarp zondo ir paviršiaus
keičiamas taip, kad zondas sektų bandinio paviršiumi. Kompiuteriu apdorotas signalas paverčiamas
bandinio topografiniu (ar kitų savybių) vaizdu.

Galimas ir darbo režimas be grįžtamojo ryšio tarp detektoriaus signalo ir zondo z postūmio
mechanizmo. Tokiu atveju matuojamas dydis yra detektoriaus signalo priklausomybė nuo x ir y
(topografija ar kita savybė). Iš valdymo elektronikos ir vėlinimo gaunama mažiau triukšmų. Tačiau
dažniausiai zondas su paviršiumi sąveikauja labai mažu atstumu (iki keleto Å), todėl esant didesniems
paviršiaus nelygumams minėtas būdas netinka. Atliekant matavimus šio tipo mikroskopais, atstumas
tarp zondo ir paviršiaus paprastai būna nuo kelių iki keliasdešimt nanometrų. Todėl net ir labai silpnos
vibracijos trukdo atlikti matavimus, gadina mikroskopu gaunamų vaizdų kokybę. Dėl šios priežasties
visiems skenuojančio zondo mikroskopams būtina gera vibracijos izoliacija. Dažniausiai tokie
mikroskopai yra statomi ant stalų, turinčių pneumatinę vibracijos izoliaciją.

Skenuojantis tunelinės srovės mikroskopas

Skenuojantis tunelinės srovės mikroskopas buvo pirmasis mikroskopas, kuriuo buvo galima gauti
erdvinius paviršiaus vaizdus, o skiriamoji geba buvo didesnė nei 1 nm. Principinė STM schema yra
pavaizduota 6.6 paveiksle:

6.6 pav. Detektoriaus signalo priklausomybė nuo x ir y.

Principinė skenuojančio tunelinės srovės mikroskopo schema.

Skenuojantis tunelinis mikroskopas naudoja nusmailintą (iki vieno atomo smaigalyje) laidžią elektros
srovei adatą. Adatos dažniausiai gaminamos iš volframo arba platinos–iridžio, iš pradžių tempiant
ploną volframo vielą ir jos galą chemiškai ėsdinant. Gauta smaili (su keleto nm spindulio smaigaliu)
adata patalpinama stipriame elektriname lauke ir kaitinama. Paviršiniai volframo atomai esant aukštai
temperatūrai gali migruoti metalo paviršiumi. Elektrinis laukas juos „tempia“ link smaigalio. Taip
dalis adatų nusmailėja iki vieno atomo smaigalyje.

Adatai priartėjus prie tiriamo laidaus paviršiaus maždaug 1 nm atstumu, dėl tarp adatos ir paviršiaus
esančio potencialų skirtumo elektronai ima tuneliuoti iš zondo į paviršių (arba atvirkščiai) – teka
tunelinė srovė. Šios srovės stipris eksponentiškai priklauso nuo atstumo tarp zondo ir paviršiaus:

I  e d (6.1), kur γ – vakuume ≈ 2 Ǻ-1 , d – atstumas tarp adatos ir paviršiaus.

Iš (6.1) formulės matyti, kad tunelinė srovė eksponentiškai priklauso nuo atstumo tarp adatos ir
bandinio. Didžiausia srovė teka per arčiausiai bandinio esantį adatos atomą adatos smaigalyje –
bandinys yra zonduojamas atomine skyra. Tunelinio mikroskopo adatos mechanizmas yra valdomas
taip, kad tunelinė srovė tarp bandinio paviršiaus ir adatos visuomet išliktų pastovi adatai judant išilgai
paviršiaus (galimas ir anksčiau minėtas režimas be adatos judėjimo z ašimi). Todėl adata, skenuodama
paviršių, atkartoja jo reljefą. Duomenys registruojami kompiuteriu, atomine skiriamąja geba
išmatuojamas bandinio paviršiaus reljefas. Šių mikroskopų pranašumas – didžiausia iš visų
mikroskopų skiriamoji geba (apie 0,1 Ǻ horizontali ir 0,01 Å vertikali), trūkumas – mikroskopo
darbinė dalis yra vakuume. Be to, galima tirti tik laidininkus arba puslaidininkius (taip pat ir šiek tiek
elektros srovei laidžius biologinius objektus). Šiuo metu kuriami būdai dirbti su dielektriniais
bandiniais. Vienas jų – bandinio paviršiaus apšaudymas elektronine patranka (bandinio paviršiuje
atsiranda perteklinių elektronų) ir šio krūvio „surinkimas“ STM adata. Skenuojančiu tuneliniu
mikroskopu gauti biologinių objektų vaizdai pavaizduoti 6.7 pav.
 Citochromo C baltymo ŽIV viruso atvirkštinės DNR molekulė
molekulės, 100 nm laukas transkriptazės molekulės
6.7 pav. Skenuojančiu tuneliniu mikroskopu gauti įvairių molekulių vaizdai

Atominės jėgos mikroskopas

Patys universaliausi iš skenuojančiųjų mikroskopų – atominės jėgos mikroskopai. Atominės jėgos

mikroskopas turi keletą vaizdinimo pranašumų, palyginus su kitais mikroskopais (pvz. elektroniniu
mikroskopu). AJM gali pasiekti molekulinę skiriamąją gebą, atlikti matavimus vandenyje (ar
kitokiame skystyje), biologiniams bandiniams natūralioje aplinkoje. Yra galimybė skenavimo metu
keisti matavimo parametrus, skystį, gauti vaizdus realiu laiku (angl. real time measurements). Labai
dažnai paviršių ir medžiagų tyrimams naudojami keli prietaisai vienu metu.

Atominės jėgos mikroskopų zondai – ant lankstaus liežuvėlio pritvirtinti smaigaliai (dažniausiai
silicio arba silicio nitrido), kurie kontaktuoja su paviršiumi (arba yra Van der Valso jėgų veikimo
atstumu). Grįžtamojo ryšio mechanizmas palaiko vienodą sąveikos jėgą tarp zondo ir paviršiaus
skenavimo metu. Sąveikos jėga proporcinga liežuvėlio atsilenkimui. Jis registruojamas optiškai –
lazerio spindulys, atsispindėjęs nuo liežuvėlio, patenka į šviesos diodą, padalytą į dvi dalis.
Registruojamas skirtuminis signalas tarp šviesos diodo dalių (6.8 pav.).

Lazeris

Fotodetektorius

Personalinis
Zondas kompiuteris
Bandinys
Pavyzdëlis

6.8 pav. Principinė atomo jėgos mikroskopo schema

Tikslesniuse mikroskopuose lazerio spindulys registruojamas Fabri–Pero interferometru. Geriausių

atominės jėgos mikroskopų horizontali skiriamoji geba siekia 0,1 Å, vertikali – 0,01 Å (vakuume).
Ore ant bandinio susidaro plonas vandens kondensato sluoksnis, kuris gerokai sumažina mikroskopo
skiriamąją gebą. Todėl ore mikroskopo horizontali skiriamoji geba neviršija 10–20 Å, o vertikali –
apie 1 Å.

Šiuolaikiniuose atominės jėgos mikroskopuose (AJM) paviršiaus skenavimui naudojami zondai su

smailiomis adatomis. Jų ilgis – keli mikrometrai, smaigalio spindulys <10 nm. Ši adatėlė yra plono
100–200 nm ilgio liežuvėlio gale (6.9 pav.).

6.9 pav. Kairėje: AJM zondo schema;

Dešinėje: AJM zondo vaizdas, gautas elektroniniu mikroskopu.

Atomo jėgos mikroskopo skiriamoji geba labai priklauso nuo adatėlės smailumo. Pačiame gale jis
gali siekti kelis nanometrus. Tačiau (žiūrint iš labai arti) galas vis tiek bus apvalios formos. Todėl
adatėlės dažniausiai apibūdinamos jų smailės skersmeniu. Šiuo metu tobulinant ir smailinant adatėlės
galą naudojami anglies nanovamzdeliai, išbandomos kitos įvairios medžiagos.

Kai adatėlė priartinama kelių ar kelių šimtų angstremų atstumu prie paviršiaus, tarp jos ir paviršiaus
atsiranda sąveika. Sąveiką tarp paviršiaus ir adatėlės atomų nusako Lennardo–Joneso potencialas,
aprašomas (6.2) lygtimi (grafikas pateiktas 6.11 pav.):

wr   
A B
6
 12 (6.2) , kur A ir B – koeficientai, atitinkamai lygūs 10-77 m6 ir 10-134 m12, r –
r r
atstumas tarp atomų.

(6.2) formulėje pirmasis narys nusako Van der Valso sąveikos jėgas, antrasis nusako artiveikes
stūmos jėgas. Dėl šios sąveikos liežuvėlis yra išlenkiamas. Liežuvėlio išlinkimas dažniausiai
matuojamas optiniais metodais (6.10 pav.), nors kartais naudojami ir kiti būdai.
 6.10 pav. AJM zondo atsilenkimo aptikimas naudojant lazerį ir kvadrupolinį detektorių

Matuojant optiniais metodais, į liežuvėlį nukreipiamas diodinio lazerio spindulys. Jis atsispindėjęs
nuo plokštelės patenka į kvadrupolinį detektorių (detektorių, padalintą į keturias dalis). Kai
krintančios šviesos intensyvumas visose dalyse vienodas, detektoriaus išėjimo srovė lygi nuliui.
Liežuvėlio atsilenkimas apskaičiuojamas pagal šviesos intensyvumų sektoriuose skirtumus. Pagal tai
kompiuteris apskaičiuoja zondo išlinkimą. Topografiją (zondo atsilenkimą aukštyn–žemyn) atspindi
A–B signalas, adhezijos jėgas (zondo išlinkimą į kairę–dešinę) atspindi signalas C–D.

Priklausomybę tarp zondo atsilenkimo d ir zondą veikiančios jėgos F nusako Huko dėsnis (6.3):

F  k  d (6.3), kur k – tamprumo modulis.

Šiuo metu yra gaminami zondai, kurių tamprumo modulis k yra mažesnis nei 1 N/m. Kadangi galima
išmatuoti mažesnį nei 1 Å zondo atsilenkimą, galima išmatuoti jėgas, silpnesnes už 0,1 nN. Atominė
skyra AJM pasiekiama tik tiriant kietus ir stabilius paviršius. Minkšti bandiniai (dažniausiai
biologiniai) sukelia daugiau rūpesčių, nes paviršių veikiančios jėgos gali jį deformuoti. Yra keletas
atomo jėgos mikroskopo darbo režimų: kontaktinis, nekontaktinis ir virpančiojo zondo (angl. tapping
mode).

Kontaktinis AJM režimas

Mikroskopui veikiant kontaktiniu režimu, priartintas zondas skenuoja paviršių mažesniu nei 1 Å
atstumu. Tokiu atstumu pradeda persidengti zondo adatėlės ir bandinio atomų elektroninės orbitalės.
Todėl stūmos jėga tarp zondo ir paviršiaus tolstant zondui mažėja eksponentiškai (6.11 pav.).

6.11 pav. Sąveikos jėgos tarp bandinio paviršiaus ir adatėlės priklausomybė nuo atstumo

Yra du kontaktinio režimo būdai: pastovios jėgos ( F = сonst.) ir pastovaus aukščio (z = const.).
Matuojant pastovaus aukščio režimu (z = const.) topografiniai bandinio duomenys gaunami iš
liežuvėlio atsilenkimo. Skenuojant paviršių zondas stumdomas tik x ir y kryptimis, o z koordinatė
išlieka pastovi (išlaikomas pastovus skenerio aukštis). Matuojant pastovios jėgos režimu ( F = сonst.)
stengiamasi, kad liežuvėlio atsilenkimas (o kartu ir jėga, veikianti adatėlę) būtų pastovi. Liežuvėlio
atsilenkimas yra naudojamas grįžtamajam ryšiui užtikrinti. Jis keičia skenerio aukštį taip, kad adatėlės
atsilenkimas būtų pastovus.
Dažniau yra naudojamas pastovios jėgos režimas. Tačiau dirbant šiuo režimu skenavimo greitis yra
mažesnis (jį riboja grįžtamojo ryšio greitis). Pastovaus aukščio režimas tinkamas tik gana plokštiems
paviršiams skenuoti, jo skenavimo greitis yra didesnis. Šiuo režimu gaunama didžiausia iš visų jėgos
mikroskopų skiriamoji geba, bet jo taikymą riboja keletas trūkumų. Sąveikos jėgos tarp zondo ir
bandinio vertikaliąja kryptimi gana didelės (iki keleto nN). Be to, zondui slenkant paviršiumi dėl
adhezijos atsiranda gana didelės horizontaliosios jėgos, todėl galima pažeisti minkštus bandinius.
Nepaisant didelės skiriamosios gebos, šis metodas gana ribotai taikomas biologinės kilmės
bandiniams tirti. Todėl minkštų bandinių topografijos matavimams geriau tinka nekontaktinis arba
virpančiojo zondo režimai.

Nekontaktinis AJM režimas

Mikroskopui veikiant nekontaktiniu režimu zondas yra gana toli nuo bandinio paviršiaus (10–25 nm
atstumu). Tarp adatos ir paviršiaus veikia traukos jėga (6.11 pav.). Jos kilmė – toliasiekės Van der
Valso jėgos. Šiuo atveju supaprastinta sąveikos potencialo priklausomybė aprašoma (6.4) lygtimi:

HR
w(r )  - (6.4), kur H – Hamakerio konstanta, R – adatėlės smaigalio spindulys, r – atstumas
6r 6
tarp paviršiaus ir adatėlės.

Jėga veikianti bandinį matuojant nekontaktiniu režimu yra labai silpna – apie 10-12 N. Tai pranašumas
tiriant „minkštus“ bandinius. Kad būtų lengviau registruoti jėgos pokyčius, zondas virpinamas
dažniu, artimu jo rezonansiniam dažniui (paprastai šis dažnis priklauso intervalui nuo 100 iki 400
kHz). Zondo virpesių amplitudė – kelios dešimtys ar šimtai angstremų. Topografija matuojama taip
pat, kaip ir kontaktiniu pastovios jėgos režimu, tik grįžtamajam ryšiui naudojami rezonansinio dažnio
ir amplitudės pokyčiai.

Virpančiojo zondo AJM režimas

Virpančiojo zondo režimas – universaliausias, jis jungia kontaktinio ir nekontaktinio režimų

privalumus. Virpančiojo zondo režimas yra panašus į nekontaktinį režimą, tik čia zondas priartinamas
prie paviršiaus tiek, kad jis „stuksentų“ per paviršių. Mikroskopui veikiant šiuo režimu liežuvėlis su
zondu virpinamas (dažniausiai pjezoelektriniu, kartais magnetiniu būdu) 3–30 nm amplitude ir 25–
1200 kHz dažniu (priklausomai nuo liežuvėlio tipo). Taip zondu „stuksenant“ bandinį beveik visiškai
eliminuojamos horizontaliosios adhezijos jėgos, sumažėja vandens kondensato ant bandinio
paviršiaus įtaka (zondas tai panardinamas, tai ištraukiamas iš kondensato). Bandinys beveik nėra
pažeidžiamas, nes nėra horizontaliųjų jėgų (6.12 pav.). Gaunama artima kontaktiniam režimui
skiriamoji geba. Dar vienas šio metodo pranašumas – fazinio vaizdinimo galimybė.

Matavimo metu registruojama ne tik zondo virpėjimo amplitudė, bet ir fazių skirtumas tarp zondą
virpinančiojo signalo ir zondo virpėjimo. Fazių skirtumą lemia ne tik paviršiaus reljefas, bet ir
mechaninės paviršiaus savybės, ahhezijos jėgos tarp zondo ir bandinio. Šiuo metodu galima lengvai
išskirti plonus organinius sluoksnius ant silicio padėklo, kurių storis mažesnis už vertikaliąją
mikroskopo skiriamąją gebą, bet mechaninės savybės ir sąveikos su zondu pobūdis skiriasi.
Matuojant fazinio vaizdinimo būdu, dažniausiai gaunami du vaizdai: topografinis (turintis
informaciją apie bandinio aukščius) ir fazinis – kontrastingesnis ir didesnės horizontalios
skiriamosios gebos, tačiau neturintis informacijos apie bandinio reljefą.
 Kontaktinis Nekontaktinis Virpančiojo zondo

6.12 pav. AJM darbo režimų artefaktų palyginimas

Yra keletas veiksnių, ribojančių atominės jėgos mikroskopų skiriamąją gebą. Tai – zondo geometrija,
vandens kondensatas (jei dirbama ore), adhezijos jėgos, šiluminis judėjimas. Geriausi jėgos
mikroskopo zondai yra zondai su vienu atomu smaigalyje. Tačiau toks zondas labai greitai
„nusitrina“, todėl dažniausiai (ypač dirbant ore) yra naudojami zondai su keleto nanometrų spindulio
smaigaliu. STM zondas mechaniškai nekontaktuoja su paviršiumi, todėl vienas atomas ant zondo
smaigalio gali išlikti neribotai ilgai – STM zondai turi didesnę skyrą nei AJM. Dirbant ore bandinio
paviršiuje susidarantis kondensatas „užapvalina“ smulkias detales. Šią problemą galima iš dalies
išspręsti skenuojant vandenyje (6.13 pav.). Vandenyje taip pat ekranuojami bandinio paviršiniai
krūviai, dėl kurių taip pat mažėja mikroskopo skiriamoji geba.

Vanduo eliminuoja
kapiliarines jėgas
Krūviai
Krūviai ekranuojami
Vandens sluoksnis - - - - - - - - -
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +

Ore Vandenyje

6.13 pav. Atliekant matavimus vandenyje galima kompensuoti kai kuriuos

kontaktinio AJM trūkumus: skiriamosios gebos praradimą dėl
elektrostatinių sąveikų ir kapiliarinių jėgų

Šiluminiai zondo–bandinio atomų judesiai taip pat riboja mikroskopų skyrą. Šis ribojimas yra gana
nedidelis, bet vertikaliajai skyrai turi gana juntamą įtaką (tai yra pagrindinis ribojantis veiksnys
dirbant vakuume). Šiluminius judesius galima įvertinti tokiu būdu:

F  kx (6.5) – zondo sąveikos su paviršiumi jėgos modulis. k – liežuvėlio tamprumo koeficientas, x

– atsilenkimas.
kx2
U (6.6) – zondo sąveikos su paviršiumi energija;
2
 k BT
E (6.7) – energija, tenkanti vienam laisvės laipsniui (laikome, kad zondas turi vieną judėjimo
2
laisvės laipsnį). T –aplinkos temperatūra, kB – Bolcmano konstanta.

Tarkime, kad esant ribinei skyrai, signalas yra lygus triukšmui (zondo – bandinio sąveikos energija
lygi zondo kinetinei energijai dėl šiluminio judėjimo):

dU
x  E (6.8)
dx

dU k BT k T
Kadangi  kx  F , tai Fx  ir x  B . (6.9)
dx 2 2F

Dirbdami su 100 pn sąveikos jėga kambario temperatūroje vertikalią skyrą gauname:

1,38 1023 J / K  293K

x  10
 211 m  0,02nm .
2 10 N

Tai – gana žymus skyros apribojimas. Dažniausiai dirbant atomine skyra naudojamos didesnės jėgos
(apie 500 pN). Todėl kai kurių didelės skyros AJM darbinė dalis yra šaldoma skystu azotu arba heliu.
Horizontaliai skyrai termodinamika beveik neturi įtakos, nes zondo matmenys kur kas labiau apriboja
mikroskopo skyrą.

Pasirinkus virpančiojo zondo režimą, galima gauti trijų rūšių informaciją (6.14 pav.):

6.14 pav. Virpančiojo zondo režimo metu gaunama informacija

  Informacija apie aukštį. Vertikali laikiklio pozicija stebima nekeičiant jo atstumo z ašies
atžvilgiu. Pjezoelementą reguliuojanti įtampa yra proporcinga jo ilgiui. Pokyčio z ašyje matavimas
leidžia užfiksuoti bandinio paviršiaus struktūrą. Iš šių rezultatų galima tiksliai apskaičiuoti bandinio
aukštį, tačiau juo sunku nustatyti tikslius iškilimų ir įdubų matmenis.

 Informacija apie fazę. Pasirinkus šį režimą matuojamas fazės pokytis (arba kitaip – fazinis
kampas tarp įeinančio signalo ir svyruojančio laikiklio). Pradinio signalo fazė yra palyginama su
laikiklio atsaku fotodiodiniam detektoriui. Fazių skirtumas, kai laikiklis laisvai svyruoja ore, yra
prilyginamas nuliui. Kai adatėlė pasiekia paviršių, jos virpėjimo fazinis kampas pasikeičia. Pereinant
skirtingo elastingumo ar drėgnumo paviršius fazinis kampas taip pat keičiasi. Visus šiuos pokyčius
galime matyti fazinio vaizdo paveikslėlyje.

 Informacija apie amplitudę. Amplitudė matuojama šviesai jautriu detektoriumi. Jame y ašyje
lazerio signalo RMS amplitudės vertė yra įrašoma kiekviename matricos (dažniausiai ji būna
512·512) taške. Šis vaizdavimas puikiai parodo visus smulkius paviršiaus nelygumus ir briaunas.

DNR molekulių topografinė ir fazinė nuotrauka parodyta 6.15 pav.

6.15 pav. DNR, topografija ir fazinis vaizdas (325 nm laukas)

Skenuojančio zondo mikroskopų taikymas biotechnologijos srityje

Skenuojančio zondo mikroskopai taikomi daugelyje mokslo sričių kur reikalingas paviršiaus
vaizdinimas didele skiriamąja geba. Biologijoje ir medicinoje šių mikroskopų taikymas neapsiriboja
vien biologinių objektų paviršiaus topografijos matavimais (baltymų ar baltymų kristalų) ar vaistų
tirpimo dinamikos matavimais (skenuojant tą pačią eilutę ir stebint topografijos pokyčius tirpstant
vaistams). Yra išnaudojama šio mikroskopo galimybė matuoti itin silpnas jėgas: atliekami
biomolekulių atpažinimo tyrimai, biomolekulių sąveikos matavimai, baltymų išvyniojimo
eksperimentai, ląstelių adhezijos matavimai, detektuojamos biomolekulės.

Molekulių atpažinimas, molekulių sąveikos matavimas

Kai kurioms biomolekulėms būdinga specifinė sąveika (afiniškumas) su kitomis molekulėmis

(antikūnas – antigenas, receptorius – ligandas, komplementarios DNR sekos). Naudojant atomo jėgos
mikroskopo zondus, padengtus biomolekulėmis, galima atpažinti, ar bandinyje yra molekulių,
afiniškų kitoms molekulėms (jomis yra padengta adatėlė). Skenuojant bandinį (pvz. ląstelės
membraną), toje vietoje, kur molekulė yra afiniška ant adatėlės prikabintoms molekulėms pastebima
itin stipri sąveika tarp adatėlės ir bandinio (6.16 pav.).
 6.16 pav. Paviršinių baltymų vaizdinimas naudojant AJM

Naudojant biologiškai aktyviomis molekulėmis padengtas adatėles galima išmatuoti ir dviejų

tarpusavyje sąveikaujančių molekulių sąveikos jėgą. Tokiu atveju yra matuojama jėgos (veikiančios
tarp adatėlės ir bandinio paviršiaus) priklausomybė nuo atstumo (angl. force–distance curve). Tai
atliekama adatėlę iš pradžių artinant prie paviršiaus, o paskui tolinant. Matuojama, kaip keičiasi
kantileverio išlinkimas. Adatėlės polinkis d priklauso nuo adatėlę veikiančios jėgos F ir adatėlės
elastingumo koeficiento (Huko dėsnis, 6.3 lygtis).

Tarkime, prie paviršiaus yra pritvirtintas ligandas, o prie adatėlės – receptorius. Jų tarpusavio sąveiką
galima nustatyti matuojant jėgos (išlenkiančios zondą) priklausomybę nuo atstumo. Tokio matavimo
schema pavaizduota 6.17 pav.

6.17 pav. Dviejų biomolekulių sąveikos jėgos matavimo schema, kanitileverį veikiančios jėgos
priklausomybė nuo atstumo (matavimo metu)

Iš pradžių adatėlė yra artinama prie bandinio, tarp receptoriaus ir ligando atsiranda sąveika. Paskui
adatėlė tolinama nuo bandinio. Dėl sąveikos, atsiradusios tarp receptoriaus ir ligando, kantileveris
išlinksta link bandinio (paveikslėlyje pavaizduota 6 ir 7 stadijomis). Kai ši jėga viršija sąveikos tarp
biomolekulių jėgą, receptoriaus–ligando kompleksas išyra (2 stadija). Zondą išlenkianti jėga, kuriai
veikiant adatėlė atšoka nuo paviršiaus, yra lygi ligando ir receptoriaus sąveikos jėgai. Panašiai galima
atlikti eksperimentus tiriant jėgas, kurių reikia baltymams „išvynioti“. Pirmieji baltymo išvyniojimo
darbai skystoje terpėje (naudojant AJM) buvo pradėti Bazelio universiteto A. Engel grupėje. Ši grupė
tyrė bakterijų membranines struktūras, kurias sudarė heksagoniniai baltyminiai kompleksai.
Kiekvienas heksagoninis baltyminis kompleksas buvo sudarytas iš šešių monomerų. Mokslininkai
pabandė išvynioti vieną iš baltyminių kompleksų naudojant AJM. Šis eksperimentas pademonstruotas
6.18 pav.
 6.18 pav. Kairėje: Heksagoniniai baltymų kompleksai prieš išvyniojimą.
Dešinėje: Rodykle pavaizduotas išvyniotas baltymų kompleksas

Naudojant AJM jėgos moduliacijos režimą galima matuoti ir bandinių elastingumą (minkštumą).
Vėžinės ląstelės yra minkštesnės nei sveikos ląstelės (tai padeda joms lengviau metastazuoti). Šį
elastingumo pokytį galima panaudoti identifikuojant navikines ląsteles. Matuojant ląstelių
elastingumą galima tirti ir vaistų poveikį ląstelėms. Ląstelių elastingumo matavimai taip pat gali būti
taikomi ir senėjimo tyrimuose, nes senstant ląstelės praranda elastingumą.

Nanokantileveriai

Nanomechaniniai jutikliai – tai kantileveriai, kurių paviršius modifikuotas taip, kad prie jų gali
jungtis tam tikros biomolekulės. Kantileverių vienas galas pritvirtintas prie platformos, o kitas juda
laisvai (6.19 pav.). Nuo AJM zondų jie skiriasi tuo, kad AJM zondai gale turi adatėlę
(nanomechaniniai kantileveriai jos neturi).

Kantileveriai

6.19 pav. Principinė kantileverių panaudojimo jutikliuose schema

Nanomechaniniai kantileverių atsako signalai (priklausomai nuo kantileverių tipo) gali atsirasti prie
jo prisijungus biomolekulėms dėl:

1) Kantileverio masės pokyčio;

2) Temperatūros pokyčio;
 3) Paviršiaus įtempimo.

Pakitus kantileverio masei pakinta ir jo rezonansinis dažnis. Matuojant kantileverio rezonansinį

dažnį galima nustatyti ar prie kantileverio yra prisijungusios detektuojamos biomolekulės. Šis
metodas gali būti taikomas atliekant matavimus dujose ir skysčiuose, nors matuojant skysčiuose
jautrumas šiek tiek sumažėja.

Temperatūros pokyčiai (šiluma), atsirandantys prie kantileverio jungiantis biomolekulėms, taip pat
gali būti detektuojami kantileveriais. Tokie kantileveriai pagaminti iš medžiagų su skirtingais
šiluminio plėtimosi koeficientais (silicio kantileveris iš viršaus padengtas aukso plėvele). Tokiu
atveju, išsiskyrus šilumai kantileveris išlinksta. Šis metodas nelabai tinka naudoti skystyje.

Trečiojo tipo nanokantileveriuose yra detektuojamas kantileverio išlinkimas, atsirandantis dėl

kantileverio paviršiuje (prie kurio prisijungia biomolekulės) pakitusių įtempimo jėgų. Tai galima
įsivaizduoti kaip „biocheminį“ efektą. Šio tipo kantileveriai yra naudojami dažniausiai. Be to, norint
detektuoti signalą, nereikia kantileverio virpinti – detektavimas yra paprastesnis.

Nanomanipuliavimas

Skenuojančio zondo mikroskopai taikomi ne tik paviršiaus analizei, bet ir manipuliavimui. Vienas iš
būdų – adatėlę priartinti labai arti paviršiaus ir leisti tarp adatėlės ir paviršiaus tekėti didelei srovei.
Dėl to paviršius po adatėle labai įkaista, gali išsilydyti arba net būti išgarinamas. Taip galima paviršių
modifikuoti. Kitas būdas – mažų darinių, molekulių ar net pavienių atomų stumdymas ant bandinio
paviršiaus, iš jų formuojant norimas struktūras. 1990 m. D. M. Eigleris ir E. K. Schweizeris
(mokslininkai iš IBM kompanijos) naudodami skenuojantį tunelinį mikroskopą suformavo IBM
logotipą iš ksenono atomų ant nikelio substrato (6.20 pav.). Buvo pasirinktas nikelis, kadangi jo
sąveika su ksenonu yra pakankama išlaikyti ksenono atomams vietoje (sąveika didesnė už šiluminę
ksenono atomų energiją kambario temperatūroje). Tačiau sąveika ir gana silpna, todėl galima atomus
stumdyti STM adata. Adatą priartinus prie ksenono atomo tuneliuojanti srovė padidėja. Atsiranda
trauka tarp ksenono atomo ir adatos. Judinant adatą paskui ją paviršiumi slenka ir ksenono atomas.
Atitolinus adatą tunelinė srovė sumažėja, todėl ksenono atomas paliekamas naujoje vietoje ant nikelio
paviršiaus.

6.20 pav. IBM logotipas ant nikelio, sudarytas iš ksenono atomų

AJM anodinė oksidacija pakeičia ne tik bandinio topografiją, bet ir bandinio chemines bei elektrines
savybes. Prie laidaus AJM zondo prijungus įtampą ir jį priartinus prie laidaus bandinio paviršiaus gali
pradėti vykti elektrocheminė reakcija. Jos metu bandinio paviršius yra oksiduojamas ir jame
suformuojamos oksido „salelės“. Oksido srities dydis ir gylis priklauso nuo laiko, kurį adatėlė buvo
virš tam tikro bandinio taško bei nuo to, kaip arti buvo priartinta adatėlė. Šiuo metodu galima
suformuoti 8–10 nm skersmens oksido sritis. Pritaikius šį metodą informacijai užrašyti, į 1 cm2 būtų
galima įrašyti 250 GB informacijos. Šiuo metodu galima ne tik formuoti taškelius, bet ir linijas ar net
paveiksliukus (6.21 pav.).
 6.21 pav. AJM anodinės oksidacijos pavyzdžiai. Kairėje: oksido salelės;
Dešinėje: Nobelio premijos laureato Zhoeso Alferovo nuotrauka (2,5 x 3 μm)

Taip pat galimas mechaninis paviršiaus modifikavimas AJM zondu. Tai – tarsi graviravimas, tik adata,
kuria atliekamas graviravimas, yra labai smaila – jos smaigalio spindulys yra apie 10 nm. Atliekant
šio tipo litografiją mikroskopas adatėlę prie paviršiaus prispaudžia didesne jėga nei vaizdinant
bandinį. Adatėle braukiant per paviršių yra formuojami paviršiaus įbrėžimai ar įspaudimai. Norint
atlikti mechaninį paviršiaus modifikavimą reikia, kad paviršius būtų minkštesnis nei AJM zondo
adatėlė. Todėl dažniausiai naudojamos deimantinės AJM adatėlės. Tačiau naudojant minkštus
paviršius (tokius kaip polikarbonatas, polietilenas ir kt.) galima naudoti ir įprastas AJM kontaktinio
režimo adatėles. Taip pat svarbu, kad paviršiaus medžiaga „neliptų“ prie adatėlės. Priešingu atveju
adatėlė greitai bus užteršiama, o tai trukdys atlikti mechaninį modifikavimą ir vaizdinti paviršių.

6.3. Optinis pincetas: veikimo principai ir taikymas molekulinių jėgų tyrimuose

Įvadas

Jau seniai žinoma, kad šviesa turi impulsą ir gali mechaniškai veikti medžiagą. Apie 1970 m. kilo
idėja, kaip šį slėgį galima būtų išnaudoti manipuliavui mažais objektais (be jokio kito įsikišimo). Kaip
tik tuo metu buvo sukonstruoti nauji galingi apšvietimo šaltiniai – lazeriai. Jų spinduliuotės
koherentiškumas leido fokusuojant pasiekti didelį energijos srauto tankį ir (atitinkamai) pasiekti gana
dideles jėgas, veikiančias medžiagą. Taip susiformavo lazerinių optinių pincetų koncepcija. Lazerinis
pincetas – tai stipriai sufokusuotas lazerio šviesos pluoštas. Buvo parodyta, kad naudojant optinius
pincetus galima pagauti (ir išlaikyti norimoje vietoje tirpale) mažas daleles maždaug nuo 50 nm iki
keliolikos mikrometrų dydžio. Taip pat galima jas pernešti į norimą vietą, suformuoti iš jų norimą
struktūrą ir kt. Ypač daug optinių pincetų taikymų atsirado pastaraisiais metais – nagrinėjant
biocheminių reakcijų ypatybes ir atskirų makromolekulių mechanines savybes, koloidinių tirpalų
tyrimuose, ląstelės biofizikoje ir kitose srityse, kur galima panaudoti tikslią manipuliaciją
mikroskopinio dydžio objektais.

Lazerinių pincetų veikimo principas

h
Fotonas, kurio dažnis  , turi judesio kiekį p  (6.10) , kur h – Planko konstanta, c – šviesos
c
greitis.

Jeigu sąveikaujant su medžiaga fotonas yra išsklaidomas arba sugeriamas, pakinta jo judesio kiekis.
Dalis fotono judesio kiekio yra perduodama medžiagai, su kuria jis sąveikauja. Iš to seka, kad
medžiagos dalelę šviesos srautas veikia tam tikra jėga. Tai ir išnaudojama lazeriniuose pincetuose.
Norint sužinoti, kokios jėgos veikia dalelę, reikia apskaičiuoti išsklaidytos šviesos srautą.
Priklausomai nuo dalelės, kurią norime pagauti, dydžio, yra išskiriami du sklaidos režimai:

Relėjaus, kai dalelės matmenys (a) gerokai mažesni už bangos ilgį ( a   );

Mi, kai dalelės matmenys palyginami arba daug didesni už bangos ilgį ( a   ).

Kai bangos ilgis ir dalelės matmenys palyginami, skaičiavimas darosi sudėtingas. Norint aprašyti šias
sklaidas, sprendžiamos įvairaus sudėtingumo diferencialinės lygtys. Gaunami labai sudėtingi
analitiniai sprendiniai.

Dalelę veikiančios jėgos skaičiavimas

Elektromagnetiniame lauke esančią dalelę veikia dvi jėgos:

1. Sklaidos jėga, susijusi su išsklaidytos šviesos impulso pokyčiu;

2. Gradientinė jėga, susijusi su tuo, kad dalelė išoriniame elektriniame lauke poliarizuojasi. Šį
dipolį veikia elektrinis laukas.

Sklaidos jėgos bendru atveju trukdo – jos dalelę stumia lauk iš optinės gaudyklės, gradientinės –
atvirkščiai. Būtina stabilaus pagavimo sąlyga – gradientinės jėgos turi viršyti sklaidos jėgas.

Panagrinėsime atvejį, kai dalelės matmenys gerokai didesni už bangos ilgį ir galima taikyti
geometrinės optikos artinį. Mi ir Relėjaus sklaidos atvejų nenagrinėsime, nes jie pernelyg sudėtingi
ir galima gauti tik skaitmenines priklausomybes.

Geometrinės optikos režimas

Kaip parodyta 6.22 pav. kairėje, atsispindėję ar dalelės išsklaidyti fotonai sukuria sklaidos jėgą. Ji
stumia dalelę lauk iš optinės gaudyklės. Jėga, traukianti dalelę link didžiausio lauko intensyvumo,
atsiranda dėl lūžusių dalelės paviršiuje spindulių impulso pokyčio. Galima geometriškai įrodyti, kad
gradientinė jėga visada traukia dalelę link židinio (jame šviesos intensyvumas didžiausias). Židinys
– tai taškas, kuriame susikirstų sufokusuoto pluošto spinduliai, jei dalelės nebūtų. Tai pavaizduota
6.22 pav. dešinėje.
 6.22 pav. Kairėje: Mikrodalelę veikiančių jėgų paaiškinimas geometrinės optikos artiniu.
Raudoni – krintantys spinduliai, mėlyni – atsispindėję nuo paviršiaus (dėl jų atsiranda sklaidos
jėga), žali – lūžę spinduliai (sukeliantys gradientinę jėgą). Dešinėje: Gradientinė jėga visada veikia
link židinio taško. Tai užtikrina dalelės stabilų pagavimą. Čia židinys pavaizduotas brūkšninių
raudonų linijų susikirtimu.

Sklaidos ir gradientinės jėgų atstojamoji gali būti užrašyta taip (6.11):

Qnm P
F (6.11), kur nm – terpės lūžio rodiklis, P – lazerinio pluošto galia, Q – pagavimo
c
efektyvumas. Jis paprastai yra Q  0.3 .

Pavyzdžiui, naudojant 10 mW galios lazerį (Q = 0,25) 3 μm dyžio polistireno (n = 1,58) dalelei

vandenyje pagavimo jėga lygi F  10 pN .

Įvairios geometrijos lazeriniai pincetai

Kaip jau rašyta, optinis pincetas – tai stipriai sufokusuotas lazerio pluoštas. Taigi tikėtina, kad optinių
pincetų gali būti įvairių (priklausomai nuo šviesos pluošto savybių). Klasikinis pluoštas, naudojamas
lazeriniams pincetams suformuoti, yra Gauso pluoštas. Jo skersinis skirstinys yra Gauso funkcija
(6.23 pav. kairėje).

6.23 pav. Kairėje: Gauso pluošto intensyvumo priklausomybė nuo atstumo iki pluošto ašies.
Dešinėje: pirmos eilės (topologinis krūvis = 1)
Beselio–Gauso sūkurinio pluošto skersinis skirstinys.

Jei mikrodalelės lūžio rodiklis mažesnis nei aplinkos, ji yra traukiama į mažiausio intensyvumo sritį
(todėl sufokusuotu Gauso pluoštu jos pagauti negalima). Lygiai taip pat neįmanoma pagauti ir
atspindinčių arba sugeriančių objektų. Buvo parodyta, kad (skaičiuojant pagavimo jėgą geometrinės
optikos artiniu) beveik lygiagretūs pluošto sklidimo ašiai (paraksialiniai) spinduliai nesudaro
gradientinės jėgos (silpnai lūžta). Tačiau tokie spinduliai sudaro didžiąją dalį sklaidos jėgos (yra
stipriai atspindimi). Taigi, kuo daugiau energijos pernešama beveik lygiagrečiai sklidimo ašiai, tuo
blogesni pagavimo parametrai. Šiuos trūkumus galima panaikinti panaudojant kitokį intensyvumo
skirstinį turinčius pluoštus – šviesos sūkurius.

Sūkurinius pluoštus galima panaudoti pagaunant daleles, kurių lūžio rodiklis mažesnis nei aplinkos.
Taip pat (statmenai pluošto ašies) galima sugauti atspindinčias ir sugeriančias mikrodaleles. Išilgai
pluošto ašies jų sugauti negalima. Be to, naudojant sūkurinius pluoštus, pagerėja pagavimo jėgos ir
pluošto galios santykis manipuliuojant skaidriomis dalelėmis, kurių lūžio rodiklis didesnis nei
aplinkos (kai mikrodalelių matmenys daug didesni už bangos ilgį). Vienas pavyzdžių yra Beselio–
Gauso sūkuriai (6.23 pav. dešinėje). Jie pasižymi tuo, kad net sklidimo ašies pagautoms dalelėms
esant ant pluošto, pluoštas išlaiko vienodą skersinį lauko skirstinį išilgai sklidimo ašies (todėl
Beselio–Gauso sūkuriai dar vadinami nedifraguojančiais). Tai leidžia manipuliuoti keliomis
dalelėmis iš karto.

Jėgų matavimas naudojant optinius pincetus. Jėgos matavimo principai

Kol kas parodėme, kad dėl sklaidos atsirandančios jėgos gali būti panaudotos suformuoti „pincetui“,
kuris leidžia manipuliuoti mikrodalelėmis. Naudodami šį instrumentą, galime taip pat matuoti mažas
jėgas, veikiančias objektą. Veikianti jėga proporcinga dalelės atstumui nuo židinio:
 
F  kx (6.12), kur k – stangrumo koeficientas

Jeigu žinomas stangrumo koeficientas k, išmatavę objekto poziciją galime apskaičiuoti ir jį veikiančią
jėgą (6.12).

6.24 pav. Kairėje: interferometrinio detektavimo schema. Lazerio spindulys skaidomas į du

spindulius, kurių poliarizacija ortogonali. Kiekvieno spindulio optinio kelio ilgis priklauso nuo
dalelės koordinatės. Iš spindulių interferencinio vaizdo galime spręsti apie dalelės poziciją.
Dešinėje: jėgos, veikiančios dalelę, matavimas. Kai dalelė pajuda iš centro, lazerio pluoštas
atlenkiamas. Atlenkimas matuojamas pozicijai jautriu fotodiodiniu detektoriumi.

Modernios vaizdo analizės metodikos leidžia išmatuoti mikrometrinio dydžio dalelių poziciją iki 10
nm tikslumu. Stangrumo koeficientas stipriai kinta priklausomai nuo šviesos srauto, dalelės dydžio ir
gaudyklės geometrijos. Apytikslis įvertinimas gali būti 50 pN/µm. Tai leidžia pasiekti apie 0,5 pN
jėgos matavimo skiriamąją gebą. Norint padidinti jėgos matavimo skiriamąją gebą galima sumažinti
stangrumą k.

Tačiau procentiškai jėgos matavimo skiriamoji geba lieka ta pati ir priklauso nuo maksimalios
leistinos nuokrypio amplitudės ir dalelės pozicijos matavimo tikslumo santykio. Norint padidinti
jėgos matavimo tikslumą buvo pasiūlyti nauji metodai tiksliau išmatuoti dalelės poziciją. Dalelės
pozicijai nustatyti naudojamas dviejų spindulių, atskirtų mažu atstumu, interferencinis vaizdas (6.24
pav.). Šitoks matavimo būdas leidžia pasiekti mažiau negu vieno nanometro koordinatės matavimo
tikslumą. Jei naudojame dviejų spindulių įrangą, veikiančiai dalelę jėgai matuoti gali būti panaudotas
tas pats lazerio spindulys, kuris ją ir sukelia. Ši jėga atsiranda dėl to, kad šviesa perduoda dalelei dalį
savo impulso. Tačiau dalis šviesos pluošto nukrypsta į šalį – tai neišvengiama impulso perdavimo
pasekmė. Taigi matuodami praėjusios šviesos intensyvumo skirstinį galime rasti perduotą jėgą.
Tačiau vieno spindulio prietaisuose lazerinio pluošto skersmuo paprastai lygus (arba kiek didesnis)
objektyvo skersmeniui. Todėl išmatuoti išsklaidytos šviesos nuokrypio neįmanoma. Dviejų spindulių
sistemoje yra užpildoma tik dalis objektyvo apertūros. Sudaromos sąlygos lazerinio pluošto
atlenkimo tiesioginiam matavimui, panaudojant pozicijai jautrų fotodiodinį detektorių (6.24 pav.
dešinėje). Tokiomis sąlygomis galima išmatuoti išsklaidytos šviesos nuokrypį ir apskaičiuoti dalelę
veikiančią šviesos jėgą.

Vieną molekulę veikiančių jėgų matavimas

Kur gali būti panaudotos šios mažų jėgų, veikiančių mikrometrinio dydžio objektus, matavimo
galimybės? Pasirodo, tai gali būti panaudota biotechnologijoje. Prikabinus prie mikrosferos
makromolekulę galima tirti jėgas, veikiančias molekulę įvairiomis sąlygomis. Taip pat galima tirti
molekulės atsaką į tam tikras jėgas. Kodėl ir kam tai naudinga? Yra keli šio metodo pranašumai.

 Pirma, izoliavę atskirą molekulę, mes supaprastiname sistemą išvengdami sąveikos tarp tokių
pat molekulių. Tai daro analizę paprastesnę.
 Antra, matuodami atskiros molekulės charakteristikas, mes išvengiame vidurkinimo
ansamblio atžvilgiu. Vidurkinimas gali „paslėpti“ kai kuriuos parametrus.

Vienos molekulės matavimo metodikos buvo panaudotos įvairiems klausimams spręsti. Čia kai
kuriuos iš jų ir aptarsime.

Jėgos matavimų taikymai. „Molekulinių motorų“ sąveikos su DNR tyrimas

Daug dėmesio pastaruoju metu buvo skirta studijuoti E. coli RNR polimerazės ir DNR sąveikai. RNR
polimerazės yra fermentai, kurie kopijuoja DNR seką sukurdami informacinę (angl. messenger) RNR
(iRNR). iRNR ribosomose naudojama konkrečiam baltymui transliacijos metu sukurti. Kadangi
polimerazės sujungia NTP (N reiškia bet kurį iš keturių RNR ribonukleotidų iRNR sekoje) į iRNR
molekulę, yra išlaisvinama energija. Ji naudojama RNR polimerazės judėjimui DNR molekule.
Vadinasi, RNR polimerazės naudoja energiją generuoti judesiui. Todėl jas galima vadinti
molekuliniais motorais. DNR polimerazės sukuriamos jėgos buvo matuojamos naudojant optinių
pincetų įrangą. Optinio pinceto panaudojimo schema šiame bandyme pavaizduota 6.25 pav.
 6.25 pav. DNR–RNR polimerazės sąveikos matavimo schema

Prie polistireno mikrodalelės pritvirtinama DNR grandinė. Pritvirtinimo metodai gali būti įvairūs.
Dažniausiai mikrodalelė padengiama streptavidinu, o prie vieno iš DNR galų prikabinamas biotinas.
Biotinui reaguojant su streptavidinu DNR vienu galu pritvirtinama prie mikrosferos. Prie kitos
mikrosferos, laikomos ant pipetės, pritvirtinama RNR polimerazė. Pirmoji mikrosfera valdoma
lazeriniu pincetu. Pipetė judinama, kol pasiekiama norimo dydžio jėga. Išmatuota, kad transkripcija
vyksta be didesnių polimerizacijos greičio pokyčių, kol veikianti jėga nesiekia 25 pN. Didinant jėgą
toliau, transkripcija lėtėja. Taip pat buvo atrasta, kad polimerazei pasiekus tam tikrus DNR
segmentus, veikianti jėga stipriai sumažėja.

Šie rezultatai padėjo paaiškinti priklausomą nuo sekos polimerizacijos proceso sulėtėjimą
transkripcijos reguliavimo srityje. Naudojant optinius pincetus taip pat buvo daryti eksperimentai,
kurių metu buvo matuotas DNR polimerazės aktyvumas. Buvo stebėtas T7 DNR polimerazės
gebėjimas sintetinti viengrandinės DNR antrąją grandinę esant išorinei jėgai. Eksperimento schema
pateikta 6.26 pav. Kitaip nei praeitame eksperimente, parodyta, kad polimerizacijos greitis yra labai
jautrus tempimui. Be to, polimerizacija visiškai sustodavo, kai tempimo jėga viršydavo 34 pN. Esant
dar didesnėmis jėgų vertėmis stebėta egzonukleosintezė – dvigrandinė DNR būdavo greitai ardoma
3‘–5‘ kryptimi. Panašūs eksperimentų rezultatai (naudojant magnetinius pincetus) buvo gauti tiriant
Sequenase ir Klenowo DNR polimerazes.

6.26 pav. DNR polimerazės generuojamos jėgos matavimo schema

Nukleorūgščių fizikinių savybių tyrimas

Norint suprasti tokius biologinius procesus, kuriuose dalyvauja nukleorūgštys (DNR replikacija,
reparacija, RNR transkripcija ir transliacija), svarbu suprasti nukleorūgščių savybes ir elgesį esant
įvairioms sąlygoms, kurios būdingos ląstelei. Konkrečios molekulės matavimai atveria naujas
galimybes išmatuoti svarbias šiems procesams nukleorūgščių fizikines savybes. DNR įtempimo
matavimai leidžia stebėti keletą skirtingo elgesio fazių, išmatuoti termodinaminius dydžius, susijusius
su DNR molekulių perėjimu iš vienos struktūros į kitą. Šie faziniai virsmai stebimi ir vykstant
natūraliems procesams. RNR transkripcijos ir DNR replikacijos metu dvigrandinės DNR bazių seka
turi būti nuskaitoma tam, kad būtų sukurta (atitinkamai) RNR arba DNR molekulė. Tam, kad seka
būtų nuskaityta ir nukopijuota, ryšiai tarp bazių turi būti nutraukti. Fazinis dvigrandinės–
viengrandinės DNR virsmas, kurio metu ryšiai tarp komplementarių DNR grandinių yra nutraukiami,
vadinamas „helix–coil“ faziniu virsmu. Šio fazinio virsmo parametrai gali būti išmatuojami DNR
tempimo eksperimentuose. Eksperimentų metu viena λ–DNR molekulė tempiama tarp dviejų
polistireno sferų, kaip parodyta 6.27 pav.

6.27 pav. DNR tempimo eksperimento schema

Kai DNR molekulė ištempiama daugiau, nei jos charakteringas B formos ilgis (apie 0,34 nm tarp
bazių), tempimui reikalinga jėga stipriai padidėja (6.28 pav). Didinant tempimo jėgą toliau (jeigu
vienam molekulės galui leidžiame laisvai suktis), pasiekus apie 65 pN jėgą įvyksta pertempimo
fazinis virsmas. Norint toliau ištempti molekulę (maždaug iki 1,7 jos B formos ilgio) reikia labai
mažo jėgos pokyčio.

2001 metais buvo pasiūlytas jėgos indukuoto tirpimo modelis, kuris paaiškino šį fazinį virsmą.
Manoma, kad šis fazinis virsmas atsiranda tada, kai išsivyniojant DNR nutrūksta ryšiai tarp bazių
porų, esančių komplementariose DNR grandinėse. Modelis paaiškino faziniam virsmui
charakteringos jėgos priklausomybes nuo tirpalo rūgštingumo ir temperatūros. Taip pat buvo
parodyta, kad poly(dG–dC)poly(dG–dC) pertempimo faziniam virsmui reikia 30 pN didesnės jėgos
nei poly(dA–dT)poly(dA–dT). Šis rezultatas sutampa su temperatūrų skirtumu šių grandinių tirpimo
procesuose. Jėgos indukuoto tirpimo teorijoje fazinis virsmas yra pusiausvyras. Todėl jėga, kuriai
esant vyksta virsmas, nepriklauso nuo tempimo greičio. Jeigu šis modelis yra teisingas, 6.28 pav.
užbrūkšniuotas plotas atitinka laisvąją „helix–coil“ fazinio virsmo energiją.
 6.28 pav. DNR tempimo eksperimento rezultatai. Pavaizduoti viengrandinės (ssDNR) ir
dvigrandinės (dsDNR) DNR tempimo eksperimentų rezultatai. Užbrūkšniuotas plotas atitinka
fazinio virsmo laisvąją energiją.

Kitas minėto modelio patikrinimas buvo pertempimo faziniam virsmui būdingos jėgos
priklausomybių nuo terpės rūgštingumo matavimas. Kadangi labai didelės ir mažos pH vertės
sumažina dvigrandinės DNR tirpimo temperatūrą, galima buvo tikėtis pertempimo fazinio virsmo
jėgos sumažėjimo. Šis sumažėjimas buvo stebėtas. Gauta entropijos pokyčio fazinio virsmo metu
vertė atitiko vertę, gautą kalorimetrinių matavimų metu. Taip pat buvo matuotos ir temperatūrinės
priklausomybės. Rezultatai atitiko ankstesnių eksperimentų (kurie buvo daryti naudojant AFM)
duomenis. Padidintas tikslumas leido apskaičiuoti laisvąją energiją.
Mikroskopinių objektų sąveikos tyrimas

Lazeriniai pincetai gali būti panaudoti sąveikai tarp mikrometrinio dydžio objektų tirti. Jų naudojimo
pranašumas yra tas, kad galima kontroliuoti daugelį eksperimento parametrų, kurie tyrimuose
„susividurkina“ dėl didelio molekulių ansamblio – tirti dalelių tarpusavio orientaciją, sekti sąveikos
dinamiką. Vienas iš tokių tyrimų pavyzdžių aprašytas 6.29 pav. Tirtas slopiklių, trukdančių virusams
prisikabinti prie ląstelės paviršiaus, efektyvumas.

Stebėtas gripo virusų prisikabinimo prie eritrocitų procesas. Gripo virusui prisikabinti prie eritrocito
reikalingi specifiniai hemagliutino (HA, lektinas) ir N-acetilneuraminato rūgšties (SA, angl. sialic
acid) tankiai ant eritrocito paviršiaus. Reikalingas HA išsidėstymo tankis – 2–3 molekulės/100 nm2,
SA išsidėstymo tankis – 150–200 molekulės/100 nm2 eritrocito paviršiaus. Jeigu tirpale yra
molekulių, kurios turi daug SA funkcinių grupių, jos gali veikti kaip stiprus virusų sąveikos su
eritrocitais slopiklis, neutralizuojantis aktyvias virusų grupes. Daugiavalenčiai polimeriniai
slopikliai, turintys daug SA grupių kaip šoninių grandinių, yra ypač efektyvūs slopikliai. 6.29 pav.
parodytas jų veikimo mechanizmas.

6.29 pav. Viruso prisikabinimo prie ląstelės ir šios reakcijos slopiklių veikimo schema. HA3 –
hemagliutino trimeras (225 000 g/mol, 200–300 vienam virusui),
NA4 – neuraminidazės tetrameras (240 000 g/mol, 20–60 vienam virusui).

Norint tirti šį procesą, anksčiau buvo naudojama vadinamoji hemagliutinacijos slopinimo (HAI)
metodika. Per HAI matavimus eritrocitai, veikiami gravitacijos jėgos, sėda iš tirpalo ant indo dugno
maždaug 5 µm/s greičiu. Sėdimo metu jie susiduria ir (jei nėra slopiklių arba jei jie neefektyvūs)
susikabina su virusais. Tokiu atveju, eritrocitai ant indo dugno sukimba tarpusavyje, susiformuoja
gelis. Jei slopiklių pakanka gelis nesuformuojamas. Šis metodas ribotas, nes parenkama virusų
koncentracija negali būti labai žema – gelis tokiu atveju nesusiformuos. Kita vertus, parinkę didesnę
virusų koncentraciją, negalime išmatuoti mažesnių slopiklio koncentracijų veikimo efektyvumo.
Visos slopiklio molekulės yra surišamos (nepaisant jų veikimo efektyvumo), o likę virusai sudaro
kompleksus su eritrocitais. Ribinė slopiklio koncentracija yra maždaug 1 nmol/l.

Labai efektyvioms medžiagoms (kurių ir mažos koncentracijos smarkiai slopina reakciją) šis metodas
matuoti netinka.

6.30 pav. OPTCOL eksperimento principas. Mikrosfera atsiskiria nuo eritrocito jeigu slopiklio
koncentracija maža. Mikrosfera prikimba prie eritrocito jeigu slopiklio koncentracija gana didelė.

Aprašomame tyrime (principas parodytas 6.30 pav., schema – 6.31 pav.) virusais buvo padengta 5
µm mikrosfera. Matuota jos susikabinimo su eritrocitu tikimybė. Matavimo metu mikrosfera ir
eritrocitas buvo traukiami vienas kito atžvilgiu 5 µm/s greičiu (standartinis HAI matavimams). Net ir
esant didžiausiai naudotai lazerio galiai (500 mW), atplėšti eritrocito nuo virusais padengtos sferos
buvo neįmanoma. Taip pat buvo atlikti papildomi testai, kurie akivaizdžiai parodė, kad sąveiką lemia
būtent HA–SA reakcija. Šis metodas leidžia prikibimo tikimybę matuoti ir kai slopiklių koncentracija
labai maža, o efektyvumas labai didelis. Paties efektyviausio matuoto slopiklio ribinė koncentracija
buvo 35 pmol/l. Tačiau manoma, kad tai irgi nėra žemiausia riba. Manoma, kad metodas galėtų veikti
iki maždaug 25 fmol/l koncentracijų.
 6.31 pav. OPTCOL eksperimento schema

Aprašyta metodika gali būti naudojama tirti adhezijai tarp įvairių biologinių (ląstelių, bakterijų,
virusų, ribosomų, liposomų, mikrosferų, padengtų biologiniais objektais) ir nebiologinių objektų
(magnetinių dalelių, koloidinių dalelių, kristalų).

Naudojant tą pačią optinių pincetų įrangą buvo tyrinėta antigeno ir antikūno adhezijos/disociacijos
(dėl Brauno judesių) tikimybė esant skirtingam tarpusavio ryšių kiekiui. Gautasis rezultatas – esant
keliems ryšiams charakteringas disociacijos laikas yra mažesnis nei esant vienam. Tai paaiškinama
tuo, kad susidarius keliems ryšiams atsiranda papildomų įtempimų, todėl ryšiai labai susilpnėja.
Eksperimento rezultatai ir prielaidos parodyti 6.32 pav.
6.32 pav. Antikūno ir antigeno komplekso disociacijos dėl Brauno judesių matavimai. Kairėje:
disociacijos laikų skirstiniai kai suformuotas a) vienas ryšys; b) keli ryšiai; c) keli ryšiai, ligandai gali
laisvai sukiotis mikrosferos atžvilgiu. Dešinėje: parodyti b) ir c) atvejai.

Cheminių reakcijų mažuose tūriuose kontroliavimas

Ląstelėje cheminės reakcijos vyksta mažame tūryje, paprastai reaguoja pakankamai mažas skaičius
molekulių. Norint modeliuoti ląstelės sąlygas, vykdyti chemines reakcijas mažuose tūriuose
naudojamos specialios talpos. Jose yra nuo piko- iki femtolitrų reagentų tūriai. Vienas galimas tokios
talpos variantas – liposomos kaip cheminių medžiagų konteineriai. Tam, kad vyktų reakcija dvi
liposomos priartinamos ir suliejamos destabilizuojant jų membranas elektrinio lauko impulsu.
Naudojant lazerinius pincetus liposomomis patogu manipuliuoti. Be to, suliejimas gali būti
inicijuojamas trumpu gerai fokusuotu UV lazerio impulsu (eksperimento schema parodyta 6.33 pav.).
Taip membrana suardoma tik lokaliai. Vadinasi, galime garantuoti, kad viduje esančios cheminės
medžiagos nedifunduoja į aplinką. Tai svarbu, norint užtikrinti reikiamas reaguojančių medžiagų
koncentracijas. Tuo tarpu, destabilizavus visą liposomą, yra labai tikėtina medžiagų difuzija į aplinką.
Kai kuriuose darbuose bandoma lipidinį bisluoksnį pakeisti polimeru. Vietoje liposomų naudojamos
„polimerosomos“. Teigiama, kad taip stipriai sumažinamas difuzijos per sienelę greitis.
6.33 pav. a) dvi liposomos su skirtingais reagentais; b) jos suartinamos manipuliuojant lazeriniais
pincetais; c) trumpas UV lazerio impulsas suardo vidinę sienelę; d) membrana atsikuria, sudarydama
vieną didelę liposomą.

Aktino ir miozino sąveikos tyrimai

Gerai žinoma, kad ATP yra energijos šaltinis daugelyje biocheminių procesų. ATP hidrolizė
reikalinga ir jėgos generavime miozinui keičiant savo konformaciją. Šio proceso kinetika buvo
intensyviai studijuota. Pastaruoju metu naudojami lazeriniai pincetai. 6.34 pav. parodyta, kaip
matuota jėga, kuria miozinas veikia aktino siūlą. Reikia paminėti, kad 6.34 pav. yra pateikiama ne
buvusio, bet dar hipotetinio eksperimento schema. Tačiau jis tinka iliustracijai. Nuo buvusių
eksperimentų jis skiriasi tuo, kad padėklas (ant kurio yra miozinas) apšviečiamas iš apačios taip, jog
būtų pasiektas visiškas vidaus atspindys. Tokiu būdu prie paviršiaus yra artimasis laukas, kuris
naudojamas ATP (ATP su fluoroforais) fluorescencijai nustatyti. Tai įgalina stebėti koreliacijas tarp
ATP „atėjimo“ ir mechaninės jėgos generavimo. Tikimasi nustatyti, kiek ATP sunaudojama vienam
mechaniniam žingsniui, kurioje biocheminio proceso fazėje generuojama jėga, kaip šiuo atžvilgiu
skiriasi mutantiniai ir ne raumenyse esantys miozinai.

6.34 pav. Aktino ir miozino sąveikos tyrimų schema. Miozinas – ant padėklo, iš apačios krinta ir
visiškai atsispindi šviesa. Pavaizduotas aktino siūlas, kurį eksperimente laiko optiniai pincetai.
6.4. Molekulinės fizikos metodai

Chromatografija

Chromatografija apima laboratorinius metodus, kurie naudojami siekiant medžiagų mišinį išskirstyti
į pavienius komponentus. Biotechnologijoje dažniausiai naudojama biomolekulių tirpalų
chromatografija, nors kartais taikoma ir dujų chromatografija. Medžiagų mišinio tirpalui (judriąjai
fazei) leidžiant tekėti per tam tikrą terpę (stacionariąją, nejudriąją fazę) vienos molekulės stipriau
sąveikauja su šia terpe ir užlaikomos ilgiau, kitos sąveikauja silpniau ir užlaikomos trumpiau. Todėl
skirtingų medžiagų tekėjimo greičiai chromatografinėje kolonėlėje skiriasi (6.35 pav.). Ištekantis
tirpalas yra surenkamas mažomis frakcijomis: pirmosiose frakcijose daugiausia bus greitai
pratekančių molekulių, o vėlesnėse bus daugiau „lėtųjų“ molekulių. Taip išskirstomos tirpalo
sudedamosios medžiagos.

Nors pats chromatografijos principas yra paprastas, norint pasiekti aukštos kokybės ir didelio našumo
procesą yra naudojami brangūs automatizuoti prietaisai. Tai svarbu, nes dažnai tenka iš didelės
įvairovės ląstelės biomolekulių mišinio (žmogaus organizme priskaičiuojama iki 100 000 skirtingų
baltymų) reikia išskirti vieną (ir tik vieną...) komponentą. Negana to, jo koncentracija būna keliomis
eilėmis mažesnė, palyginus su kitų tirpalo medžiagų koncentracijomis.

6.35 pav. Kairėje: adsorbcinės chromatografijos principas;

Dešinėje: automatizuoto chromatografo veikimo schema.

Biotechnologijoje pasitelkiami įvairūs fizikocheminiai principai, kuriais remiantis tiriamosios

medžiagos sąveikauja su nejudriaja faze ir pagal kuriuos skirstomi chromatografijos metodai (6.36
pav.).

Pagrindiniai chromatografijos metodai yra:

 Adsorbcinė chromatografija. Ji pagrįsta skirtinga mišinio sudedamųjų dalių adsorbcija

pasirinktoje stacionarioje terpėje. Kaip adsorbentai naudojamos iki tam tikro laipsnio
susmulkintos kietos medžiagos.

 Gelchromatografija. Jos metu molekulės atskiriamos pagal dydį ar formą sieto principu,
leidžiant joms tekėti pro porėtus nešiklius. Nejudriąją fazę sudaro poliakrilamido gelis,
 agarozė, silikagelis ar kt. Smulkios molekulės įkliūna į smulkias poras ir kurį laiką
užlaikomos, o stambesnės molekulės į jas netelpa ir todėl prateka greičiau.

 Pasiskirstymo chromatografija. Jos judrioji ir nejudrioji fazės sudarytos iš dviejų

nesimaišančių (ar sunkiai besimaišančių) tirpalų. Tokioje sistemoje medžiaga bus labiau tirpi
viename iš tirpiklių ir pereis iš vienos fazės į kitą. Nusistovėjus pusiausvyrai aukštesnė
medžiagos koncentracija bus tame tirpiklyje, kuriame medžiaga pasižymi didesniu tirpumu.
Kuo medžiaga giminingesnė nejudriajai fazei (t. y. jos tirpumas šioje fazėje didesnis), tuo ji
lėčiau juda išilgai kolonėlės ar plokštelės. Dažniausiai viena iš fazių yra organinis tirpiklis, o
kitą fazę sudaro vandeninis tirpalas (paprastai tai nejudrioji fazė). Šiuo atveju, medžiagų
frakcionavimas vyksta priklausomai nuo mišinio sandų hidrofobiškumo.

 Atvirkštinių fazių chromatografija. Jos metu fazės yra „atvirkščios“, nes prie kietos matricos
yra fiksuojama organinio tirpiklio plėvelė, o judriąją fazę sudaro vandeninis tirpalas.

 Afininė chromatografija. Ji pagrįsta selektyvia konkrečios medžiagos sąveika su specialiai

modifikuotu nejudriosios fazės paviršiumi. Dažniausiai naudojama selektyvi antikūno ir
antigeno sąveika (imunoafiniškumas) arba metalų chelatinis afiniškumas tam tikroms
aminorūgščių sekoms. Pratekėjus neprisitvirtinusioms medžiagoms, prie nejudriosios fazės
lieka tik selektyviai prisijungusios molekulės. Šios prikibusios molekulės vėliau išplaunamos
iš kolonėlės naudojant kito pH ar kitos druskų koncentracijos tirpalą, o norima medžiaga
surenkama į atskirą frakciją. Afininės chromatografijos metodas leidžia atskirti labai panašias
medžiagas (baltymus su tokiu pat krūviu, dydžiu, hidrofobiškumu) netgi esant itin mažai jų
koncentracijai.

 Jonų mainų chromatografija. Ji pagrįsta skirtinga įvairių medžiagų jonizacija. Dėl įvairios
jonizacijos įvairios mišinio molekulės skirtingai sąveikauja su elektrostatiškai įkrautu
stacionarios terpės paviršiumi (jonitais). Pavyzdžiui, kaip nejudriąją fazę naudojant neigiamai
įkrautus jonitus, teigiamą krūvį turintys peptidai sąveikaus su jonitais ir todėl bus ilgiau
užlaikomi kolonėlėje. Priešingai, neigiami peptidai bus stipriau veikiami paviršiaus stūmos
jėgų ir iš kolonėlės ištekės pirmiau.
 6.36 pav. Kai kurios biomolekulėms gryninti naudojamos chromatografijos rūšys

Aptarti chromatografijos metodai yra vienmačiai. Juos naudojant molekulės yra išskirstomos tik
pagal vieną savybę (dydį, krūvį, afiniškumą ar kt.). Tačiau turint realų biologinį tirpalą, kuriame yra
daugybė įvairių tyrėjo nedominančių medžiagų, kartais reikia papildomo (bei dar aukštesnės
kokybės) medžiagų išgryninimo. Tam gali būti taikoma daugiamatė skysčių chromatografija (DMSC).
Ji turi daug privalumų išskirstant kompleksinius baltymų (ypač suskaidytų proteolitiniais fermentais)
tirpalus: DMSC yra lengvai automatizuojama, pasižymi geru atsikartojamumu, skirstymas vyksta skystoje
fazėje, analitės nėra „užrakinamos“ gelyje. DMSC labai tinka hidrofobinių, rūgštinių, bazinių, labai mažų
(labai didelių) ir negausių baltymų išskirstymui, kuriuos būtų sunku analizuoti kitais tradiciniais metodais.
DMSC chromatografijos metu tirpalo komponentės iš pradžių išskirstomos vienu metodu (pvz. jonų
mainų chromatografija), o surinktos frakcijos vėliau išskirstomos kitu metodu (pvz. atvirkštinių fazių
chromatografija).

Izoterminio titravimo kalorimetrija

Vienas svarbiausių biochemijos tikslų yra suprasti molekulinius baltymų ir ligandų sąveikos
reiškinius. Baltymai gali specifiškai atpažinti ir grįžtamai prisijungti bet kurio tipo molekules. Šios
molekulės – mažamolekuliniai ligandai (jonai, lipidai, angliavandeniai), makromolekulės (baltymai,
DNR) ar net makromolekulių kompleksai. Būtent dėl biomolekulių sąveikos specifiškumo jaučiame
skonį, kvapą, ląstelės geba atpažinti viena kitai perduodamus signalus ir juos „iššifruoti“.

Dviejų molekulių sąveikos specifiškumas dar vadinamas giminingumu (arba afiniškumu). Siekiant
kiekybiškai įvertinti dviejų molekulių A ir B giminingumą (įvertinti, kiek patvarus yra jų
suformuojamas kompleksas), naudojama jungimosi pusiausvyros asociacijos konstanta KA (6.37
pav.).
 (6.13)

6.37 pav. Reakcijos pusiausvyros asociacijos konstantos KA formulė (6.13). [A] ir [B] – reakcijos
produktų koncentracijos; [C] – susidariusio komplekso koncentracija; a, b, c – reakcijos koeficientai,
kurie parodo reakcijos stechiometriją.

Kuo KA konstanta didesnė, tuo reakcijos pusiausvyra yra labiau paslinkta į dešinę – tuo stipriau
sąveikauja A ir B molekulės ir tuo stabilesnis reakcijos produktas. Ir priešingai: kuo KA mažesnė, tuo
pradinės medžiagos jungiasi silpniau. Kai kurios reakcijos yra itin specifiškos. Pavyzdžiui, kai kurie
baltymai sąveikauja tik su vienu konkrečiu ligandu ir net menkiausias jo molekulinės struktūros
pokytis gali pakeisti sąveikos stiprumą tūkstančius kartų.

Nuodingosios medžiagos α-bungarotoksino sąveika su raumeninių skaidulų acetilcholino

receptoriumi KA gali siekti 1012 M-1. Tuo tarpu natūralaus šio receptoriaus ligando – acetilcholino,
kuris prisijungęs perduoda signalą susitraukti raumens skaidulai, KA yra 107 M-1. Tokiu būdu,
nuodingoji medžiaga daug stipriau (5 eilėmis) sąveikauja su receptoriaus aktyviaisiais centrais, juos
„užkemša“. Acetilcholinas tiesiog nebegali prisijungti prie receptoriaus, nes didžioji dalis aktyviųjų
centrų jau užimti toksino. Todėl raumuo negali susitraukti ir sukeliamas paralyžius.

Siekiant nustatyti reakcijos KA iš visų termodinaminių parametrų eksperimentiškai matuojama

reakcijos metu išsiskyrusi (ar sunaudota) energija6 (6.14). Jos pokytis nustatomas baltymui pereinant
iš laisvos (ligandas neprijungtas) į susijungusią su ligandu būseną. Šiuo metu populiariausias ir
lengviausiai atliekamas yra izoterminio titravimo kalorimetrijos metodas. Tačiau energijos pokytis
vyksta visų cheminių reakcijų metu, todėl kalorimetriniai matavimai yra universalūs (ir taikomi ne
tik baltymams).

Atsižvelgiant į šilumos matavimo pobūdį, kalorimetrai gali būti suskirstyti į tris pagrindines grupes:

 Adiabatiniai;
 Šiluminio laidumo;
 Galios kompensacijos.

Trumpai aptarsime kalorimetrinio matavimo principą.

6
Eksperimento metu yra matuojamas sistemos entalpijos pokytis ΔH: ΔH= ΔU + pV (6.14). Esant pastoviam slėgiui ir
sistemai neatliekant darbo, šios sistemos entalpijos pokytis lygus vidinės energijos pokyčiui ΔU arba išsiskyrusio šilumos
kiekio Q pokyčiui: ΔH = ΔQ. Paprastumo dėlei, tekste taikome ne entalpijos, o energijos sąvoką.
 6.38 pav. Kalorimetrinio matavimo principas: (a) kalorimetro sandaros schema;
(b) kompensacinio šildymo galios kitimo kreivė;
(c) integruoti baltymo–ligando sąveikos duomenys.

Kalorimetrą sudaro dvi kiuvetės, kurių vienoje yra reakcijoje dalyvaujanti makromolekulė
(baltymas), o kita yra atraminė – joje yra tik tirpiklis. Eksperimento metu yra matuojamas
temperatūrų skirtumas tarp kiuvečių bei skirtumas tarp aplinkos ir matuojamos kiuvetės.
Grįžtamuoju ryšiu mėginio kiuvetė yra arba šildoma arba šaldoma (kad būtų palaikoma pastovi
kiuvetės temperatūra). Temperatūros matavimui naudojamos termopilės – įrenginiai, kurie šilumos
energiją verčia elektros srove. Temperatūros reguliavimui pasitelkiami Peltjė elementai, kurie
priklausomai nuo elektros srovės stiprumo proporcingai šildo ar šaldo kiuvetę.

Nusistovėjus pastoviai kiuvetės temperatūrai pradedamas mėginio titravimas ligandu. Sureagavęs

ligando kiekis yra tiesiogiai proporcingas reakcijos metu išsiskyrusiam (sunaudotam) šilumos
kiekiui. Todėl kiuvetė yra šaldoma (šildoma) siekiant kompensuoti atsiradusį temperatūros pokytį.
Šildymo galios kitimo kreivė (6.38 pav., b) yra registruojama viso eksperimento metu. Pagal ją
vėliau apskaičiuojama išsiskyrusios energijos priklausomybė nuo ligando koncentracijos (6.38 pav.,
c). Kuo ši kreivė statesnė, tuo greičiau pasiekiamas įsisotinimas ir tuo didesnis ligando
giminingumas baltymui (didesnė KA). Iš gautų duomenų galima apskaičiuoti kelis reakcijos
termodinaminius parametrus, kurie charakterizuoja baltymo–ligando sąveiką: jungimosi konstantą,
stechiometriją (keliose baltymo vietose jungiasi ligandas), entalpijos ir entropijos pokyčius.

Difuziniai metodai biomolekulių tyrimams

Dinaminės sklaidos (DS) metodas

Dinaminės sklaidos matavimas dažniausias atliekamas siekiant nustatyti molekulių, polimerinių ar

kitų dalelių dydį tirpale. Metodas remiasi tirpalo išsklaidytos šviesos intensyvumo matavimu (6.39
pav.). Lazerio spinduliuotė yra sufokusuojama lęšiais į mažą tirpalo tūrį. Dėl molekulių
netaisyklingo judėjimo tirpale (Brauno judėjimo) šiame tūryje esančių molekulių kiekis nuolat kinta
– jos nuolatos „įplaukia“ ir „išplaukia“ iš matuojamos zonos ribų. Šviesa atsispindi nuo kiekvienos
dalelės visomis kryptimis. Kelių dalelių tuo pačiu kampu išskaidyti spinduliai interferuoja
tarpusavyje. Spindulių intensyvumai gali arba sumuotis (konstruktyvi interferencija) arba slopinti
vienas kitą (destruktyvi interferencija). Atitinkamai kinta ir detektoriumi fiksuotu kampu
registruojamas sklaidos intensyvumas. Toks dalelių difuzinis judėjimas priklauso nuo tirpalo tūrio,
klampos ir dalelių dydžio. Nuo dalelių judėjimo greičio priklauso detektuojamo signalo kitimo
greitis. Didesnės dalelės juda lėčiau, todėl signalo kitimas bus lėtesnis.

6.39 pav. Dalelių dydžio nustatymas dinaminės sklaidos metodu

Iš užregistruoto signalo matematiškai yra išskaičiuojamas santykinis dalelių dydis. Iš pradžių

apskaičiuojama autokoreliacijos funkcija g2(τ) (6.15).

6.40 pav. Autokoreliacijos funkcija (6.15) ir jos priklausomybė nuo laiko τ

Autokoreliacijos funkcija parodo, kaip signalas koreliuoja (sutampa pats su savimi) laike. Ši
funkcija matematikoje dažnai taikoma ieškant signalo kitimo dėsningumų, aptinkant periodinį
signalą stipraus triukšmo fone. Esant gretimiems signalo I(t) taškams (kai τ mažas) ši funkcija turės
didesnę vertę (6.40 pav.), o tolesnių signalo taškų (didinant τ) funkcija – mažesnes vertes.

Taip yra todėl, kad per trumpą laiko tarpą dalelė nespėja išplaukti iš matuojamo ploto ir signalas
stipriai nepakinta, o ilgėjant laikui signalas vis silpnėja. Iš autokoreliacijos funkcijos mažėjimo yra
išskaičiuojamas medžiagos difuzijos koeficientas. Jis tiesiogiai priklauso nuo dalelės dydžio.
Fluorescencinė koreliacinė spektroskopija

Fluorescencinė koreliacinė spektroskopija (FKS) suteikia informacijos apie dalelių difuziją, jų dydį,
cheminės reakcijos greitį (kinetiką), molekulių agregaciją ir panašius procesus. Šie parametrai
svarbūs tiriant baltymų savybes ir jų tarpusavio sąveikas. Metodo principas remiasi fluorescencijos
reiškiniu – medžiagų gebėjimu sugėrus šviesos kvantą išspinduliuoti kitos (mažesnės) energijos
fotoną. Tokiu būdu, apšvietę kelių medžiagų tirpalą atitinkama spinduliuote, stebėsime tik vieno tipo
molekulių fluorescenciją (antrinį švytėjimą) – tų molekulių, kurioms ši savybė būdinga. Šis metodas
pasižymi selektyvumu, kurio neturi anksčiau aptartas dinaminės sklaidos metodas.

6.41 pav. Fluorescencinės koreliacinės spektroskopijos matavimo principas

FKS metu lazerio spinduliuotė suvedama į mažą tirpalo tūrį, iš kurio registruojamas fluorescencijos
intensyvumas (6.41 pav.). Detektuojamas signalas nėra pastovus. Jis kinta laike dėl dviejų pagrindinių
priežasčių: molekulių Brauno judėjimo ir fluorescencijos kvantinio našumo fliuktuacijų, kurios
vyksta dėl cheminės reakcijos. Panašiai kaip DS atveju, iš signalo fliuktuacijų yra apskaičiuojama
autokoreliacijos funkcija (6.15) ir kiti matematiniai parametrai. Iš jų galiausiai gaunamos svarbios
fizikocheminės konstantos – difuzijos koeficientas, koncentracija ar molekulės dydis. Molekulių
kiekio pokyčiai gali suteikti informacijos apie tirpale vykstančią disociaciją ar asociaciją (t. y.
vykstančią biocheminę reakciją arba agregatų susidarymą). Šis metodas gali būti įdiegiamas kaip
mikroskopijos papildinys ir taip matuoti minėtas charakteristikas gyvose ląstelėse. Tai ypač aktualu
biotechnologiniuose tyrimuose.

Jeigu fluorescencijos intensyvumas bus matuojamas ne viename fiksuotame taške, o bus skenuojamas
tam tikras bandinio plotas (ląstelės, augančios ant paviršiaus), gausime tam tikrą FKS vaizdą. Jame
bus informacija apie plokštuminį (ar erdvinį) fluorescencijos fliuktuacijų pasiskirstymą bandinyje.
Iš gautų duomenų išskaičiuojamas dominantis parametras – baltymo susijungimas su ligandu ar kitas
parametras (6.42 pav.). Taip galime sužinoti, kurioje vietoje ląstelėje mus dominantis baltymas yra
susijungęs su ligandu – kurioje ląstelės vietoje vyksta tiriamoji reakcija.
 6.42 pav. Skenuojanti fluorescencinė koreliacinė spektroskopija. Skenuojant pataškiui (kairėje)
gaunama informacija apie Pax-EGFP baltymą gyvose ląstelėse – jo lokalizaciją ląstelėse ir būseną
(susijungęs su ligandu arba laisvas).

Mikrofluidika

Dabartiniai biotechnologiniai metodai gali būti ženkliai patobulinami, o jų efektyvumas dar

padidinamas sumažinus laboratoriją iki mikrometrinių matmenų. Toks fantasmagorinis procesas jau
yra prasidėjęs. Pastaruoju metu, sparčiai tobulėjant mikrotechnologijoms įvairūs baltymų ar kitų
biomolekulių analizės metodai sutalpinami monetos dydžio lustuose (6.43 pav.).

6.43 pav. Mikrofluidinis chemostatas, naudojamas mikroorganizmų augimui tirti. Prietaisas

sudarytas iš daugybės mikrovamzdelių, vožtuvų ir pompų, kurios užtikrina tikslų ir pastovų tirpalų
bei dujų tiekimą.
Mikrolustų laboratorijos (angl. lab on chip) praplečia įprastines biotechnologijas keliais aspektais:
 Sumažinamos sąnaudos, kurios yra labai aktualios turint mažus analizuojamų brangių
medžiagų kiekius;

 Mikroskalėje galima kur kas tiksliau valdyti skysčių ir dujų srautus, atlikti pavienių
molekulių analizę;

 Kuriami mikrojutikliai ir injektoriai, kuriuos galima implantuoti po oda ir panaudoti

medicinoje.

Vienas iš galimų mikrolustų taikymų yra DNR analizė. Įsivaizduokite, kad iš vieno kraujo lašo
galėtume diagnozuoti ligą ar nustatyti paciento būklę neišeidami iš namų, neimdami kraujo iš venos
ir nenaudodami brangių laboratorijos žmogiškųjų bei technologinių išteklių. 6.44 pav. pavaizduota
principinė DNR analizę atliekančio mikrolusto schema. Vienas kraujo lašelis užlašinamas ant kelių
lygiagrečių kapiliarų, kuriais pompos varinėja tirpalus. Mikrokamerose atliekamas biocheminis
medžiagos apdorojimas: padauginama DNR medžiaga, molekulės suskaidomos reikiamais
fragmentais ir pan. Galutinis tirpalas leidžiamas per fluorescencinės analizės skyrių. Jame DNR
fragmentai išskirstomi pagal dydį ar kitą savybę ir fluorescenciniu skeneriu nuskaitoma DNR sudėtis.
Mikrolustas atlieka gautų duomenų analizę ir pateikia išvadas apie pradinio mėginio sudėtį.

6.44 pav. DNR analizę atliekančio mikrolusto veikimo principas

Mikrofluidinės sistemos padeda pagreitinti kai kurias laboratorines procedūras. DNR hibridizacija,
kuri yra naudojama genų ekspresijos tyrimuose (jie parodo, kurie genai tuo metu yra aktyvūs ir kurie
neveiklūs) įprastinėmis sąlygomis trunka kelias valandas. Mikroluste hibridizacijos reakcija gali
įvykti per daug trumpesnį laiką.

Aptarsime kelis fizikinius procesus, kuriais remiantis valdomi tirpalai mikrolustuose. Viena iš dažnų
užduočių – suskaidyti lašą į du smulkesnius. Tai daroma norint išskaidyti tirpalą į dvi porcijas arba
sumažinti tiriamojo tirpalo tūrį. Pateikiamas pavyzdys (6.45 pav. A), kaip pasitelkiant skirtingus
paviršius galima „perpjauti“ lašą.
Hidrofilinių paviršių elektrodai yra įjungti, todėl kapiliarinės ir elektrostatinės jėgos traukia lašą į
priešingas puses. Per vidurį esantis elektrodas yra išjungtas, jo hidrofobinis paviršius atstumia
vandenį. Taip lašas suskaidomas į du mažesnius. Kapiliarinės jėgos taip pat labai svarbios valdant
skysčio tekėjimą. Jeigu skystis patenka ant paviršiaus, kuris nėra visur vienodai drėkinamas, jis tekės
link didesnio drėkinimo (6.45 pav. B).

Dažnai reikia keisti ir tekančio tirpalo tūrį. Tai galima nesudėtingai padaryti tiesiog keičiant tekėjimo
kapiliaro plotį (6.45 pav. C). Lėtas tekėjimas svarbus ten, kur vyksta baltymų biocheminės reakcijos
(specialiai modifikuotai paviršiai). Tokių reakcijų našumas labai priklauso nuo paviršiaus ploto, todėl
stengiamai jį padaryti kuo didesnį. Siekiant išgryninti tam tikrą medžiagą iš medžiagų mišinio arba
padidinti jos koncentraciją, galima pasinaudoti dviem nesimaišančiais skysčiais, kurie teka
lygiagrečiais kapiliarais ir tam tikroje srityje yra sujungti skersiniais kapiliarais (6.45 pav. D). Esant
tokiai sistemai, molekulės gali pereiti iš vieno tirpalo į kitą. Molekulė pereis į tą tirpalą, kuriame ji
yra labiau tirpi ar turi kokį nors afiniškumą (panašiai kaip pasiskirstymo chromatografijoje).
Reguliuojant šių dviejų skysčių tekėjimo greičius galima kontroliuoti pratekančių molekulių kiekį,
gauti norimą koncentraciją ir pan.

6.45 pav. Tirpalų tekėjimo valdymas mikrofluidinėse sistemose. A) Tirpalo lašo perskyrimas
kapiliarinėmis ir elektrostatinėmis jėgomis; B) Tekėjimo krypties valdymas naudojant paviršiaus
drėkinimo gradientą; C) Tekėjimo greičio keitimas, didinant pratekančio tirpalo plotą,
sąveikaujančio paviršiaus ploto didinimas; D) Makromolekulių gryninimas ir išskyrimas naudojant
nesimaišančius tirpalus.

6.5. Proteominiai analizės metodai: elektroforezė ir masės spektrometrija

Elektroforezės principas

Elektroforezė – metodas biomolekulėms atskirti laidžiojoje terpėje panaudojant jų skirtingą judrumą

elektriniame lauke. Baltymai dėl juos sudarančių aminorūgščių yra amfoteriniai elektrolitai. Jie,
priklausomai nuo tirpalo pH, gali būti anijonai arba katijonai. Biomolekulės turinčios skirtingus (ar
skirtingo dydžio) krūvius judės skirtingomis kryptimis arba skirtingu greičiu link priešingą krūvį
turinčių elektrodų.

Panagrinėkime šį procesą detaliau. Tarkime, elektrinis laukas E veikia biomolekulę jėga F = qE.
Pagal Stoksą, trinties jėga f = qE. Elektroforetinis biomolekulių judrumas u = v/E. Pasinaudoję
šiomis formulėmis, galime gauti biomolekulių judrumą u:

v q
u=  (6.16)
E f

Įskaičiavę tirpalo, kuriame juda biomolekulė, klampą  ir pačios biomolekulės geometriją

(spindulys r), galime (6.16) formulę perrašyti. Tuomet biomolekulių judrumas užrašomas:
 qE
u (6.17), kur q – biomolekulės krūvis, E – biomolekulę veikiantis elektrinis laukas,
6 r
 – terpės klampa, r – biomolekulės spindulys.

Biomolekulių judrumo nustatymas difuzijos būdu yra netikslus. Jos „velka“ paskui save priešingo
ženklo daleles – keičiasi efektyvus biomolekulės tūris, be to, kintant greičiui kinta ir jos forma.
Judrumas priklauso ne tik nuo biomolekulės dydžio, bet ir nuo tirpiklio, kuriame šios biomolekulės
yra. Tirpalo pH taip pat daro ženklią įtaką baltymų krūviui.

Esant skirtingam biomolekulių krūviui, masei ir formai, jų greitis elektriniame lauke skirsis. Taip
galima atskirti skirtingus baltymus ar kitas biomolekules. Baltymai ir DNR molekulės dažniausiai
frakcionuojami poliakrilamidiniuose geliuose. Molekulių judrumas tokiuose geliuose priklauso nuo
elektrinio lauko stiprumo ir gelio porų dydžio. Principinė elektroforezės schema pavaizduota 6.46
pav.

6.46 pav. Principinė elektroforezės schema

Elektroforezė būna horizontali ir vertikali, plokštelinė ir cilindrinė. Taip pat elektroforezė būna
vienkryptė ir dvikryptė. Atliekant dvikryptę elektroforezę, galima sužinoti ne tik biomolekulės dydį,
bet ir jos krūvį. Elektroforezės būdu išfrakcionuotus biomolekulių mišinius galima specifiškai dažyti
histocheminiais metodais. Taip išvengiama papildomo tiriamos medžiagos gryninimo, kas labai
palengvina tiriamąjį darbą.

6.47 pav. Kraujo serumo baltymų elektroforetinis spektras

(mėlynai nudažyti skirtingos molekulinės masės baltymai)

Masių spektrometrija

Baltymų masių spektrometrija – tai populiarėjantis didelio tikslumo nežinomų baltymų atpažinimo
metodas. Masių spektrometrai yra analitinė įranga medžiagų masei matuoti. Šiuo metodu
nustatomas medžiagos jonų masės (m) ir jų krūvio (z) santykis. Masės spektras – tai dalelių
išskirstymas pagal jų jonų krūvį ir masę. Didelių biomolekulių masė masės spektrometrijos (MS)
metodu gali būti išmatuota 0,01 proc. tikslumu, mažų organinių molekulių masė nustatoma 0,00005
proc. tikslumu.

Masės spektrometras sudarytas iš trijų pagrindinių dalių: jonizacijos šaltinio, analizatoriaus ir

detektoriaus (6.48 pav.). Tiriama medžiaga patalpinama prietaiso jonizacijos šaltinyje, kur
molekulės yra jonizuojamos ir suardomos į fragmentus. Toliau gauti fragmentų jonai siunčiami į
masės spektrometro analizatoriaus sritį, kur jie yra atskiriami pagal masės (m) ir krūvio (z) santykį
(m/z). Atskirti jonai (tik jonai, ne neutralūs fragmentai) registruojami, o gautas signalas siunčiamas į
duomenų sistemą, kur duomenys yra saugomi. Gauti duomenys gali būti pateikiami kaip m/z
spektrai. Iš spektro duomenų galima nustatyti sandų skaičių, kiekvieno sando molekulinę masę,
įvairių sandų santykinį dažnį mėginyje.

6.48 pav. Masių spektrometro principinė schema

Jonizuojant mėginius (M), kurių molekulinė masė yra didesnė nei 1200 Da, susidaro įvairūs,
skirtingai įkrauti molekuliniai jonai (M+nH)n+ arba (M-nH)n-. Baltymuose gali protonizuotis visi
amidinio azoto atomai, šoninių grandinių lizino ir arginino liekanos. 6.49 pav. pateikiamas baltymo
lizocimo ESI-MS spektro pavyzdys. Kiekviena smailė spektre atitinka baltymo molekulę, turinčią
skirtingą krūvį.

6.49 pav. Teigiamos jonizacijos baltymo lizocimo ESI masių spektras

(pagal http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/Mstut/mstutorial.htm)

Taikoma formulė m/z = (Mm + nH+)/n (6.18)

Iš spektro duomenų galima gana lengvai apskaičiuoti tiriamo baltymo molekulinę masę, jeigu jonų
krūvis yra žinomas. Tačiau dažniausiai jonų krūviai yra nežinomi. Jie gali būti apskaičiuoti padarius
prielaidą, kad gretimų jonų krūvis skiriasi vienetu. Tarkime, kad jono ties m/z(1431,6) krūvis yra
„n“, tai jono ties m/z(1301,4) krūvis bus „n+1“.

Tuomet galima užrašyti dvi lygtis:

1431,6 = (Mm + nH+) / n; (6.19)

1301,4 = [(Mm + (n + 1) H+)] / (n + 1) (6.20)

Pertvarkę lygtis ir atlikę skaičiavimus gauname, kad jonų krūvis ties m/z(1431,2) = 10.

Įrašę gautąją n reikšmę į lygtį 1431,6 = (Mm + nH+) / n, gauname, kad Mm = 14 305,9 Da.

Šie skaičiavimai atrodo sudėtingi, tačiau molekulinės masės gali būti apskaičiuotos automatiškai,
prijungus prie masės spektrometro tam tikrą programinę įrangą.
Elektroporacija

Plazminė membrana – ląstelės dengiamasis sluoksnis, kurio pagrindinė funkcija yra atskirti
citoplazmą nuo ląstelę supančios aplinkos ir reguliuoti molekulių srautą į ląstelės išorę ir vidų.
Plazminė membrana sudaryta daugiausiai iš fosfolipidų dvisluoksnio. Fosfolipidus sudaro
hidrofilinės „galvutės“ ir hidrofobinės „uodegėlės“. Tokia membrana yra iš esmės nelaidi
hidrofilinėms medžiagoms.

Jau XX a. penktajame dešimtmetyje Goldmanas ir kt. nustatė, kad ląstelių membranos yra jautrios
elektrinio lauko poveikiui. Veikiant ją trumpais ir intensyviais elektriniais impulsais, plazminėje
membranoje susidaro mikroporos. Dėl jų susidarymo galima padidinti plazminės membranos
pralaidumą jonams ir įvairioms molekulėms, kurios įprastinėmis sąlygomis negali arba sunkiai
prasiskverbia į ląstelės vidų (baltymams, DNR, vaistams ir kt.).

Elektroporacija (arba elektropermeabilizacija) – tai fizikinis metodas, kurio metu ląstelės

paveikiamos trumpais (nuo ns iki ms) ir galingais (iki 100 kV/cm) elektrinio lauko impulsais. Ląstelės
plazminė membrana transformuojasi, joje susiformuoja pralaidžios struktūros – hidrofilinės poros.
Pora – tai membranos struktūros konformacinis pakitimas, sukuriantis vandeninę terpę tarp ląstelės
vidaus ir išorės. Per susidariusias poras į ląstelės vidų patenka minėtos molekulės.

Elektroporacijos veikimo principas

Įprastinėmis sąlygomis ląstelės membrana turi tam tikrą potencialą. Veikiant išoriniu elektriniu lauku
ląstelėje indukuojamas transmembraninio potencialo pokytis ΔΦm :

ΔΦm  1,5E0 R cos α (6.21) , kur E0 – ląstelę veikiantis išorinis elektrinis laukas, R – ląstelės
spindulys, α – kampas tarp membranos paviršiaus normalės ir elektrinio lauko krypties (6.50 pav.).

(6.21) formulė tinka, kai ląstelė yra sferos formos, o membranos storis ir talpa yra maži. Nagrinėjant
kitokios geometrijos ląsteles, šioje formulėje daugiklį 1,5 reikėtų pakeisti kitu faktoriumi f.

6.50 pav. Ląstelė išoriniame elektriniame lauke. Indukuotas transmembraninis potencialas yra
maksimalus ląstelės poliuose, o minimalus viduje.
Kai transmembraninis potencialas viršija tam tikrą slenkstinę ribą ΔΦs , įvyksta membranos
elektroporacija. ΔΦs yra pastovus daugeliui eukariotinių ląstelių, jis priklauso nuo ląstelės spindulio
R. Kuo mažesnis ląstelės spindulys R, tuo didesniu išoriniu lauku reikia veikti ląsteles, norint, kad jų
membranoje susidarytų poros.

Elektroporacijos mechanizmo principas pavaizduotas 6.51 pav.:

6.51 pav. Ląstelės membranos pokyčiai dėl elektrinio lauko poveikio: a) ląstelė prieš elektrinio
lauko poveikį; b) atsiradus elektriniam laukui pradeda judėti jonai; c) ląstelės membranoje atsiranda
porų; d) panaikinus išorinį lauką membrana atsikuria.

6.51 pav. a) ląstelė yra įprastinės būsenos, prieš tai, kai ji paveikiama elektriniais impulsais. Ją supa
molekulės sunkiai prasiskverbiančios į ląstelės vidų. Kai ląstelė patalpinama į elektrinį lauką
(6.51 pav. b), jonai persiskirsto ir ląstelės membranoje formuojasi poros (6.51 pav. c). Pirmiau poros
formuojasi toje membranos paviršiaus dalyje, kuri yra arčiau elektrodų.

Transmembraninis potencialas ląstelės viduje išorės atžvilgiu yra neigiamas, todėl pirmiausia bus
paveikta arčiau teigiamo elektrodo esanti ląstelės membranos sritis. Be to, kuo didesnė elektrinio
lauko impulso amplitudė, tuo didesnis ląstelės membranos plotas bus elektroporuotas. Per
susidariusias poras gana didelės molekulės gali patekti į ląstelės vidų. Jeigu parenkami tinkami
elektroporacijos parametrai, po kurio laiko membrana vėl atsikuria, poros „užsiveria“ (6.51 pav. d) ir
ląstelė gali toliau augti. Mikroporos susiformuoja maždaug per 1 μs ir išsilaiko keletą minučių.

Teoriniai elektroporacijos modeliai

Elektroporacijos reiškiniui apibūdinti pasiūlyti du modeliai: elektromechanis ir statistinis. Pagal
elektromechaninį modelį, membranos pramušimas įvyksta, kai dėl išorinio elektrinio lauko atsiradęs
elektromechaninis slėgis viršija membranos tamprumo jėgas. Šis modelis buvo vėliau tobulinamas,
tačiau kilo prieštaravimų tarp teorijos ir eksperimentinių rezultatų. Šiuo metu elektroporacija
aprašoma remiantis statistiniu modeliu, kai membranoje dėl šiluminių fosfolipidų transformacijų
formuojasi mikroporos (6.52 pav.).

Ląstelės plazminė membrana yra metastabili struktūra. Išorinė plazminės membranos dalis yra
hidrofilinė, o vidinė – hidrofobinė. Dėl šiluminių fliuktuacijų membranoje atsiranda hidrofobinių
porų (6.52 pav. b). Tačiau fosfolipidai išlieka pradinėje padėtyje. Didinant išorinio elektrinio lauko
amplitudę, poros energija pasiekia tokį dydį, kuriam esant fosfolipidai pakeičia savo orientaciją ir
susiformuoja vandeninė (hidrofilinė) pora (6.52 pav. c). Jeigu elektrinio lauko amplitudė didinama
dar labiau, pora plečiasi ir galų gale plazminė membrana gali visiškai suirti.
Todėl yra galima grįžtamoji ir negrįžtamoji elektroporacijos. Jeigu elektrinio lauko impulsų
amplitudė ir trukmė nebus per dideli, tai membrana gebės grįžti į pradinę padėtį. Nutraukus elektrinio
lauko poveikį poros po truputį mažėja, kol visiškai užsiveria.

6.52 pav. Hidrofilinių porų formavimasis: a) membrana be porų; b) hidrofobinės poros

formavimasis; c) jos transformacija į hidrofilinę porą (grįžtamoji elektroporacija); d) žymiai
padidėjus poros skersmeniui, elektroporacija tampa negrįžtama.

Todėl taikant elektroporaciją yra priimti elektrinių impulsų standartiniai parametrai (6.1 lentelė):

Parametrai In vitro In vivo

Impulso amplitudė (A) 1200 V/cm 1300 V/cm

Impulso trukmė (τ) 100 μs 100 μs

Impulsų dažnis (f) 1 Hz (1 impulsas/s) 1 Hz

Impulsų kiekis 8 impulsai 8 impulsai

6.1 lentelė. Standartiniai elektroporacijos parametrai in vitro ir in vivo

6.53 pav. Elektrinio impulso charakteristikos

Elektroporacijos taikymas gydant navikus

Elektroporaciją navikams gydyti pirmą kartą pritaikė Okinas ir kt. 1987 m. Dėl navikinių ląstelių
elektroporacijos į jų vidų lengviau gali prasiskverbti kai kurios vaistų molekulės. Gydymo metodas,
kai kartu su chemoterapiniu vaistu yra taikomi elektriniai impulsai, vadinamas elektrochemoterapija.
Įvairių tyrimų metu nustatyta, kad chemoterapinių preparatų kaupimasis navikinėse ląstelėse taikant
elektroporaciją padidėja kelis kartus, o jų citotoksiškumas gali išaugti net kelis šimtus kartų. Taikant
elektrochemoterapiją, nuo navikų skiriamų vaistų dozės gali būti sumažinamos nuo 100 iki net 700
kartų. Tokios mažos dozės įprastoje chemoterapijoje būtų neveiksmingos, be elektroporacijos nebūtų
pasiektas terapinis efektyvumas.

Magnetinių jėgų, laidumo, talpos mikroskopijos, termomikroskopija

Atomo jėgos mikroskopu galima gauti informacijos ne tik apie medžiagos paviršiaus topografiją, bet
ir apie magnetines (magnetinės jėgos mikroskopija), elektrostatines (elektrostatinės jėgos
mikroskopija), šilumines savybes (termomikroskopija).

Magnetinių jėgų mikroskopas turi zondą iš magnetinės medžiagos. Skenuojama virš paviršiaus,
zondas mechaniškai nesąveikauja su bandiniu. Elektrinių jėgų mikroskopo zondas yra laidus.
Virpinant tokį zondą virš elektrinio krūvio zonde indukuojamos elektrinės srovės. Registruojant
zondo virpėjimo fazę ir amplitudę yra nustatomas paviršinių krūvių pasiskirstymas bandinyje.
Matuojant šiais metodais zondas turi sekti paviršių tam tikru pastoviu atstumu. Todėl dažniausiai
kiekviena vaizdo eilutė skenuojama du kartus. Pirmą kartą zondas kontaktiniu režimu išmatuoja
paviršiaus topografiją. Tada zondas pakeliamas į tam tikrą atstumą nuo paviršiaus ir (išlaikant šį
atstumą) išmatuojamas magnetinių arba elektrinių jėgų vaizdas (6.54 pav. kairėje). Magnetinių ir
elektrinių jėgų mikroskopijos vaizdai pateikti 6.54 pav. dešinėje dalyje.

6.54 pav. Kairėje: specialieji skenuojančiojo zondo mikroskopo režimai.

Dešinėje: magnetinių ir elektrinių jėgų mikroskopais gauti vaizdai.

Pasitelkus laidumo arba talpos mikroskopiją (6.55 pav.) gaunamas bandinio varžos ir talpos
vaizdas. Šios mikroskopijos rūšys yra plačiai taikomos elektronikos pramonėje Tarp AJM bandinio
ir zondo prijungiamas srovės šaltinis (matuojant talpą – kintamos srovės šaltinis).
 6.55 pav. Laidumo arba talpos mikroskopas

Gaunamas srovės stiprio pasiskirstymas bandinio paviršiuje. Grandinės varžą/talpą sudaro kontaktinė
(zondo ir bandinio kontakto vietoje) varža/talpa ir bandinio tūrinė varža/talpa. Per papildomą
matematinį apdorojimą galima gauti detalų bandinio paviršinės varžos ir talpos vaizdą. Šie duomenys
gali būti panaudoti puslaidininkio priemaišų koncentracijos pasiskirstymui išmatuoti (nuo priemaišų
koncentracijos priklauso bandinio varža), dielektrinės plėvelės storiui ant laidaus paviršiaus išmatuoti
(talpa priklauso nuo plėvelės storio). Taip pat metodas naudojamas defektų dielektrinėje dangoje
paieškai ir kt. Kiekviename bandinio taške keičiant bandinio–zondo įtampą galima išmatuoti bandinio
voltamperinę charakteristiką.

Skenuojanti terminė mikroskopija yra kontaktinės atomo jėgos mikroskopijos (AJM) rūšis. Ja
galima matuoti paviršiaus temperatūrines savybes dviem režimais: temperatūrinio laidumo kontrasto
arba temperatūrinio kontrasto režimais. Vietoje adatėlės naudojamas plonas sulenktas laidelis, kuriuo
teka elektros srovė.

Temperatūrinio laidumo kontrasto vaizdas gaunamas skenuojant paviršių „pakaitinta“ adata. Per
adatėlę tekant srovei, ši įkaista. Adatėlės įkaitimas priklauso nuo tekančios per adatėlę srovės bei
aplinkos ar medžiagos (su kuria adatėlė kontaktuoja) temperatūros ir šiluminio laidumo. Jeigu
aplinkos ir tiriamos medžiagos temperatūra nekinta, per laidelį tekanti elektros srovė palaiko pastovią
temperatūrą. Todėl per laidelį tekančios srovės stipris yra proporcingas medžiagos (su kuria
kontaktuoja įkaitęs laidelis) šiluminiam laidumui. Kuo didesnis tiriamos medžiagos šiluminis
laidumas, tuo daugiau šilumos laidelis atiduoda medžiagai. Vadinasi, pakaitinta adata (kad būtų
išlaikyta nepakitusi jos temperatūra) turi tekėti didesnė srovė.

Pagal tekančios srovės stiprį apskaičiuojamas medžiagos šiluminis laidumas. Jeigu yra skenuojamas
tiriamosios medžiagos paviršius, tose vietose kur medžiagos paviršiaus šiluminis laidumas yra
didesnis per adatą teka didesnė srovė. Atidėjus kiekvieno skenuojamo taško šiluminės vertės dydį ir
atvaizdavus rezultatus trimatėje erdvėje, gaunamas šiluminio laidumo vertės topografinis vaizdas
(6.56 pav.).
 6.56 pav. Standžiojo disko skaitymo/rašymo galvutės šiluminio laidumo topografinis vaizdas
(nuotraukos matmenys 8,5·8,5 μm)

6.6. Optiniai biomolekulių sąveikos tyrimai

Optinė mikroskopija

Įvadas

Nors jau praėjo keturi šimtai metų nuo mikroskopo sukūrimo, jis tebėra vienas iš svarbiausių biologo
pažinimo instrumentų. Palyginus su pirmaisiais sukonstruotais modeliais, šiandieniniai mikroskopai
labai pakito ir ištobulėjo. Šiuo metu jie leidžia atlikti ilgalaikius ląstelių stebėjimus, stebėti molekulių
sąveiką, migraciją gyvose ląstelėse, manipuliuoti ląstelėmis, jų dalimis, genetine medžiaga ir pan.
Tačiau pagrindiniai mikroskopijos principai nesikeičia ir galioja net ir sudėtingiausioms
šiuolaikinėms vaizdinimo sistemoms. Trumpai juos aptarsime.

Paprastame praeinančios šviesos mikroskope (6.57 pav.) šaltinio skleidžiama šviesa kolimatoriumi
yra surenkama ir nukreipiama į bandinį. Šviesos šaltinio apšviečiamas bandinio plotas reguliuojamas
lauko diafragma. Svarbiausią vaidmenį objektyve atlieka kondenseris ir objektyvas. Šie du lęšiai būna
suderinti taip, kad sufokusuotų šviesos kūgį į tą pačią bandinio plokštumą. Kondenseris kolimuoja
krentančią šviesą, o objektyvas surenka pro bandinį praėjusiąją spinduliuotę ir nukreipia ją į okuliarą.
Svarbiausios objektyvo charakteristikos yra jo didinimas ir skaitinė apertūra (angl. numerical
aperture, NA).

Skaitinė apertūra apibrėžiama kaip terpės lūžio rodiklio ir pusės šviesos surinkimo kampo sinuso
sandauga:

NA = n⋅sinα (6.22), kur n – terpės tarp objektyvo ir bandinio lūžio rodiklis, α – pusė šviesos
surinkimo kampo (6.57 pav.)

Kuo apertūra didesnė, tuo daugiau skirtinga kryptimi sklindančių spindulių kerta bandinį ir patenka į
objektyvą. Todėl gaunama ir geresnė vaizdo kokybė. Idealiu atveju, kondensoriaus ir objektyvo
skaitinės apertūros turi sutapti.
6.57 pav. Pralaidumo mikroskopo dalys, šviesos sklidimo schema ir šviesos surinkimo kampas, nuo
kurio priklauso skaitinė apertūra (NA).

Mikroskopo skiriamoji geba

Bendras mikroskopo didinimas gaunamas sudauginus objektyvo ir okuliaro didinimą. Šiuolaikinių

mikroskopų didinimas siekia iki 1500 kartų. Mikroskopo maksimalų didinimą riboja jo skiriamoji
geba. Ji priklauso nuo šviesos difrakcijos. Dėl difrakcijos ir interferencijos reiškinių kiekvienas iš
bandinio sklindantis taškas galutiniame atvaizde formuoja ne tik taškinį atvaizdą. Jis sukuria
pasikartojančių šviesių ir tamsių juostų seriją, o centriniame taške šviesos intensyvumas didžiausias
(6.58 pav.). Gretimi bandinio taškai gali būti išskirti vienas nuo kito tik esant didesniam už kritinį
atstumui (δ) tarp jų. Kuo geresnė mikroskopo skiriamoji geba, tuo šis kritinis atstumas yra mažesnis.
 6.58 pav. Bandinio taškas, perėjęs per mikroskopo optinę sistemą formuoja difrakcinį šviesos
pasiskirstymą (a). Centrinis diskas vadinamas Erio disku. Du taškiniai objektai gali būti išskiriami
(b), kol atstumas tarp jų yra didesnis už kritinį atstumą δ (c).

Difrakcinio vaizdo centrinio disko skersmuo (d) teoriškai yra lygus:

d = 1.22 ⋅λ/(n ⋅ sin α) = 1.22 ⋅λ/NA (6.23)

Kaip matome iš 6.23 formulės, šį Erio diską galime sumažinti naudodami mažesnio bangos ilgio
šviesą (λ) ir didesnę objektyvo skaitinę apertūrą (NA). Mikroskopo skiriamąją gebą galima apibūdinti
kaip mažiausią atstumą (δ), kuriuo nutolusius objektus dar galima atskirti vieną nuo kito (15.58 pav.
c). Dar arčiau esančių objektų atskirti jau nebeįmanoma, nes jų kuriami Erio diskai persikloja. Tokiu
atveju bus matomas tik vienas taškas, o objektų atvaizdai bus susilieję. Pagal Relėjaus sąlygą,
mažiausias santykinis apšvietimo pokytis (intensyvumų skirtumas), kurį gali skirti akis, yra 4 %.
Todėl mažiausias atstumas tarp išskiriamų objektų yra:

δ = 0,42 d = 0,51⋅λ/NA (6.24), kur δ – kritinis atstumas, λ – šviesos bangos ilgis, d – Erio
disko skersmuo, NA – skaitinė apertūra

Siekiant apibūdinti mikroskopo tikslumą išskiriant mažus objektus, dažnai naudojamas atvirkščias
dydis – skiriamoji geba: R = 1/δ. Siekiant gauti geresnės optinės skyros vaizdą, naudojami kuo
didesnės skaitinės apertūros objektyvai. Vienas iš būdų padidinti skaitinę apertūrą yra naudoti
imersinę alyvą, kurios lūžio rodiklis (n≈1,5) yra gerokai didesnis už oro (n≈1). Šviesai pereinant iš
stiklo (n ≈1,6) į orą (n = 1), dalis spindulių lūžta ir nepatenka į objektyvą. Naudojant imersinę alyvą
ženkliai sumažinamas skirtumas tarp terpių lūžio rodiklio. Todėl surenkama daugiau šviesos
spindulių (6.59 pav.).
 6.59 pav. Taškinio šaltinio formuojamas vaizdas priklausomai nuo objektyvo skaitinės apertūros
(kairėje). Šviesos surinkimo kampo padidinimas naudojant imersinę alyvą.

Pralaidumo mikroskopija

Šviesos pralaidumo mikroskopu vaizdas matomas todėl, kad skirtingos bandinio vietos nevienodai
sugeria ir išsklaido šviesą. Todėl stebimos tamsios ir šviesios bandinio dalys (šviesos lauko
mikroskopija). Tačiau dažniausiai biologijoje tiriami objektai būna skaidrūs ir toks susidaręs
kontrastas yra nepakankamas jų vaizdinimui (6. 60 pav. a).

6.60 pav. Ląstelės ir jos viduje esančių bakterijų vaizdas,

matomas skirtingais mikroskopijos metodais.

Todėl naudojami mikroskopijos patobulinimai, kurie sukuria dirbtinį intesyvumo kontrastą. Dauguma
biologinių objektų vadinami faziniais objektais. Jie šiek tiek pakeičia per bandinį praleistos (ir užlenktos)
šviesos fazę. Dažniausiai tokia šviesa yra sulaikoma ketvirtadaliu bangos ilgio (palyginus su šviesa, kuri
pereina per bandinį statmenai arba praeina greta jo nepaveikta). Toks šviesos atsilikimas priklauso nuo
„užlaikančiosios“ terpės lūžio rodiklio ir terpės storio. Šio fazių skirtumo nepastebi nei akis, nei vaizdo
registravimo kameros. Akis jautri tik spalvai ir šviesos stipriui, kuris atitinka bangos amplitudę. Tačiau
įterpus į mikroskopo optinę sistemą fazinę plokštelę, kuri papildomai užlaiko šviesą λ/4 atstumu, fazių
skirtumas tarp dviejų spindulių tampa λ/2. Tokie spinduliai destruktyviai interferuoja (tenkinama tokios
interferencijos sąlyga) ir okuliare stebima tamsi dėmė (6.61 pav.). Tokiu būdu, fazių skirtumas (kuris
paprastai yra nematomas) tampa šviesos intensyvumų skirtumu. Jį lengvai aptinka akis ir fotokameros
(6.60 pav. b).

6.61 pav. Šviesos sklidimas ir vaizdo susidarymas fazių kontrasto, tamsaus lauko ir skirtuminės
interferencijos mikroskopijoje.

Kai kurie objektai pasižymi didele šviesos sklaida – per juos perėjęs šviesos spindulys stipriai
pakeičia savo skriejimo kryptį. Tokius objektus galima efektyviai vaizdinti tamsaus lauko
mikroskopijos metodu (6.61 pav.). Šiuo atveju, prieš kondensorių įterpiama atkirtimo plokštelė, kuri
praleidžia šviesą tik siaurame žiede. Todėl už kondensoriaus susidaro tuščiaviduris šviesos kūgis ir,
nesant bandinio, šviesa į objektyvą nepakliūna. Tačiau jei šviesos kelyje atsiras bandinys, kuris
sklaidys šviesą, nuo jo užlinkę spinduliai pakeis savo skriejimo kryptį. Jie pateks į objektyvą ir pro
okuliarą bus stebimi kaip šviesios dėmės. 6.60 pav. c) nuotraukoje ląstelės membrana ir branduolys
beveik nematomi, o bakterijos daug stipriau sklaido šviesą ir gali būti ryškiai išskiriamos.

Yra ir kitų būdų sukurti skaidraus bandinio kontrastą. Vienas iš jų yra skirtuminės interferencijos
mikroskopija (angl. differential interference contrast, DIC), dar kitaip vadinama Nomarskio mikroskopija
(6.61 pav.). Jos optinė sistema yra kiek sudėtingesnė, todėl aptarsime tik patį metodo principą. Tiesiškai
poliarizuota šviesa, praėjusi per specialų kristalą (Volastono prizmę), skyla į du spindulius, kurių
poliarizacija yra tarpusavyje statmena. Spinduliai atsiskiria erdviškai, todėl šie du spinduliai sklinda per
skirtingas bandinio dalis (atstumas tarp spindulių ~0,2 µm), kuriose skiriasi bandinio lūžio rodiklis bei
storis. Todėl šių spindulių fazės užlaikomos šiek tiek skirtingai – tarp jų susidaro fazės poslinkis. Už
objektyvo įterpiama kita kristalinė prizmė, per kurią praėję abu skirtingos poliarizacijos spinduliai
suliejami į vieną ir interferuoja tarpusavyje. Priklausomai nuo fazių poslinkio, spinduliai interferuodami
atkurs mažesnio intensyvumo spindulį negu jis buvo prieš jį padalinant pirmąją prizme. Šis intensyvumo
sumažėjimas priklausys nuo spindulių fazių skirtumo ir mikroskopu stebėsime tamsias bei šviesias dėmes
– išryškinsime pralaidumo mikroskopijos nematomas detales (6.60 pav. d).

Fluorescencinė mikroskopija

Fluorescencinės mikroskopijos rūšys paremtos kai kurių medžiagų savybe sugėrus šviesos kvantą
išspinduliuoti gautą energiją antrinės šviesos pavidalu – fluorescuoti. Išspinduliuotos šviesos energija
visuomet yra mažesnė negu sugertos, todėl fluorescencijos spektras visuomet yra pasislinkęs į
ilgabangę (mažesnių energijų) pusę nuo sugerties spektro. Paprasčiau tariant, molekulė, sugėrusi
vienos spalvos šviesą (tarkime mėlynos), spinduliuos kita spalva (pvz. žalia). Tokios
fluorescuojančios medžiagos vadinamos fluoroforais. Mikroskopijoje galima pasinaudoti kai kuriais
pačiuose biologiniuose objektuose esančiais fluoroforais (baltymais, pigmentais, kofaktoriais). Taip
pat bandiniai gali būti nudažomi specialiais dažikliais, siekiant pažymėti tam tikrą audinio dalį,
ląstelės organelę ar net pavienes molekules. Fluorescenciniai metodai yra daug selektyvesni negu
pralaidumo mikroskopijos, nes šviesa sklinda ne iš viso bandinio, o tik iš ten, kur yra fluoroforo
molekulės. Šiuolaikiniai imunohistochemijos metodai leidžia sukurti itin specifiškus žymenis, kurie
sąveikauja tik su vieno tipo molekulėmis.

Kitaip nei pralaidumo mikroskopijoje, fluorescenciniuose metoduose šviesa nukreipiama ir surenkama iš

bandinio tuo pačiu objektyvu (6.62 pav.). Šviesos šaltinis dažniausia yra lempa, kuri spinduliuoja platų
šviesos spektrą nuo UV iki IR srities. Norint selektyviai sužadinti dominantį fluoroforą, iš šio spektro
filtrais išskiriama reikalinga (labai siauro bangos ilgių intervalo) šviesa – UV, violetinė, mėlyna ar kt.
Bandinyje dėl krintančios sužadinančios spinduliuotės sukeliama fluorescencinė spinduliuotė. Ji sklinda
visomis kryptimis, taigi ir atgal į objektyvą. Jeigu būtų naudojamas paprastas veidrodis, tai bandinio
fluorescencija patektų į šviesos šaltinį. Todėl siekiant atskirti sužadinančios spinduliuotės ir
fluorescencinės spinduliuotės optinius kelius naudojamas dichroinis veidrodis. Jis pagaminamas taip, kad
praleistų fluorescenciją ir atspindėtų sužadinančią spinduliuotę (6. 62 pav. A). Papildomai yra dedamas
fluorescencijos atkirtimo filtras. Jis sugeria sužadinimo spinduliuotės likutį, kurį gali iš dalies praleisti
dichroinis veidrodis (6.61 pav. B).
6.62 pav. A) fluorescencinės mikroskopijos principinė schema; B) naudojamų filtrų šviesos pralaidumo
spektrai branduolio dažikliui DAPI; (C) ląstelės fluorescencinis vaizdas, kuriame ląstelės citoplazma
nudažyta žaliu, o branduolys mėlynu dažikliu.

Paprastai filtrai derinami prie naudojamų fluoroforų optinių savybių. Turėdami kelis filtrų rinkinius
galime atskirti kelis fluoroforus ir daugiaspalvį vaizdą (6.62 pav. C). Silpnosios fluorescencinės
mikroskopijos pusės yra šios:

 Naudojami dažikliai nėra fotostabilūs. Ilgai vaizdinant bandinį jie išblykšta;

 Sudėtingesnis preparatų paruošimas;
 Kai kurie dažymo metodai gali būti atliekami tik su fiksuotais bandiniais, todėl negalima atlikti
eksperimentų su gyvomis sistemomis;
 Aukšta įrangos kaina.

Svarbu paminėti, kad vaizdinant storesnius objektus sužadinimo spinduliuotė sužadina ne tik
molekules,
esančias objektyvo židinyje, bet ir esančias aukščiau bei žemiau jo. Šių molekulių nesufokusuota
fluorescencija taip pat pakliūva į registracijos sistemą. Dėl to stebimas neryškus, išplaukęs vaizdas.
Šį trūkumą pašalinti leidžia skenuojantis konfokalinis fluorescencijos mikroskopas.

Kitaip nei plataus lauko mikroskopijoje, atliekant konfokalinį skenavimą apšviečiamas ne visas
bandinys. Šviesa sufokusuojama į vieną mažą tašką. Išmatavus fluorescencijos intensyvumą šiame
erdvės taške (vòkselyje, angl. voxel) lazeris nukreipiamas į gretimą bandinio vietą (ir taip toliau).
Lazeris juda tol, kol nuskenuojamas visas bandinys ir kompiuteryje atkuriamas bendras vaizdas. Ši
mikroskopijos technika ypatinga tuo, kad optinėje mikroskopo sistemoje yra diafragma, kuri atkerta
ne iš židinio plokštumos ateinančius (nesufokusuotus) spindulius (6.63 pav. A). Taip į detektorių
nepakliūva šviesa iš žemiau ar aukščiau židinio plokštumos esančių taškų, gaunama fluorescencija
tik iš vienos bandinio plokštumos. Keičiant objektyvo aukštį atliekamas skenavimas gretimose
plokštumose, vėliau kompiuterine įranga atkuriamas trimatis objekto vaizdas.
6.63 pav. A) konfokalinės fluorescencijos mikroskopijos principas; B) bandinio apšvietimas plataus
lauko ir konfokalinėje mikroskopijoje; C) abiem metodais gautų vaizdo kokybės palyginimas.

Bandinio skenavimas į gylį (optinis sekcionavimas) yra išskirtinė konfokalinės mikroskopijos savybė
(6.64 pav. A). Ši mikroskopija suteikia daug galimybių biologams stebint biologinėse sistemose
vykstančius procesus. Pavyzdžiui, skenuojant lazeriu galima išblyškinti dalį bandinio (angl.
photobleaching) ir vėliau stebėti fluorescencijos atsikūrimą. Jis priklauso nuo molekulių difuzijos iš
aplinkinės erdvės į išblyškintą plotą, molekulių dinamikos (6.64 pav. B). Atlikę kiekybinę analizę
gauname informacijos apie difuzijos greitį. Sužinome terpės, kurioje yra fluoroforas, savybes
(klampą, koncentraciją, molekulių judrumą).

Konfokalinė mikroskopija taip pat plačiai naudojama tirti molekulių sąveikai ląstelėje. Šis metodas
itin naudingas biotechnologijai ir jis sparčiai tobulinamas visame pasaulyje.

6.64 pav. Konfokalinės mikroskopijos taikymas: A) optinis sekcionavimas ir trimačių vaizdų

rekonstrukcija; B) fluorescencijos atsikūrimo po išblyškinimo tyrimai (FRAP);
C) aukštos kokybės daugiaspalvis vaizdinimas.
Ramano sklaida

Šviesos sklaida yra procesas, kai šviesos fotonai sąveikaudami su terpe, kurioje jie sklinda, keičia
savo judėjimo trajektoriją. Optinės sklaidos tipai skirstomi į dvi grupes:

 Elastinę sklaidą, kai fotono energija (taigi ir bangos ilgis) nepakinta. Šiuo atveju

(6.25), kur ν – fotono dažnis, λ – bangos ilgis

 Neelastinę sklaidą, kai fotono energija pakinta.

Gamtoje dominuoja elastinė sklaida (pvz. Relėjaus sklaida). Dėl jos stebime mėlyną dangų ar raudoną
saulėlydį (6.65 pav.). Dauguma objektų yra neskaidrūs būtent dėl elastinės sklaidos.

6.65 pav. Elastinės ir neelastinės sklaidos pavyzdžiai. Relėjaus sklaidos metu fotono energija
nepakinta. Ramano sklaidos metu fotonas, sąveikaudamas su terpės molekulių elektromagnetiniu
dipoliu, praranda ar įgyja dalį energijos. Dėl to, kad fotono energija (taigi ir dažnis) pakinta, pakinta
ir šio fotono spinduliuojamos bangos ilgis (spalva).

Vienas iš biologijoje ir medicinoje plačiai taikomų neelastinės sklaidos tipų yra Ramano sklaida. Jos
metu fotonas, kuris kartu yra ir elektromagnetinė banga, sąveikauja su terpės molekulės
elektromagnetiniu dipoliu ir dalį energijos perduoda molekulei (Stokso Ramano sklaida) arba dalį
energijos iš jos perima (anti-Stokso Ramano sklaida). Dėl šių virsmų po sąveikos šis fotonas turės
pakitusį energijos kiekį ir jo bangos dažnis bus kitas (pasikeis šviesos spalva). Pasirodo, kiekviena
medžiaga pasižymi specifiniu fotono energijos pokyčiu ir gali spinduliuoti ne vieno, o kelių tipų
pakitusius fotonus. Išmatavę tokios medžiagos visų skleidžiamų fotonų kiekį (šviesos intensyvumą)
gausime Ramano spektrą. Jis yra unikalus kiekvienai medžiagai – yra tarsi medžiagos pirštų
atspaudas (6.66 pav.).

Ramano spektroskopija tapo labai svarbiu įrankiu chemikų ir biochemikų laboratorijose dėl
galimybės identifikuoti medžiagą ir tirti molekulių sudaromus ryšius. Šis metodas yra neinvazinis,
nepakeičia medžiagos savybių, todėl tinkamas tirti jautriems biologiniams mėginiams. Ramano
spektrometras gali būti įdiegiamas į mikroskopą. Tokiu būdu galima tirti mikroorganizmus bei
ląsteles. Kai kurias bakterijų rūšis galima identifikuoti pagal jų Ramano spektrus. Taip pat tikimasi
atskirti sveiką ir navikinį audinį įmontavus spektrometrą į endoskopą (6.66 pav.). Atlikus neinvazinę
audinių apžiūrą, būtų galima nustatyti audinio fiziologinę būklę. Todėl Ramano spektroskopija
ateityje gali būti pritaikyta ankstyvai, neinvazinei ligų diagnostikai.

6.66 pav. In vivo endoskopijos metu atliekama Ramano spektroskopija. Tikimasi pagal tam tikras
spektro dedamąsias atskirti sveiką audinį nuo navikinio ir taip diagnozuoti organizmo būklę

6.7. Spektroskopijos metodai: sugerties, fluorescencijos spektroskopija

Įvadas

Fizikinės analizės metodai – tai medžiagos tyrimo metodai, kuriais galima nustatyti jos sudėtį
nesinaudojant cheminėmis reakcijomis. Šie metodai yra pagrįsti įvairių medžiagos parametrų
nustatymu:

 Spinduliuotės matavimas;
 Spinduliuotės ir medžiagos sąveika (spektrinė analizė);
 Medžiagos elektrinių savybių parametrai (elektrocheminė analizė);
 Radioaktyvumas (radiometrinė ir radiocheminė analizė);
 Sistemos parametrų priklausomybės nuo temperatūros (terminė analizė) ir kt.

Spektroskopija – tai fizikos šaka, tirianti atomų, jų branduolių, molekulių, kondensuotosios būsenos
medžiagų elektromagnetinės spinduliuotės sugerties, liuminescencijos arba sklaidos bei masių,
elektronų, jonų energijos ir kitus spektrus. Spinduliuotės dažnis (bangos ilgis) priklauso nuo
medžiagos sudėties, o analizinio signalo stipris proporcingas nustatomosios medžiagos kiekiui.

Spektroskopija jau seniai naudojama biomolekulių sandarai ir jų struktūros pokyčiams nustatyti.

Įvairių rūšių spektroskopija apima spektrinės analizės metodus, kurių pranašumai yra:
  Tiriamoji medžiaga nesuardoma;
 Tyrimo metodikos lengvai modifikuojamos ir automatizuojamos;
 Galima nustatyti nedidelius biomolekulių kiekius netgi gana sudėtingose sistemose.

Spektrinės analizės metodai skirstomi įvairiai, kol kas nėra vienareikšmės jų klasifikacijos.
Biomolekulių spektrinės analizės metodai gali būti skirstomi taip:

 Biomolekulių sugerties spektrų analizė:

 ultravioletinio (UV) spektro diapazono;
 regimojo spektro (VIS) diapazono;
 infraraudonojo spektro (IR) diapazono.

 Biomolekulių fluorescencijos spektrų analizė;

 Biomolekulių magnetinio rezonanso spektrų analizė.

Dažniausiai tiriant biologinius objektus yra naudojama nedidelės energijos spinduliuotė (regimosios
srities). Ji yra visiškai nekenksminga bandiniams (6.67 pav.).

Regimoji šviesa apima tik nedidelę elektromagnetinių bangų spektro dalį – nuo 400 nm iki 700 nm.
Artimojo UV ruožui priskiriama sritis nuo 300 nm iki 400 nm. UV ruožas, kurio spinduliai daro
poveikį gyviems organizmams savo ruožtu pagal bangų ilgius skirstomas į tris sritis: UVA, UVB ir
UVC. Artimasis IR ruožas – nuo 760 nm iki 1400 nm.

Rentgeno sp. Ultravioletinė sp. Regimosios šviesos spinduliuotė Infraraudonoji sp.

Vakuumo UVC UVB UVA

UV

Bangos ilgis, nm

6.67 pav. Elektromagnetinių bangų spektrinis diapazonas

Sugerties ir fluorescencijos principai

Vieni svarbiausi medžiagų ir energijos apykaitos viduląstelinės reguliacijos tyrimo metodai yra
spektroskopijos metodai. Jie leidžia tirti fizikocheminius procesus, vykstančius gyvojoje ląstelėje ir
jos organelėse. Spektrinės analizės galimybės pirmiausia siejamos su tuo, kad daugelis biologinės
kilmės medžiagų turi charakteringus sugerties ir fluorescencijos spektrus. Ląstelės, turinčios tokių
biologinės kilmės medžiagų, kurios geba fluorescuoti, taip pat pasižymės fluorescencija. Tais
atvejais, kai dominančių ląstelių komponentų savoji (pirminė) fluorescencija yra silpna, naudojami
specifiniai dažikliai–žymekliai.

Fluoroforų ir žymeklių sugertį bei fluorescenciją galima aiškinti remiantis šviesos kvantinėmis
savybėmis. Daugelis biologinių molekulių sugeria įvairios energijos šviesos fotonus. Dėl nevienodo
įvairių energijų kvantų sugėrimo biologiniai objektai būna spalvoti. Pabandykime panagrinėti šviesos
sugertį ir fluorescenciją išsamiau. Sugerties atveju, šviesos fotono energija panaudojama medžiagai
sužadinti, t. y. elektronams perkelti į aukštesnės energijos lygmenis (pvz. šuolis iš S 0  S1) (6.68
pav.). Tačiau sužadinta būsena gyvuoja neilgai, ji spinduliniu ar nespinduliniu būdu atiduoda
sužadinimui išnaudotą energiją ir grįžta į pagrindinį energijos lygmenį S0. Jeigu šuolio metu
išspinduliuojamas fotonas vyksta fluorescencija (šuolis S1  S0) (6.68 pav.). Jeigu elektronui grįžtant
iš aukštesnės energijos lygmenų į žemesnius fotonas nėra išspinduliuojamas, molekulės sužadinimui
išnaudota energija virsta šilumine energija.

6.68 pav. Kairėje: sugerties ir fluorescencijos vyksmų demonstracija;

Dešinėje: biomolekulės energetinių lygmenų diagrama.

Šviesos sugertis kiekybiškai įvertinama optiniu tankiu, kuris priklauso nuo medžiagos prigimties,
cheminės sudėties, agregatinės būsenos, koncentracijos, temperatūros ir nuo sąveikaujančios su
medžiaga šviesos bangos ilgio. Biomolekulių sugertį dažniausiai aprašo Lamberto–Bugero–Bero
dėsnis:

I  I 0  10 cl (6.26), kur I0 – kritusios, o I – praėjusios šviesos intensyvumas, l – optinio kelio

ilgis (bandinio ar kiuvetės storis), ε – ekstinkcijos koeficientas, nusakantis medžiagos gebėjimą
sugerti tam tikro bangos ilgio šviesą, c – medžiagos molinė koncentracija (mol/l), o cl = D – bandinio
optinis tankis.

Fluorescencija charakterizuojama energiniu našumu – tai išspinduliuotos ir sugertos energijos

santykis, arba kvantiniu našumu – per tą patį laiką išspinduliuotų ir sugertų fotonų santykis:

E fl N fl
energet  arba  kvant  (6.27)
Es Ns

Egzistuoja ryšys tarp biomolekulių sugerties ir fluorescencijos. Biomolekulių išspinduliuotos šviesos

energija yra žemesnė nei sugertos šviesos – fluorescencijos šviesa yra pastumta į ilgesnių bangų pusę
(Stokso poslinkis). Optinio tankio priklausomybė nuo bangos ilgio vadinama sugerties spektru, o
fluorescencijos intensyvumo priklausomybė nuo bangos ilgio vadinama fluorescencijos spektru.
Hipotetinės biomolekulės sugerties ir fluorescencijos spektrai pavaizduoti 6.69 pav.
 6.69 pav. Hipotetinės molekulės sugerties ir fluorescencijos spektrai,
normuoti pagal spektro smailes

Žmogaus organizme yra nemažai biomolekulių, kurios pasižymi fluorescencija. Daugiausia tai
įvairūs baltymai. Lipidai ir sacharidai iš esmės nefluorescuoja, o DNR fluorescencija yra per silpna,
kad ją būtų galima užregistruoti. Baltymų fluorescenciją sukelia juose esančios aromatinės
aminorūgštys – fenilalaninas (Phe), tirozinas (Tyr) ir triptofanas (Trp). Jei fluorescuotų visos 20
aminorūgščių, gali būti, kad baltymų fluorescencija būtų per sudėtinga analizuoti. Svarbi baltymų
struktūros ypatybė yra ta, kad trys fluorescuojančios aminorūgštys baltymuose yra santykinai retos.

Tiptofanas, kuris yra pagrindinis fluoroforas, sudaro apie 1 % aminorūgščių kiekio. Baltyme gali būti
viena arba kelios Trp liekanos (radikalai). Trp fluorescencijos spektras labai priklauso nuo aplinkos.
Todėl baltyme esant didesniam radikalų kiekiui fluorescencijos spektras sudėtingėja, nes skiriasi
kiekvienos liekanos aplinka. Pagrindinių audinio fluoroforų sugerties ir fluorescencijos spektrai
pateikti 6.70 pav.
 6.70 pav. (A) Pagrindinių audinio fluoroforų sugerties; (B) fluoroforų fluorescencijos spektrai.

Baltymų fluorescencija paprastai sužadinama šviečiant 280 nm ar ilgesnių bangos ilgių spinduliuote,
o fluorescencija stebima 300–430 nm srityje. Audiniuose yra nustatytos kelios grupės
fluorescuojančių pigmentų, susijusių su audinių senėjimu ir įvairiais patologiniais procesais. Šie
pigmentai yra siejami su lipidų apykaitos produktais, dėl to jie vadinami lipopigmentais.
Lipopigmentai fluorescuoja 430–460 nm ir 540–640 nm intervaluose, o fluorescencija yra
sužadinama 340–390 nm srityje. Naudojant skirtingus sužadinimo bangos ilgius galima selektyviai
sužadinti tik tam tikras biomolekules. Taip galima vizualizuoti audinius, kuriuose jų koncentracija
didžiausia (6.71 pav.).
 6.71 pav. Širdies tarpskilvelinė pertvara ir joje matoma kairė Hiso pluošto šaka (fluorescuoja
mėlynai). A) vaizdas esant dienos šviesai; B) vaizdas, apšvietus 365 nm bangos ilgio spinduliuote.

Dažnai vien tik iš biologiniuose objektuose esančių fluoroforų gautos informacijos nepakanka, todėl
tenka įvesti įvairius papildomus dažiklius. Pastarieji, nors ir yra pašaliniai, turi tinkamas spektrines
savybes. Dažiklis – tai molekulė, galinti fluorescuoti. Dažikliui chemiškai susijungus su kita molekule
(pvz. antikūnu) gaunamas žymeklis. Jis selektyviai gali jungtis prie kurios nors dominančios
biomolekulės. Kai ši biomolekulė apšviečiama tam tikro bangos ilgio šviesa prie jos prikibęs
žymeklis pradeda fluorescuoti. Švytėjimas gali būti skirtingų spalvų. Fluorescencinėje analizėje
naudojamas žymeklis turi pasižymėti tokiomis savybėmis:

 Jis turi tvirtai jungtis tik tam tikroje biomolekulės srityje;

 Jo fluorescencija turi būti jautri aplinkos sąlygoms;
 Jis neturi daryti jokios įtakos tiriamos makromolekulės savybėms.

Todėl plėtojant naujus optinės mikroskopijos metodus, skirtus diagnostikai, ieškoma papildomų
dažiklių, kurie būtų selektyvūs tam tikriems audiniams, jų grupėms, ląstelėms ar ląstelių sudėtinėms
dalims ir padėtų aptikti juose vykstančius metabolinius vyksmus arba atsiradusias pažaidas.
Pasitelkus šių dažiklių fluorescencinį signalą galima vaizdinti tam tikras biologinių objektų dalis ar
registruoti ląstelių ir audinių metabolinį aktyvumą (6.72 pav.).

6.72 pav. Audinio, nudažyto selektyviais dažikliais, fluorescencijos vaizdas

Pastaruoju metu, tobulinant technologijas, žymekliams keliami vis didesni reikalavimai. Norima
vienu metu stebėti keletą objektų, nudažytų skirtingomis spalvomis. Žymekliai turi neišblukti net ir
ilgai švitinant bandinius. Jų fluorescencija turi išsiskirti bendro audinių švytėjimo – savitosios
fluorescencijos (autofluorescencijos) – fone. Įprastiniai organiniai žymekliai jau nebetenkina šių
reikalavimų. Tačiau tam puikiausiai tinka nauja žymeklių karta – fluorescuojantys baltymai ir įvairios
nanodalelės. Jos pasižymi ypatingomis savybėmis, kurias lemia jų nanometriniai matmenys.

Pirmą kartą (1960 m.) žaliai fluorescuojantį baltymą – GFP iš Aequorea victoria medūzos išskyrė
Osamu Shimomura. Medūzoje fluorescencija vyksta, kai liuminescencinis baltymas aekvorinas (angl.
aequorin) sureaguoja su Ca2+ jonu, kuris sukelia melsvą švytėjimą. Dalis šios liuminescencinės
energijos perduodama GFP, kuris pakeičia bendrąją spalvą į žalią. Dauguma mažų fluorescuojančių
žymeklių (FITC), naudojamų gyvose ląstelėse, yra labai fototoksiškos. Fluorescenciniai baltymai
(GFP) dažnai yra mažiau kenksmingi gyvoms ląstelėms. GFP yra pakankamai mažas baltymas (~28
kDa). Tai svarbu, nes dėl mažo baltymo prijungimo prie tiriamojo baltymo mažai tikėtina, kad
pastarojo funkcinis aktyvumas žymiai pakistų. Fluorescuojančių baltymų yra įvairių, jie skirstomi
pagal fluorescencijos spalvą:

1. Žaliai fluorescuojantys baltymai;

2. Mėlynai fluorescuojantys baltymai;
3. Žalsvai mėlynai fluorescuojantys baltymai;
4. Geltonai fluorescuojantys baltymai;
5. Raudonai fluorescuojantys baltymai.

6.73 pav. pavaizduoti Rogerio Tsieno laboratorijoje sukurti skirtingų spalvų fluorescuojantys
baltymai.

6.73 pav. Kairėje: bakterijų kolonija, sukurta panaudojant įvairius GFP ir į GFP panašius baltymus.
Dešinėje: fluorescuojančių baltymų sugerties ir fluorescencijos spektrai.

6.72 pav. matyti dažniausiai naudojamų fluorescuojančių baltymų sugerties ir fluorescencijos

spektrai. Jie užima matomo spektro sritį nuo žalsvai mėlynos iki tolimosios raudonos spektro dalies.
Iš medūzos Aequorea victoria išskirti fluorescuojantys baltymai: ECFP, EGFP, EYFP
fluorescencijos maksimumus turi srityje nuo 425 iki 525 nm.

Be fluorescuojančių baltymų, vieni perspektyviausių fluorescuojančių žymeklių yra puslaidininkinės

nanodalelės, kitaip dar vadinamos kvantiniais taškais (6.74 pav.).
 6.74 pav. Kairėje: kvantiniai taškai esant dieniniam apšvietimui.
Dešinėje: jų fluorescencija esant mėlynam apšvietimui

Kvantiniai taškai pasižymi specifinėmis optinėmis ir elektroninėmis savybėmis, kurios priklauso nuo
nanodalelės erdvinių matmenų. Nuo jų dydžio priklauso daugelis kvantinių taškų parametrų,
svarbiausia – fluorescencijos bangos ilgis. Keičiant kvantinių taškų cheminę sudėtį ir dydį gaunamos
nanodalelės, kurios fotoliuminescuoja plačiame spektriniame diapazone – nuo 400 iki 2000 nm.
Kvantinių taškų sugerties juostos yra plačios, o fluorescencijos – siauros (6.75 pav. A, B). Dėl jų
plačių sugerties juostų, įvairių spalvų KT galima žadinti vienu šviesos šaltiniu, taip realizuojant
ląstelės dalių daugiaspalvį vaizdinimą (6.75 pav. C).

6.75 pav. A) kvantinių taškų sugerties spektrai; B) kvantinių taškų fluorescencijos spektrai;
C) ląstelės organelių vaizdinimas įvairaus dydžio kvantiniais taškais.
Sugerties ir fluorescencijos spektrų registravimas

Sugerties spektrai matuojami spektrometru, kuris matuoja šviesos pralaidumą. Principinė

spektrometro schema pavaizduota 6.76 pav. Žadinimo šaltinio skleidžiama spinduliuotė yra
fokusuojama į bandinį. Jame dalis fotonų, kurių energija atitinka tarpą tarp biomolekulių energijos
lygmenų, sugeriama. Kita fotonų dalis praeina pro bandinį ir yra registruojama detektoriuje.
Užregistravus praėjusios šviesos intensyvumą su bandiniu ir be jo yra apskaičiuojama bandinio
sugertis. Dažnai prieš detektorių būna prizmė arba difrakcinė gardelė. Todėl palaipsniui keičiant
bangos ilgius yra įmanoma išmatuoti visą sugerties spektrą.

6.76 pav. Principinė sugerties spektrometro schema

Fluorescencijos spektrai yra registruojami spektrofluorimetru. Jo veikimas paremtas tuo, kad šaltinio
skleidžiama spinduliuotė yra išskaidoma į monochrominę šviesą. Tam tikra žadinančiosios
spinduliuotės bangos ilgio šviesa nukreipiama į bandinį, kuriame sukelia fluorescenciją. Tačiau
žadinančioji spinduliuotė pati yra stipriai išsklaidoma bandinyje. Todėl didelė jos dalis kartu su
biomolekulių fluorescencija patenka į detektorių. Į detektorių patekęs išsklaidytos žadinančiosios
spinduliuotės intensyvumas yra daug didesnis nei naudingą informaciją skleidžiančio fluorescencijos
signalo.

Todėl sunku detektoriumi užregistruoti palyginus silpną fluorescencijos signalą intensyvios

žadinančiosios spinduliuotės fone. Tam fluorescencijos surinkimo kanale statoma spektrinės sudėties
modifikavimo sistema, galinti atskirti žadinančiąją spinduliuotę ir nepraleisti jos į detektorių. Jei
sužadinimui naudojame mėlyną šviesą, fluorescencija bus žalios spalvos. Spektrinės sudėties
modifikavimo sistema skirtingas spinduliuotes galima nesunkiai atskirti (6.77 pav.). Šiuo metu yra
naudojamos dviejų tipų spektrinės sudėties modifikavimo sistemos – monochromatoriai ir filtrai.
Fluorescencijos spektrai gaunami esant fiksuotam žadinančiosios šviesos bangos ilgiui ir matuojant
fluorescencijos intensyvumą tam tikrame nustatytame bangos ilgio diapazone.

Žadinančioji
spinduliuotė

6.77 pav. Fluorimetro

Surenkama principinė matavimo schema
spinduliuotė Į detektorių Detektorius

Fluorescencija
Spektrinės sudėties
modifikavimo įrenginys
Literatūros sąrašas:

6.1
 Kerienė J. CHEMIJA. Įvadas į dalyko studijas. Kontrolinių darbų temos. Mokomoji knyga. Vilnius, Technika,
2007. Prieiga: http://www.scribd.com/doc/67446304/keriene-chemija-tirazui
 Mishra RK. Biomolecules: introduction, structure and Functions. University of Lucknow. Prieiga:
http://nsdl.niscair.res.in/bitstream/123456789/561/1/

6.2

 S. Gauthier, „Atomic and molecular manipulations of individual adsorbates by STM.“ Applied Surface Science,
V. 164., p. 84, 2000.
 G. Binning, C. F. Quate, „Atomic force microscope.“ Phys. Rev. Lett. V. 56., No. 9, p. 930, 1986.
 V. L. Mironov, The textbook for students of the senior courses of higher educational institutions, 2004.
 V. Kruglov, D. O. Filatov, A. O. Golubok, The first step towards the study of nanotechnology Study Book,
2004.
 R. Garcia, P. Perez, „Dynamic atomic force microscopy methods.“ Surface science reports V. 47., p. 197–301,
2002.

6.3
 Bharat Bhushan (ed.), Springer Handbook of Nanotechnology, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2004.
 V. L. Mironov, The textbook for students of the senior courses of higher educational institutions, 2004
 A.V. Kruglov, D.O. Filatov, A.O.Golubok, The first step towards the study of nanotechnology Study Book,
2004.
 R. Garcia, P. Perez, Dynamic atomic force microscopy methods. Surface science reports V. 47., p. 197-301,
2002.
 K. Visser, G. J. Brakenhoff, and J. J. Krol, "Micromanipulation by "multiple" optical traps created by a single
fast scanning trap integrated with the bilateral confocal scanning microscope," Cytometry, V. 14, pp. 105-114,
1993.
 Morgan, et al, “Two dimensional matrix addressed vertical cavity top surface emitting laser array display”, IEEE
Photonics Technology Letters, Vol. 6, pp. 913 - 917.
 Denk, W. and W.W. Webb, "Optical Measurement of Picometer Displacements of Transparent Microscopic
Objects," Applied Optics 29(16), 2382-2391, 1990.

6.4
 Berthier J., Silberzan P. Microfluidics for Biotechnology. Second edition. Artech house. 2010, London, UK.
 Barry R., Ivanov D. „Microfluidics in biotechnology.“ J Nanobiotechnology. 2004; 2:2.
 Whitesides G. M. „The origins and the future of microfluidics.“ Nature. 2006; 442, 368–3 .

6.5

 Labeikytė D., Bagdonienė L. Proteominės analizės eksperimentiniai pagrindai, Vilnius, 2008.

 Sale A. J. H., Hamilton W. A. Effects of high electric fields on microorganisms: I. Killing of bacteria and
yeasts. Biochem. Biophys. Acta, 1967, 148:781-788.
 Dimitrov D. S. Electroporation and electrofusion of membranes. Handbook of Biological Physics, 1995,
1(18):851-900.
 Šatkauskas S. Elektroporacijos metodo efektyvumo tyrimas navikų elektrochemoterapijoje in vivo.
Daktaro disertacija, 1998.
 Weaver J. C., Gowrishankar, R. C. Lee. Acterization of cell membrane. Electropotarion. 1993.
 Dimitrov D. S. Electric field induced breakdown of lipid bilayers and cell membranes: a thin viscoelastic
model. J. Membr. Biol.,1984, 78:53-60.
 Powell K. T., Weaver J. C. Transieant aqueous pores in bilayer membranes: a statistical theory, 1986,
15:211-227.
 Miklavčič D., Kotnik T. Electroporation for electrochemotherapy and gene therapy. Bioelectromegnetic
Medicine, 2004.
 Gehl J., Skovsgaard T., Mir L. M. Enhancement of cytotoxicity by electropermeabilization: an improved
method for screening drugs. Anticancer drugs, 1998; 9(4):319-325.
6.6
 Kapitza HG. Microscopy from the very beginning. 2nd revised edition. Carl Zeiss Jena GmbH 1997.
 Kirvelienė V. Optinė mikroskopija ir skaitmeninis vaizdinimas. Technologija, Kaunas 2008.
 Vengris M. Eksperimentinės biofizikos metodai: paskaitų konspektas. Vilnius 2006-2008.
 Tutorials: http://www.olympusmicro.com/primer/java/index.html
 http://www.microscopyu.com/
 Brewster V, Jarvis R, Goodacre R. Raman spectroscopic techniques for biotechnology and Bioprocessing.
European pharmaceutical review, issue 1. 2009
 http://www.timkelf.com/Research/ResearchSERS.html

6.7
 Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. New York, 1998.
 G.A. Wagnieres, W.M. Star, B.C. Wilson. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological
applications. J. Photochem. Photobiol. 1998, 68, p. 630-632.
7. Nanotechnologijos taikymai biomedicinoje
7.1. Nanobiorobotikos pagrindai

Įvadas

Įsivaizduokite, kad jūsų kaulai apipinti tokia medžiaga, kad nukritus nuo namo stogo galite atsikelti
ir eiti toliau. Įsivaizduokite, jog gaisro atveju mikroskopinės 1000 atmosferų slėgio kameros pilnos
gryno deguonies, reaguodamos į deguonies kiekį kraujyje užtikrins visų audinių „kvėpavimą“
kelioms valandoms. Įsivaizduokite mažutėlius mechanizmus – nanorobotus įleistus į kraujotaką. Jie
ardytų ant kraujagyslių sienelių susidariusias nuosėdas, sukeliančias aterosklerozę, taisytų vėžio
pažeistas ląsteles ar atkurtų audinius. Arba burnos nanoprižiūrėtojus, kurie galėtų gydyti dantenų ligas
ir dantų ėduonį. Ir dar daugybę kitų įvairių nanomechanizmų, patruliuojančių organizme ir puolančių
kiekvieną nepažįstamąjį bei teikiančių informaciją apie jūsų sveikatos būklę molekuliniu lygmeniu.

Šiuo metu nanorobotizacijos medicinoje pradžia numatoma 2050-aisiais metais. Žinoma, prieš
susižavint jos pažadais reikėtų išsiaiškinti, kurie iš jų iš tiesų įmanomi. Naujausi mokslo laimėjimai
teikia vilčių, kad nanomechanizmai gali būti sukurti. Pavyzdžiui, atominės jėgos mikroskopu buvo
atliktas pirmas žingsnis nanogamybos link: du stačiakampiai plyšiai ir 50 nm stačiakampis kaištis
buvo išpjauti iš kristalo. Kaištis slankiojo iš vieno plyšio į kitą, pakaitomis juos mechaniškai
uždarydamas. Mikroelektromechaninių sistemų (MEMS) technologija buvo pagaminti 100 µm
dydžio akselerometrai, vožtuvai, stūmokliai, krumpliaračiai ir pjezomotorai, kurie šiandien jau yra
masinėje prekyboje. Taip pat – mikrogniaužtai, kuriais galima manipuliuoti 2,7 µm objektais, ar netgi
veikiantis 2,8 mm dydžio elektromobilis. Jis turi variklį, ratus, kėbulą, padangas, bamperius ir netgi
10 µm storio numerio lentelę.

Nanodalių kūrimas šiuo metu yra tik kompiuterinės simuliacijos, tačiau jau yra ir detaliai aprašyti
keli tikėtinų nanorobotų modeliai. Šiandien numatoma nanorobotus gaminti pasitelkiant molekulinę
nanotechnologiją. Tačiau dar reikia išspręsti nanodalių gamybos ir sujungimo klausimus, ieškoti
optimalių gamybos būdų. Taip pat reikia įgyvendinti kompiuterizuotą nonorobotų valdymą. Be visų
techninių sunkumų, iškyla dar ir finansinių išteklių ribotumas bei socialiniai klausimai.

Nanorobotai

Taikant nanobiotechnologiją medicinoje yra keliami tokie klausimai: kokias specifines problemas
medicininėje terapijoje galima bus išspręsti naudojant nanobiotechnologiją? Kokias problemas gali
išspręsti nanobiotechnologija, bet dar neįmanoma išspręsti naudojant mikrotechnologiją? Kokie
mechanizmai ir medžiagos, turinčios terapeutinį pritaikymą, gali būti sukurtos pasitelkiant
nanobiotechnologiją?

Nanorobotų kūrimo galimybės

Pagrindiniai medicinai keliami tikslai per ateinančius 10–30 metų yra mikrometrinio dydžio
mechanizmų, sudarytų iš nanometrų dydžio dalių, konstravimo metodų kūrimas ir gamyba. Tokie
mechanizmai galėtų būti sudaryti iš 100 nm manipuliatoriaus rankos, 400 nm mechaninių GHz dažnio
kompiuterių, 10 nm rūšiuojančių rotorių bei lygaus itin tvirto deimantinio paviršiaus.

Nanorobotai yra apibrėžiami kaip kompiuteriu valdomi ~ 1 m (1000 nm) dydžio mechanizmai,
surinkti iš nanokomponentų ir sukurti tam tikrai pasikartojančiai ir preciziškai užduočiai atlikti. Jie
taip pat dar vadinami „patvaria molekuline nanotechnologija“ ir gali būti suskirstyti į dvi grupes:

 Autonominiai nanorobotai – kiekviename jų yra valdantis nanokompiuteris, leidžiantis

funkcionuoti nepriklausomai;

 „Vabzdžiai“ – taip vadinama grupė identiškų nanorobotų, valdomų vieno centrinio kompiuterio.

Dabar yra dvi pagrindinės problemos, kurios turi būti išspręstos – tai nanorobotų gamyba ir jų
valdymas. Jos yra labai susijusios, nes tokie maži dydžiai apriboja valdymo ir programavimo
galimybes. Tikrai nerealu tikėtis, kad nanorobote bus šiuolaikinis asmeninis kompiuteris ir
komunikacija vyks per TCP/IP protokolus. Labiausiai tikėtina, kad nanorobotų valdymas bus
dabartinių sensorinių tinklų tyrimų tąsa. Nanorobotų konstrukcija turi derinti nanodydžio jutiklius,
kompiuterius, stimuliatorius ir komunikacijas.

7.2. Molekuliniai mechaniniai komponentai, biomolekulių nanomašinos

Dauguma pasiūlymų ilgalaikėms nanostruktūroms yra naudoti stipriausias, kiečiausias medžiagas

(tokias kaip deimantas ar safyras). Galima sudėti atomą prie atomo ir taip sukurti medžiagas, kurių
Jungo modulis yra 1012 N/m2. Dažnai sutinkama sąvoka diamondoid. Tai – struktūros, panašios į
deimantą plačiąja prasme. Jos yra tvirtos, labai tankios, turinčios trimates kovalentines jungtis,
suformuotos daugiausia iš pirmos ar antros eilės trivalenčių ar didesnio valentingumo atomų.

Taip pat numatoma galimybė kaip statybinę medžiagą naudoti DNR molekules. Jungiant atitinkamas
bazes galima suformuoti trimates geometrines struktūras – blokus sudėtingesnėms struktūroms –
alkūnėms, kilpoms, pynėms ir kt. (7.1 pav.).

7.1 pav. Struktūros, sudarytos iš DNR molekulių: a) dvimatis tinklelis; b) „Borromean Rings“;
c) DNR molekulės, sujungtos į kubą
DNR grandinių pranašumai:

 Tarpmolekulinės reakcijos nuspėjamos ir gali būti valdomos;

 DNR gali būti valdoma ir modifikuojama įvairiais žinomais fermentais;

 Dviguba DNR grandinė yra stabili molekulė ir tvirtas polimeras.

Bet kokios rūšies mechanizmų gamybai reikalingi du etapai – dalių gamyba ir jų sujungimas.
Neteisinga įsivaizduoti, kad atomais lengva manipuliuoti – jie nuolatos juda, svyruoja, reaguoja ir
tarpusavyje jungiasi. Kiekvienas „paklydęs“ atomas ar molekulė tokioje struktūroje gali veikti kaip
priemaišos, kurios gali užkimšti ir sugadinti įrenginį. Įvairios vibracijos, elektrinės jėgos, šiluminis
plėtimasis, magnetinės sąveikos bei paviršiaus įtempimai turi visai kitokią įtaką nanoskalėje.
Konstrukcija, kuri atrodo labai pagrįsta ir priimtina makro- ar mikropasaulyje, nanoskalėje gali visai
nepasiteisinti.

Pirmiausia reikėtų atsirinkti, kokius nanodydžio mechaninius komponentus yra įmanoma pagaminti.
Molekulinės technologijos kompanijos „Zyvex Corp.“ mokslininkai K. Ericas Drexleris ir C. Ralphas
Merklas kuria ir išbando molekulinius nanotechnologinius mechanizmus (taip pat ir didelės
struktūros bei visiškai sukomplektuotus įrenginius) per kompiuterines simuliacijas.

Molekuliniai guoliai yra viena iš galimų nanorobotų komponenčių. Ji patogi savo nesudėtinga
struktūra ir veikimu. 7.2 pav. pavaizduotas tuščiaviduris guolis, sudarytas iš 2808 atomų. Jo skersmuo
– 4,8 nm. Ašies ir įvorės briaunos susikabina sudarydamos labai tvirtą struktūrą. Bandymais kilnoti
ašį žemyn ar aukštyn, lenkti į šonus ar nukreipti bet kokia kryptimi buvo nustatytas didelis šio guolio
atsparumas. Kokio mažumo tokie guoliai gali išlikti tvirti? Tai dar nėra aišku.

7.2 pav. Molekulinis guolis

7.3 pav. pavaizduotas iš 3557 atomų sudarytas krumpliaratis, kuris turi 12 judančių dalių. Jis yra 4,3
nm skersmens ir 4,4 nm ilgio, jo molekulinė masė apie 51 MDa, tūris 33,458 nm3. Kompiuterinės
molekulinės dinamikos skaičiavimai parodė, kad tokio krumpliaračio centrinė ašis sukasi greitai, o
kraštinės ašys – lėtai. Makropasaulyje tokie krumpliaračiai naudojami automobiliuose ar kituose
mechanizmuose, norint keisti ašių sukimosi greičius. Esant normalios veiklos sukimosi dažniams
(nuo <1 GHz) krumpliaratis veikė kaip buvo numatyta – neperkaisdamas. Pakėlus temperatūrą iki
400 K ir pasiekus apie 100 GHz sukimosi dažnį atsirado nestabilumų, nors krumpliaratis ir neiširo.
Tikrame nanorobote, susidedančiame iš daugelio mechaninių komponentų, toks krumpliaratis bus
įtvirtintas korpuse. Sukimosi dažniai bus ne tokie dideli.
 7.3 pav. Molekulinis krumpliaratis

NASA „Systems Division“ pasiūlyti krumpliaračiai (taip pat kompiuteriniai skaičiavimai) būtų
gaminami iš anglies nanovamzdelių – 7.4 pav.

7.4 pav. Krumpliaračiai iš anglies nanovamzdelių

Molekulinis dujų siurblys (7.5 pav.) – įrenginys, veikiantis kaip siurblys neono dujų atomams arba
kaip variklis, kuris gali neono dujų slėgį paversti sukimosi jėga. Siurblys sudarytas iš 6165 atomų, jo
tūris 64 nm3. Sraigtinis rotorius kiekviename savo gale turi po cilindrini guolį su grioveliais. Veikimo
metu, besisukant ašiai, sraigtinis griovelis yra įstumiamas išilgai griovelių į siurblio vidų. Pakanka
vietos tik toms mažoms dujų molekulėms, kurios susiduria su grioveliu kai ašis sukasi – neono atomai
juda kartu (tolyn). Šio molekulinio siurblio struktūriniai nestabilumai atsiranda esant žemiems ir
aukštiems sukimosi dažniams.
 7.5 pav. Molekulinė neono dujų pompa

Taip pat buvo sumodeliuotas tikslaus judėjimo valdiklis (7.6 pav. kairėje), leidžiantis nustatyti padėtį
atomo tikslumu. Jis yra sudarytas iš 2596 atomų. Sistemos šerdis susideda iš ašies, jungiančios dvi
heksagonalines plokšteles sujungtas su aštuoniais žiedais. Šis valdiklis primena modifikuotą Stiuarto
platformą (jos brėžinys pateiktas 7.6 pav. dešinėje). Toks nanoįrenginys geba atlikti preciziškus
judesius, panašius į mūsų rankos pirštų. Jis gali keisti savo padėtį net kelių atomų tikslumu bei
pasisukti 90 laipsnių kampu. Visiškai surinktoje sistemoje kiekvienas žiedas bus sukamas sverto,
ateinančio iš pirštelio. Kiekvienas žiedas turi atramą, prijungtą prie centrinės platformos. Žiedo
sukimasis pajudina atramą, atrama – platformą. Visų aštuonių žiedų padėties nustatymas nusako
platformos padėtį x, y ir z ašyse, sukimąsi bei nuolydį.

7.6 pav. Kairėje: tikslaus judėjimo valdiklis; Dešinėje: Stiuarto platforma

Numatomi nanodalių jungimo būdai

Bet kokios rūšies mechanizmų gamybai reikalingi du etapai – dalių gamyba ir jų sujungimas. Vienas
didžiausių trukdžių norint pritaikyti molekulinę nanobiotechnologiją yra programuojamo
nanosurinktuvo (PNS) reikalingumas. Tai – nanodydžio įrenginys, skirtas atomų ar mažų molekulių
tiksliai padėčiai nustatyti ir joms sujungti. Jis būtų naudojamas paralelinėse surinkimo linijose,
kuriant kietas nanodydžio dalis, kurių neįmanoma sukurti kitomis priemonėmis. Tam, kad PNS būtų
pagamintas, reikia atomus arba mažas molekules tiksliai surinkti į kietas dalis. Norint gauti
„struktūrinį kietumą“, reikia nustatyti atomų padėtis ir tvirtai sujungti atomus ar molekulių grupes
kovalentinėmis jungtimis. Šiuo metu didžiausios praktiškai sukurtos kietos molekulės yra
nanovamzdeliai. Tačiau jie gaminami iš tirpalų, o ne tiesiogiai surenkami iš atskirų molekulių.
„Zyvex Corp.“ žada per 10 metų pagaminti PNS nanodalis pasitelkę atominės jėgos mikroskopiją.

Kai pagaminamos atskiros būsimo roboto nanodalys, jas dar reikia prasmingai sujungti. Kuriant
molekulinius įrenginius (įrankius, kurie padėtų susidaryti kompaktinėms struktūroms, turinčioms
kovalentines jungtis) gali būti naudojama baltymų inžinerija.

Yra du būdai:

 Paruošti molekules, kad tiksliai kontroliuojant padėtį ir orientaciją jos reaguotų ir „susirištų“
taip, kaip planuota. Sudėtingiausios šiuo metu dirbtinai pagamintos nanodydžio dalys –
molekuliniai jungikliai. Jie yra naudojami molekulinės elektronikos srityje;

 Sukurti fermentus, kurie sugriebtų molekules, nustatytų atitinkamą jų padėtį ir jas sujungtų.

Fermentų ar robofermentų skaičius, reikalingas vidutinio dydžio nanomechanizmo daliai pagaminti,

kinta nuo dešimčių iki kelių šimtų. Genai ar reguliuojančios sekos reikalingos šiems baltymams
sintetinti galėtų būti įkomponuojamos į mikroorganizmų genomą – taip modifikuoti organizmai galės
„gaminti“ atitinkamas nanodalis. Toliau šios dalys gali būti surenkamos į nanosistemas – tokias kaip
PNS. Tam galima naudoti MEMS ar NEMS metodus.

Mikro/Nanoelektroninių mechaninių sistemų metodai (MEMS/NEMS) – gali būti traktuojami kaip

technologija arba gamybos procesas. Jo metu nanomechaniniai elementai, nanobiojutikliai,
nanostimuliatoriai ir nanoelektronika sujungiami į veikiančias nanosistemas. Dažnai tokių sistemų
gamybai naudojami įvairūs nanolitografijos metodai, kuriais suformuojami nanomechaniniai arba
bioelektromechaniniai įrenginiai. Sujungiama nanoelektronika ir nanobiotechnologijos. Tačiau
perspektyvesnis yra „bottom–up“ nanosistemų gamybos metodas. Jis sietinas su supermolekuline
saviorganizacija ar savitvarka. Pirminės biomolekulės ar atomai kuriami taip, kad (esant
atitinkamoms aplinkos sąlygoms) savarankiškai susiorganizuotų į dideles nanosistemas. Tam labai
svarbi molekulių tarpusavio sąveika, specifinės atomų ar molekulių erdvinės struktūros ar atskirų jas
sudarančių dalių orientacijos.

Įvertinus esančias ir besiplečiančias technologijas, numatoma, kad atskiros nanodalies, sudarytos iš

~ 2600 atomų, gamybos linijos kaina bus apie 6 milijonai eurų. Numatoma, kad per 20 metų
nanorobotų dalių surinkimo linijos kaina bus mažesnė nei 1 milijonas eurų.

Nanorobotų forma

Nanomechaninės sistemos nuo biologinių skiriasi tuo, kad nanomechaniniai komponentai yra
suvaržyti kietu korpusu. Biologiniai komponentai gali laisvai judėti vienas kito atžvilgiu. Nanodydžio
komponentai gali būti jungiami į rinkinius, kurie nebūtinai turi būti pastovios formos. Galimas
periodinis jų konfigūracijos ir pozicijos keitimas. Mechanizmo forma yra nustatoma pagal tai, kokios
yra jo numatomos funkcijos ir kokioje aplinkoje jis turės veikti.

Yra išskiriamos kelios pagrindinės nanoįrenginių klasės:

1. Laisvai plaukiojantys pavieniai nanoįrenginiai. Jie būtų pritaikomi pernešant ar saugant
medžiagas. Tokie nanorobotai gali būti sferiškai simetriški, turintys kietą paviršių. Sferinės dalelės
turi mažiausią įtaką kraujo klampumui (mažiausias jų sąveikos plotas su krauju). Tai leidžia naudoti
didelius jų kiekius iš karto, sumažinama biologinio suderinamumo problema.

2. Aktyviai plaukiantys nanoįrenginiai. Jie greitai plaukia kraujotakos sistemoje. Tokius įrenginius
reikia atitinkamai vairuoti, dideli jų kiekiai būtų pavojingi organizmui. Medicininių taikymų srityje
ši savybė daugeliu atveju nėra reikalinga. Didžiausią įtaką daro aplinkos klampumas, o ne inercija.
Tinkamiausios šių nanoįrenginių formos – tokios, kad per nanoįrenginių vidurį galėtų pratekėti juos
stumiantys skysčiai.

3. Ląstelių viduje veikiantys nanoįrenginiai (artimos sferai formos).

4. Mozaikiniai nanoirenginių agregatai – nanoaudiniai. Vienas svarbus medicininių

nanomechanizmų taikymo reikalavimas – kelių milijonų ar milijardų artimai vienas su kitu susijusių
nanorobotų bendra veikla. Tam reikia, kad atskiri įrenginiai tiktų (gerai priglustų) vienas prie kito,
sudarydami periodinę mozaiką išilgai paviršiaus. Šio nanoįrenginių agregato reikia tam, kad būtų
sukurtas orui ir vandeniui nepralaidus izoliacinis sluoksnis.

5. Erdviniai nanoįrenginių agregatai – nanoorganai. Specializuotose struktūrose (tokiose kaip

sintetiniai kaulai ar dirbtiniai organai), kurie yra surinkti iš milijonų ar milijardų nanorobotų taip pat
gali būti reikalingi nanoįrenginiai. Jų reikia, kad būtų visiškai užpildyti tam tikri vidiniai tūriai.

7.3. Dirbtinis mechaninis eritrocitas – „respirocitas“

Yra pabandyta detaliai aprašyti tik kelių specifinių medicininių nanoįrenginių teorinius modelius.
Aktyviausias šioje srityje yra „Zyvex Corp.“ ir Molekulinės pramonės instituto („Institute for
Molecular Manufacturing“) mokslininkas R. A. Freitas. Jis nuosekliai aprašė trijų galimų nanorobotų
teorinius kūrimo modelius: kraujo kūnelių atitikmenų – dirbtinio mechaninio eritrocito (respirocito),
dirbtinio mechaninio fagocito microbivores (galimas vertimas pažodžiui – „mikrobų dantys“) ir
dirbtinio mechaninio trombocito (klotocito).

Deguonis ir CO2 į plaučius bei kitus audinius daugiausia yra pernešami raudonųjų kraujo kūnelių.
Hemoglobinas (pagrindinis baltymas eritrocite) susijungia su deguonimi ir virsta oksihemoglobinu.
Taip yra pernešama apie 95 % deguonies, jo likutis ištirpsta kraujyje. CO2 taip pat susijungia su
hemoglobino aminogrupėmis – suformuojamas karbamihemoglobinas. Apie 25 % CO2, susidariusio
ląstelių metabolizmo procesuose, yra pernešama šios formos. 10 % ištirpsta kraujo plazmoje, o likę
65 % CO2 yra pernešami eritrocitų viduje hidratavus CO2 iki bikarbonato jono (veikia fermentas
karboanhidrazė). Karbamihemoglobino ir bikarbonato jonų susidarymo metu atsipalaiduoja
vandenilio jonai. Jie (jeigu nebūtų hemoglobino, kuris sugeria perteklinius H+) veninį kraują padarytų
apie 800 kartus rūgštesnį nei arterinį.

Dabartiniai kraujo pakaitalai yra įvairios hemoglobino fluorokarbono emulsijos. Tačiau jos tik
perneša deguonį į audinius, bet nereguliuoja CO2 kiekio kraujyje. Pagrindinis modeliuojamo dirbtinio
mechaninio eritrocito tikslas – pernešti deguonį iš plaučių į kūno audinius ir palaikyti kraujo
rūgštingumą. Dirbtinio respirocito pagrindiniai taikymai:

 Perpilamo kraujo pakaitalas;

 Anemijų, įvairių plaučių ligų, kvėpavimo sutrikimų gydymas;
  Dirbtinio kvėpavimo palaikymas atitinkamose aplinkose ar operacijos metu, išlaikant
pakankamą audinių deguonies prisotinimą.
-9
Vidutinė gydymo dozė sudarytų 1–10 trilijonų nanorobotų. Ji užima 10 l tūrį. Tai – 100 000 kartų
mažesnis tūris nei skysčių, esančių žmogaus organizme. Dirbtinis mechaninis eritrocitas į vienetinį
audinio tūrį perneštų 236 kartus daugiau deguonies nei natūralus raudonasis kraujo kūnelis.
Paprasčiausias respirocito modelis deguoniui iš plaučių į kūno audinius pernešti yra mikroskopinė
sferinė slėgio kamera (7.7 pav.).

7.7 pav. Respirocitas, jo palyginimas su eritrocitais

Eritrocito matmenų ribą nesunku nustatyti iš to, kad respirocitas turi kraujagyslėmis pasiekti visus
audinius. Taigi jis negali būti didesnis nei žmogaus kapiliarai (kurie vidutiniškai yra 8 m, bet būna
ir 3,7 m skersmens). Kad pro tokius mažus kapiliarus pralįstų eritrocitai (eritrocito ilgis 7,82m ir
storis kraštuose 2,58 m), jie turi perlinkti pusiau. Galimas minimalus respirocito spindulys yra
nustatomas pagal veikimo reikalavimus ir minimalius komponenčių dydžius, taip pat optimalų
paviršių, skirtą rotoriams. Apskaičiavimais nustatytas galimas respirocito skersmuo nuo 0,2 iki 2 m.

Dujų saugyklų dydis nustatomas Van der Valso lygtimi (7.1). Ja aprašomas baigtinis dydis, į kurį gali
būti suspaustos molekulės, įskaitant ir tarpmolekulines jėgas, atsirandančias augant tankiui:
nRT An 2
P  2 (7.1), kur P – slėgis Pa, universalioji dujų konstanta R = 8,314
V  nB V
J/(mol·K), žmogaus kūno temperatūra T = 310 K, n - dujinės medžiagos kiekis (mol), V – tūris (m3),
A ir B – konstantos, nustatomos eksperimentiškai kiekvienoms dujoms.

Iš Van der Valso lygties gauname, kad didėjant slėgiui iki 1000 atm respirocito užpildomų dujų tankis
pastebimai didėja, tuo tarpu esant slėgiui virš 10 000 atm dujų tankio padidėjimas yra sąlyginai mažas.
Didėjant dujų slėgiui respirocito viduje atsiranda galimybė dujų saugyklų sprogimui. Pagal atliktus
skaičiavimus nustatyta, kad optimalus užpildomų dujų slėgis respirocite – 1000 atm (palyginkite –
eritrocitas sulaiko deguonį esant 0,51 atm. slėgiui, kurio tik 0,13 atm. pristatoma į audinius).

Pagrindiniai respirocite vykstantys procesai

Aktyvi dujų konvekcija. Kaip turi veikti respirocite esančios dujų saugyklos? Respirocitas nuolat
judėdamas žmogaus kraujotakoje turi aprūpinti deguonimi visą organizmą arba reaguodamas į
konkrečių vidinių organų deguonies trūkumą lokaliai pristatyti reikiamą kiekį deguonies. Be to,
reikia palaikyti atitinkamą kraujo rūgštingumą – respirocite turi vykti CO2 transportas, turi būti
buferis, galintis kaupti rūgšties perteklių. Negali būti vien pasyvių sistemų: respirocito kameros turi
būti pastoviai įkraunamos. Geriausia – plaučiuose, nes tiesiogiai O2 gauti iš CO2 negalima
energetiškai. Apsaugai nuo CO2 toksiškumo lengviausia yra sukurti papildomas respirocito
saugyklas. Jos būtų pripildomos audiniuose ir iškraunamos plaučiuose.

Sėkmingas respirocitų funkcionavimas užtikrinamas aktyvia dujų molekulių konvekcija į

hermetiškos mikrokameros vidų ir išorę. Tam būtų naudojami molekuliniai rūšiavimo rotoriai (7.8
pav.).

7.8 pav. Molekulinis rūšiavimo rotorius

Kiekvienas rotorius išilgai krašto turi prisijungimo „kišenes“, kurios jam besisukant būna atsukamos
tai į kraujo plazmą, tai į vidinę kamerą. Kiekviena atsukta į plazmą kišenė selektyviai prisijungia tam
tikrą molekulę. Kai rotoriaus kišenė atsisuka į vidinės kameros pusę, prisijungusios molekulės nuo
jos „nubraukiamos“. Molekuliniai rūšiavimo rotoriai gali būti suformuoti iš 105 atomų, jų matmenys
apytiksliai būtų nuo 7x14x14 nm, o masė 2·10-21 kg. Tokie įrenginiai galėtų rūšiuoti nedideles (iki
20 atomų) molekules 106 molekulių/s greičiu. Energinės sąnaudos – 10-22 J/molekulei. Rotoriai
sukasi į abi puses. Jie gali ir įkrauti, ir iškrauti saugojimo kameras priklausomai nuo sukimosi
krypties. Specifinių molekulių receptoriai turi būti labai patikimi (didelis specifiškumas ir
afiniškumas) ir „ištverti“ ilgalaikę sąveiką su vandenine kraujo aplinka.

Energijos gamyba. Vietinė energija yra gaunama iš mechaninio cheminio variklio, kuris
egzoenergiškai jungia gliukozę su deguonimi. Vykdoma reakcija: C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O
+ ΔEg, o išsiskyrusi energija ΔEg = 4,7 zJ. Cheminis variklis gamina mechaninę energiją reikalingą
molekulių rūšiavimo rotoriams ir kitoms subsistemoms veikti. Natūralūs metaboliniai procesai
ląstelėse (tokie kaip glikolizė ir Krebso ciklas) pasiekia apie 68 % efektyvumą. Respirocitui
apskaičiuotas apie 50 % naudingumo koeficientas.

Rūšiuojantieji rotoriai gliukozę gaus tiesiogiai iš kraujo ir kaups ją kuro kamerose, o deguonis bus
tiekiamas iš respirocito viduje esančių saugyklų. Energijos sistema nustatyta taip, kad gliukozės
variklis pripildytų visai tuščią O2 kamerą per 10 s, generuodamas apie 3 x 10-13 W galią. Pumpavimo
stiprumas – 108 molekulių/s. Dujoms šis greitis nėra apribotas difuzija, nes didžiausia difuzijos srovė
distiliuotame vandenyje esant 20 °C temperatūrai yra J = 4RCD ~ 109 molekulių/s. Čia: C = 7,3·1022
molekulių O2/m3 (arteriniame kraujyje), ir R = 0,5 μm, deguonies ir anglies dioksido difuzijos
koeficientas distiliuotame vandenyje esant 20 °C temperatūrai D = 2·10-5 cm2/s.

Pagal K. E. Drexlerio skaičiavimus, mechanocheminiam jėgos virsmui 109 W/m3 gliukozės variklio
matmenys galėtų būti 42x42x175 nm. Jis būtų sudarytas iš 108 atomų (~10-18 kg).

Gliukozės kuro kameros matmenys yra apskaičiuoti taip, kad viena pilna kuro kamera varytų variklį
10 s, sunaudodama 5 % O2 dujų ir išleisdama panaudoto vandens tūrį, kuris apytiksliai lygus
sunaudotam gliukozės kiekiui. Tokios kuro kameros matmenys būtų 42x42x115 nm, ji susidėtų iš 108
atomų (masė ~10-18 kg) ir galėtų sutalpinti ~ 106 gliukozės molekulių. Ji galėtų būti visiškai
užpildoma per ~10-3 s. Energija iš gliukozės variklio galėtų būti perduota mechaniškai arba
hidrauliškai, naudojant tam tinkamus darbinius srautus ir paskirstyta naudojant traukes,
krumpliaračius. Taip pat gali būti naudojami vamzdžiai su mechaniškai valdomais vožtuvais
(kontroliuojamais kompiuteriu).

Komunikacija. Optimalu naudoti moduliuotus spūdžiuosius slėgio impulsus, kuriuos priimtų

mechaniniai keitikliai (dažnio fliuktuacijas keičiantys į mechaninius judesius). Jie būtų įmontuoti
respirocito paviršiuje. K. E. Drexleris pasiūlė perduoti duomenis < 10 MHz dažniu ( esant~107 bitų/s
informacijos srautui) panaudojant 10 atm slėgio impulsus (tokius pat, kaip ultragarso diagnostinėse
sistemose). Tokių signalų sugeriama tik ~10 % vienam centimetrui signalo sklidimo kelio. Todėl
signalus galima būtų perduoti visame kūne. 10 nm3 dydžio jutiklis, matuodamas megahercų dažnio
0,1 atm slėgio impulsus sunaudoja tik 10-20 J/impulsui. Tai labai mažas energijos kiekis.

Jutikliai. Įvairūs jutikliai yra reikalingi išoriniams duomenims gauti, dujų iškrovimo ir įkrovimo
operacijoms reguliuoti, molekulių koncentracijoms nustatyti. Minėti molekulių rūšiavimo rotoriai
gali būti naudojami ir bet kurių molekulių koncentracijos jutikliams konstruoti (7.9 pav.) Paprastas
dviejų kamerų modelis, kuriame yra įėjimo rotorius (jis juda 1 % normalaus greičio) yra sujungtas su
skaičiuojančiuoju rotoriumi, prijungtu prie kompiuterio. Taip suskaičiuojamos reikalingos
molekulės, esančios tam tikrame skysčio tūryje. Skystis iš aplinkos patenka į fiksuoto dydžio
rezervuarą, kuris naujai pripildomas 104 kartų/s naudojantis dviem siurbliais.
 7.9 pav. Molekulinių koncentracijų jutiklis

Esant įprastinėms kraujo koncentracijoms toks jutiklis suskaičiuoja:

 ~ 100 000 gliukozės molekulių/s;

 ~ 30 000 molekulių/s arterinio ar veninio CO2;
 ~ 2000 molekulių/s arterinio ar veninio O2.

Tokio jutiklio matmenys yra 45x45x10 nm, jis sudarytas iš ~500 000 atomų, jutiklio masė ~10-20 kg.

Taip pat reikalingi ir vidiniai slėgio jutikliai O2 ir CO2 dujoms įkrauti ir iškrauti, balasto ir gliukozės
kuro kamerų užpildymui stebėti. Reikalingi vidiniai ir išoriniai temperatūros jutikliai – temperatūros
stebėjimui bei visos sistemos energijos apykaitai reguliuoti.

Respirocito plūdrumas. Jis kontroliuojamas įkraunant ir iškraunant vandens balastą. Kuo mažesnis
respirocitas, tuo lėčiau jis nusėda iš suspensijos, kaip apibrėžia Stokso dėsnis (7.2):
v  2 gR 2 ( 1   2 ) / 9 (7.2),
kur Vt – ribinis greitis (cm/s), g – laisvojo kritimo pagreitis (9,81 m/sek2), 1 ir 2 – įrenginio ir
skysčio tankiai (g/cm3),  - skysčio klampumo koeficientas. Jis lygus 0,0011 Pa·s kraujo plazmai ir
0,004 Pa·s kraujui, esant 310 K temperatūrai.

1 m respirocitas (jo tankis yra nuo 679 kg/m3, kai saugyklos tuščios, iki 1370 kg/m3, kai saugyklos
pripildytos) pakils arba nuskęs 0,1–0,6 mm/h.
Kai terapeutiniai tikslai bus pasiekti, reikės ekstrahuoti (pašalinti) dirbtinius mechanizmus iš kraujo
apytakos. Tam bus naudojama kiekvieno respirocito vandens balasto kontrolė. Nustačius jų neutralų
plūdrumą ir leidžiant kraują per centrifugą visi kiti komponentai nusės. Respirocitai liks kraujo
plazmoje. Perleidus kraujo plazmą su respirocitais per atitinkamą filtrą respirocitai bus surinkti, o
plazma ir centrifuguotos dalelės bus grąžinamos atgal į kraują.

Valdymas. „On–board“ (respirocito vidaus) kompiuteris yra reikalingas preciziškai kontrolei,

kvėpavimo dujoms įkrauti ir iškrauti į talpyklas, rotoriaus lauko ir balasto kameroms valdyti,
gliukozės varikliui reguliuoti, energijai paskirstyti, jutiklių teikiamiems duomenims bei komandoms,
gautoms iš išorės, interpretuoti ir avariniam išsijungimui aktyvinti.

104 bitų/s kompiuteris turėtų atitikti visus kompiuterinius reikalavimus, keliamus paprastoms
cheminių procesų reguliavimo sistemoms, naudojamuose gamyklų įrenginiuose. Šis kompiuteris turi
maždaug 105 bitų vidinės atminties. Skaičiuojama, kad ~500 bitų·nm3/s ir 1018 bitų·W/s yra skirta
nanomechaniniam kompiuteriui, o ~5 bitų/nm3 – nanomechaninėms kaupimo sistemoms (kiekvienai
po 104 bitų/s). Kompiuteris užima ~104 nm3 tūrį ir naudoja ~10-14 W galios. Tai maždaug 3 % galios,
sugeneruotos vieno gliukozės variklio. 500 Kb atminties reikalauja ~105 nm3 respirocito tūrio.

Respirocito saugumas

Respirocito saugumas priklauso nuo jo mechaninio patikimumo (patekus į neįprastas sąlygas) ir nuo
jo suderinamumo su žmogaus organais, audiniais ir biocheminėmis sistemomis. Paprasti respirocito
mechaniniai sutrikimai turi būti greitai detektuojami ir pataisomi (pvz.: užsikimšę rotoriai ar
dujotiekiai, dujų nutekėjimas). Tačiau kai sutrinka respirocito valdymas, avarijos tampa kritiškos:
gali įvykti mechanizmo perkaitimas, nuo patekimo į santykinai sausą padėtį (kremzles) gali
užsikimšti vienas (ar daugiau) gliukozės variklių, nereguliuojami rūšiavimo rotoriai gali perpildyti
slėgio baką ir kt. Per 10 sekundžių (jeigu gliukozės variklis nesustabdytas) respirocitas sunaudoja
degalų baką ir pagamina apie 6,1 pJ energijos. Dėl to jo temperatūra gali pakilti 5,5–32,9 laipsniais.

Pavieniai respirocitų sproginėjimai (dėl mechaninių pažeidimų) žalos organizmui nedaro.

Respirocitas gali būti sutraiškytas tik pakliuvęs tarp dviejų kietų plokščių paviršių. Kadangi skeleto
jungtys atskirtos nuo kraujotakos, vienintelė respirocito mechaninio pažeidimo galimybė – griežimas
dantimis, jei yra kokių burnos ertmės sužeidimų. Perkandus iš karto kelis tūkstančius respirocitų
burnoje pasijaustų „šnypštimas“.

7.4. Nanodalelės, jų fizikinės savybės ir taikymas biomoksluose

Nanodalelėmis (ND) vadinamos dalelės, kurių dydis yra 1–100 nm. Tai gana platus apibrėžimas,
tačiau jį sukonkretinti išties sudėtinga dėl didelės nanodalelių įvairovės, taikomos biomedicinoje
(7.10 pav.). Aptarsime kelis svarbiausius nanodalelių tipus, jų savybes ir pagrindines pritaikymo
galimybes.

Liposomos

Biologiniams taikymams priimtiniausios yra organinės nanodalelės. Atlikusios naudingą darbą

organizme jos gali būti suardytos, o nanodalelių skilimo produktai panaudoti metabolizmo
procesuose, neišsiskiriant nuodingiems junginiams. Biomedicinoje plačiai paplitusios yra
liposominės nanodalelės, į kurias galima patalpinti vaisto molekules ir jas panaudoti tikslingai
pristatant vaistą į pažeistą organizmo vietą.

Tokios nanodalelės dažnai sudarytos iš polinę grupę ir hidrofobinę grandinę turinčių molekulių –
fosfolipidų (7.10 pav. A). Fosfolipidai patekę į vandeninį tirpalą sudarys tokias struktūras, kad jų
hidrofobinė dalis minimaliai sąveikautų su polinėmis vandens molekulėmis, o hidrofilinės grupės,
priešingai, būtų orientuotos į tirpiklį. Taip iš fosfolipidų susidaro liposomos, micelės, ląstelių
membranos ir kitos struktūros (7.10 pav. B). Liposomų agregatinė būsena priklauso nuo hidrofobinės
sąveikos tarp hidrofobinių grandinių, stūmos jėgų tarp polinių grupių ir sąveikos su tirpikliu. Keičiant
temperatūrą, riebalų rūgščių ilgį, dvigubųjų (nesočiųjų) jungčių kiekį galima keisti hidrofobinės
sąveikos stiprumą, agregatinę būseną bei kitas dalelės savybes ir taip sintetinti norimo dydžio ir
stabilumo liposomas.
 7.10 pav.: A) fosfolipido molekulės struktūra; B) fosfolipidų sudaromos erdvinės struktūros;
C) liposomų panaudojimo vaistams ar kitoms molekulėms pristatyti schema

Į liposomas yra talpinami įvairūs vaistai, emulsijos, DNR ir kitos molekulės, kurios yra mažai tirpios.
Taip pat į jas talpinamos medžiagos, kurios įvestos į organizmą greitai pašalinamos iš kraujo veikiant
apsauginėms sistemoms (imuninei sistemai, kepenims ir pan.). Vaisto įterpimas į liposomą prailgina
jo cirkuliavimą kraujyje ir padidina jo veikimo laiką bei efektyvumą. Į liposomą galima įtalpinti iš
esmės bet kokią medžiagą. Taip yra todėl, nes hidrofilinės medžiagos pernešamos liposomos viduje
(5.5 pav. C), o hidrofobinės medžiagos įeina į membranų sudėtį. Dėl to ši nanodalelė yra universali
medžiagų pernašos platforma.

Prie liposomos ar kitos nanodalelės paviršiaus galima prijungti ypatingas biomolekules. Tokių
molekulių pavyzdžiais gali būti peptidai, antikūnai, kurie pasižymi specifine sąveika su organizme
esančiomis molekulėmis (ląstelių receptoriais, antigenais). Yra žinoma, kad navikų kraujagyslių
ląstelės savo paviršiuje turi daug daugiau tam tikro baltymo – integrino αVβ3. Šis integrinas stipriai
sąveikauja su cikliniu RGD peptidu. Todėl jei prie liposomos (su vaistu nuo vėžio) paviršiaus
prijungsime šį RGD peptidą ir suleisime tokią nanodalelę į kraujotaką, didžioji dalis šių liposomų
sąveikaus su vėžinėmis kraujagyslėmis, o prie sveikų ląstelių neprikibs. Taip vaistinis preparatas
įgyja specifiškumą ir veikia tik vėžines ląsteles, nekenkdamas sveikosioms ląstelėms.

Natūraliai nanodaleles organizmas atpažįsta kaip svetimkūnį, stengiasi jas neutralizuoti ir pašalinti iš
kraujotakos. Todėl, kuriant vaistines nanodaleles, siekiama jų paviršių modifikuoti taip, kad jų
neatpažintų imuninės ląstelės. Yra parodyta, kad neutralaus krūvio ir savo išorėje turinčios ilgas
polimerines grandines nanodalelės mažiausiai sąveikauja su imuninio atsako elementais ir kraujyje
cirkuliuoja ilgiausiai.

Liposomos savo turinį gali išlaisvinti keliais būdais. Kadangi ląstelių membranos taip pat yra
fosfolipidinės, liposomos sienelė gali paprasčiausiai susilieti su ląstelės membrana. Nanodalelės
turinys bus išliejamas į ląstelės citozolį. Kitas būdas yra į liposomos sienelę įterpti specialių polimerų,
kurie yra jautrūs pH. Nanodalelei patekus į terpę su mažesniu pH (rūgštesnė terpė būdinga vėžinėms
ląstelėms ir lizosomoms), polimeras pakeičia savo erdvinę struktūrą. Todėl sienelė tampa takesnė
(skystesnė), dalelė destabilizuojama ir liposomos turinys gali išsilieti. Taip pat žinoma, kad lipidų
agregatinė būsena labai priklauso nuo temperatūros. Uždegiminiame audinyje ji dažniausiai yra
aukštesnė negu sveiko audinio (>37 °C). Tokiu būdu, į šią aplinką patekusių nanodalelių fosfolipidinė
sienelė suskystėja ir išlaisvinamas jų turinys.

Kietųjų lipidų nanodalelės

Kietųjų lipidų nanodalelės yra naujesnės kartos lipidinės dalelės (7.11 pav.). Jos pradėtos kurti kaip
alternatyva emulsijoms, liposomoms ir kitoms vaistų pernašos sistemoms. Kitaip nei liposomų, visą
kietųjų lipidų nanodalelių tūrį sudaro hidrofobinis užpildas, į kurį galima sutalpinti gerokai daugiau
vandenyje netirpių vaisto molekulių. Šių nanodalelių vidų sudarantys lipidai yra kietosios agregatinės
būsenos (iš čia ir jų pavadinimas), todėl jos yra stabilesnės už liposomas. Kietųjų lipidų nanodalelės
mažiau agreguoja už liposomas (kurios pasižymi sulipimu ir augimu). Pernešama medžiaga geriau
sulaikoma viduje (neišteka), nes difuzija kietojoje fazėje yra lėtesnė.
Lipidinės nanodalelės dažniausiai gaminamos aukšto slėgio homogenizacijos būdu arba veikiant
pradinių reagentų mišinį ultragarsu. Dėl to susidaro vienalytė nanodalelės užpildo masė. Kartais
naudojami tirpiklio garinimo, purškiamojo džiovinimo ir kiti metodai.

Panašiai kaip ir liposomos, šios lipidinės nanodalelės taikomos vaisto, baltymų, peptidų,
nukleorūgščių ir kitų molekulių pernašai. Jų paviršių taip pat galima funkcionalizuoti – prie jo
prijungti specifines atpažinimo molekules, kurios leistų dalelėms selektyviai prisijungti prie
biologinio taikinio.

7.11 pav. Kietųjų lipidų nanodalelių struktūra ir elektroninės mikroskopijos nuotrauka

Magnetinės nanodalelės

Pastaruoju metu didelio dėmesio sulaukia superparamagnetinės (arba tiesiog magnetinės) nanodalelės
(MND). Tai – neorganinės, dažniausiai geležies oksido nanodalelės, pasižyminčios itin dideliu
magnetiniu jautrumu. Magnetinis jautrumas suteikia galimybę valdyti, aptikti ir paveikti šias
nanodaleles išoriniu magnetiniu lauku. Todėl MND sulaukė didelio dėmesio magnetinio rezonanso
vaizdinimo srityje – jos tampa vienu pagrindinių neinvazinių metodų, leidžiančių tirti organizmo
vidaus organus ir jų funkcijas.

MND šerdį sudaro geležies oksido, kobalto ar mangano ferito kristalas. Šią šerdį stabilizuoja
neorganinis ar biomolekulių apvalkalas. Panašiai kaip liposomų ir lipidinių dalelių atveju, prie MND
paviršiaus papildomai jungiami ligandai. Jie padidina dalelės tirpumą, apsaugo nuo sąveikos su
imuninės sistemos elementais ar funkcinės biomolekulės (ši vykdo atrankią sąveiką su taikininėmis
ląstelėmis) (7.12 pav.).

Be magnetinio rezonanso vaizdinimo, labai svarbi ir perspektyvi MND taikymo sritis yra
hiperterminė navikų terapija (7.12 pav.). Terapijos metu į kraujotaką ar tiesiogiai į auglį suleidžiama
MND. Joms susikaupus navike audinys veikiamas kintamu magnetiniu lauku. Šis verčia vibruoti ir
įkaisti magnetines nanodaleles. Pasiekus 43 °C, ląstelės pradeda žūti, vyksta audinio nekrozė.
Kadangi hipertermija sukeliama tik ten, kur yra nanodalelių, o vėžinės ląstelės yra jautresnės
temperatūrai nei sveikos, navikas yra sunaikinamas ir organizmas pasveiksta. Šis metodas gali būti
lengvai pritaikomas ne tik audinio gydymui, bet ir jo vaizdinimui, kadangi aukštesnės temperatūros
audinys gali būti vaizdinamas infraraudonųjų spindulių kamera.
7.12 pav. Magnetinių nanodalelių panaudojimas: A) hiperterminėje navikų terapijoje; B) atpažįstant
ląsteles. Ląstelės gali būti aptinkamos magnetiniu rezonansu ir fluorescenciniais metodais

MND taip pat plačiai taikomos biotechnologijoje – jos naudojamos baltymų gryninimui. Į baltymų
mišinį įpilama magnetinių nanodalelių. Jos būna modifikuotos taip, kad prisijungtų tik dominantį
baltymą, o su kitomis biomolekulėmis nesąveikautų. Po inkubacijos toks mišinys veikiamas magnetu
ir tuo pačiu metu plaunamas. Magnetinės nanodalelės su dominančiu baltymu išlieka tirpale (jas
tirpale laiko magnetinis laukas), o kitos medžiagos yra išplaunamos iš tirpalo.

Aukso nanodalelės

Besiplečiant nanotechnologijai, pastebėta, kad daugybė medžiagų, esant mažiems jų matmenims,

įgyja naujų savybių. Todėl jas galima sėkmingai panaudoti biotechnologijos ir medicinos srityse.
Didelio susidomėjimo sulaukė aukso nanodalelės (AuND). 1–2 nm dydžio AuND pradeda
fluorescuoti. Todėl jos gali būti panaudojamos kaip fluorescenciniai žymenys tiek ląstelių tyrimuose,
tiek vaizdinant audinius ar navikus organizme.

AuND gali būti panaudojamos fotoakustiniam vaizdinimui. Šis metodas remiasi kai kurių medžiagų
savybe sugėrus didelės galios šviesos impulsą efektyviai įkaisti. Tada aplinkinės tirpiklio molekulės
greitai įšyla ir išsiplečia. Dėl staigaus skysčio išsiplėtimo susidaro mechaninė banga, kuri toliau
sklinda aplinka (jei tai vyksta organizme, tuomet audiniu). Dažniausiai šis virpesys yra ultragarso
dažnių srityje ir registruojamas sonografu. 7.13 pav. A) yra pavaizduota daugiafunkcė dalelė, kurioje
yra AuND (pasižyminčių stipriu fotoakustiniu atsaku) ir vaisto molekulių. Veikiant lazeriu
pasiekiamas dvejopas poveikis: suyra dalelės dangalas (todėl išlaisvinamos vaisto molekulės) bei
sugeneruojamas fotoakustinis signalas. Vienu metu atliekamas vaizdinimas ir gydymas. AuND
pasižymi dideliu sugertos šviesos energijos vertimu į šiluminę energiją. Todėl, be fotoakustinio
efekto, jas galima panaudoti sukeliant hiperterminį poveikį ir ląstelių žūtį (naviko nekrozę).

7.13 pav. Aukso nanodalelių pritaikymo galimybės: A) daugiafunkcės dalelės schema ir

fotoakustinio signalo susidarymas; B) AuND tirpalo optinių savybių priklausomybė nuo metalo
jonų koncentracijos ir galimybė taikyti jutikliuose; C) AuND matomos elektroniniu mikroskopu;
D) AuND panaudojimas aptinkant imunines reakcijas

Aukso nanodalelių sugertos šviesos spektras (taigi ir spalva) priklauso nuo dalelių dydžio ir
agregacijos (7.13 pav. B). Ši savybė gali būti panaudojama kuriant pH ir metalų jonų jutiklius. Prie
AuND paviršiaus nesudėtinga chemiškai prijungti norimus antikūnus, kurie gali specifiškai
sąveikauti su kai kuriomis biomolekulėmis ir jas atpažinti. Tokius AuND–antikūno kompleksus
galima taikyti imuniniam atpažinimui – ląstelėms, virusams ar ligą rodantiems baltymams aptikti
(7.13 pav. D). AuND, kaip ir pats auksas, pasižymi dideliu tankiu, todėl jos taikomos elektroninės
mikroskopijos srityje kaip kontrastinės medžiagos (7.13 pav. C).

Be aukso, domimasi sidabro ir kitų neorganinių medžiagų nanodalelėmis. Sidabro nanodalelės

pasižymi antibakteriniu poveikiu. Yra parodyta, kad jos skatina žaizdų gijimą, audinių regeneraciją.
Apibendrinant galima pasakyti, kad nanodalelių potencialas yra labai didelis, nes jų savybės dar nėra
visiškai ištirtos. Randama vis naujų nanodalelių pritaikymo galimybių elektronikoje, optikoje,
biotechnologijoje ir medicinoje.

7.5. Biomimetika

Biomimetika (graik. bios „gyvybė“ + mīmēsis „mėgdžioti“) – tai technologijų kryptis, kuri tiria
biologinių sistemų funkcijas ir struktūrą, siekiant (jų pavyzdžiu) kurti naujas medžiagas ir įrenginius,
kurie būtų pritaikomi žmogaus veikloje. Sinonimai: biomimikrija, bionika, biognozė.

Vienas iš biomimetikos pavyzdžių yra medžiaginiai lipdukai, kuriuos 1941 m. sukūrė šveicarų
inžinierius G. de Mestralis. Kartą grįžęs iš medžioklės jis bandė atkabinti prie drabužių stipriai
prikibusias varnalėšų galvutes (7.14. pav.). Tyrėjui parūpo, kas lemia tokį efektyvų lipnumą.
Pažvelgęs pro mikroskopą jis pastebėjo, kad augalas turi mikrokabliukus. Jie efektyviai užsikabina
už kailio ar medžiagos tarsi už kilpučių. Jis pradėjo kurti dirbtinius lipdukus iš nailono ir įkūrė
„Velcro“ kompaniją. Pastaroji greitai išpopuliarėjo ir įsiliejo į tekstilės rinką. Šią technologiją mes
naudojame iki šiol.

7.14 pav. Varnalėšos vaisius prikimba prie gyvūno kailio mažais kabliukais. Taip išplatinamos
augalo sėklos. Šiuo principu buvo sukurti medžiaginiai lipdukai, kurių vienas paviršius padengtas
kabliukais,
o kitas kilpelėmis

Biomimetikos pavyzdžių galime rasti visose žmonių veiklos srityse: lėktuvus sukūrėme pagal
paukščius, povandeninius laivus – pagal banginius ir pan. Neseniai „Mercedes–Benz“ sukūrė naują
itin ekonomišką ir aerodinamišką automobilio modelį. Jo forma buvo sukurta pagal dėžiažuvę (7.15
pav. A). Vabalas bombožygis aukštu slėgiu purškia karštas nuodingas dujas priešui atbaidyti.
Remdamiesi šio vabzdžio dviejų skysčių sumaišymo principu britai dabar kuria lėktuvų variklių
įpurškimo sistemą, kuri būtų naudojama kariniuose orlaiviuose (7.15 pav. B).
 7.15 pav. Biomimetikos pavyzdžiai, kurių pavyzdžiu kuriamos šiuolaikinės technologijos: A)
dėžiažuvė ir jos pagrindu sukurtas automobilis; B) bombožygis, purškiantis priešus atbaidantį
skystį; C) lotoso efektas – dėl nelygaus paviršiaus, vandens lašiukų sąveikos plotas yra minimalus

Iš gamtos mokomasi ir kuriant nanotechnologinius produktus, pavyzdžiui – neišpurvinamus

drabužius. Skamba neįtikėtinai, tačiau vandeniui ir purvui atsparūs paviršiai kuriami panaudojant
lotoso efektą (7.15 pav. C). Jo principas yra tas, kad augalo lapo paviršius padengtas hidrofobiniu
vašku, o paviršius yra itin nelygus. Dėl šių nelygumų vandens lašiukai turi labai mažą sąlyčio su
paviršiumi plotą. Taip minimizuojama jų sąveikos jėga. Nuo tokių superhidrofobinių paviršių vanduo
nuteka, o ne prilimpa.

7.6. Biotechnologinė nanodalelių sintezė

Nanodalelių (ND) dydis siekia iki 100 nm. Dėl savo dydžio nanodalelės įgyja naujų savybių, kurios
nepasireiškia medžiagai esant didesnių matmenų. Visų pirma – tai didelis paviršiaus ir tūrio santykis,
dėl kurio gerokai didesnė dalis atomų gali sąveikauti su aplinka. Kai kuriuose kristaluose pasireiškia
kvantiniai efektai – nanodalelės pradeda liuminescuoti, tampa superparamagnetikais,
superlaidininkais ar pan. Šios naujos savybės lėmė tai, kad įvairios nanodalelės vis plačiau taikomos
įvairiose pramonės ir biomedicinos šakose. Jų pagrindu gaminamos kosmetinės priemonės, kuriamos
į tikslinę organizmo vietą vaistus nunešančios nanodalelės, įvairūs biologiniai jutikliai,
nanoelektrodai ląstelėms. Nanodalelės taikomos genų terapijoje, magnetinio rezonanso bei
fluorescencinio vaizdinimo metu ir kitose biomedicinos srityse. Didžioji minėtų dalelių dalis yra
gaminamos dirbtinai – cheminės sintezės metu iš koloidinių tirpalų sintetinami aukso, sidabro,
puslaidininkių nanokristalai.

Vis dėlto, pati gamta taip pat sugeba gaminti nanodaleles. Tai galima sėkmingai panaudoti žmogaus
reikmėms. Nustatyta, kad kai kurios bakterijų ir mikrogrybų rūšys gali iš aplinkos įsisavinti metalų
jonus ir iš jų formuoti nanodaleles (7.16 pav. A). Tokia nanodalelių gamyba yra pranašesnė už
įprastinę cheminę sintezę, nes jai nebūtina aukšta temperatūra, eikvojama mažiau energijos,
išvengiama toksinių medžiagų. Kaip tiksliai vyksta šių dalelių biosintezė, nėra žinoma. Manoma, kad
tai lemia mikroorganizmų gebėjimas redukuoti metalų jonus ir juos kompleksuoti. Mikroorganizmai
turi specialias metalų išmetimo pompas ląstelių membranose, vykdo specifines fermentines reakcijas,
ekstraląstelinį metalų kompleksavimą bei išsodinimą.
 7.16 pav. Magnetinių nanodalelių biosintezė: A) E. coli bakterija ir jos susintetintos FeMn
magnetinės nanodalelės (pilki taškeliai ląstelėje); B) Nanodalelių biosintezės inkubatoriaus schema.
Į bakterijų terpę įmaišoma metalų jonų. Gautas tirpalas mažomis porcijomis leidžiamas į lipidinę
fazę (hidrofobinę terpę, kurioje vanduo nesusimaišo, o formuoja mažus lašiukus); C) Susiformavę
lašiukai tarpusavyje nesusilieja, juose gyvuoja bakterijos ir sintetina nanodaleles.
Fluorescenciniame vaizde bakterijos nudažytos žaliu dažu. Tai rodo, kad ląstelės yra gyvybingos;
D) Susintetintos nanodalelės pasižymi magnetinėmis savybėmis. Todėl patalpinus lašelį į magnetinį
lauką jos yra traukiamos į lašelio kraštą magnetinio lauko kryptimi. Kartu traukiamos ir bakterijos,
kuriose yra nanodalelių

Vienas iš tokios biosintezės trūkumų yra sudėtinga nanodalelių dydžio kontrolė bei jų
heterogeniškumas. Korėjos mokslininkai pasiūlė išspręsti šią problemą pasinaudojant mikrofluidine
sistema (7.16 pav. B–D). Sintezės metu bakterijos ir reakcijai reikalingos medžiagos (metalų druskos)
sumaišomos itin tiksliais kiekiais. Gautas mišinys patalpinamas į mažo tūrio lašiukus, kurie virsta
biosintezės kameromis. Precizinė mikroaplinkos kontrolė leidžia vykti biosintezei iš esmės
identiškomis sąlygomis skirtinguose lašiukuose. Taip susintetinamos vienodo dydžio ir kokybės
nanodalelės. Tai sunkiai pasiekiama kultivuojant bakterijas įprastuose laboratoriniuose induose.
Susintetintos nanodalelės pasižymi paramagnetinėmis savybėmis, dėl kurių jas galima būtų panaudoti
magnetinio rezonanso vaizdinimo metu, magnetotermoterapijoje ar kitur.

Taip pat pranešama, kad galima ir užaląstelinė nanodalelių sintezė. Ji vyksta už ląstelės ribų, veikiant
į aplinką išskirtiems bakterijų fermentams. Veikiant S. aureus bakterijų augimo terpę sidabro druska,
susidaro sidabro nanodalelės. Jos pasižymi stipriu antibakteriniu poveikiu kai kuriems antibiotikams
atspariems kamienams – Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes. Tokios nanodalelės
gali būti panaudojamos gydymui bei dezinfekcijai. Be nanodalelių sintezės šie mikroorganizmai gali
būti panaudojami sunkiųjų metalų jonams valyti iš aplinkos ar įvairiems metalams gryninti iš rūdos.

Yra nustatyta, kad nanodalelių susidarymas dalyvaujant bakterijoms gali vykti ir žmogaus organizme.
Neseniai atrastos vadinamosios nanobakterijos, kurios sintetina hidroksiapatito kristalus ir formuoja
kalcifikatų židinius placentos audinyje (7.17 pav. A). Iš tokio audinio išskirtos kalcifikuojančios
nanodalelės pradėjo augti. Iš jų buvo išskirta RNR ir padaryta išvada, kad šie kristalai susidaro
bakterijų sienelėje. Šios bakterijos būna 50–500 nm dydžio. Manoma, kad panašūs mikrobiologiniai
procesai lemia kalcifikatų susidarymą krūties navikuose. Nanobakterijos taip pat aptiktos inkstų bei
tulžies akmenyse ir aterosklerozės židiniuose. Pastebėta, kad nanobakterijos geriau auga esant kitoms
bakterijoms (7.17 pav. B) ir gali su jomis sąveikauti, taip išbalansuodamos natūralią organizmo florą.

7.17 pav. A) nanobakterijos, išskirtos iš placentos audinio, formuoja hidroksiapatito nanokristalus.

Jie organizme vėliau sudaro kalcifikatų židinius; B) nanobakterijos gali sąveikauti su kitomis
bakterijomis (E. coli) ir išbalansuoti organizmo mikroflorą.

7.7. Biooptoelektroniniai mikro- ir nanojutikliai

Įvadas. Mikro- ir nanojutikliai

XX a. septintajame dešimtmetyje pradėtos kurti elektroninės mikroschemos. Nuo tada elektroninių

įtaisų integracijos lygmuo bei jų įvairovė nuolat augo. Šis technologinis proveržis sukėlė naujų
universalių įtaisų kūrimo bangą panaudojant panašius struktūros modeliavimo ir gamybos principus
(7.18 pav.). Nuošalyje neliko ir jutiklių kryptis. Tarpdisciplininių technologijų raida įgalina kurti vis
mažesnius ir įvairesnius jutiklius, išplėsti jais matuojamų parametrų skaičių ir padidinti gautų signalų
analizės galimybes. Technologinė miniatiūrizacija leido sukurti ir biologinius nanojutiklius. Jiems
būdinga tai, kad bent vieno jų erdvinio matmens dydis yra mažesnis už mikrometrą.
 7.18 pav. Technologinė elektromechaninių įtaisų raida ir jų miniatiūrizacija

Jutiklis – tai įtaisas, kuris vienos formos energiją paverčia kitos formos energija, o šio energetinio
virsmo metu registruoja ir praneša apie aplinkoje vykstančius fizikinius, cheminius ar biologinius
reiškinius. Kad jutiklio registruojamas signalas kuo ilgiau išliktų patikimas, jį reikia apsaugoti nuo
užteršimo biologine medžiaga. Idealiam jutikliui būdingos šios savybės:

 Nenutrūkstama veika;
 Nepakeičiamos matuojamo objekto savybės;
 Jautris ir selektyvumas atitinka matavimams keliamus reikalavimus;
 Atsakas yra spartus ir nuspėjamas;
 Darbo režimo charakteristikoms būdinga apgrąža;
 Didelis signalo/triukšmo santykis;
 Kompaktiškumas;
 Atsparumas aplinkos poveikiui;
 Paprastas kalibravimas.

Pagal fizikinius reiškinius, kurių pokyčių registravimu pagrįstas jutiklių veikimo principas, juos
galima suskirstyti į kelias klases:

1. Terminiai;
2. Spinduliuotės;
3. Mechaniniai;
4. Tėkmės;
5. Magnetiniai;
6. Optiniai;
7. Pjezoelektriniai;
8. Paviršinių akustinių bangų;
9. Elektrocheminiai.

Atsižvelgiant į tai, kokiam tikslui ketinama naudoti jutiklius, jie skirstomi į tokias kategorijas:

 Biologiniai jutikliai – jais matuojami gyvų organizmų parametrai ir aptinkami organizmų

gyvybinės veiklos produktai;
  Analizatoriai – jais atliekami bandinio medžiagos sudėties tyrimai. Tai gali būti atliekama ir
panaudojant vieną ar daugiau biologinių jutiklių;

 Kontrolės sistemos – jomis tam tikrose ribose palaikoma matuojamo dydžio vertė.
Dažniausiai tai atliekama grįžtamojo ryšio būdu, reaguojant į aplinkos pokyčius.

Kai kurie sukurti biologiniai nanoįtaisai gali matuoti genomo ar proteomo dalis. Kaip jutikliai tam
panaudojami DNR fragmentai ar fermentiniu aktyvumu pasižymintys baltymai. Tokie jutikliai
vadinami genų ar baltymų lustais. Sukurti ir tokie įtaisai, kuriuose jutiklis yra visa gyva ląstelė. Jie
panaudojami tiriant patogenų ar toksinių medžiagų poveikį biologinėms sistemoms.

Vienas iš šiuo metu esančių biologinių nanojutiklių veikia nanodydžio kantileverių pagrindu (7.19
pav.). Nanodydžio kantileveriai – mikroskopinės svirtelės, panašios į nardymo tramplinų eilę. Jie
konstruojami panaudojant litografijos metodiką. Kantileveriai gali būti padengiami molekulėmis,
galinčiomis selektyviai prisijungti substratą – savitą geno seką papildantį DNR fragmentą. Iš daugelio
nanodydžio kantileverių sudaryti mikronų dydžio įtaisai gali aptikti pavienes DNR ar baltymų
molekules.

7.19 pav. Nanomatmenų kantileveriai,

sukonstruoti kaip didesnio
diagnostikai skirto nanojutiklio dalis,
gali užtikrinti greitą ir jautrią su
vėžinėmis ligomis susietų molekulių
detekciją bandiniuose

Skystoje terpėje nanojutikliai su kantileveriais leidžia atlikti greitą kiekybinę ir kokybinę

biomolekulių detekciją nenaudojant papildomų žymių. DNR sekos hibridizacijos eksperimente
galima aptikti nukleotidų sekos skirtumus vienos bazės skiriamąja geba. Būdingas molekulių
atpažinimo pavyzdys galėtų būti antikūno–antigeno sąveikos ant kantileverio paviršiaus detekcija.

Kantileverių jutikliai gali veikti statiniu, dinaminiu ir šiluminiu režimais. Statinio režimo metu, jautriu
sluoksniu padengtas tik vienas (viršutinis) kantileverio paviršius. Šio sluoksnio mechaniniai atsakai
adsorbcijos (ar molekulės atpažinimo) atveju generuoja signalą. Paviršiaus įtempimas, atsirandantis
vykstant adsorbcijai, sukelia statinį kantileverio polinkį. Jei paviršiaus įtempimas lygus kelioms
tūkstantosioms N/m dalims, kantileveris palinks 10 nm.
Dinaminio režimo metu kantileveris yra švytuojamas rezonansiniu dažniu, naudojant pjezoelektrinę
sistemą. Kantileverio masės pokytis sukelia rezonansinio dažnio poslinkį mažesnių verčių pusėn. Iš
šio poslinkio pokyčio galima apskaičiuoti adsorbuotą masę, tarus, kad mechaninės kantileverio
savybės dėl adsorbuotos masės pakinta nežymiai. Rezonansinio dažnio 1 Hz pokytį sukelia apie 1 pg
masės pokytis.

Kai jutiklis veikia šiluminiu režimu, kantileverio medžiagos tiesinio plėtimosi koeficiento pokyčiai
sukelia jo atsilenkimą jei pasikeičia temperatūra. Silicio kantileverio paviršius dažniausiai
padengiamas dviejų skirtingų metalų 100 nm storio sluoksniu. Tai – miniatiūrinė bimetalinė
plokštelė. Todėl, kaitinant skirtingo šiluminio plėtimosi metalus, kantileverio plokštelė išlinksta. 10-
5
K temperatūros pokytis sukelia keleto nanometrų nuokrypį, kurį galima išmatuoti.

DNR, baltymų ir ląstelių biolustai. Kas tai yra?

Biologiniai lustai arba gardelės (angl. chips arba arrays) – tai vieni naujausių XXI amžiaus
biotechnologijos ir biomedicinos poreikiams skirtų technologinių gaminių. Biolustai buvo išrasti
devintojo dešimtmečio pabaigoje JAV ir Rusijoje. Šiuo metu jie aktyviai gaminami keliose JAV
biotechnologinėse firmose (Affymetrix, Hyseq, Combion, Rosetta, Proto Gene Laboratories,
Nanogen). Taip pat jie gaminami ir Rusijoje, biologinių mikrolustų centre (Molekulinės biologijos
institute).

Biolustas yra nedidelė plokštelė, padengta griežta tvarka išdėstytomis DNR arba baltymo
molekulėmis. Ji dažniausiai naudojama atlikti biocheminei analizei, įvertinti lusto paviršiuje esančių
etaloninių medžiagų ir tiriamojo bandinio medžiagų sąveikas. Esama ir tokių biolustų, kuriuose
reagentų ar jutiklių vaidmenį atlieka gyvos ląstelės ar audinių bandiniai. Lusto plokštelė (platforma)
daroma iš tvirto pagrindo. Dažniausiai ji yra stiklinė arba plastikinė, tačiau kartais gali būti ir iš kitų
medžiagų (iš kvarco).

Kiekvienai dominančiai sąveikai įvertinti plokštelės paviršius padengiamas iki 1 mln. molekulių, o
informacija nuskaitoma fluorescenciniu mikroskopu arba specialiu lazeriniu prietaisu. DNR lustų
atveju plokštelės paviršius padengiamas viengrandinėmis DNR molekulėmis, kurių bazių seka
žinoma. Smarkiai integruotu DNR lustu (jo dydis neviršija 1 cm2) galima vienu metu atlikti daugiau
nei 10 000 įvairių genų analizę.

Pasitelkus technologijos laimėjimus mažėja gaminamų lustų matmenys. Mikrolustai virsta

nanolustais, padidėja jų jautris. Kuriamos specialios tokių lustų paviršiuje vykstančių biocheminių
sąveikų informacijos nuskaitymo priemonės. Tiriant biologinius mėginius biolustais galima atlikti
daug biotestų su įvairiomis tiriamosiomis medžiagomis ir taip sutaupyti reagentų, darbo jėgos išteklių
ir laiko.

DNR biolustai

DNR biolustas (angl. DNA chip), priklausomai nuo jo dydžio, dar vadinamas DNR mikrogardele ar
nanogardele (angl. DNA micro- or nanoarray), genų lustu (angl. gene chip, genome chip), genų
gardele (angl. gene array). Lustas – tam tikrų DNR molekulių fragmentų rinkinys, kuris dažniausiai
suformuojamas kaip atskirų genų gardelė. Genetinė medžiaga išdėstoma ant specialiai paruošto kieto
paviršiaus (stiklo, plastiko ar silicio), prie kurio nukleotidai pritvirtinami cheminiais kovalentiniais
ryšiais. DNR lustai skiriasi nuo kitų biologinių lustų tipų tuo, kad šie lustai atpažįsta tik DNR (ar
RNR) molekulių fragmentus arba panaudoja DNR kaip vieną iš detekcijos sistemos sandų.

Kokybiniai ir kiekybiniai tyrimai su DNR lustais pagrįsti DNR–DNR arba DNR–RNR hibridizacija
(kuri vyksta tam tikromis sąlygomis) ir fluoroforų (jais pažymimos bandinio molekulių sekos)
išspinduliuotos fluorescencijos matavimu. DNR lustai dažnai naudojami sparčiai tuo pačiu metu
vykstančiai tūkstančių genų raiškai tirti. Ant DNR lusto pritvirtinami DNR sekų fragmentai, vadinami
zondais (angl. probes, reporters). Jie gali būti tvarkingai išdėstyti tam tikrose DNR lusto vietose.

Tyrimai, atliekami naudojant DNR lustus, sujungia tris mokslinių tyrimų kryptis:

• Biotechnologiją (funkcinė genomika);

• Nanotechnologijas (lustai ir jų gamyba);
• Bioinformatiką (gautų duomenų analizė).

Galima išskirti dviejų rūšių DNR lustus, nors sandaros ir pritaikymo skirtumai tarp jų yra nedideli:

• Taškinės mikrogardelės (angl. spotted or two-channel microarrays) (7.20 pav., A);

• Oligonukleotidų mikrogardelės (angl. oligonucleotide or single-channel microarrays) (7.20 pav.,

B).

7.20 pav. DNR lustai: A) stiklinės (taškinės) mikrogardelės; B) oligonukleotidų mikrogardelės

Esminis skirtumas tarp šių DNR lustų yra tas, kad pirmojo tipo lustai leidžia tirti dviejų tipų ląsteles
(sveikas ir pažeistas) vienu metu. Antrasis lustų tipas įgalina iškelti tik vieną eksperimentinę sąlygą.
Todėl norint ištirti dviejų rūšių ląsteles reikia naudoti du antrojo tipo lustus.

DNR biolustų veika

7.21 pav. vaizduoja vieną atskirą DNR lusto kvadratėlį (pilka spalva).

7.21 pav. Komplementarių oligonukleotidų hibridizacija

Tiriamasis mėginys yra sudarytas iš daugybės įvairių iRNR molekulių (oranžinės spiralės). Jos
gaunamos lizavus (suardžius) tiriamas ląsteles. Prie kiekvienos iRNR molekulės yra prisijungusios
biotino molekulės (juodos žvaigždutės). Biotinas (vitaminas H arba B7) yra vandenyje tirpus B
grupės vitaminas (cheminė formulė C10H16N2O3S). Biologiniuose tyrimuose biotinas yra chemiškai
prijungiamas prie tam tikrų molekulių ar baltymų. DNR lustuose biotinas tvirtai prijungiamas prie
iRNR molekulių. Šis junginys pats nėra fluorescencinis žymeklis, tačiau jis svarbus prijungiant
fluorescuojančius dažus tolesnėse genetinių tyrimų stadijose.

Biotinas prisijungia fluorescuojančius žymenis ir sudaro su jais stabilius ryšius. Tirpalas su

tiriamosiomis iRNR, prie kurių prijungtos biotino molekulės (geltonos spiralės su juodomis
žvaigždutėmis), yra užpilamas ant DNR lusto paviršiaus (7.21 pav.). iRNR fragmento hibridizacija
su ant lusto esančiu DNR fragmentu (zondu) įvyks tik tuo atveju, jei abi sekos bus komplementarios
(7.22 pav.). Kitais atvejais hibridizacija nevyks.

7.22 pav. DNR lusto veikos principai: komplementarių DNR sekų paieška ant vieno lusto
kvadratėlio
Kadangi ant vieno DNR lusto gali būti milijonai kvadratėlių su zondais, norint nustatyti kur įvyko
hibridizacija reikia specialių metodų. Tai atliekama pasinaudojant biotino ir specialiai paruošto
fluorescuojančio žymens sąveika. Kai biotinu žymėtos iRNR grandinės prisijungia prie DNR
fragmentų ant lusto paviršiaus, DNR lustas yra plaunamas tirpalu. Jame yra fluorescuojančių dažų.

Sąveikos selektyvumui užtikrinti dažai gali būti modifikuojami juos sukabinant su streptavidinu. Dėl
streptavidino selektyvios sąveikos dažas prisijungia tik ten, kur yra biotino molekulių. Nuplovus lusto
paviršių nuo perteklinių molekulių, fluorescuojantys žymenys išlieka tik tose lusto vietose, kur iš
komplementarių bandinio iRNR ir zondo grandinėlių susidaro dvigubos spiralės. Po hibridizacijos ir
sąveikos su fluoresuojančių žymenų tirpalu, nuplauti DNR lustai skenuojami lazerio spinduliuote.
Lustą apšvietus, žymekliai sugeria šią spinduliuotę ir yra sužadinami. Registruojama jų
fluorescencija. Taip vizualizuojamos tos DNR lusto sritys (kvadratėliai), kuriose įvyko hibridizacija
(7.23 pav.).

7.23 pav. DNR lusto veikos principai: DNR lusto sričių (kvadratėlių), kuriose įvyko zondo ir bandinio
molekulinių fragmentų hibridizacija, vaizdinimas fluorescuojančiais žymenimis

Kai tiriamosios RNR sekos pažymimos dviejų tipų fluoroforais, sužadinimui dažnai naudojama
dviejų bangos ilgių spinduliuotė, atitinkanti jų sugerties sritis. Matuojamas fluoroforų fluorescencijos
intensyvumas kiekvienoje lusto srityje (7.24 pav.). Paveikslėlis vaizduoja DNR lustą skenavimo
lazeriu metu.
7.24 pav. DNR lusto vaizdas skenavimo lazerio spinduliuote metu. Kvadratėlių spalvos atitinka tam
tikrą fluorescencijos intensyvumą. Mėlyna spalva – mažiausias intensyvumas, balta – didžiausias

Kairėje esanti nuotrauka yra viso lusto atvaizdas. Jame matyti visi to lusto kvadratėliai. Vien akimis
juos sunku atskirti vieną nuo kito. Vaizdas viduryje perteikia tik nedidelę viso lusto dalį, maždaug
324 kvadratėlius (vaizdas padidintas). Fluorescencijos intensyvumas yra matuojamas kiekviename
kvadratėlyje. Gautame vaizde skirtingi įvairių DNR lusto kvadratėlių fluorescencijos intensyvumai
perteikiami spalvomis. Juodi kvadratėliai reiškia nulinį fluorescencijos intensyvumą (arba tiesiog
sąveikos nebuvimą). Juose jokia iRNR nesusijungė su DNR zondu. Didesnis fluorescencijos
intensyvumas atspindi didesnį prie lusto prisijungusių RNR fragmentų skaičių, o šis tiesiogiai
proporcingas intensyvesnei geno raiškai.

Informacija apie fluorescencijos intensyvumą yra siunčiama į kompiuterį, kuriuo atliekama gautų
signalų analizė ir interpretavimas. Tokių signalų apdorojimas ir rezultatų pateikimas yra atskiro
mokslo – bioinformatikos – uždavinys. Kompiuterinėmis programomis atliekama statistinė gautų
signalų analizė. Dažniausiai naudojama klasterinė statistinė analizė (7.25 pav.). Ji leidžia įvertinti iš
DNR lusto gautą informaciją ir kokybiniu, ir kiekybiniu atžvilgiu.
mRNR

mRNR

laikas

laikas
mRNR

mRNR

laikas laikas

7.25 pav. A) DNR lusto fluorescencijos intensyvumo pasiskirstymo klasterinė analizė;

B) kiekvienas DNR lusto kvadratėlis parodo tam tikro geno raišką laiko atžvilgiu

„Laboratorija ant lusto“ („Lab on chip“)

Atskira mikroschemų technologinės raidos atmaina virto mikroelektromechaninėmis (MEM)
sistemomis. Tai – miniatiūriniai įtaisai ar jų gardelės. Jų elektros grandinėlės elementai ir mechaninės
dalys yra suformuotos serijinės mikroschemų gamybos technologijų metodais, pritaikius atitinkamus
mikromašinų gamybos būdus. Reikiamose vietose ėsdinamos silicio plokštelės pagrindas arba ant
pagrindo pridedami papildomi struktūriniai sluoksniai. Iš mikroschemų gamybos perimtos metodikos
apima oksidaciją, difuziją, žemo slėgio cheminį garų nusodinimą, fotolitografiją, epitaksiją,
purškimą. Iš mikromašinų perimtos technologijos – paviršinis ir tūrinis modifikavimas, silicio
plokštelių sukibimas (wafer bonding), giluminis ėsdinimas reaktyviais jonais, kombinuota giluminė
rentgeno spindulių litografija, elektroformavimas ir liejimas (LIGA), mikroliejimas ir kt.

Tikėtina, kad MEM sistemos gali iš esmės pakeisti kone visų tipų prietaisų galimybes. Bus sudarytos
galimybės, panaudojant silicio mikroschemų ir mikromašinų technologijas, sukurti bei sukonstruoti
universalius įtaisus – „sistemas ant lusto“. Kita vertus, sparti technologijos raida atskleidė, kad silicio
plokštelė ne visuomet gali būti tinkamas jutiklio pagrindas. Be to, gaminių partijos kokybė ne visada
patenkina didėjančius reikalavimus, o modulinė įtaisų konstravimo schema neretai gali būti
pranašesnė už integruotąsias schemas.

Iš elektronikos pramonės perimtos technologijos leido miniatiūrizuoti biologinius jutiklius. Todėl

tapo įmanoma ištirti mažesnius bandinius, o jų analizei panaudoti didelio integracijos lygmens jutiklių
gardeles. Tokios gardelės vienu metu gali atlikti skirtingus to paties bandinio tyrimus. Šiuo metu tokie
įrenginiai plačiai randa savo pritaikymą įvairių ligų diagnostikos srityje. Didelis įtaisų selektyvumas
sumažina biologinės medžiagos poreikį. Todėl diagnostika tampa mažiau invazinė. Be to, smarkiai
išauga diagnostikos efektyvumas, nes diagnostinių tyrimų metu gaunama biologinė informacija apie
biologinės medžiagos fenotipą, genotipą, proteomų rezultatai.

Keletas sudėtingų bandinio paruošimo ir analizės žingsnių gali būti integruoti. Taip sukonstruojamas
specialus įtaisas, vadinamas „laboratorija ant lusto“ (LABL) (7.26 pav.). Jis gali maišyti, apdoroti ir
atskirti skysčius, atlikti bandinių tyrimus ir jų identifikaciją. Integruoti įtaisai gali matuoti nuo
dešimčių iki tūkstančių iš vieno bandinio gaunamų signalų. Taip sutaupoma bandinio medžiagos, o
gydančiam gydytojui ar operuojančiam chirurgui suteikiama kur kas daugiau svarbios papildomos
informacijos apie jų paciento bandinį.

7.26 pav. Skirtingais metodais pagamintų „laboratorijos ant lusto“ (LABL) įtaisų pavyzdžiai

Galutinis mokslinių tyrimų tikslas yra sukurti greitą, patikimą, selektyvią ir finansiškai pagrįstą
metodiką, kaip aptikti kelias (ar net vieną!) molekules sudėtingame, neapdorotame ir nepažymėtame
biologiniame bandinyje. Siekiant šio tikslo, diagnostikos in vitro galimybių plėtrai reikalingi:
  Nanoanalitiniai įtaisai, kuriems būdinga didžiausia erdvinė skyra, jautris ir plačiausia
gaunamų duomenų sritis. Taip pat reikalingi integruoti ir sudėtiniai įtaisai;

 Kuo didesnis duomenų atrankos jautris. Tai leidžia sumažinti bandinių dydį ar anksčiau
aptikti mažas ligą diagnozuojančių molekulinių žymių koncentracijas;

 Didesnis selektyvumas. Tai leidžia aptikti molekulinius žymenis ir kiekybiškai juos įvertinti
sudėtinguose bandiniuose;

 Didesnis patikimumas, vartojimo paprastumas ir patvarumas;

 Spartesnis duomenų apdorojimas;

 Skirtingų technologijų integracija. Ji užtikrina duomenų srautą visuminei daugelio parametrų

analizei atlikti.

Siekiama pateikti rinkai nebrangius, patogius naudoti „LABL“ įtaisus. Jų reikia, kad būtų
garantuojama nuolatinė paciento būsenos kontrolė ir išvengta susirgimų namų sąlygomis. Moksliniai
tyrimai plėtojami dviem kryptimis. Kuriamos įvairios sistemos:

 Patogios naudoti bandinių paruošimo priemonės. Jos leidžia aptikti mažiausius ligos žymių
kiekius natūralaus kraujo laše ar jo koncentrate. Reikia aptikti labai mažą ligos žymių skaičių,
atskiestą santykinai dideliame bandinio tūryje. Pavyzdžiui, reikia aptikti penkias ar dešimt
vėžinių ląstelių, esančių 100 ml šlapimo;

 Itin jautrios ir žymenų nenaudojančios priemonės. Jos skirtos greitesniam ir

kompaktiškesniam tiesioginiam ligos žymių aptikimui. Aptikimui panaudojami kantileveriai
ar laidūs polimerai;

 Sintetiniai aptikimo elementai jutikliams. Siekiama didinti jutiklių aptikimo jautrį,

selektyvumą ir atsparumą aplinkos poveikiui. Tam reikalinga paviršiaus chemijos ir
padengimo metodų pažanga. Ji aprėpia savitvarkę biomolekulių sandarą, hibridinius
biomolekulių ir nanodalelių darinius ar molekulinių įspaudų metodu paruoštus polimerus;

 Integruoti, sudėtingi įtaisai. Jų veikimas pagrįstas skysčių tėkmės mikro- ir nanokanalėliais

principu. Panaudojamos aktyvios, funkcinėmis grupėmis padengtos kanalėlių sieneles.
Naudojami sudėtingi tyrimo protokolai;

 Biologines sistemas imituojantys jutikliai. Juose ligos žymėms aptikti panaudojamos

biomolekulės.

7.8. Nanomedicinos pagrindai: apibrėžimas ir idėjos istorija

Nanomedicinos tikslas gali būti apibrėžtas kaip visos žmogaus biologinės sistemos visapusiška
stebėsena, kontrolė, kūrimas, gydymas, apsauga bei stiprinimas, pradedant nuo molekulinio lygio.
Naudojami inžineriniai nanoprietaisai bei nanostruktūros, tikslingai siekiama medicininio rezultato.
Aktyvūs objektai ar jų sandai turi būti nanoskalės matmenų. Jų dydis gali būti nuo vieno iki šimtų
nanometrų. Sandai gali būti surinkti ir sudaryti mikroprietaisus ar mikroinstrumentus (kurie jau
priskiriami mikroskalei) arba netgi biologinę aplinką. Tačiau esmė visada susijusi su nanodariniais
ir specifine sąveika tarp jų net ir didesnės apimties prietaisams ar bioobjektams.

Trumpiausią nanomedicinos apibrėžimą matyt yra suformulavęs Robertas A. Freitas jaunesnysis:

„Nanomedicina – tai nanotechnologijų panaudojimas medicinoje“. Nanobotai, nanomašinos,
nanomotorai, nanokompiuteriai ar nanorobotai šiandien ne tik atspindi sudėtingų inžinerijos objektų
kūrimą molekulės dydžio erdvinio pozicionavimo tikslumu, bet yra glaudžiai susiję ir su medicina.

Visa pirminė ląstelės (ar bet kurio gyvo organizmo) struktūra prasideda nuo nanometrinių dalelių.
Galbūt galima pasakyti, kad gyvybės paslaptis glūdi nanometrinių darinių pasaulyje. Jau prieš 3,5
mlrd. metų pačiose pirmosiose ląstelėse veikė nanodydžio „molekuliniai robotai“. Jie,
„nuskaitydami“ genuose užkoduotą informaciją, kūrė gyvus organizmus. Šiandieninės
nanomedicinos misija atrodo labai paprasta ir gamtos realizuota prieš daugelį metų. Tačiau per visą
žmonijos raidos laikotarpį mokslas, technologijos ir inžinerija tik dabar pasiekė tokį lygį, kad būtų
galima pradėti realizuoti kai kurias nanomedicinines technologijas.

1906 m. P. Erlichas pateikė vaistų, kurie labai tiksliai orientuoti į pažaidos židinį, koncepciją. Jis
pavadino juos magiškomis kulkomis (magic bullets). Tai, matyt, buvo pirmasis nanotechnologinių
sprendimų paminėjimas. Tokie sprendimai užtikrina, kad vaistai būtų tikslingai skiriami reikiamai
vietai organizme, o nanodalelės naudojamos kaip specifinė transportavimo įranga tikslingai
orientuojanti vaistus į ligos židinį. Šiandien jau planuojama sukurti nanodaleles–konteinerius, į kurių
vidų būtų įdėta vaistų. Prie tokių konteinerių (nanokiáutų) išorinės pusės būtų prikabintos pažaidos
vietų atpažinimo molekulės. Jos tikslingai nugabentų nanokiáutą į ligos pažeistą vietą. Tačiau tik
1975 m. G. Grigoriadis pasiūlė liposomas naudoti kaip vaistus pernešančias nanodaleles. Į jas galima
įtalpinti ir tirpių, ir netirpių vandenyje vaistų (7.27 pav.).

XX amžiaus septintajame dešimtmetyje mokslo ir technologijų laimėjimai ir pačių mokslininkų

kalbos jau vienaip ar kitaip įvardijo nanomedicinos ar jos atskirų krypčių idėjas. 1964 m. Robertas
Etingeris išsakė mintį, kad gyvenimo prailginimas gali būti pasiektas tada, kai bus įvaldytos
technologijos, leidžiančios tvarkyti audinius, keisti ląsteles ar net atskiras biomolekules. Jis manė,
kad chirurginės mašinos dirbs 24 valandas per parą dešimtmečius ar net šimtmečius. Švelniai ir
tiksliai, ląstelė po ląstelės (ar net molekulė po molekulės) bus atkuriamos smegenys, gydomos
pažeistos ar kritinės būklės vietos.

7.27 pav. Liposoma su įkapsuliuotais vaistais

1965 m. dirbtinės gyvybės kūrimas Amerikos chemijos draugijos prezidento profesoriaus Čarlio
Praiso buvo viešai pristatytas kaip nacionalinis prioritetas. Jis pabrėžė, kad galės būti sukurta netgi
įvairių ir naujų gyvybės rūšių, netgi neimituojant dabar žinomų biologinių sistemų.

1967 m. žinomas fantastas Aizekas Azimovas pristatė idėją, kad ateityje bus gamyklų, kuriose bus
naudojamos submikroskopinės aminorūgštys (baltymų statybinė medžiaga). Šimtų ar tūkstančių
fermentų repertuaras bus panaudotas cheminėms reakcijoms daug tikslingiau, negu dabar tai daroma
bet kuriais kitais metodais. Be to, šie „fabrikai“ galės būti naudojami net gyviems organizmams
formuoti.

1968 m. G. R. Teiloras paminėjo genų inžineriją ir genų chirurgiją. Jo nuomone, DNR

mikrochirurgija gali būti vykdoma fizikiniais metodais. Siauras lazerio ar rentgeno spinduliukas gali
būti panaudotas DNR supjaustyti reikiamose vietose. Tai būtų viena iš pradinių chirurginių operacijų
tvarkant sugadintas DNR dalis (7.28 pav.).

1969 m. J. Vaitas iškėlė idėją, kad modifikuotas virusas gali būti naudojamas kaip ląsteles
remontuojantis įrenginys. Reikiama genetinė informacija gali būti įterpiama į dirbtinai sukonstruotas
viruso daleles. Šie virusai, įvesti į organizmą, įterpia tą informaciją į ląstelės genetinę informacinę
sistemą. Taip gali būti atkurta prarasta ar dėl kokių nors priežasčių pažeista genetinė ląstelės
informacija. Tačiau galimi ir tolesni žingsniai, kai dėl įterptos informacijos ląstelė pradeda pati
sintetinti atitinkamus baltymus ar tvarkyti metabolinius procesus. Taip gydomi ląstelės pažeidimai.

7.28 pav. Lazerinė genų chirurgija

1985 m. Marvinas Minskis (šiandien žinomas kompiuterių specialistas ir dirbtinio intelekto kūrimo
pionierius) savo knygoje „Robotics“ trumpai aprašė, kaip gali dirbti visiškai automatinė ląstelę
taisanti mašina. Įsivaizduokime, kad galime sukurti remonto mašiną. Tokią mažą, kad ji galėtų taisyti
kraujo arteriją būdama joje. Pirmoji tokia mašina gali būti blusos dydžio. Be abejonės, norint padaryti
net ir tokią mašiną, kuri netilptų smulkesniuose kraujo induose, tektų rimtai paplušėti kuriant vidines
mašinos detales. Jos turėtų užtikrinti tinkamą tokios mašinos veikimą.

Tokios smulkios mašinos galėtų plaukioti kraujagyslėmis, valyti jose susikaupusį šlamštą, taisyti
kraujagyslių sieneles su tam pritaikytomis medžiagomis. Tačiau tokios medžiagos dar turėtų būti
išrastos. Ko gero, tokie biologiniai sanitarai galėtų būti implantuoti į mūsų organizmą ir ten būti visą
laiką kaip nuolat dirbantys darbininkai. Šiandien (kaip ir 1985 m.) tokia idėja dar atrodo fantastiškai.
Tačiau daugelis elektros grandinių dabartiniuose kompiuteriuose yra daug mažesnės už mūsų
audinius sudarančias ląsteles.

1857 m. Maiklas Faradėjus pirmasis pagamino nanodaleles. Tačiau turėjo praeiti daug laiko, kol jos
buvo susintetintos reikiamu pavidalu ir turinčios savybių, kurios buvo tinkamos nanomedicinai. 1980
m. teoriniame darbe rusų mokslininkai A. Jekimovas ir A. Efrosas bei L. Briusas iš Belo laboratorijos
(JAV) pirmą kartą nustatė dydžio kvantavimo efektus stikle, turinčiame PbS. Tuomet jau buvo
susintetinta daug įvairių kvantinių taškų, pasižyminčių įvairiomis savybėmis. Viena jų savybė nulėmė
platų kvantinių taškų taikymą. Tai – jų skleidžiamos fotoliuminescencijos spalvos priklausomybė nuo
taškų dydžio. Tiesa, tik 1998 m. kvantiniai taškai buvo pritaikyti biomedicinoje. Tik praėjus ilgam
laiko tarpui buvo susintetinti vandenyje tirpūs kvantiniai taškai. Jie panaudoti kaip fluorescenciniai
žymekliai mikroskopijos srityje.

Nepaisant didelės molekulinės nanotechnologijos svarbos, išspausdintų daugelio straipsnių ir

apžvalgų apie robotus, specializuotai taikytinus medicinoje, iki pat 1990 m. nebuvo nė karto
paminėtas nanomedicinos terminas. Terminas „nanomedicina“ pirmą kartą buvo pavartotas 1991 m.,
populiarioje E. Drekslerio, K. Petersono ir G. Pergamito knygoje „Unbounding the Future“.

Nanomedicinos šaknys ir jos raida glaudžiai susijusios su nanotechnologijų ir nanomokslo plėtra.

Šiandien nanomedicina apima įvairiausias sritis. Jų pagrindinis motto – panaudoti nanodarinius ir
nanoprietaisus darbui molekulių lygiu, sprendžiant įvairiausias problemas moksliniuose medicinos
tyrimuose, eksperimentinėje medicinoje ir klinikoje.
Literatūros sąrašas:

7.1-7.3

 Tsai A. Nanomedicine – The Medical Revolution. Greif Entrepreneurship Center, 2001.

 Freitas R.A. Nanomedicine, Vol. I: Basic Capabilities. 1999. http://www.nanomedicine.com/NMI.htm.
 Bradbury R. J. Protein Based Assembly of Nanoscale Parts. 2001.
http://www.aeiveos.com/~bradbury/Papers/PBAoNP.html.
 Freitas R.A. A Mechanical Artificial Red Cell: Exploratory Design in Medical Nanotechnology. 1998.
http://www.foresight.org/Nanomedicine/Respirocytes.html.
 Freitas R.A Microbivores: Artificial Mechanical Phagocytes using Digest and Discharge Protocol. 2001.
http://www.rfreitas.com/Nano/Microbivores.htm.
7.4

 Ekambaram P, Abdul Hasan Sathali A, PriyankaK. Solid lipid nanoparticles: a review. Sci. Revs. Chem.
Commun.: 2(1), 2012, 80-102
 Lee JH, Jang JT, Choi JS, Moon SH, Noh SH, Kim JW, Kim JG, Kim IS, Park KI, Cheon J. Exchange-coupled
magnetic nanoparticles for efficient heat induction. Nat Nanotechnol. 2011 Jun 26;6(7):418-22.
 Wilson K, Homan K, Emelianov S. Biomedical photoacoustics beyond thermal expansion using triggered
nanodroplet vaporizationfor contrast-enhanced imaging. Nat Commun. 2012 Jan 10;3:618.
 De Jong WH, Hagens WI, Krystek P, Burger MC, Sips AJ, Geertsma RE. Particle size-dependent organ
distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 2008 Apr;29(12):1912-9.
7.5 – 7.6

 Kajander EO. Nanobacteria--propagating calcifying nanoparticles. Lett Appl Microbiol. 2006 Jun;42(6):549-
52.
 Guo Y, Zhang D, Lu H, Luo S, Shen X. Association between calcifying nanoparticles and placental
calcification. Int J Nanomedicine. 2012;7:1679-86.
 Korbekandi H, Iravani S, Abbasi S. Production of nanoparticles using organisms. Crit Rev Biotechnol.
2009;29(4):279-306.
 Jung JH, Park TJ, Lee SY, Seo TS. Homogeneous Biogenic Paramagnetic Nanoparticle Synthesis Based on a
Microfluidic Droplet Generator. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 May 13. doi: 10.1002/anie.201203244.
 Mokslo populiarinimo svetainė “Chemistry views”:
http://www.chemistryviews.org/details/ezine/2043227/Biogenic_Paramagnetic_Nanoparticle_Synthesis.html
 Šiuolaikinio dizaino svetainė “Yanko Desgn”: http://www.yankodesign.com/2009/06/03/ten-inspirational-and-
creative-bionic-designs/
7.7

 Rotomskis R., Karabanovas V., Poderys V., Bagdonas S., Didžiapetrienė J. Įvadas į nanomediciną. Lietuvos
mokslas kn. 69. Vilnius: VU Onkologijos institutas, VĮ Mokslotyros institutas, 2008, 302 p.

7.8

 McNeil SE. Nanotechnology for the biologist., J Leuk Bio 2005, pp. 585-594.
 Ehrlich P., The collected papers of Paul Ehrlich, Pergamon, London, 1960.
 Ettinger R., The Prospect of Immortality, Doubleday, NY, 1964.
 Asimov I. Is Anyone There? Ace Books, New York, 1967.
 Drexler K. Eric, Ch. Peterson, G. Pergamit, Unbounding the Future: The Nanotechnology Revolution, William
Morrow/Quill Books, NY, 1991.
 Minsky M., "Our Robotized Future," in Marvin Minsky, ed., Robotics, Omni Publications International, NY,
1985, pp. 286-307
8. Genai ir genomai

8.1. Organizmai ir jų požymių visuma: genominis požiūris

„Yra sakančių, kad žmogaus genomo nuskaitymas sumenkins žmogiškumą ir atims paslaptį iš
gyvybės... Tai be galo toli nuo tiesos. Sudėtingi ir nuostabūs keliai, kuriais cheminės molekulės,
sudarančios mūsų genetinį kodą, leidžia gyvuoti neaprėpiamiems žmogaus sielos klodams, turėtų
likti įkvėpimo šaltiniu poetams ir filosofams dar tūkstančius metų.“ Dr. J. Craigas Venteris, tuometinis
Celera Genomics prezidentas (2000 m. birželis).

Genomas – tai visa organizmo paveldimoji informacija, užrašyta DNR ar RNR sekoje (priklausomai
nuo to, kurią nukleorūgštį organizmas naudoja paveldimai informacijai užrašyti, mat kai kurie virusai
naudoja RNR). Tai organizmo genetinės informacijos visuma, visos nukleorūgščių sekos:

 koduojančios baltymus;
 įvairias RNR;
 reguliacinės;
 kitos, mums dar nežinomos paskirties sekos;
 vykstant evoliucijai „užsilikusios“, galbūt nebereikalingos, nebenaudojamos sekos.

Genome užrašytos visos organizmo galimybės, funkcijos, kurias turės ir galės atlikti jo ląstelės. Arba,
kitaip tariant, koks organizmas bus, ką jis galės daryti, kuo maitintis, kaip daugintis ir panašiai,
priklauso nuo to, kokias funkcijas jis turi užrašytas genome. Žinoma, galutinis fenotipinis rezultatas
priklauso ir nuo aplinkos, t. y. nuo aplinkos suteikiamų galimybių įgyvendinti tai, kas užrašyta
genome.
Dabar žinome daugiau nei 3000 organizmų pilnų genomų sekų (8.1 pav.). Daugiausia tai
mikroorganizmų genomai. Jie mažesni, todėl lengviau ir greičiau nuskaitomi. Tačiau jau žinome ir
visas sekas, kurių reikia, kad iš ląstelės susidarytų tokie gerai pažįstami ir svarbūs organizmai kaip
kopūstas, bulvė, ryžiai, kukurūzas, obelis, karvė, arklys, šuo, višta, bitė, maliarinis uodas ir pan. Taip
pat nuskaityti mokslo modelinių organizmų genomai: vaisinės muselės (Drosophila melanogaster),
baltažiedžio vairenio (Arabidopsis thaliana), pelės, žiurkės. Dėmesio sulaukė ir šimpanzės, makakos.
Na ir, aišku, turime nuskaitytą žmogaus genomą. Jau net ne vieną. Prieš 2000-uosius metus didysis
tikslas buvo nuskaityti vieną žmogaus genomą, o dabar siekiamas tikslas – turėti nuskaitytus
tūkstančio skirtingų asmenų genomus. Taip tikimasi daugiau suprasti apie mus aprašančias sekas ir,
svarbiausia, šias žinias pritaikyti medicinoje.
 8.1 pav. Genomų sekų duomenų bazės skaičiavimais, užbaigtų skaityti genomų
yra 3402. Dar keliolikos tūkstančių genomų nuskaitymo projektai vyksta. (2012
liepos 16 d. duomenys)

Pirmasis žmogaus genomas buvo surinktas iš kelių skirtingų asmenų genomų fragmentų. Pirmiausia,
kelių genomų reikėjo dėl konfidecialumo, kad tai būtų tiesiog „žmogaus“ genomas be vardo ir
pavardės. Antra, dėl to, kad reikėjo ne vieno mėginio visam projektui įvykdyti. Be to, projektą vykdė
daug atskirų laboratorijų visame pasaulyje. Vėliau buvo nuskaityti atskirų rasių žmonių genomai.
Žmogaus genomo projektui pasirinkti ir žinomi asmenys, kurių genomai buvo pirmieji nuskaityti
pilni vieno asmens genomai. Pirmiausia savo genomą savo privačioje firmoje nuskaitė vienas
žymiausių genomų tyrinėtojų dr. J. Craigas Venteris. Jo firma „Celera Genomics“ vykdė žmogaus
genomo nuskaitymą tuo pat metu, kaip ir valstybinės organizacijos. Ši firma tikėjosi tai padaryti
greičiau ir patentuoti. Tada visos genomo informacija paremtos medicinos galimybės būtų
nebeprieinamos plačiajai visuomenei. Laimei, valstybinės organizacijos laimėjo šias lenktynes ir
suspėjo žmogaus genomo seką publikuoti pirmos.
Antrasis asmuo, kurio visas genomas nuskaitytas, yra Jamesas Watsonas – tas pats Watsonas, kuris
kartu su F. Cricku pirmieji 1953 m. nustatė DNR struktūrą. Neįtikėtinai puikiai tinkanti dovana šiam
mokslininkui! J. Watsonas griežtai pasisakė prieš žmogaus genomo sekų patentavimą (mat tokių
minčių būta ir valstybinėse institucijose) ir paskelbė savo genomą laisvai prieinamu visiems, kad jis
būtų naudojamas medicinai tobulinti. Turėtų apimti įdomus jausmas, pasidėjus priešais save surašytą
visą savo DNR seką. Tačiau jei bandytume skaityti ją kaip knygą – visus nukleotidus paeiliui,
neužtektų viso gyvenimo. Mat genome nukleotidų turime 3,2 milijardo (galima apskaičiuoti, kiek
sekundžių prireiktų perskaityti tiek raidžių), o kadangi esame diploidai, tai visame chromosomų
rinkinyje – 6,4 milijardo.
Beje, pasirodė, kad genomo dydis ir jame randamų atvirų skaitymo rėmelių skaičius nekoreliuoja su
organizmo išsivystymo lygiu (8.2 pav.). Žinoma, prokariotų genomai mažesni – milijonų nukleotidų
eilės, o eukariotų – milijardų. Tačiau tarp eukariotų dėsningų skirtumų nėra. O jei lygintume atvirų
skaitymo rėmelių (angl. open reading frame, ORF) – tiesiogiai baltymus koduojančių (ne reguliacinių
ar pan.) sekų skaičių? Tuomet susiduriame su paradoksu, kad bakterijos turi jų tūkstančius, o
eukariotai – dešimtis tūkstančių. Tik 10 kartų skirtumas! Nelabai jauku žinoti, kad turime tik 10 kartų
daugiau genų nei E. coli (kai kuriais skaičiavimais, iš viso tik 5 kartus: E. coli turi 4000–5000, H.
sapiens 20000–25000 ORF).
Lyginti eukariotus tarpusavyje dar kebliau. Žmogaus genome nustatytų ORF skaičius panašus kaip ir
vaisinės muselės, vairenio, dafnijos, karvės ir kt. O štai kukurūzo genome nustatyta apie 100 000
ORF. Panašu, kad svarbu ne kiek, o būtent kokių sekų turime. Be to, ORF – tai tik baltymus
koduojančios sekos. Jie sudaro tik menką dalį genomo sekų, žmogaus genome – 2 %. Likusios sekos
juk irgi kažką veikia: koduoja RNR, reguliuoja genų veiklą ir pan., tik jų bioinformatiškai įvertinti
dar nemokame. Galbūt ten ir slypi svarbiausi žmogumi mus paverčiantys požymiai? Taip pat svarbu
prisiminti, kad ORF skaičius nereiškia galutinio baltymų skaičiaus. Alternatyvus splaisingas šiuos
keliasdešimt tūkstančių sekų gali paversti daug didesne įvairove susintetinamų baltymų.
Dabar turime tikslą nuskaityti kuo daugiau genomų, kad juos skaitydami ir lygindami suprastume,
kaip veikia gyvybė. Gautas žinias galima panaudoti medicinoje ir/arba biotechnologijoje.
Biotechnologijai ypač įdomūs mikroorganizmų genai. Mat šie mažieji pasaulio gyventojai dažnai
sugeba daryti neįtikėtinus dalykus: skaidyti sudėtingas organines medžiagas, teršalus, sintetinti
sudėtingus junginius, gyventi (vadinasi, ir atlikti įvairias reakcijas) atšiauriomis sąlygomis –
karštuose geizeriuose, ledynuose, ten, kur labai rūgšti aplinka ar daug sunkiųjų metalų ir pan.
Moksliniuose tyrimuose ir pramonėje labai paranku būtų panaudoti jų fermentus. Taip pat įdomu,
kokios rūšys gyvena, kokį metabolizmą pasitelkia dirvožemyje, atviroje jūroje ar mūsų žarnyne.
Užauginti laboratorijose pavyksta tik 1–2 % mikroorganizmų rūšių. Bet kad galėtume tirti jų
genomus, to nebereikia. Ištobulėjus DNR išgryninimo ir sekoskaitos technologijoms, galima
nuskaityti tiesiog bendrą DNR iš norimo mėginio (dirvožemio, geizerio, jūros vandens, ekskrementų
ir pan.). Gauname sekų visumą iš įvairiausių mėginyje buvusių organizmų – metagenomą. Tokie
sekoskaitos projektai taip pat jau plačiai vykdomi (8.3 pav.).

8.2 pav. Įvairių organizmų grupių genomų 8.3 pav. Metagenomų projektų ir mėginių
dydžiai. skaičius pagal GOLD.
(2012 liepos 16 d. duomenys)

Vis dėlto – kas tas genomas? Ar teisingai parinktų ir sudėliotų DNR sekų rinkinio užtenka ląstelei
suteikti gyvybės požymius ir norimas savybes? Ar mūsų įsivaizdavimas, kad genome yra visa
instrukcija, kaip ląstelė turi veikti, ir ląstelė veikia ją skaitydama, yra teisingas? Visa tai patvirtino
eksperimentas: sukurta bakterija su sintetiniu genomu. Eksperimentui buvo pasirinktos laboratorijoje
galinčios augti bakterijos su mažu genomu – mikoplazmos. Iš chemiškai susintetintų DNR fragmentų
buvo sukonstruota visa 1 mln. bazių ilgio bakterijos Mycoplasma mycoides žiedinė chromosoma ir
perkelta į artimai giminingos bakterijos M. capricolum ląstelę, iš kurios prieš tai buvo pašalinta jos
natūrali DNR. Pasitelkusi sintetinį genomą ląstelė pradėjo dalytis ir gaminti naują baltymų rinkinį.
Sintetiniam genomui sukonstruoti buvo panaudota 1000 chemiškai susintetintų DNR fragmentų,
kurių kiekvienas buvo 1080 bp ilgio. Šių fragmentų sekos padengė visą M. mycoides genomą. Kad
būtų galima juos surinkti teisinga tvarka, fragmentai galuose turėjo 80 bp sekas, persidengiančias su
kaimyniniais fragmentais. Sintetinis genomas buvo beveik identiškas natūraliam. Tam, kad vėliau
būtų galima atskirti sintetinį genomą nuo natūralaus, buvo įdėtos ir sekos, kuriose genetiniu kodu
(skaitant tripletus kaip vienos raidės aminorūgščių simbolius) buvo užrašytas instituto pavadinimas,
elektroninio pašto adresas, daugelio projekte dalyvavusių žmonių vardai ir keletas žinomų citatų.
Venter Institute būtų užrašyta taip:

Žodyje „Institute“ „u“ raidę teko pakeisti į „v“, nes „u“ raide žymimõs aminorūgšties standartiniame
kode nėra. „U“ raide žymima retoji aminorūgštis selenocisteinas.
Pašalinus natūralų genomą iš M. capricolum ir įkėlus sintetinį M. mycoides, ląstelės pradėjo dalytis
ir kolonijos nusidažė mėlynai – toks buvo užprogramuotas požymis, kuris leido lengvai atskirti
sėkmingai pakeistas ląsteles. Kad augančios kolonijos yra iš naują genomą turinčių ląstelių, buvo
patvirtinta nuskaičius jų DNR bei parodžius, kad jos sintetina M. mycoides būdingus baltymus.
Kolonijų augimas buvo tipiškas M. mycoides, o ne M. capricolum. Vienos rūšies ląstelės aiškiai buvo
paverstos kitos rūšies ląstelėmis (8.4 pav.).

8.4 pav. Ląstelės su sintetiniu genomu. Mėlyna kolonijų spalva rodo, kad naudojamas sintetinis
genomas. Nuotraukoje šalia matyti, kad ląstelės dauginasi ir formuoja koloniją.
(J. Craigo Venterio instituto ir Kalifornijos universiteto nuotraukos)

Šį 40 milijonų dolerių kainavusį projektą įvykdė J. Craigo Venterio Institutas, kuriame 20 žmonių
dirbo daugiau nei 10 metų. Tikslas pasiektas 2010 metais. Nepaisant sėkmingo eksperimento, žmogui
parankūs mikroorganizmų genomai, kurie koduotų galimybes gaminti kurą ar vaistus ir veiktų
ląstelėse dar tolima realybė. Prireiks daugybės tyrimų, kol genų inžinieriai galės kaip nori dėlioti ir
naujai kurti organizmų genomus. Šiuo metu sintetiniam genomui naudota technologija yra per daug
sudėtinga, kad galėtume masiškai kurti žmonijai naudingus mikroorganizmus arba ji keltų potencialią
bioterorizmo grėsmę. Tačiau ilgainiui tokie projektai bus taikomi kuriant būtent naujų savybių
mikroorganizmus, todėl jau reikia rengti stiprią teisinę bazę jų priežiūrai.
Šiuo metu (2012 m.) J. C. Venterio vadovaujami mokslininkai kuria sintetinį kepimo mielių genomą.
Jei galėsime iš norimų DNR sekų susikurti pramonei ir sveikatai naudingų mikroorganizmų, lygiai tą
pačią technologiją bus galima panaudoti kuriant itin patogeniškus organizmus – biologinį ginklą.
Kaip ir visoms technologijoms, čia tinka posakis: pati technologija nėra nei blogis, nei gėris, tačiau
ką ji duos žmonijai, priklauso nuo to, kaip ji bus panaudota. Kuo galingesnė ši technologija, tuo
daugiau naudos ir/arba žalos gali atnešti. Todėl būtina nuo pat technologijos vystymosi pradžios sekti,
kokia informacija yra publikuojama. Precedentų jau yra ne tik fizikos srityje (branduolinėje
energetikoje), bet ir biomedicinos moksluose. Visai neseniai (2012 m. pradžioje) mokslo pasaulyje
buvo sprendžiama dilema, ar publikuoti mokslinį darbą apie sukonstruotą labai lengvai tarp žmonių
plintančią paukščių gripo viruso atmainą. Virusas buvo sukonstruotas tiriant, kas lemia jo plitimą ir
ieškant kelių tokiam plitimui užkirsti. Tačiau informacija, kaip sukonstruoti pavojingą virusą,
patekusi į teroristų rankas, galėtų būti pražūtinga. Kita vertus, biomedicinos mokslinius tyrimus
vykdančioms, vaistus kuriančioms organizacijoms ji labai naudinga – tai didelis žingsnis į priekį
virusų biologijos supratimo ir valdymo link. Galiausiai buvo nuspręsta publikuoti tyrimą,
neatskleidžiant metodinių detalių ir jas paliekant prieinamas tik mažai specialistų grupei. Panašūs
sprendimai turės būti priimami ir genomų sintezės klausimais.

8.2. Genomikos, transkriptomikos ir proteomikos sąvokos ir šiuolaikinis požiūris į požymius

lemiančius veiksnius
Genetikos mokslas tiria atskirus genus, jų poras, grupes, jų lemiamus požymius, mutacijas ir
paveldimumą. Molekulinė genetika tiria atskirų genų sekas, jų koduojamų baltymų savybes, sąveikas
su kitais baltymais, mutacijų įtakas molekuliniu lygiu bei pavienių genų reguliacijos mechanizmus.
O genomika tiria visą genomą. Pirmoji užduotis – surinkti genomo seką iš nuskaitymo metu gautų
fragmentų. Toliau reikia nustatyti, kaip genai išsidėstę genome, kiek ir kokių yra įvairias funkcijas
atliekančių baltymų genų, kiek ir kokių yra RNR genų, kiek ir kokių rasta pasikartojančių sekų, kiek
yra keistų, nesuprantamų sekų... Tada viską reikia sužymėti genomo sekoje. Tiriant pavienius genus,
dirbama su tūkstančių bazių ilgio sekomis, genomus – su milijonais ir milijardais bazių kiekvienoje
sekoje. Šiems tyrimams reikalingi galingi bioinformatiniai įrankiai.
Tačiau tai, kad genas yra genome, dar nereiškia, kad jis yra aktyvus. Genomo sekos nurodo viską, ką
ląstelė turi užkoduota, bet ne tai, ką naudoja. Daugialąsčių organizmų visų ląstelių genomas vienodas,
bet skirtingų audinių ląstelės yra skirtingos - diferencijuotos, nes jose yra aktyvūs skirtingi genai.
Žinoma, yra daug genų, kurie svarbūs visų organizmo ląstelių veiklai ir visose ląstelėse yra aktyvūs.
Jie vadinami namų ūkio (angl. housekeeping) genais. Kiti genai reikalingi tik tam tikrų audinių
veiklai. Kepenų veiklai reikalingi vieni genai, o širdies – kiti. Kaip išsiaiškinti, kurie genai tiriamose
ląstelėse yra aktyvūs, t. y. nurašomi, traskribuojami? Tam tikslui, yra nustatoma, kokių RNR
molekulių yra ląstelėse. Ląstelės (bei jų populiacijos, audinio, organizmo) RNR sekų visuma
vadinama transkriptomu, o ją tirianti mokslo sritis – transkriptomika. Skirtingai nei genomas,
transkriptomas gali kisti priklausomai nuo aplinkos sąlygų (bei ląstelės reakcijos į jas), ląstelės
brandos, diferenciacijos stadijos ar supiktybėjimo. Taigi, lyginant skirtingų mėginių transkriptomus,
galima nustatyti, kokie genai dalyvauja kokiuose procesuose.
Vis dėlto, galutinis baltymus koduojančių genų produktas – tai baltymai. Ir jei norime žinoti, kokie
baltymai dalyvauja ląstelės procesuose (atsake į aplinkos sąlygų pakitimus, diferenciacijoje),
geriausia tirti juos tiesiogiai. Nes transkriptome randamos iRNR taip pat dar nereiškia, kad ląstelėse
yra tų RNR koduojamų baltymų. Be to, skirtingų baltymų ir RNR kiekiai ląstelėje nebūtinai sutampa
(gali veikti RNR nutildymo mechanizmai, kurie neleidžia nurašytos iRNR transliuoti ir pan.).
Ląstelės (jų populiacijos, audinio, organizmo) baltymų visuma vadinama proteomu. Tirianti mokslo
sritis – proteomika.
Paminėtos -omikos – tai požiūris į ląsteles, kaip į didžiulį visuminį turimų (ir naudojamų arba ne)
funkcijų tinklą, kuris ir lemia galutinį fenotipą. Vis labiau plėtojama sistemų biologija. Kad
suprastume, kas yra gyvybė, turime į ją žvelgti įvairiais lygiais, matyti tų lygių sąveikas, tinklą, pilną
abipusių sąveikų tarp įvairių veiklos lygių, nuo genų iki ekosistemų.
8.3. Genomų struktūros: baltymus koduojančių ir kitų sekų reikšmė

8.5 pav. Šiuolaikiniai genolapiai su įvairiomis funkcijų anotacijomis.

E. coli genomas ir nedidelis žmogaus genomo fragmentas.

Nuskaitytas genomas anotuojamas, sudaromas jo genolapis – sužymima, kur yra koks genas ar kitokia
seka (8.5 pav.). Genų koduojamos funkcijos žinomos iš ankstesnių eksperimentų arba (dauguma)
nuspėjamos bioinformatiškai pagal sekų panašumus. Nuskaičius daug genomų, pasirodė, kad
bakterijų genomų apie 90 % sekų sudaro baltymus ar RNR koduojantys genai. Tad žinomomis
funkcijomis užpildome genolapį ir (su bakterijomis) tampa aiškiau – genome koduojami baltymai,
RNR. Galime įsivaizduoti, kaip visa tai veikia ląstelėje: suderintas baltymų ir RNR tinklas vykdo
įvairias ląstelei reikalingas reakcijas. Eukariotų genomai pasirodė ne tokie aiškūs. Be aiškios
funkcijos baltymus ir RNR koduojančių sekų (tokios sekos, neįskaičiuojant intronų, sudarančių apie
30 % genomo, sudaro apie 2 % žmogaus genomo), eukariotų genome randama daug nekoduojančių
sekų. Todėl didesnis eukariotų genomas nereiškia proporcingai daugiau genų, o tik daugiau
nekoduojančių sekų. Vis dėlto, įžvelgiamas dėsningumas, kad žemesnieji eukariotai (kirmėlės,
vabzdžiai) turi mažiau šių sekų nei aukštesnieji (stuburiniai, induočiai augalai).
Jau yra duomenų, kad minėtos nekoduojančios sekos iš tikrųjų yra labai svarbios ir kartu su
koduojančiais genais aktyviai lemia organizmo fenotipą. Nekoduojančių DNR sekų skirtumai tarp
individų taip pat pasireiškia fenotipiškai. Šios sekos reguliuoja genų aktyvumą. Prie jų jungiasi
transkripcijos veiksniai, kurie lemia kur nors toliau sekoje esančių genų raišką. Tad jei pakinta
transkripcijos veiksnių prisijungimo sekos, pakinta ir genų raiška. Nekoduojančių sekų mutacijos gali
būti susijusios su diabetu, šizofrenija, nutukimu, širdies infarkto rizika. Parodyta, kad didžioji dalis
žmogaus genomo (76 %, 2012 m.) yra transkribuojama susidarant įvairiausioms reguliacines
funkcijas atliekančioms nekoduojančioms RNR (ncRNR). Jos „užrašytos“ tarpgeninėse sekose ir
intronuose.
Reguliacinių RNR įvairovė ir veikla (ko gero) labiausiai lemia žinduolių tarprūšinius skirtumus, nes
žinduolių baltymų sekos ganėtinai panašios. ncRNR būna įvairaus ilgio: nuo ilgų (placentinių
žinduolių vieną X chromosomą inaktyvinanti Xist, žmogaus yra 17 kb ilgio) iki trumpų (apie 22 nt
ilgio miRNR). Nekoduojančios RNR gali veikti įvariai. Jos gali būti koduojančių RNR jungikliai, t.
y. būti tame pačiame transkripte, kaip ir koduojanti RNR, tačiau nekoduojančioje jos dalyje. Taip pat,
ncRNR gali egzistuoti ir kaip atskiros molekulės. Jos gali veikti bazių poravimosi principu,
komplementariai sąveikaudamos su DNR ar kitomis RNR sekomis. ncRNR reguliuoja genų raišką
įvairiais lygiais, o tai reikalinga fiziologijai ir vystymuisi. Jos dalyvauja procesuose, susijusiuose su
chromatino būsena, epigenetine atmintimi, splaisingu, transkripcijos, transliacijos reguliacija, RNR
redagavimu ir kt. Nenuostabu, kad šios RNR yra susijusios ir su ligomis. Jos (tikriausiai labai daug)
prisideda ir lemiant tarprūšinius bei tarpindividinius skirtumus. Reguliacinių nekoduojančių RNR
rasta ir prokariotuose, tačiau eukariotuose jų nepalyginamai daugiau. Panašu, kad prokariotų
gyvybinės funkcijos daugiausia remiasi baltymų veikla (bei tradicinių, transliacijoje dalyvaujančių
rRNR, tRNR veikla). O štai (ypač aukštesnieji) eukariotai, šalia baltymų veiklos ištobulino
nekoduojančių RNR tinklą. Tai labai galinga reguliacinių signalų sistema, kuri leidžia „nulipdyti“
sudėtingą organizmą.
Eukariotų genomuose yra randama daug pasikartojančių sekų. Vienos tokių sekų – transpozonai,
kurie yra mobilūs genomo elementai. Juose koduojama sistema, galinti nukopijuoti ir perkelti
transpozono seką į kitą genomo vietą. Nors ląstelei iš minėto sekų perkėlimo nėra naudos, yra
nuomonių, kad transpozonai padeda evoliucionuoti. Jie suaktyvėja esant nepalankioms gyvenimo
sąlygoms ir savo „šokinėjimu“ sukelia genomo nestabilumą bei persitvarkymus. Daugeliu atvejų,
tokie persitvarkymai organizmui nebūna naudingi. Tačiau kartais, netyčia, jie „susidėlioja“ geriau ir
toks genomas atrenkamas vykstant evoliucijai. Specifinės pasikartojančios sekos ypač svarbios
chromosomų struktūriniuose elementuose – centromerose ir telomerose. Telomerose jos veikia kaip
apsaugos, kad dalijantis ląstelei ir dėl replikacijos ypatumų trumpėjant DNR, nebūtų pažeisti genai.
Centromerose esantys pasikartojimai (dar kitaip vadinamos α-satelitinės sekos) – tai vieta
kinetochorui susidaryti mitozės metu. Kai kuriose chromosomose gali būti likusių nebenaudojamų α-
satelitinių sekų, esančių ne centromerų regionuose. Jos atsirado, kai vykstant evoliucijai susijungė
buvusios atskiros chromosomos.
Taip pat genome būna pseudogenų, kadaise funkcionavusių protėviuose, bet po kokios nors mutacijos
„sugedusių“ ir tapusių neaktyviais. Neveiklią, nenaudojamą DNR galima atsekti lyginant genomus –
ji bus mažiausiai konservatyvi, kadangi jos seka organizmui neturi reikšmės, joje greičiau kaupiasi
mutacijos. Tokia DNR vadinama „šlamštine“ (angl. junk). Reikia pabrėžti skirtumą tarp
nekoduojančios DNR (kuri nekoduoja baltymų, bet turi ir atlieka funkciją) ir šlamštinės DNR (kuri
yra vykstant evoliucijai užsilikusios nebenaudojamos sekos).

8.4. Genų raiškos reguliacija

Yra genų, kurių koduojama funkcija ląstelėms reikalinga tik esant tam tikroms sąlygoms. Kai kurios
funkcijos reikalingos visada (minėtieji „namų ūkio“ genai), bet jų koduojamų makromolekulių kiekio
poreikis gali skirtis priklausomai nuo situacijos. Biotechnologijoje taip pat labai pravartu įjungti
tikslinį geną tik norimu metu. Tam, kad visos genome koduojamos funkcijos neveiktų vienu metu ir
vienodu stiprumu (o tik tada, kada reikia, ir tiek, kiek reikia), reikalinga genų raiškos reguliacija.
Ląstelės turi daugybę reguliacijos būdų, veikiančių įvairiais raiškos lygiais: gali būti reguliuojama
transkripcija, nurašytos RNR stabilumas, transliacija, baltymų stabilumas.
Pirmiausia transkripcijos efektyvumas priklauso nuo promotoriaus sekos. Stiprūs promotoriai leidžia
dažnai ir tvirtai prisijungti fermentui RNR polimerazei, o tai lemia gausią geno transkripciją.
Neoptimalios prisijungimo sekos lemia mažesnę RNR produkciją.
Prokariotuose promotoriams atpažinti ir transkripcijai pradėti labai svarbus vienas iš RNR
polimerazės subvienetų – sigma (σ) veiksnys. Jų yra daug bei skirtingų. σ-veiksnys pasirenkamas
priklausomai nuo geno ir nuo aplinkos signalų. Genų raiškos valdyme dalyvauja ir daug specializuotų
baltymų – transkripcijos veiksnių bei slopiklių (represorių). Šalia promotorių yra vadinamosios
operatorių sekos, prie kurių jungiasi specialūs reguliaciniai baltymai. Prisijungę jie gali blokuoti
(neigiama reguliacija) arba inicijuoti (teigiama reguliacija) transkripciją. Klasikinis operono valdymo
modelis – neigiama reguliacija: baltymas slopiklis (represorius) yra susirišęs su promotoriumi ir
neleidžia vykti transkripcijai tol, kol ląstelei neprireikia to geno (ar genų, nes operone dažnai jų būna
keli) koduojamos funkcijos. Kai atsiranda operone koduojamų funkcijų poreikis, slopiklis atsikabina
ir genai pradedami transkribuoti. Taip valdomas laktozės pasisavinimą lemiantis operonas. Kai
laktozės bakterijos aplinkoje nėra – genai užblokuoti, kad nereikalingų baltymų gamybai nebūtų
švaistomi ląstelės resursai. Kai laktozės atsiranda, ji jungiasi prie slopiklio, šio konformacija pakinta
ir jis nebesiriša su DNR, o transkripcija aktyvinama (8.6 pav.). Labai panašiai veikia aminorūgšties
triptofano sintezei skirtas operonas. Kai triptofano ląstelė gauna iš aplinkos, operonas būna išjungtas,
o kai ląstelei reikia jo susisintetinti pačiai – operonas įjungiamas. Šiuo atveju, triptofano molekulė,
prisijungusi prie represoriaus, lemia jo jungimąsi prie DNR operatoriaus. Jei triptofano nėra,
represorius nesiriša prie DNR ir operonas paleidžiamas veikti.

(a) (b)
8.6 pav. Genų transkripcijos reguliacija: (a) Neigiama operono reguliacija. (b) Teigiama operono
reguliacija. Čia parodyti atvejai, kai genai yra išjungti, o įjungiami tik tada, kai to reikia. Tačiau
būna atvejų, kai genai paprastai yra įjungti ir tik esant tam tikroms sąlygoms
jie išjungiami – prisijungia slopiklis (represorius).

Biotechnologijoje plačiai taikoma neigiama genų reguliacija. Rekombinantiniai (tiksliniai, kurių

produktas domina, perkelti iš kitų organizmų) genai įterpiami prie įvairių hibridinių promotorių-
operatorių sekų. Labai svarbu, kad tikslinio geno raiška prasidėtų tik tada, kai užauginame
pakankamai biomasės, nes įterptas genas gali būti ląstelėms toksiškas ir stabdyti biomasės augimą.
Be to, tikslinio baltymo (rekombinantinio interferono ar pan.) norime gauti kuo daugiau iš kuo mažiau
biomasės. Tam reikia geros represijos, galimybės efektyviai represiją išjungti (kai reikia) ir gausios
transkripcijos po to. Visa tai yra panaudota E. coli pET sistemoje. Plazmidėje pET yra sudėta visa
genetinė informacija, reikalinga geno koduojamo baltymo raiškai: promotorius, transkripcijos
terminatorius, ribosomos prisijungimo seka. Tarp ribosomos prisijungimo sekos ir terminatoriaus yra
klonavimo vieta (angl. multiple cloning site). Joje įterpta daug ir įvairių restrikcijos endonukleazių
atpažinimo sekų, kad galima būtų įterpti norimą baltymą koduojančios DNR seką. Parinktas T7
bakteriofago promotorius. Tai labai stiprus promotorius. Jį atpažįsta tik T7 bakteriofago RNR
polimerazė, neatpažįsta bakterinės polimerazės. Daugiau tokių promotorių bakterijos ląstelėje nėra.
Už promotoriaus įterpta lac operatoriaus seka, prie kurios jungiasi lac operono slopiklis (represorius).
Taip pat plazmidėje yra genai, koduojantys lac operono slopiklį ir atsparumą antibiotikui lemiantį
baltymą (plazmidę turinčių ląstelių atrankai). Tikslinis genas nėra transkribuojamas, kol bakterijose
nėra T7 bakteriofago polimerazės. Jos genas būna genų inžinerijos būdu įterptas į laboratorinių E.
coli padermių chromosomą. Šios polimerazės genas valdomas lac promotoriaus ir lac operatoriaus.
Kai laktozė (ar į ją panaši molekulė) įdedama į terpę ir patenka į ląsteles, lac operono slopikliai
pasišalina nuo operatorių ir bakterijose prasideda T7 polimerazės sintezė. T7 polimerazė toliau vykdo
tikslinio geno transkripciją, o ląstelės ribosomos gamina norimą baltymą. Kadangi minėtas
bakteriofago T7 promotorius labai stiprus, po kelių valandų tikslinis baltymas sudaro didelę dalį visų
ląstelėje esančių baltymų. Vietoj laktozės induktoriumi naudojamas IPTG (izopropil-β-
tiogalaktozidas). Jis jungiasi prie slopiklio kaip ir laktozė, bet, skirtingai nuo laktozės, ląstelė negali
jo suskaidyti, dėl to indukcija išlieka pastovi.

Kitas reguliacijos variantas – teigiama reguliacija. Tam, kad nuo geno prasidėtų transkripcija,
reikalingas specialus prie promotoriaus besijungiantis baltymas – transkripcijos veiksnys. Bakterijose
neigiama ir teigiama reguliacija naudojama maždaug vienodu dažniu, o eukariotuose pagrindinis
būdas yra teigiama reguliacija (per transkripcijos veiksnius). Tačiau transkripcijos veiksnių
galimybės jungtis prie promotorių taip pat priklauso nuo chromatino struktūros. Aktyvaus
(transkribuojamo) chromatino – euchromatino – histonai būna acetilinti, todėl DNR prieinama
transkripcijos sistemoms. Neaktyvaus chromatino (heteterochromatino) histonai būna deacetilinti.
Histonus acetilina ir deacetilina specialūs fermentai (histonų acetilazės ir deacetilazės), taip
chromatino struktūra gali būti keičiama. Be to, ilgam nuslopinamų genų promotoriniuose regionuose
esantys citozinai dažnai būna metilinami. Metilo grupė prijungiama 5-ojoje pirimidino žiedo
padėtyje, toks citozinas paprastai žymimas 5mC. Prie metilintų promotorių nebegali jungtis
transkripcijos veiksniai, čia jungiasi specialūs metilintą DNR atpažįstantys baltymai, histonai
deacetilinami ir tokia DNR nutildoma. Nereikalingų genų metilinimas ir „uždarymas“ į
heterochromatiną – labai svarbus veiksnys vykstant audinių diferenciacijai daugialąsčiuose
organizmuose. Deja, šis procesas stebimas ir vėžiniuose audiniuose, kur taip nutildomi ląsteles nuo
supiktybėjimo saugantys genai (vėžio supresoriai).
Visi šie veiksniai (DNR metilinimas, histonų (de)acetilinimas), nekeičiantys genų sekos, bet darantys
įtaką jų raiškai, vadinami epigenetiniais, o jų tyrimai – epigenetika. Neseniai atrasta, kad žinduolių
DNR sudėtyje yra ir hidroksimetilcitozino (hmC). Jo biologinė reikšmė dar nėra galutinai išaiškinta.
Panašu, kad hmC dalyvauja kaip tarpininkas DNR demetilinime: 5mC yra verčiamas į 5hmC
specialaus baltymo, o hmC toliau gali virsti į C pasyviai (dalijantis DNR) arba aktyviai (dalyvaujant
specialiam fermentui, aktyvus kelias dar nėra įrodytas). Neatmetama prielaida, kad hmC tarnauja kaip
dar vienas epigenetinis DNR žymuo. Chromatino inaktyvacijoje gali dalyvauti ir specialios RNR.
Pavyzdžiui, placentinių žinduolių Xist RNR yra transkribuojama nuo vienos iš X chromosomų, ją
„apsivynioja“ ir taip inaktyvina.
Kitas genų raiškos reguliavimo lygis – kontroliuoti jau susintetintas iRNR molekules. Kaip ir prie
DNR sekų besijungiantys, gali būti ir prie mRNR besijungiantys slopikliai (represoriai), trukdantys
prisijungti ribosomai. RNR sekose taip pat gali būti vadinamųjų ribojungiklių (angl. riboswitch). Šiuo
atveju pačios iRNR seka sudaro struktūrą, kuri jungiasi su atitinkamu metabolitu. Nesant metabolito,
susidaro kitokia RNR struktūra. Nuo struktūros priklauso, ar iRNR bus transliuojama, ar ne. Yra
variantų, kai prisijungus mažai molekulei geno raiška sustabdoma, yra ir tokių, kai įjungiama.
Eukariotai plačiai naudoja RNR nutildymą. Šiuo atveju mRNR nutildyme dalyvauja kitos RNR
molekulės – mažos (~20 nt) reguliacinės RNR: miRNR (mikroRNR) ir siRNR (nuo angl. short
interfering RNR) komplementariai jungiasi prie iRNR, trukdo vykti transliacijai arba lemia iRNR
sukarpymą. miRNR yra tiesiogiai nuskaitomos nuo genomo, o siRNR iškarpomos iš ilgų dvigrandinių
RNR. miRNR veikimui užtenka ne visiško komplementarumo su iRNR, todėl jos gali turėti daugiau
nei vieną taikinį. Kitaip tariant, vėl turime sąveikų tinklą – vieną iRNR gali veikti daug įvairių miRNR
ir siRNR, ir viena miRNR gali turėti daug taikinių skirtingose iRNR. Šias RNR reikiamai sukarpo
baltymas Dicer, o veikia jos kompleksuose su baltymais, vadinamais argonautais7. Bakterijose taip
pat žinoma keletas atvejų, kai geno raišką reguliuoja ne baltymai, o mažos RNR.
RNR nutildymas naudojamas ir moksliniuose tyrimuose bei biotechnologijoje, kai reikia išjungti
tikslinį geną eukariotinėse ląstelėse. Geną galima išjungti ir genų inžinerijos metodais – padaryti
deleciją ar pan., bet RNR nutildymas – santykinai paprastesnis metodas. Tereikia į ląsteles įterpti
dvigrandinių RNR, atitinkančių norimą nutildyti iRNR. O ląstelėse esanti RNR nutildymo sistema
jau padarys visą kitą darbą, kol galiausiai mūsų tikslinė iRNR bus sukarpyta. Rezultatas toks pats,
kaip ir po geno delecijos – nėra tikslinio baltymo. Be to, šiuo atveju geną galima nutildyti esant
norimai augimo stadijai. RNR nutildymas buvo atrastas, kai norint padaryti violetinių petunijų spalvą
sodresnę, į jas buvo įkelta papildomų kopijų vieno iš pigmentą lemiančių genų su stipriais
promotoriais. Netikėtai naujosios petunijos pražydo baltais ir margais žiedais (8.7 pav.). Didelis
kiekis iRNR sukėlė nuo RNR priklausomos RNR polimerazės veikimą, susidarė dvigrandinė RNR,
suveikė visa RNR interfrencijos sistema ir buvo suskaldyta ne tik naujai įkeltų, bet ir natūraliai
esančių genų pigmentą gaminančio fermento iRNR. Vienas pirmųjų komercinių produktų, sukurtas
taikant RNR nutildymą, buvo tvirtesni pomidorai, kuriuose nutildytas genas, lemiantis sunokusių
pomidorų minkštėjimą.

8.7 pav. Petunijos. Kairėje – laukinio tipo, dešiniau – augalai su papildomais pigmentą
gaminančio fermento genais, kurie dėl RNR nutildymo lėmė pigmentą gaminančių genų
nutildymą ir taip žieduose susidarė balti ploteliai. Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of
a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.0020133 Author Marjori A. Matzke,
Antonius J. M. Matzke; credit Jan Kooter for the left and middle images, and Natalie Doetsch and Rich Jorgensen
for the right images

8.5 Geno funkcijos nustatymas

Klasikinėje genetikoje, geno funkcijos paieška prasidėdavo nuo mutantinio fenotipo paieškos ir
analizės. Paskui buvo ieškoma, kur chromosomoje genas išsidėstęs. Galiausiai – kokia geno seka ir
koks koduojamas baltymas ar RNR. Tai gana ribotas būdas. Mat genų, dalyvaujančių baziniuose
ląstelės procesuose (pvz. RNR sintezėje ir tvarkyme, ląstelės ciklo kontrolėje), mutacijos dažniausiai
yra letalios (mirtinos) – negaunama mutantinių organizmų. Tokiais atvejais, kartais gelbsti nuo
temperatūros priklausomos mutacijos, t. y. kai žalingas mutacijos efektas pasireiškia tik esant

7 RNA interference (RNAi): by Nature Video: http://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE

aukštesnei temperatūrai. Pavyzdžiui, kai mutacija lemia mažesnį koduojamo baltymo struktūros
stabilumą. Žemesnėje temperatūroje toks fermentas išlaiko struktūrą (kaip ir laukinis tipas) bei atlieka
savo funkciją. Aukštesnėje temperatūroje (pvz. tos pačios bakterijos auginamos 30 ºC ir 42 ºC
temperatūroje) mutantinis baltymas denatūruoja ir nebeatlieka savo funkcijos, o visi laukinio tipo
baltymai funkcionuoja. Stebime nuo mutantinio baltymo pokyčio priklausantį fenotipą. Tačiau,
žinoma, yra daugybė atvejų, kai vienodą fenotipą gali lemti skirtingų genų mutacijos, o vieno geno
mutacija gali pasireikšti daugybiniais fenotipiniais požymiais. Todėl surasti, kur yra mutacija
(kokiame ji gene), nėra paprasta.
Turėdami nuskaitytus genomus, jau iš karto turime genų sekas ir jų vietas genome. Tačiau nežinome,
kokias funkcijas jie koduoja, kokius fenotipus lemia. Pirmiausia šios sekos palyginamos su duomenų
bazėse esančiomis nustatytą funkciją turinčiomis DNR ir baltymų sekomis. Jei tarp sekų yra
statistiškai patikimas panašumas (8.9 pav.), tai rodo, kad jos evoliucionavo iš bendro protėvio. Kitaip
tariant, jos yra homologinės. Panašios sekos baltymai dažnai atlieka tas pačias ar panašias funkcijas.
Tad pagal sekų panašumą į ištirtus homologus, genams priskiriamos spėjamos funkcijos – genomas
anotuojamas. Panašumas, o kartu ir spėjimo patikimumas, kiekvieno geno atveju gali būti labai
įvairus: nuo didelio panašumo su gerai ištirtais homologais iki variantų, kai homologija randama tik
su kitais nežinomos funkcijos baltymais. Sekos laikomos mažai panašiomis, kai statistinis jų
atitikimas yra mažiau nei 30 %. Genomo anotacija pagal homologines sekas – tai tik pradiniai
spėjimai ir nuorodos, kurlink turėtų sukti tų genų funkcijos tyrimai.

8.9 pav. (a) Labai panašių ir (b) mažiau panašių homologinių baltymų sekų palyginimai.
Tamsia spalva pažymėtos vienodos aminorūgštys, balta – besiskiriančios. Taškeliais
žymimi tarpai palyginyje, kai baltyme išvis nėra fragmento,
kuris yra kitame palyginio baltyme.

Atsakyti į klausimą, ką konkretus baltymas veikia ląstelėje nėra paprasta. Tarkime, jo seka panaši į
baltymų kinazių (fermentų, fosforilinančių kitus baltymus) sekas. Pirmiausia reikia įrodyti, kad jis
tikrai (kaip ir jo homologai) geba fosforilinti baltymus (arba kad negali to daryti). Jei fosforilina,
kokie baltymai yra šios kinazės substratai, kur ląstelėje kinazė veikia, kokiuose audiniuose. Kokiuose
signaliniuose, metaboliniuose keliuose dalyvauja? Kokia šios kinazės paskirtis, svarba organizmo
vystymuisi ir gyvenimui?
Norint ištirti baltymo aktyvumą, geną iš sudėtingo organizmo galima perkelti į modelinį laboratorinį
organizmą (E. coli, mieles ir pan.). Iš šių organizmų biomasės tikslinį baltymą galima išgryninti ir
tirti jo aktyvumą mėgintuvėliuose – in vitro. Keičiant reakcijos sąlygas, substratus, nustatoma, kokią
reakciją ir kokiomis sąlygomis, kaip greitai ir efektyviai (ir pan.) katalizuoja tiriamasis baltymas.
Turint išgrynintą baltymą, galima nustatyti jo tretinę struktūrą, kuri daug pasako apie baltymo
funkciją: galima nustatyti, kokios aminorūgštys yra aktyviajame centre ir kitus parametrus. Kai ką
apie erdvinę struktūrą galima pasakyti jau vien analizuojant seką: galima nuspėti, kurios sekõs vietos
sudaro α-spirales ar β-klostes. Tačiau dar nėra patikimų metodų sumodeliuoti tretinę struktūrą tik iš
aminorūgščių sekos. Nebent tiriamo baltymo seka yra labai panaši į homologo, kurio erdvinė
struktūra jau yra nustatyta. Pagrindinis metodas baltymo erdvinei struktūrai nustatyti – kristalografija.
Tam reikia turėti išgrynintą baltymą ir rasti tirpalo sąlygas, kurioms esant tiriamos molekulės
suformuoja kristalus. Gautas kristalas peršviečiamas rentgeno spinduliais ir pagal tai, kaip kristale
esančios molekulės išsklaido spindulius, nustatoma ir aprašoma visų molekulės atomų padėtis erdvėje
(8.10 pav.). Baltymai kristalizuotis gali ir kartu su savo substratais – tada struktūroje matoma baltymo
ir substrato sąveika (8.11 pav.). Baltymų struktūrų duomenų bazėje Protein data bank (PDB) šiuo
metu saugoma apie 69 000 baltymų struktūrų, kasdien jų daugėja.
(a) (b)

8.10 pav. (a) Baltymo tretinė struktūra atomų tikslumu. (b) Aminorūgščių atomų erdvinis
išsidėstymas iš arčiau.

(a) (b)

8.11 pav. (a) Baltymo ir DNR kompleksas. (b) Gliukozė fermento aktyviajame centre. Šiuose
paveiksluose baltymo struktūra pavaizduota supaprastintai (tik polipeptidinių grandinių
išsidėstymas erdvėje), kad geriau būtų matomi komplekso komponentai. Matomos α-spiralės ir β-
klostės (pastarosios žymimos kaip rodyklės). Paveikslėlyje (a) matoma, kad DNR citozino
 metiltransferazė išsuka taikinio bazę iš DNR grandinės į savo aktyvųjį centrą, kad galėtų atlikti
metilo grupės pernašą.

Baltymo erdvinę struktūrą galima nustatyti ir pasitelkiant branduolių magnetinį rezonansą. Šiam
metodui taip pat reikia turėti išgryninto baltymo tirpalą, bet nereikia jo kristalizuoti. Tačiau kol kas
gera skiriamoji geba gaunama tik nedideliems (iki 20 kDa molekulinio svorio) baltymams. Metodas
tobulinamas, siekiant gauti gerą skiriamąją gebą ir didesniems baltymams.

Kadangi dauguma baltymų ląstelėse funkcionuoja didesnių kompleksų sudėtyje, svarbu žinoti su
kokiais kitais baltymais sąveikauja mūsų tiriamasis baltymas. Tai gali nemažai pasakyti apie jo
funkciją. Jeigu nustatoma, kad baltymas įeina į proteasomos komplekso sudėtį, jis tikriausiai kažkaip
prisideda skaldant ląstelei nereikalingus baltymus.

Baltymų tarpusavio sąveikai nustatyti gali būti naudojama vadinamoji mielių dviejų hibridų sistema.
Čia panaudojami genų aktyvatoriai, sudaryti iš dviejų domenų: vienas domenas atpažįsta DNR, kitas
aktyvina transkripciją. Genų inžinerijos būdu tiriamojo baltymo seka prijungiama prie DNR
atpažįstančio aktyvatoriaus domeno sekos. Kai ši konstrukcija įterpiama į mielių ląsteles, jose
gaminasi hibridinis baltymas, sudarytas iš DNR atpažįstančio domeno ir tiriamojo baltymo. Šis
baltymas jungiasi prie reporterinio geno (to, kurio raišką galime lengvai stebėti) promotoriaus. Tačiau
transkripcija neprasideda, nes nėra ją aktyvinančio domeno. Aktyvinančio domeno DNR seka
sujungiama su visa įvairove potencialių tiriamojo baltymo sąveikos partnerių genų sekų.

Dažniausiai seka sujungiama su visa kDNR (angl. copy DNA), gauta nukopijavus visas audinio ar
organizmo ląstelėse esančias informacines RNR. Ji reprezentuoja visų aktyvių baltymų genų
biblioteką. Tokie konstruktai įterpiami po vieną į mielių ląsteles, jau turinčias pirmąjį konstruktą. Kai
pasitaiko su tiriamuoju sąveikaujantis baltymas, ši sąveika kartu suveda ir abu transkripcijos
aktyvatoriaus domenus. Tada prasideda reporterinio geno transkripcija (8.12 pav.). Tokios ląstelės
atrenkamos ir nustatoma jose esanti tiriamojo baltymo partnerio DNR seka. Galimos ir šio metodo
modifikacijos, kai stebima, kokios medžiagos gali trukdyti tiriamų baltymų sąveikai.

Sistemą galima pritaikyti netgi visoms organizmo baltymų sąveikoms aptikti. Šiuo atveju,
konstruojant ir hibridus su DNR atpažįstančiu domenu, ir su transkripciją aktyvinančiu domenu,
naudojama visa genų biblioteka. Tada konstruktų bibliotekos įterpiamos į ląsteles taip, kad į vieną
ląstelę patektų po vieną konstruktą. Galiausiai, pirmojo domeno konstruktų ląstelių imtys
kryžminamos su antrojo domeno konstruktų imtimis. Atrenkamos retos ląstelės, kuriose aptiktos
sąveikaujančių baltymų poros. Tada nustatomos tiriamųjų baltymų sekos. Šitaip buvo sudarytas
daugumos iš 6000 mielių baltymų sąveikos žemėlapis, vykdomi projektai C.elegans ir Drosophila
baltymų sąveikoms nustatyti.
 8.12 pav. Baltymų sąveikos tyrimo mielių dviejų hibridų sistemos metodu schema

Afininė chromatografija taip pat leidžia ne tik gryninti baltymus, bet ir nustatyti jų sąveikos
partnerius. Tiriamasis baltymas pritvirtinamas prie chromatografijos sorbento, o kiti tiriamų ląstelių
baltymai tiesiog leidžiami per tą sorbentą. Nesąveikaujantys prabėga, nusiplauna, o sąveikaujantys
su tiriamuoju baltymu – prikimba. Juos vėliau galima susirinkti ir atpažinti masių spektrometrijos ar
kitais būdais. Ko-imunoprecipitacijos atveju naudojamas antikūnas, atpažįstantis tiriamąjį baltymą,
prijungtas prie didesnių kietų dalelių. Antikūnas suriša tiriamąjį baltymą, o jei tirpale buvo ir su juo
sąveikaujančių baltymų, tai „sužvejojamas“ ir už tų dalelių ištraukiamas visas baltymų kompleksas
(8.13 pav).

8.13 pav. Imunoprecipitacijos schema

Kitas galingas baltymų ir baltymų ar kitų molekulių sąveikas parodantis metodas – tiriamų baltymų
eksponavimas ant bakteriofago (bakterijų viruso) paviršiaus (angl. phage-display). Šiuo atveju, genų
inžinerijos būdu tiriamųjų baltymų (ar jų dalių) biblioteka suliejama su viruso apvalkalo baltymu.
Tuomet, susidarant viruso dalelėms, tiriamieji baltymai išsidėsto ant dalelių paviršiaus. Tada ant
sorbento prikabinamas norimas ligandas: išgrynintas vienas tiriamasis baltymas, DNR ar pan. Visa
gauta virusinių dalelių biblioteka leidžiama per šį sorbentą. Ant sorbento prikimba su ligandu
sąveikaujantys baltymai (o kartu ir visos virusinės dalelės, ant kurių paviršiaus jie išsidėstę). Patogu
tai, kad virusinėse dalelėse yra DNR, kuri kodavo sąveikavusius baltymus. Išskyrus iš prikibusių
dalelių DNR, galima lengvai sužinoti su ligandu sąveikavusių baltymų sekas (8.14 pav.).

8.14 pav. Eksponavimo ant fago paviršiaus metodo schema

Tiriant su nukleorūgštimis sąveikaujančius baltymus (pvz. transkripcijos veiksnius) svarbu nustatyti,

kokią seką jie atpažįsta. Baltymų sąveiką su DNR puikiai parodo vadinamasis pirštų atspaudų
metodas (DNA footprinting). Žinomos sekos DNR fragmentas pažymimas prie vienos grandinės galo
prijungiant fosfato liekaną su radioaktyviu fosforu. Tiriamam baltymui leidžiama sudaryti kompleksą
su tokia DNR. Tada DNR sukarpoma nukleazėmis (nukleorūgštis karpančiais fermentais) arba
cheminiais reagentais. Sąlygos parenkamos tokios, kad gaunamas įvairaus ilgio sukirpimo fragmentų
mišinys. Jame yra ties kiekvienu pradinės DNR molekulės nukleotidu nukirptų fragmentų.

Šis įvairaus ilgio fragmentų mišinys išskirstomas pagal dydį elektroforezės būdu ir vizualizuojamas,
naudojant radioaktyvumui jautrias plokšteles. Mėginiai, kuriuose baltymas buvo įdėtas į reakciją ir
kur baltymo nebuvo, lyginami tarpusavyje. Mėginiuose, kur buvo baltymo, prisijungusio prie DNR,
šis apsaugojo DNR nuo sukarpymo – tokio ilgio sukarpytų fragmentų mėginyje nėra (8.15 pav.).
Pasitelkus dar keletą gudrybių, galima atsekti, ties kokia konkrečiai seka baltymas „sėdėjo“ ant DNR.
Šį metodą galima taikyti ir baltymų sąveikos su RNR tyrimams.
 8.15 pav. DNR pirštų antspaudų metodas baltymo ir DNR sąveikai tirti

Vis dėlto, galiausiai reikia nustatyti, kokią funkciją baltymas atlieka ląstelėje ir organizme, kodėl
baltymas svarbus. Baltymo lokalizacija ląstelėje taip pat gali papasakoti apie jo funkciją. Dažnai tam
prie tiriamo baltymo sekos genų inžinerijos būdu prijungiamas nedidelis oligopeptidas – epitopas (8–
12 aminorūgščių ilgio), kuriam surišti turimi saviti antikūnai. Antikūnai būna pažymėti
fluorescuojančiais dažais. Tad tikslinis baltymas gali būti ląstelėje specifiškai aptinkamas – tos
ląstelės vietos fluorescuoja. Jei turime antikūnus, specifinius mūsų tiriamam baltymui, epitopo
prikabinti nereikia (8.16 pav.).
 8.16 pav. Žalia spalva imunofluorescentiškai (antikūnais su
fluorescuojančiu dažu) nudažytas tubulinas fiksuotose žmogaus
ląstelėse. Mėlynai – paprastu cheminiu su DNR sąveikaujančiu dažu
nudažyti branduoliai.

Norint sekti tiriamo baltymo vietą, judėjimą gyvose ląstelėse ar net organizmuose, pasitelkiamas
žaliai fluorescuojantis baltymas (angl. green fluorescent protein, GFP). Tai baltymas iš medūzos
Aequorea victoria, kuris, apšviestas UV šviesa fluorescuoja. GFP genų inžinerijos būdu prijungiamas
prie kurio nors tiriamojo baltymo galo. Dažniausiai tai netrukdo tiriamajam baltymui veikti kaip
įprasta. Tačiau stebint GFP fluorescenciniu mikroskopu, galima sekti, kur sulietasis baltymas ląstelėje
juda ir kaupiasi, kaip greitai suskaidomos pavienės baltymo molekulės ir pan. Suliejimas su GFP jau
tapo standartine metodika tiriamojo baltymo lokalizacijai ir dinamikai ląstelėse ir organizmuose tirti
(8.17 pav.).

(a) (b)
8.17 pav. GFP fluorescencijos panaudojimas. (a) Svogūno ląstelėje GFP sulietas su peroksisomų
daugiafunkciu baltymu; (b) Paprastas peliukas ir peliukas, kurio odoje vyksta GFP raiška,
apšviesti UV šviesa. Transgeniniai GFP peliukai naudojami vėžio ir kitiems tyrimams.

Nemažai apie tikslinį geną gali pasakyti jo raiškos organizme pobūdis. Genas, kuris aktyviai
nurašomas tik suaugusio organizmo kepenyse, tikriausiai bus susijęs su toksinų skaidymu, bet mažai
tikėtina, kad dalyvaus formuojantis akims. Kokiame audinyje ir kaip gausiai yra transkribuojamas
tiriamasis genas, galima nustatyti naudojant RT-PGR (atvirkštinės transkripcijos PGR) metodą. Iš
ląstelių išskirta iRNR, naudojant atvirkštinę transkriptazę (fermentas naudoja iRNR seką kaip matricą
ir susintetina jai komplementarią DNR) perrašoma į DNR. Gaunama vadinamoji kDNR (copy DNR),
kuri reprezentuoja visus ląstelėje aktyviai transkribuojamus genus. Su tiksliniam genui parinktais
pradmenimis atliekama PGR reakcija ir nustatoma, ar tikslinis genas buvo aktyvus ir kaip stipriai
aktyvus.
O štai DNR mikrogardelės leidžia stebėti tūkstančių genų raiškos lygį vienu metu. Tiriant tiek daug
genų iš karto, galima matyti, kurie jie įjungiami ar išjungiami ląstelėms augant, dalijantis, atsakant į
hormoninius signalus, susidūrus su toksinais ir pan. DNR mikrogardelės – tai mažytės stiklo
plokštelės, ant kurių išdėliota daugybė DNR oligonukleotidų, kurių kiekvieno sekos specifiškai
atitinka kurį nors geną. Gardelė gali turėti dešimtis tūkstančių skirtingų DNR fragmentų, o tai leidžia
paraleliai tirti tokio kiekio genų raišką. Kiekvienos sekos vieta ant gardelės yra žinoma.
Mėginio kDNR bibliotekoje esančios sekos pažymimos fluorescuojančiu dažu ir užpilamos ant
mikrogardelės. Komplementarios sekos iš mėginio ir prikabintos ant plokštelės atranda viena kitą ir
suformuoja dvigrandinę struktūrą. Pozicijos, prie kurių prisijungė DNR iš mėginio, nustatomos pagal
fluorescenciją. Kadangi žinome, kokį geną atitinkanti seka yra kokioje gardelės vietoje, sužinome ir
kokių genų kDNR buvo mėginyje. Dažnai tiriamasis mėginys (pvz. vėžinio audinio) sumaišomas su
kita fluorescencine spalva pažymėtu kontroliniu mėginiu (sveiko audinio) ir tada perkeliamas ant
gardelės. Atsižvelgus į spalvų santykį, matoma, kurių genų raiška padidėjo, kurių sumažėjo
patologijos apimtame audinyje (8.18 pav.).

8.18 pav. Genų raiškos tyrimo ant mikrogardelės schema

Vis labiau tobulėjant ir pingant DNR sekoskaitos metodams, nuo mikrogardelių pamažu pereinama
prie visos mėginio kDNR bibliotekos sekų nuskaitymo.
Tiriant genų funkciją ir šiais laikais neapsieinama be mutagenezės. Galima pasirinktą geną (genų
inžinerijos metodais) išimti iš genomo ar tiesiog sukelti taškinę mutaciją ir stebėti to pasekmes.
Tiriant daugialąsčius organizmus, minėtus veiksmus reikia atlikti ląstelėse, iš kurių vėliau formuojasi
visas organizmas. Gyvūnų atveju, reikia dirbti su kiaušialąste ar embrioninėmis ląstelėmis. Norima
DNR gali būti įšvirkšta į ląstelę mikroinjekcijos būdu naudojant stiklinę mikropipetę arba pasitelkiant
virusą, sukonstruotą taip, kad perneštų norimus svetimus genus. Augalų atveju paprasčiau – galima
modifikuoti kaliaus ląsteles ir iš jų paskui išauginti mutantinį augalą. Į augalų ląsteles norima DNR
dažnai įterpiama naudojant technologiją, vadinamą dalelių bombardavimu: mažulyčiai aukso
rutuliukai yra padengiami DNR ir jais iš specialaus „šautuvo“ tiesiog šaudoma į ląsteles. Vėliau tiek
gyvūnų, tiek augalų ląstelėse šios įterptos DNR sekos homologinės rekombinacijos būdu gali
persikelti į genomą. Taip gaunamas mutantinis organizmas. Diploidiniuose organizmuose minėtais
būdais gauti heterozigotiniai individai yra tarpusavyje kryžminami. Taip gaunami homozigotiniai
individai, turintys įvesto geno seką. Žinoma, visa tai tinka tik tuo atveju, jei mutacijos nėra letalios.
Kita vertus, mutacijos letalumas pasako, kad tiriamasis genas yra labai svarbus kuriam nors baziniam
gyvybės procesui.
Tirti geną mutagenezės būdu galima ir jį perkėlus į laboratorinį organizmą. Tarkime, tikslinį baltymo
geną turime perkeltą į plazmidę, kurią nesunkiai galime dauginti laboratorinėje E. coli padermėje.
Turime išsigryninę šį baltymą, yra nustatyta jo tretinė struktūra. Tretinėje struktūroje matome, kurios
aminorūgštys sudaro aktyvųjį centrą. Norėdami ištirti, kurios iš jų svarbios (ir kaip) katalizėje, po
vieną jas pakeičiame į kitas (kitokias funkcines grupes turinčias aminorūgštis).
Pavyzdžiui, matome, kad DNR metiltransferazės aktyviajame centre yra cisteinas, kuris, manome,
sudaro laikiną kovalentinį ryšį su taikinio citozinu metilinimo reakcijos katalizės metu. Genų
inžinerijos būdu (pvz. naudojant PGR su norimą mutaciją galinčiais suteikti pradmenimis, DNR
hidrolizę ir susiuvimą) plazmidėje esančiame gene gana lengva pakeisti pasirinktos aminorūgšties
tripletą kitu. Galime keisti cisteiną į bet kurią kitą pasirinktą aminorūgštį. Dažniausiai tokių tyrimų
atvejais keičiama į alaniną – aminorūgštį, neturinčią krūvio, reaktyvių grupių ir turinčią nedidelę
šoninę grandinę, kuri nesudarys erdvinių trukdžių aktyviajame centre. Žinoma, platesniuose
tyrimuose pasirinkta aminorūgštis gali būti keičiama ir į keletą skirtingų pakaitų. Plazmidėje pakeitę
pasirinktos aminorūgšties tripletą, ta plazmide transformuojame E. coli, išsigryniname mutantinį
baltymą (ar kelis jo variantus). Tada in vitro stebime, kaip pasikeitė baltymo savybės, palyginus su
laukiniu tipu. Būna, kad nustatomos netgi mutantinių baltymų erdvinės struktūros. Taip
vizualizuojama, kaip pasikeitė baltymo aktyvusis centras ir sąveika su substratu.
Kadangi aukštesniesiems eukariotams pridėti papildomų genų yra paprasčiau, negu jų genus pakeisti,
naudinga sukelti dominuojančias neigiamas mutacijas (kurios panaikina normalaus tiriamo geno
aktyvumą). Šiuo atveju gali būti panaudojamas nukleorūgščių komplementarumas ir hibridizacija
(dviejų komplementarių grandinių susijungimas ir susisukimas į dvigrandinę spiralę). Jei įterpiame
geną, nuo kurio sintetinama RNR yra komplementari mūsų tiriamo geno iRNR (priešprasminė, angl.
antisense), šios RNR susijungia. Priešprasminė RNR hibridizuojasi su tiriamojo geno iRNR ir ši
nebegali atlikti savo funkcijos (nuo jos nebetransliuojamas baltymas ar pan.).
Taigi, praktiškai genas nurašomas, bet iRNR lieka neaktyvi, susijungusi su priešprasmine RNR ir
geno funkcija nutildoma. Priešprasminę RNR netgi nebūtina įterpti į genomą atskiro geno pavidalu.
Buvo pastebėta, kad įterpiant iš karto dvigrandines RNR (atitinkančias tiriamąjį geną) tiesiai į ląsteles,
tiriamojo geno veikla nutildoma taip pat sėkmingai. Reiškinys pavadintas RNR nutildymu. Dabar jau
žinoma, kad nuo dvigrandinės RNR priklausančiame geno nutildyme dalyvauja visas būrys natūralių
ląstelės baltymų. Šis reiškinys plačiai naudojamas genų funkcijoms tirti. Jis labai tiko C. elegans
tyrimams: dvigrandinę RNR galima sušvirkšti tiesiai kirmėlaitei į žarnyną. Galima kirmėlaitę
pamaitinti ir E. coli ląstelėmis, kuriose sukonstruota norimos dvigrandinės RNR raiška. RNR
pasiskirsto po visą kirmėlaitės kūną ir slopina tikslinio geno raišką įvairiuose audiniuose. Kadangi
visas C. elegans genomas yra nuskaitytas, RNR interfrencija pasitelkiama visiems jo genams
charakterizuoti. Mokslininkai jau sugebėjo šiuo būdu nuslopinti 96 % iš maždaug 2300 spėjamų genų
trečiojoje C. elegans chromosomoje.
Apie geno funkciją galima sužinoti ne tik jį išjungiant, bet ir indukuojant jo veiklą ne tuo laiku ir/arba
ne toje vietoje, kur (ir kada) paprastai pasireiškia jo veikla. Taip pat galima tiesiog labai sustiprinti
geno raišką ir stebėti pasikeitusį fenotipą. Raišką sustiprinti galima įterpiant tiriamąjį geną kartu su
stipriu promotoriumi arba įterpiant daug geno kopijų. Taip pat galima naudoti promotorius,
indukuojamus („įjungiamus“) tik norimu laiku ar norimoje vietoje. Dar vienas variantas – galima
tiesiog įšvirkšti į daug iRNR kopijų. Tokiu būdu buvo tiriama baltymo Wnt reikšmė ankstyvoje
ontogenezėje. Šis baltymas svarbus susidarant organizmo pirminei ašiai, kurios vietoje vėliau
formuojasi stuburas. Paprastai šio geno raiška vyksta tik vienoje blastomeros pusėje, kur ir susidaro
pirminė ašis. Įšvirkštus šio baltymo iRNR į varlės Xenopus blastomeros pilvinę pusę, ten taip pat
susidarė pirminė ašis (8.19 pav.).

8.19 pav. Ektopinė (kitoje, nei įprasta, vietoje) geno

raiška. Įšvirkštus Wnt baltymo iRNR į varlės blastomeros
pilvinę pusę, ten susidarė antra pirminė ašis.
(Nuotrauka iš S. Sokol et al., Cell 67:741–752, 1992. © Elsevier.)

O kaip tiriami žmogaus genai? Visi aprašytieji in vitro tyrimų ir mutagenezės geną perkėlus į kitą
organizmą metodai tinka ir žmogaus baltymams ar kitoms makromolekulėms. Tačiau mutagenezė
pačiame žmogaus organizme negalima. Yra du būdai žmogaus genams tirti. Abu jie sėkmingai
naudojami. Pirma, kadangi genai ir genų funkcijos evoliucijoje išlieka konservatyvūs, tyrimai
modeliniuose organizmuose atskleidžia pagrindinę informaciją apie panašius genus ir procesus
žmogaus organizme. Atitinkami žmogaus genai gali taip pat būti tiriami žmogaus ląstelių kultūrose.
Antra, daug mutacijų, kurios nėra letalios, atsiskleidžia žmonių populiacijose. Atitinkamą patologiją
turinčių žmonių tyrimai (o kartais ir jų ląstelių kultūrų tyrimai) gali atskleisti daug informacijos apie
su liga susijusius genus. Nors dauguma mutacijų yra retos, jas aptikti nėra sunku, nes jas turintys
žmonės patys atkreipia į save dėmesį, kreipdamiesi pagalbos į medikus.
Čia apžvelgėme tik keletą populiariausių genų ir baltymų tyrimų metodų.

8.6. Skirtingų rūšių genomų tarpusavio lyginimas

Nuskaičius ir surinkus genomą, iškyla užduotis identifikuoti visas sekoje esančias funkcionalias sritis,
įskaitant genus ir reguliacines sekas. Genus aptikti palyginti paprasta kompaktiškuose
mikroorganizmų genomuose, nes ten nedidelės tarpgeninės sritys. Eukariotuose jos didelės, todėl
labai išauga sekų „triukšmas“ ir genus nustatyti ne taip paprasta. Bakterijų genomai sudaryti
daugiausia iš baltymus koduojančių sekų (85–95 %), o žmogaus genomo tik 1,5–2 % tiesiogiai
koduoja baltymus. Daugybės kitų organizmų įvertis išsidėsto kažkur tarp šių dviejų kraštutinumų.
Yra dvi strategijos genams identifikuoti:
1) Pasinaudoti panašių sekų paieškomis duomenų bazėse, kuriose sudėtos žinomos ar spėjamos
funkcijos genų sekos (daugumos bakterijų genomų ~70 % anotuotų genų turi homologus –
giminingus ar panašius genus kitose rūšyse);

2) Naujų (ab initio, de novo) genų spėjimai, panaudojant tikimybinius skaičiavimus baltymus
koduojančioms sritims nuspėti (pagal statistinius duomenis apie nukleotidų išsidėstymą, kodonų
naudojimą rūšyje ir pan.).

Kadangi genų genomuose yra tūkstančiai, pirminė anotacija padaroma automatiškai. Paskui ji dar turi
būti kruopščiai peržiūrima, tobulinama, tikslinama, kad liktų kuo mažiau neteisingai anotuotų vietų.
Neteisingai anotuotos vietos gali klaidinti, o netiksli anotacija netgi gali būti perkelta į kitus genomus
(taikant anotavimą pagal homologijas).

Anotuoti labai padeda palyginamoji genomika. Lyginant skirtingų rūšių genomus atsiskleidžia
konservatyvūs koduojantys ir kiti biologiškai svarbūs regionai. Taip pat, lyginant įvairių rūšių
genomus tiriami organizmų filogenetiniai ryšiai, evoliucijos keliai, horizontali genų pernaša tarp
rūšių. Artimų rūšių palyginys gali atskleisti fenotipinių variacijų genetinį pagrindą ir rūšiai specifinius
regionus, kurie vėliau gali būti panaudojami rūšies ar padermės identifikavimui, pvz. greitai patogeno
diagnostikai.

Genomus lyginti galima poromis arba po keletą iš karto (daugybinis palyginys). Lyginant poromis,
gaunama informacija apie sintenijos (panašių genų vienodos vietos) išlaikymą, polimorfizmus
(skirtumus), galimą genų anotaciją ir genolapį. Daugybiniai palyginiai leidžia identifikuoti
konservatyvias sekas (t. y. funkcionalius elementus) ir galbūt juos anotuoti arba atrasti dar visai
nežinomų baltymų genus, taip pat tirti polimorfizmą, filogenezę ir kt. (8.20 pav.).

Kadangi lyginant genomus reikia dirbti su milijonų ir milijardų nukleotidų sekomis, reikalingi galingi
bioinformatiniai resursai ir gudrūs algoritmai. Sukurta ne viena genomus analizuojanti kompiuterinė
programa, lyginanti genomus skirtingais aspektais ir naudojanti skirtingas strategijas. Vienos ieško
tarp genomų ilgiausios vienodos sekos ir nuo jos sugretina viską. Kitos lygina „tekstą“ statistiškai –
panašiai kaip ir programos, skirtos tekstų plagijavimui aptikti. Vienos didžiausią dėmesį kreipia į
koduojančius regionus, kitos ieško bet kokių konservatyvių sekų, trečios bando apimti viską ir pan.
 (a) (b)

(c)

8.20 pav. Genomų palyginimai. (a) Sintenijos grafikas: palyginti dviejų E. coli
padermių genomai, parodyti įvairūs genomo evoliucijos pobūdžiai. Visiškai
atitinkančių genomų grafike būtų tiesi lygi įstrižainė; (b) Žmogaus (x-ašis) ir
šimpanzės (y-ašis) sintenijos grafikas; (c) Daugybinis genomų palyginys.
Vienuolikos Yersinia genties rūšių genomai. Linijos jungia atitinkančias sritis.

8.7. Ateities genomikos perspektyvos

Jau turime daugybės genų ir genomų sekas. Tačiau dar tik nedidelė dalis tų sekų mums kažką sako
apie genų funkcijas. Vienas iš didžiųjų ateities mokslo žingsnių bus galimybė žinoti ne tik visą norimo
organizmo genomo seką, bet ir visas tame genome esančių genų funkcijas. Toks požiūris į genomą
vadinamas funkcine genomika. Funkcinė genomika turėtų suteikti daug žinių apie gyvybės pagrindus
ir apie evoliuciją – ko, kokių funkcijų ir jų derinių reikia, kad organizmai gyvuotų. Galiausiai
turėtume suprasti, kas skiria bet kokį „maišelį“, pilną prikimštą įvairiausių baltymų ir kitų
makromolekulių, nuo gyvos ląstelės.
Šiuo metu vykdomas „1000 žmogaus genomų“ analizės projektas. Be to, siekiama nustatyti visus
įmanomus (ar bent jau dažniau pasitaikančius) vieno nukleotido skirtumus (angl. single nucleotide
polymorphism, SNP) žmonių genomuose. Siekiama sudaryti visų galimų žmogaus genomo variacijų
žemėlapį (HapMap). Šiuos skirtumus reikia susieti su įvairiausiomis ligomis, taip pat atrasti
variantus, kurie lemia gerą sveikatą. Pagal individualias paciento genomo sekas turės būti skiriamas
atitinkamas gydymas ir ligų profilaktika. Be to, žmonės labai skiriasi pagal savo organizmo reakcijas
į vaistus. Tad vaistai taip pat bus parenkami pagal individualias genetines savybes.
Genomika bus neatsiejama ir nuo biotechnologijos. Tai svarbu nuo pramonei skirtų mielių ir bakterijų
genomų nuskaitymo, interpretavimo iki transgeninių augalų (ir gyvūnų) su geresnėmis maistinėmis
bei atsparumo patogenams savybėmis, vaistų produkavimu juose, sumažintu (o gal ir visai
panaikintu) poreikiu naudoti cheminius, gamtai neįprastus, pesticidus ir kitus cheminius agentus, be
kurių neapsieina dabartinis žemės ūkis. Žmogaus patogenų genomika atvers kelius efektyviai kovai
su infekcinėmis ligomis.
Tyrimams plečiantis, apimant vis didesnes genų, genomų ir baltymų imtis, reikės naujų technologijų
laboratorijose. Svarbu paminėti, kad jau pristatytas prietaisas, kuriuo galima žmogaus genomo seką
nuskaityti per pusdienį. Tiesa, paskui reikia dar poros dienų informacinei jo analizei. Palyginkime –
pirmajam žmogaus genomui nuskaityti prireikė maždaug 10 metų. Dar neseniai vienam genomui
nuskaityti reikėjo 2–3 savaičių. Kitas svarbus dalykas – kaina. Manoma, kad kai žmogaus genomo
nuskaitymo kaina pasieks 1000 JAV dolerių, ji jau bus pakankamai maža, kad genomo nuskaitymą
galima būtų pradėti masiškai naudoti medicinoje. Prie šios kainos taip pat jau beveik priartėta. Be to,
kompanija „23andMe“ (https://www.23andme.com/howitworks/) jau siūlo asmeninį genotipavimą
už 300 JAV dolerių. Tereikia jiems nusiųsti savo seilių mėginį. Jie nenuskaito visos genomo sekos
(kuri visų žmonių sutampa 99,5 %), bet patikrina maždaug milijoną genomo vietų, kurių sekõs
variacijos yra patvirtintai susijusios su polinkiu sirgti tam tikromis ligomis bei atspindi asmens kilmę.
Ši informacija naudinga ligų profilaktikai, parenkant gydymą, taip pat žmonėms, besidomintiems
savo genealogija.
Visai funkcinės genomikos informacijai rinkti ir apdoroti reikės dar didesnių ir sudėtingesnių
informacinių technologijų bei didžiulių duomenų bazių. Reglamentavimui – naujų teisės ir
sociologinių tyrimų bei sprendimų. Taip pat – mokslininkų, medikų, mokytojų specialaus parengimo,
kad jie galėtų taikyti genomikos žinias savo darbe. Dar daugiau – reikalingas atitinkamas visos
visuomenės švietimas. Kad galėtume plačiai taikyti genomikos pasiekimus medicinoje ir pramonėje,
reikia, kad visuomenė šias naujoves vertintų teigiamai ir būtų pasirengusi jas priimti, žinotų šių
technologijų pagrindus ir suvoktų jų teikiamą naudą.
Kita vertus, asmeninis genotipavimas ir net viso genomo nuskaitymas – dar viena galinga
technologija, kurią būtina naudoti atsargiai ir apgalvotai. JAV jau priimtas Genetinės informacijos
nediskriminacijos aktas (Genetic Information Nondiscrimination Act), draudžiantis įdarbinant ar
sudarant draudimo sutartį vertinti žmogų pagal jo genetinę informaciją. Kai kurių ligų atveju,
genotipo nustatymo nauda akivaizdi: pavyzdžiu gali būti metabolinių sutrikimų atvejai, kai neveikia
vienas fermentas, o jo substratas kaupiasi organizme, sukeldamas toksinį poveikį. Tokiu atveju,
genotipavimas padeda greitai išsiaiškinti, kokius maisto produktus pacientas turi pašalinti iš savo
raciono. Tada žmogus gali gyventi visavertį gyvenimą.
Tačiau yra ligų (Alzheimerio, Parkinsono ligos), kurių didesnio polinkio susirgti genotipus žinome,
bet dar neturime efektyvaus būdo, kaip jas gydyti ar jų išvengti. Čia ir kyla klausimas: ar tada verta
žinoti savo genotipą tokios ligos atžvilgiu? Jeigu sužinome, kad rizika ne didesnė už populiacijos
vidurkį, gal ir būtų įdomu. O jeigu ji didesnė? Ar tikrai norėtume tai žinoti? Ar galėtume pasidalyti
šia informacija su artimaisiais ar kuo nors kitu? Ar norėtume nešioti tokią etiketę: „aš turiu genetiškai
užkoduotą didesnę nei vidutinę riziką susirgti nesustabdoma ir nepagydoma liga“? Kaip tai paveiktų
santykius su aplinkiniais? Dar pridėkime tai, kad sąvoka „genetinė rizika“ ir kiti medicininiai bei
moksliniai terminai didžiajai visuomenės daliai gali būti per sudėtingi ir galiausiai „etiketėje“ gali
likti tik „jis greit susirgs Alzheimeriu“. O ir vidinis balsas gali pradėti kartoti „aš tuoj susirgsiu ta
liga“, pamiršdamas, kad genome užrašyta tik didesnė nei vidutinė rizika. Todėl pats gali nesusirgti, o
galbūt susirgs kaimynas, kurio rizika buvo vidutinė. Todėl prieš renkantis genotipavimo paslaugą
reikėtų gerai apsvarstyti, kokią informaciją, užrašytą genome, mums reikia žinoti.
Literatūros sąrašas:
 http://www.sciencemag.org/content/328/5981/958.full
 http://www.genomesonline.org/cgi-bin/GOLD/index.cgi
 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908400012256
 http://www.newscientist.com/article/dn18680-junk-dna-gets-credit-for-making-us-who-we-
are.html
 http://hmg.oxfordjournals.org/content/15/suppl_1/R17.full
 Benjamin Lewin “Genes VII”. Oxford university press, New York. 2000
 http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/causey/pet.html
 http://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE (video)
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26818/
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26820/
 http://biochem218.stanford.edu/Projects%202001/Chain.pdf
 http://genomevolution.org/wiki/index.php/2011_BSA_Workshop
 http://genomebiology.com/2010/11/1/R1/
 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X11012897
 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982203007887
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26820/
 http://www.abcam.com/alpha-Tubulin-antibody-DM1A-Loading-Control-
ab7291.html#ab7291_2.jpg
 http://en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein
 http://cellularimaging.perkinelmer.com/lab_of_the_month/detail.php?id=17
 http://www.sciencephoto.com/media/212479/enlarge
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26818/
 Francis S. Collins, Eric D. Green, Alan E. Guttmacher & Mark S. Guyer. A vision for the
future of genomics research. Nature 422, 835-847 (24 April 2003)
 http://www.smh.com.au/technology/sci-tech/armageddon-super-virus-recipe-keep-secret-or-
publish-20111206-1og76.html
 http://rytis.org/2012/09/05/genetika/
9. Genų inžinerijos pagrindiniai metodai
Genų klonavimas – genų kopijų padauginimo ar perkėlimo technologijos

9.1. Pagrindinės raiškos sistemos: prokariotai, grybai, augalai, gyvūnai, audinių kultūros; jų
panaudojimo galimybės ir apribojimai

Nuo klonavimo tikslų priklauso, kokios ląstelės šeimininkės bus naudojamos transformacijai. Jeigu
klonavimo tikslas yra nustatyti geno seką ar sintetinti paprastą baltymą, galima naudoti paprastesnę
sistemą (pvz. bakterijas). Jeigu siekiama ištirti geno transkripcijos reguliaciją ar koduojamo baltymo
funkcijas, gali tekti pasirinkti sudėtingesnes sistemas. Pavyzdžiui, ištirti augalo geno veiklą pavyks
tik augalų ląstelėse (ar kultūrose), kuriose yra visi augalo geno transkripcijai, baltymo transliacijai,
modifikavimui ir veiklai būtini veiksniai (baltymai, organelės). Kai kuriais atvejais galima pritaikyti
tyrimams kelių etapų procedūrą. Klonavimas atliekamas naudojant kuo paprastesnes ląsteles
šeimininkes (bakterijas), kurias paprasta auginti ir manipuliuoti (įterpti ir išgryninti DNR). Tada
sukonstruota rekombinantinė DNR molekulė perkeliama į sudėtingesnes ląsteles (eukariotines) ir jose
atliekami tolesni tyrimai. Rekombinantinei DNR įterpti dažniausiai naudojama bakterija Escherichia
coli. E. coli ląstelėje transkripcija ir transliacija vyksta vienu metu: prie naujai sintetinamos iRNR
nedelsiant jungiasi ribosomos ir prasideda baltymo sintezė (9.1 pav.). Susintetinta iRNR nėra
modifikuojama. Tai skiriasi nuo procesų, vykstančių eukariotinėse ląstelėse: jose iRNR molekulės 5‘
gale prijungiama „kepurė“ – 7-metilguanozinas, 3‘ gale vyksta poliadenilinimas, vyksta splaisingas
– pašalinami intronai. Tada subrendusi iRNR pernešama iš branduolio į citoplazmą (ar endoplazminį
tinklą), kur vyksta baltymo sintezė (9.1 pav.).

9.1 pav. iRNR brendimas ir baltymų sintezė eukariotuose ir prokariotuose

Laboratorijose atliekama daugybė klonavimo darbų naudojant įvairių genotipų E. coli variantus
(kitaip vadinamus kamienais). Kitos bakterijos taip pat naudojamos klonuojant (pvz. Bacillus,
Pseudomonas genties bakterijos). Tačiau dažniausiai darbas su šiais prokariotais yra sudėtingesnis:
sunkiau įterpti svetimą DNR į jų ląsteles, gerokai mažesnis klonavimo vektorių pasirinkimas. Todėl
dažniausiai pirminiai klonavimo darbai atliekami naudojant E. coli bakterijas, o sukurta
rekombinantinė DNR vėliau įterpiama į tos rūšies organizmą, kuriame būtina atlikti tolesnius tyrimus
(9.2 pav.). Tam būtina naudoti klonavimo vektorius, kurie galėtų replikuotis abiejuose organizmuose.
Tokie vektoriai vadinami universaliais (angl. shuttle), jie turi replikacijos pradžios sritis ori,
lemiančias DNR replikaciją skirtinguose organizmuose.

9.2 pav. Klonavimas, naudojant universalų bakterijų ir mielių klonavimo vektorių

Nepaisant to, kad E. coli ląsteles yra paprasta naudoti klonavimui, pagrindinis šio šeimininko
trūkumas yra tai, kad E. coli yra prokariotas. Vadinasi, jame nėra branduolio ir organelių, būdingų
eukariotinėms ląstelėms. Todėl klonuoti eukariotų genai ir jų produktai gali neveikti E. coli ląstelėje
taip, kaip jie funkcionuoja natūralioje aplinkoje. Genai gali būti netranskribuojami (nes E. coli RNR
polimerazė neatpažins eukariotinio geno promotoriaus), jie gali būti neaktyvūs. Gali būti, kad geno
iRNR nebuvo modifikuota taip, kaip tai atliekama eukariotinėje ląstelėje – iš jos nebuvo pašalinti
intronai ar kt. Arba, susintetintas baltymas nėra aktyvus dėl to, kad prokariotinėje ląstelėje nėra
fermentų, galinčių prie baltymo prijungti angliavandenius (glikozilinti). Baltymų glikozilinimas yra
dažnas reiškinys eukariotuose, būtinas baltymų funkcionalumui. Didelė dalis medicinoje naudojamų
baltymų yra glikoproteinai. Pavyzdžiui, folikulus stimuliuojančio hormono FSH molekulės trečdalį
masės (32 kDa) sudaro angliavandeniai.

Kai kuriais atvejais galima problemų išvengti naudojant vienaląsčius eukariotus – mieles, dumblius
(t. y. organizmus, kuriais irgi paprasta manipuliuoti). Dažniausiai naudojamas tokio tipo eukariotas –
mielės Sacharomyces cerevisae. Jam yra sukurti specialūs klonavimo vektoriai ir išvesta įvairių
kamienų. Nepaisant to, kad mielės yra eukariotai, kai kurie procesai mielių ląstelėse nevyksta taip,
kaip aukštesniuosiuose eukariotuose. Todėl kai kuriais atvejais problemų nepavyksta išvengti. Yra
žinoma, kad mielėse baltymų glikozilinimas vyksta kitaip nei žinduoliuose. Mielėse, Goldžio
komplekse prie baltymų dažniau yra prijungiama manozė, o aukštesniuosiuose eukariotuose – sialo
rūgštis.

Siekiant išvengti šių problemų buvo sukurtos humanizuotos mielių Pichia pastoris ląstelės. Jose buvo
inaktyvinti per glikozilinimą dalyvaujančių mielių fermentų genai ir įterpta 14 aukštesniųjų eukariotų
(žmogaus, pelės ir žiurkės) genų, kurių produktai glikozilina baltymus pagal eukariotinės ląstelės
„scenarijų“. Alternatyvus problemos sprendimas – geno klonavimas aukštesniųjų eukariotų
kultūrinėse ląstelėse ar daugialąsčiuose organizmuose. Pastaruoju atveju šie darbai yra neišvengiamai
susiję su sudėtingesnių metodų naudojimu ir didesnėmis sąnaudomis. Todėl dažniau dirbama
naudojant augalų ir gyvūnų ląstelių (kitaip – audinių) kultūrų linijas, kuriomis paprasčiau
manipuliuoti nei visu organizmu. Savo ruožtu, klonavimo augalų ar gyvūnų organizmuose rezultatas
yra transgeniniai augalai ir gyvūnai, kurių genomo informacija yra pakeista visam laikui ir
perduodama palikuonims. Jie gali turėti įterptą svetimą, inaktyvintą geną, mutuotą savą geną.

9.2. Klonavimo vektoriai

Plazmidiniai klonavimo vektoriai

Dažniausiai naudojami klonavimo vektoriai yra sukurti iš bakterijų plazmidžių. Plazmidės

aptinkamos daugelyje bakterijų. Tai yra įvairaus dydžio (nuo kelių šimtų iki tūkstančių bp) ir nuo
bakterijos chromosomos nepriklausomai egzistuojančios DNR molekulės (todėl vadinamos
ekstrachromosominėmis). Jos dažniausiai būna žiedinės, dvigrandinės ir superspiralizuotos. Didelė
dalis klonavimo vektorių yra sukurti E. coli gamtinės plazmidės (vadinamos ColE1) pagrindu. Į ją
buvo įterptos papildomos DNR sekos, kad būtų lengva manipuliuoti plazmide laboratorijoje
klonavimo metu. Geras klonavimo vektorius turi turėti šiuos pagrindinius elementus: ori, klonavimo
sritį ir atrankos geną (9.3 pav.).

DNR sekos, vadinamos ori (nuo angl. origin of replication), yra būtinos plazmidės replikacijai. Jas
atpažįsta, prie jų jungiasi ir čia plazmidės replikaciją pradeda ląstelės šeimininkės baltymai, atsakingi
už DNR replikaciją – DNR polimerazės. Plazmidės, turinčios gamtinės plazmidės ColE1 ori, yra
vadinamos daugiakopinėmis. Šios plazmidės ląstelėje randama ~ 15 kopijų. Jos pagrindu yra sukurti
daugiakopiniai vektoriai, kurių ląstelėje būna net keli šimtai kopijų. Vektoriuose ColE1 ori sekoje
yra įvestos mutacijos, dėl kurių sutrikdoma plazmidės kopijų skaičiaus reguliacija – jų kopijų skaičius
ląstelėje padidėja. Todėl tokius plazmidinius klonavimo vektorius yra lengviau išgryninti iš ląstelių
– gaunama didesnė DNR išeiga. Tačiau kai kuriais atvejais naudojami mažakopiniai vektoriai – jų
ląstelėse būna tik kelios kopijos. Jie naudojami tada, kai į daugiakopinį plazmidinį vektorių klonuoto
geno produkto raiška būtų per didelė, o pats baltymas gali būti toksiškas ląstelei. Kai kurios plazmidės
ir jų pagrindų sukurti vektoriai gal replikuotis įvairiose bakterijose (Escherichia ir Salmonella arba
Pseudomonas ir Klebsiella genčių bakterijose). Tokios plazmidės vadinamos plataus šeimininkų rato.

Tačiau dauguma plazmidžių yra siauro šeimininkų rato. Jeigu plazmidė yra paplitusi E. coli
bakterijose, gali būti, kad ji „artimoje“ bakterijoje Salmonella typhimurium negalės replikuotis ir
nebus padalijama dukterinėms ląstelėms. Todėl, jei pirminius klonavimo darbus planuojama atlikti
E. coli bakterijoje, o vėlesnius – kitose ląstelėse, naudojami klonavimo vektoriai, kurie gali
replikuotis abiejuose organizmuose. Tokie vektoriai vadinami universaliais (angl. shuttle), kurie turi
replikacijos pradžios sritis ori, lemiančias DNR replikaciją skirtinguose organizmuose (9.3 pav.).
Kitas svarbus klonavimo vektoriaus elementas yra klonavimo sritis. Tai – vieta, kurioje įterpiamas
klonuojamas genas. Aišku, kad ši sritis turi būti plazmidės regione, kuris nėra būtinas replikacijai ar
kitai svarbiai plazmidės išsilaikymo ląstelėje funkcijai. Klonavimo srityje yra restrikcijos
endonukleazės atpažįstama DNR seka (taikinys), prie kurios fermentas prisijungia ir hidolizuoja
DNR. Svarbu tai, kad tokia seka plazmidėje būtų tik viena. Tada restrikcijos reakcijos metu žiedinė
plazmidė yra linearizuojama ir jos galus vėliau nesudėtinga sujungti su įterpiamu DNR fragmentu.
Jei plazmidėje yra keli tos pačios restrikcijos endonukleazės taikiniai, plazmidė bus sukarpyta į keletą
fragmentų. Šiuos fragmentus vėliau bus sunku (ar net neįmanoma) sujungti į intaktinę molekulę,
atkurti visų joje esančių svarbių sričių bei koduojamų genų funkcijų. Šiuolaikiniuose klonavimo
vektoriuose yra multikloninės sritys (MCS – angl. multicloning site). MCS – sritis, kurioje sutelkti
keliolikos skirtingų restrikcijos endonukleazių taikiniai (9.3 pav.). Tai naudinga, kai atliekami
sudėtingesni – keli, vienas paskui kitą einantys klonavimai tame pačiame vektoriuje. Pavyzdžiui, kai
į klonavimo vektorių įterpiamas genas, o vėliau priešais jį įterpiamos iRNR raiškos reguliacijai
svarbios DNR sekos. Arba, jei į jau anksčiau sukurtą rekombinantinę DNR reikia įterpti dar vieną
atrankos geną. Tokiu atveju per pirmą klonavimą galima naudoti vieną restrikcijos endonukleazę, o
per kitus klonavimus – jau kitą fermentą.

Trečiasis svarbus klonavimo vektoriaus elementas – atrankos genas. Jo reikia, kadangi bakterinė
plazmidės transformacija nėra efektyvi. Po transformacijos auginant ląsteles, jas reikia atskirti
(transformuotas su rekombinantine DNR nuo tų, į kurias DNR nepakliuvo). Dažniausiai atrankos
genai lemia atsparumą antibiotikams (ampicilinui, kanamicinui, gentamicinui, tetraciklinui). 9.3 pav.
pateiktame klonavimo vektoriuje pUC18 yra genas bla, koduojantis -laktamazę. Šis fermentas
hidrolizuoja laktaminius antibiotikus (peniciliną, ampiciliną, karbeniciliną). Laktamų koncentracija
mažėja, todėl ląstelės šie antibiotikai nebenužudo. bla geno buvimas klonavimo vektoriuje reiškia,
kad (išsėjus ląsteles po transformacijos ant terpės su ampicilinu) ant terpės užaugs tik tos ląstelės,
kurios turi pUC18 rekombinantinę DNR.

9.3 pav. Plazmidinio klonavimo vektoriaus pUC18 genolapis ir multikloninės srities MCS seka.
Vektoriaus koduojami genai (bla, rep ir lacZ) pavaizduoti storomis rodyklėmis, MCS sritis
pažymėta genolapyje. Restrikcijos endonukleazių taikiniai pabraukti virš DNR sekos, fermentų
pavadinimai sužymėti viršuje. Apačioje užrašyta LacZ α subvieneto N galo aminorūgščių seka.
Bakteriofaginiai klonavimo vektoriai

Nors bakteriofagų pagrindu sukurti vektoriai iš pirmo žvilgsnio labai skiriasi nuo anksčiau aptartų
plazmidinių, jie iš esmės atlieka tą pačią funkciją – tai ląstelėje besireplikuojanti DNR molekulė, į
kurią įklonuojamas genas.

Kas yra bakteriofagas? Bakteriofagai – bakterijų virusai, trumpai dar vadinami fagais. Kaip ir kitų
organizmų virusai, jie visiškai priklauso nuo ląstelės šeimininkės. Jose virusai dauginasi. Pagal
sandarą fagus galima būtų suskirstyti į keletą grupių: uodeguotieji, beuodegiai ir filamentiniai (kaip
siūlai) (9.4 pav). Genetinė informacija – dvigrandinė ar viengrandinė DNR yra supakuota į
uodeguotųjų ir beuodegių fagų galvutę, sudarytą iš baltymų (kapsidę). Filamentiniuose faguose
viengrandinė DNR yra supakuota siūliniame baltyminiame apvalkale.

9.4 pav. Bakteriofagų elektroninės mikroskopijos nuotraukos

E. coli  virusas yra vienas labiausiai ištirtų bakteriofagų, tad nenuostabu, kad jo pagrindu buvo
sukurti ir klonavimo vektoriai. Šis  virusas yra uodeguotasis fagas. Jo genomas – linijinė dvigrandinė
48,5 kb ilgio DNR, koduojanti 46 genus. Genomo galuose yra trumpi komplementarūs 12 bazių
viengrandinės DNR fragmentai, vadinami cos (nuo angl. cohesive ends).

Įdomus yra šio fago gyvenimo ciklas E. coli bakterijoje. Kai fagas užpuola bakteriją, jis adsorbuojasi
ant bakterijos paviršiaus – fago uodegos baltymai prisijungia prie E. coli ląstelės paviršiaus baltymo
LamB. E. coli ląstelei, šis baltymas yra svarbus nešiklis (perneša į ląstelę maltozę). Tuo tarpu fagui
jis naudingas kaip receptorius. Vėliau fago DNR įšvirkščiama į bakterijos ląstelę. Linijinės DNR
lipnūs cos galai susikabina ir susidaro žiedinė DNR molekulė. Nuo šio momento fago gyvenimas gali
pakrypti dviem keliais (9.5 pav.):

 Lizogenijos ciklas;
 Lizinis ciklas.

Kuriuo keliu pasuks fagas, priklauso nuo įvairių aplinkybių: nuo aplinkos fizinių veiksnių, nuo
ląstelės būsenos ir net nuo to, kiek virusų adsorbavosi ant tos pačios ląstelės. Jei aktyvinamas
lizogenijos ciklas, fago DNR yra įterpiama (integruojama) į E. coli chromosomą, susidaro
vadinamasis profagas. DNR integracijai yra būtini fermentai, jų genai koduojami paties fago genome.
Profago DNR tampa sudėtine bakterijos chromosomos dalimi, ji replikuojama kartu. Po dalijimosi
dukterinės ląstelės gauna po chromosomą, kurioje tyliai tūno profagas.
 9.5 pav. fago lizinis ir lizogeninis gyvenimo ciklas

Lizinis fago gyvenimo ciklas gali aktyvintis iškart po infekcijos arba „prabudus“ profagui (ir jo DNR
išsikirpus iš bakterijos chromosomos) (9.5 pav.). Šiame cikle fago DNR (atskirai nuo bakterijos
chromosomos) yra sparčiai replikuojama. Nuo jos koduojamų genų vyksta iRNR transkripcija,
sintetinami fago baltymai, kurie suformuoja fago kapsides, į jas sukemšama DNR, prijungiama
uodegėlė. Bakterija virsta nedideliu fabrikėliu, kuriame intensyviai dauginamas virusas, kol galiausiai
ląstelė lizuojama fago fermentų ir žūva, o tūkstančiai ką tik pagamintų fagų pasklinda į aplinką,
ieškodami naujos aukos. Būtent todėl šis fago gyvenimo ciklas ir vadinamas liziniu (9.6 pav.).

9.6 pav. Petri lėkštutės nuotrauka, kurioje matyti skaidrios lizės zonos,
gautos užkrėtus bakterijas bakteriofagais

Idėja panaudoti fago DNR kaip klonavimo vektorių kilo supratus, koks veiksmingas procesas yra
fago DNR įterpimas į ląstelę, palyginus su įprasta DNR transformacija. Paaiškėjo, kad jei į fago
genomą įterpiamas ilgesnis fragmentas nei 2,5 kb (t. y. jei fago rekombinantinis genomas > 51 kb),
jis nėra nesupakuojamas – DNR nebetelpa į galvutę. Tačiau fagui daugintis ir sekretuoti palikuonis į
aplinką, visas genomas nėra būtinas. Didžioji dalis fago genų koduoja struktūrinius baltymus
(AWB....J) – kapsidės ir uodegos komponentus (9.7 pav.). Centrinė genomo dalis koduoja fermentus,
būtinus fago DNR integracijai į bakterijos chromosomą ir išsikirpimui – integrazę (int) ir ekscionazę
(exo). Už ekscionazės lokalizuoti genai atsakingi už genų raiškos reguliaciją, fago DNR sintezę ir
bakterijų lizavimą. Iš esmės, centrinė fago genomo dalis nėra būtina. Ją pašalinus fagas vis tiek sugeba
infekuoti ląsteles. Kadangi tokios fago genome nėra integracijai būtino fermento geno int, jis gyvuoja
tik liziniu būdu, niekada nesudarydamas profago. Tad jeigu laboratorijoje sukursime rekombinantinį
fagą, kurio centrinė genomo dalis bus pakeista mūsų klonuotu genu, turėsime puikią klonavimo
sistemą. Fagas rekombinantinį genomą lygiai taip pat veiksmingai sušvirkš į ląsteles ir tai bus gerokai
veiksmingiau nei bakterinė transformacija. Ląstelėse pasidaugins ir į aplinką bus paleistas didelis
kiekis fago kopijų – virusų su klonuota DNR, kurią nesudėtingais metodais galima išsigryninti iš fago
kapsidžių.

9.7 pav. yra pateikta  DNR pagrindu sukurto klonavimo vektoriaus Charon 40 schema. Šiame
vektoriuje yra dvi multikloninės sritys MCS, tarp jų (vietoj centrinės genomo dalies) įterptas DNR
fragmentas – „kamšalas“ (angl. stuffer). Kamšalas prieš klonavimą paveikus restrikcijos
endonukleazėmis yra pašalinamas, o vietoj jo klonuojamas pageidaujamas DNR fragmentas (detalus
klonavimo principas bus nagrinėjamas vėliau). „Kamšalas“ yra būtinas siekiant išlaikyti šio fago
klonavimo vektoriaus dydį artimą natūraliam fago genomui, nes ir per ilga (> 51 kb), ir per trumpa
(< 37 kb) DNR nėra veiksmingai pakuojama į galvutes. Į tokio tipo fago klonavimo vektorių galima
klonuoti labai ilgus DNR fragmentus (~ 22 kb.). Tai yra labai svarbu kuriant genų bibliotekas (žr. 9.6
sk.), nes į plazmidinius klonavimo vektorius paprastai nepavyksta įterpti ilgesnių nei 5 kb fragmentų.

9.7 pav.  fago genomo ir klonavimo vektoriaus Charon 40 schema



 DNR supakuoti į kapsides reikia dviejų dalykų (9.7 pav.):

 DNR turi būti optimalaus ilgio (t. y. 37 kb < DNR < 51 kb);
 DNR jos galuose turi būti viena kitai komplementarios 12 bazių viengrandinės DNR cos
sekos. Šias sekas atpažįsta fago baltymai, pakuojantys DNR į galvutes.

Tuo remiantis buvo sukurti hibridiniai klonavimo vektoriai – kosmidės. Iš esmės, kosmidė yra
plazmidė, turinti  fago cos seką (9.8 pav.). Kaip ir visi plazmidiniai vektoriai, ji turi ori, atrankos
geną ir klonavimo sritį. Geno klonavimas į šį vektorių vyksta taip pat, kaip ir į paprastą plazmidinį
vektorių. Tačiau užuot ligavimo mišinį transformavus į bakterijas, sukurtą rekombinantinę DNR (jei
ji bus ilga) galima in vitro (mėgintuvėlyje) supakuoti į virusus (kosmidė turi cos taikinius). Šiais
rekombinantiniais virusais infekuojamos ląstelės. Kaip minėta anksčiau, tai yra labai veiksmingas
būdas įterpti DNR į ląsteles. Ląstelėje rekombinantinė DNR egzistuos ir replikuosis kaip plazmidė,
nes ji nekoduoja jokių fago baltymų. Ji suteiks ląstelėms atsparumą antibiotikui, todėl po infekcijos
fagais terpėje su antibiotiku užaugs tik ląstelės su rekombinantine DNR. Kadangi pati kosmidė yra
maža (paprastai ~ 5 kb), į ją galima įklonuoti 32–45 kb ilgio DNR fragmentus (palyginkite: į
plazmides – ~ 5 kb, į Charon 40 – ~ 22 kb).

9.8 pav. Klonavimo vektorius – kosmidė

Eukariotinio geno klonavimas į prokariotinius vektorius – klasikinio klonavimo pavyzdys

Bet kurio klonavimo metu tenka numatyti tinkamą strategiją. Strategijos parinkimas grindžiamas tuo,
kokius tyrimus bus norima atlikti su rekombinantine DNR. Jeigu bus siekiama nustatyti DNR seką ar
sukurti eukariotinį baltymą gausiai sintetinančias bakterijas, galima panaudoti paprastus
prokariotinius klonavimo vektorius. Jeigu bus atliekami detalūs baltymo funkcijos tyrimai
eukariotinėse ląstelėse, teks pasirinkti tokį klonavimo vektorių, kuriuo būtų paprasta manipuliuoti (ir
konstruoti vektorių) bakterijose, o vėliau būtų nesudėtinga įterpti į eukariotines ląsteles tolesniems
tyrimams.

Sukurkime planą pelytės dab2 baltymo genui klonuoti. Šis baltymas yra svarbus įvairių ląstelės
procesų reguliacijai. Sumažėjus jo sintezei išsivysto kiaušidžių arba pieno liaukų vėžys. Dab2 geno
klonavimas bus sudėtingas, nes geno DNR seka yra neįprastai ilga – 40 kb.

 Pirmuoju atveju klonuojame pelių chromosominės DNR fragmentą, turintį šį geną. Tam teks iš
pelės ląstelių išgryninti DNR, dab2 geną iškirpti restrikcijos endonukleazėmis arba padauginti
polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) metodu. Kadangi fragmentas didžiulis (40 kb), teks
 pasirinkti klonavimo vektorių, į kurį būtų įmanoma įterpti tokio dydžio DNR. Tam geriausiai tiktų
kosmidė. Klonavimo schema pateikta 9.10 pav.

 Galima parinkti ir kitokią strategiją – klonuoti kDNR. Tam reikės išgryninti iš pelės ląstelių iRNR.
Tada panaudoti fermentą atvirkštinę transkriptazę, kuri nuo šios iRNR susintetins DNR. Nuo
iRNR susintetinta DNR vadinama kDNR (angl. cDNA, nuo copy DNA – ši DNR yra padaroma
seką nukopijuojant nuo iRNR), o pats fermentas yra paplitęs retrovirusuose (žr. 9.3 sk.). kDNR
reikia įterpti į klonavimo vektorių. Šiuo atveju klonuoti teks gerokai trumpesnį fragmentą, nes pre-
iRNR brendimo metu pelių ląstelėse yra pašalinami intronai, ji sutrumpėja. Dab2 geno iRNR ilgis
– tik 3,6 kb. Taigi ir kDNR yra kur kas trumpesnė – ją bus nesunku įterpti į paprastą bakterijų
klonavimo vektorių, pvz. pUC18 (9.10 pav.). Įterpus sukonstruotą rekombinantinę DNR į E. coli
bakterijas, galima tikėtis, kad vyks klonuoto geno transkripcija ir baltymo sintezė. Tuo tarpu, jeigu
nuo kosmidėje klonuoto viso dab2 geno (40 kb) ir vyks iRNR sintezė, veiklus baltymas nebus
susintetintas, nes E. coli ląstelėse nevyksta iRNR brendimas – nėra pašalinami intronai.

9.10 pav. dap2 geno klonavimas

Supervektoriai
Nors į bakteriofaginį Charon 40 klonavimo vektorių ir kosmides galima klonuoti gana ilgus (~ 22 kb,
45 kb) DNR fragmentus ir to kai kuriais atvejais nepakanka. Ypač tada kai kuriamos genų bibliotekos.
Sukūrus dirbtines chromosomas, ilgų DNR fragmentų klonavimo galimybės dar labiau išsiplėtė. Į
mielių dirbtines chromosomas (YAC – nuo angl. yeast artificial chromosome) galima klonuoti
didžiulius DNR fragmentus (~ 1000 kb.). Šiuose klonavimo vektoriuose yra įterpti mielių
chromosomų fragmentai, atsakingi už DNR replikaciją ir chromosomų stabilumą bei padalijimą
dukterinėms ląstelėms: replikacijos sritys ori, telomeros (tel) ir centromeros (cen) (9.11 pav.). YAC
yra universalūs vektoriai – juos galima įterpti į E. coli bakterijas, kuriose replikuojasi kaip žiedinė
plazmidė, vėliau iš bakterijų ląstelių išgryninti.

9.11 pav. Mielių dirbtinė chromosoma. Klonuojant į šį klonavimo vektorių, kerpama su dviem
skirtingomis restrikcijos endonukleazėmis. BamHI iškerpa nereikalingą DNR fragmentą, o į EcoRI
taikinį įterpiami ilgi DNR fragmentai. Vėliau susiuvami visi trys DNR fragmentai – kairė rankovė,
norimas įterpti DNR fragmentas ir dešinė rankovė. Konstruktas įterpiamas į mielių ląsteles, o
transformuotos mielės atrenkamos pagal abu atrankos genus.

9.3. Augalų ir gyvūnų klonavimo vektoriai

Augalų klonavimo vektoriai

Šiame skyriuje bus narinėjami klonavimo vektoriai, skirti įterpti DNR į augalų ląsteles. Jų kūrimui
buvo panaudota natūralaus dviskilčių augalų priešo – bakterijos Agrobacterium tumefaciens plazmidė
Ti (nuo angl. tumor inducing). Bakterija infekuoja augalą per pažeistas vietas ir aktyvina augalų
ląstelių nereguliuojamą dalijimasį. Dėl to susiformuoja augalų augliai (9.12 pav.).

9.12 pav. Augalo auglys, sukeltas A. tumefaciens infekcijos

A. tumefaciens infekcijos metu vyksta augalų ląstelių transformacija. Iš bakterijos Ti plazmidės 23

kb ilgio DNR fragmentas (vadinamas T-DNR) yra pernešamas į augalų ląstelės branduolį ir
integruojasi į augalo genomą (9.13 pav.). Visus šiam procesui reikalingus baltymus koduoja pačios
bakterijos genai – vir, esantys Ti plazmidėje. Šių genų produktai iškerpa T-DNR fragmentą iš Ti
plazmidės. Yra baltymai, kurie (panašiai kaip restrikcijos endonukleazės) atpažįsta ir hidrolizuoja dvi
T-DNR sekas, esančias kraštuose (vadinamas riboženkliais). Kiti baltymai suformuoja kanalą
bakterijos membranoje ir augalo sienelėje ir galiausiai nuneša T-DNR į augalo branduolį. T-DNR
fragmentas koduoja dviejų tipų genus:

 Augalų hormonų (auksinų ir citokinų) sintezės fermentus koduojantys genai

 Cheminių junginių – opinų – sintezės fermentus koduojantys genai

Ląstelės, į kurių genomus įsiterpia T-DNR, dėl joje esančių augalo hormonų genų raiškos pradeda
nepaliaujamai dalytis. Be to, jos sintetina opinus. Opinai yra aminorūgšties (dažniausiai arginino) ir
keto rūgšties (-ketoglutarato ar piruvato) junginiai. Tai – anglies ir azoto šaltinis, maisto medžiagos
bakterijai. Bakterija priverčia augalo ląsteles vergauti – daugintis ir sintetinti maisto medžiagas, nes
augalas opinų kaip maisto medžiagų nenaudoja.
 9.13 pav. A. tumefaciens T-DNR pernaša į augalo ląsteles

Išnagrinėjus A. tumefaciens augalų ląstelių transformacijos pavyzdį matyti, kad tai gali būti patogus
modelis klonavimui: Ti plazmidė gali būti geras klonavimo vektorius, o bakterija – įrankis DNR
įterpti į augalo ląsteles. Klonavimo metu vietoj T-DNR tarp riboženklių įterpiamas pageidaujamas
genas ir atrankos genas (pvz. genas, lemiantis atsparumą antibiotikui kanamicinui). Panaudojus A.
tumefaciens, sukurta daug transgeninių augalų (9.7 sk.).

Gyvūnų klonavimo vektoriai

Klonavimui gyvūnų ląstelėse naudojami gyvūnų virusai. Vieni iš populiariausių klonuoti žinduolių
ląstelėse yra retrovirusų (lentivirusų (ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas), onkovirusų (MLV–
pelių leukemijos virusas)) pagrindu sukurti klonavimo vektoriai.

Retrovirusų genomas – dvi linijinės 8–11 kb ilgio RNR molekulės, koduojančios viruso apvalkalo
baltymus (gag, env) ir fermentus: atvirkštinę transkriptazę ir integrazę (pol). Palyginkite: bakteriofago
 genomas net 4 kartus didesnis (48,5 kb)! Infekcijos metu retrovirusas pirmiausia prisijungia prie
ląstelės paviršiaus baltymų – receptorių (9.14 pav.). Susiliejus viruso apvalkalėliui ir ląstelės
membranai, viruso kapsidės turinys (fermentai ir RNR) patenka į ląstelę. Nuo genominės RNR yra
susintetinama kDNR. Šią reakciją katalizuoja atvirkštinė transkriptazė (dar žinoma kaip nuo RNR
priklausoma DNR polimerazė). Šis baltymas kartu su RNR molekulėmis yra supakuotas virusuose ir
į šeimininko ląstelę patenka infekcijos metu. Susintetinta DNR galuose turi LTR sekas (nuo angl.
long terminal repeats), kurios yra būtinos DNR integracijai į ląstelės genomą atsitiktinėse srityse.
Šiam procesui yra svarbus kitas viruso baltymas – integrazė. Nuo genome tūnančio proviruso DNR
ląstelės šeimininkės RNR polimerazė sintetina iRNR, ribosomose vyksta viruso baltymų sintezė.
Prisintetinus viruso dalelėms susidaryti būtinų baltymų aktyvinama viruso genominės RNR sintezė,
ji supakuojama į virionus. Tam, kad RNR būtų pakuojama į virionus, yra svarbi tam tikra pakavimo
signalinė seka, vadinama (psi), esanti genominės RNR molekulėje. Naujai „pagaminti“ virusai
sekretuojami į ląstelės aplinką ir infekuoja kaimynines ląsteles.
 9.14 pav. Retrovirusų gyvenimo ciklas

Klonavimo vektoriai retrovirusų pagrindu buvo sukurti išsiaiškinus, kad genai, kurių produktai yra
reikalingi virusui daugintis ir jo kapsidės apvalkalui sudaryti (gag, pol, env) gali būti koduojami ne
pačiame vektoriuje, o atskirame DNR fragmente. Tada sukuriama speciali pagalbinė ląstelių linija,
turinti defektyvų virusą. Jo DNR integruota į ląstelės genomą. Ji koduoja virusui daugintis ir
virionams susidaryti būtinus baltymus, tačiau pats virusas negali daugintis, nes neturi funkcionalios
sekos, kuri yra būtina supakuoti jo genominę RNR.

Tuo tarpu klonavime naudojamas vektorius turi tik genomo galines sekas LTR ir pakavimo signalą
Vektoriai dažniausiai yra universalūs – E. coli ląstelėje sukuriama rekombinantinė plazmidė, kuri
išgryninama ir įterpiama į pagalbinės linijos ląsteles, turinčias pagalbinį virusą. Šioje ląstelėje sukurta
rekombinantinė DNR yra padauginama taip, lyg tai būtų viruso DNR, ir supakuojama į virionus.
Surinkti virusai naudojami taikininėms žinduolių ląstelėms infekuoti. Kadangi jie turi atvirkštinę
transkriptazę ir integrazę, pagalbinėse ląstelėse supakuotas kartu su rekombinantine DNR, taikinio
ląstelėse rekombinantinė DNR bus įterpta į ląstelės genomą. O kadangi taikinio ląstelės neturi virusui
daugintis ir virionams susidaryti būtinų baltymų genų, šiose ląstelėse rekombinatinė DNR nebus
pakuojama į virusus, o stabiliai liks įterpta į ląstelės genomą. Nuo jos koduojamų genų vyks iRNR
raiška ir baltymų sintezė (9.15 pav.). Vienas pagrindinių šių vektorių trūkumų – įklonuoti galima tik
neilgus (iki 10 kb) DNR fragmentus.

9.15 pav. Klonavimas naudojant retrovirusų klonavimo vektorius

9.4. Restrikcijos endonukleazių ir DNR ligazių panaudojimas

Konstruojant rekombinantinę DNR yra svarbu turėti gerus įrankius, leidžiančius manipuliuoti DNR
molekulėmis: jas hidrolizuoti (tam naudojamos restrikcijos endonukleazės) ir vėl sujungti (tam
naudojamos DNR ligazės) mėgintuvėlyje. Šie fermentai dažniausiai perkami iš tiekėjų –
biotechnologinių kompanijų, kurios juos išgrynina iš įvairių organizmų.

Restrikcijos endonukleazės – vieni svarbiausių fermentų, genų inžinerijos įrankių, hidrolizuojančios

fosfodiesterinę DNR jungtį. Jos buvo apibūdintos 3.3 sk. Restrikcijos endonukleazės dažnai
aptinkamos gamtoje – bakterijose, kuriose jos yra restrikcijos ir modifikacijos sistemų dalis.
Restrikcijos ir modifikacijos sistema yra bakterijų „imuninė sistema“, apsauganti bakterijų ląsteles
nuo svetimos DNR (9.16 pav.). Jeigu svetima DNR pakliūva į ląstelę (bakteriofago DNR infekcijos
metu), restrikcijos endonukleazės ją hidrolizuoja. Šeimininko chromosominė DNR yra apsaugota nuo
endonukleazės poveikio. DNR metilina (prie nukleotidų prijungia metilo grupę) kitas šios „imuninės
sistemos“ komponentas – fermentas metilazė. Jei DNR yra metilinta, restrikcijos endonukleazė jos
nehidrolizuoja. Tuo tarpu į ląstelę pakliuvusi svetimoji nemetilinta DNR yra puikus taikinys
hidrolizei.

9.16 pav. Restrikcijos modifikacijos sistema bakterijose

Šiuo metu yra atrasta daugiau nei 3000 restrikcijos endonukleazių. Jos hidrolizuoja ~ 260 savitų DNR
sekų. Komerciškai tiekiama ~ 600 fermentų. Genų inžinerijai dažniau vartojamos vadinamosios II
tipo restrikcijos endonukleazės, kurios atpažįsta neilgus (6–8 nt) DNR simetrinius palindrominius
DNR taikinius. Palindrominiai taikiniai turi tą pačią taikinio seką ir tiesioginėje, ir jai
komplementarioje DNR grandinėje skaitant 5‘3‘ kryptimi (3.1 lentelė 3.3 skyriuje). Restrikcijos
endonukleazės naudojamos DNR fragmentų, klonavimo vektorių hidrolizei prieš klonavimą ir
rekombinantinės DNR analizei. 9.17 pav. yra pateikta rekombinantinės plazmidės DNR restrikcinė
analizė. Plazmidės DNR buvo hidrolizuota restrikcijos endonukleaze EcoRI ir endonukleazių EcoRI
bei HindIII mišiniu. Restrikcijos reakcijos produktai kartu su kontroline (restriktazėmis nepaveikta)
DNR išanalizuoti elektroforezės gelyje.

Matome, kad po elektroforezės gelyje buvo stebimi įvairaus ilgio DNR fragmentai (9.17 pav.).
Pirmame takelyje superspiralizuota ir kompaktiška kontrolinė DNR (kaip ir įprasta) judėjo greičiau
nei EcoRI hidrolizuota DNR antrajame takelyje. Sprendžiant pagal DNR ilgio standartus, pastarosios
ilgis bp atitinka teorinį – t. y. 4000 bp (4 kb). Veikiant DNR dviem restriktazėmis EcoRI ir HindIII,
plazmidinė DNR buvo hidrolizuota dviejose vietose, todėl susidarė du DNR fragmentai. Sprendžiant
pagal jų judrumą gelyje šių fragmentų ilgis yra 3 kb ir 1 kb.

Tai atitinka teorinius duomenis: plazmidės genolapyje ties restriktazių nurodytomis kirpimo sritimis
yra nurodytos ir tikslios hidrolizės koordinatės – EcoRI kerpa ties 396-a bp, HindIII – ties 1396-a bp
(9.17 pav.). Vadinasi, šios restriktazės iškerpa iš plazmidinės DNR 1396-396=1000 bp ilgio DNR
fragmentą. Likusio fragmento ilgį galima apskaičiuoti: 4000 bp (visos plazmidės ilgis) – 1000 bp
(iškirptas DNR fragmentas) = 3000 bp.
 9.17 pav. Plazmidės restrikcinė analizė

Klonavimo metu dviems DNR molekulėms sujungti ir fosfodiesterinei jungčiai tarp jų suformuoti
naudojamos DNR ligazės. Praktiškai dažniausiai yra naudojama DNR ligazė išgryninta iš
bakteriofagu T4 infekuotų E. coli ląstelių. Tai labai aktyvus fermentas, sujungiantis lipnius ir bukus
DNR galus ir vykdantis reakciją esant plačiam temperatūros intervalui (nuo +4 °C iki +37 °C). Dažnai
ši reakcija vadinama tiesiog ligavimu.

9.5. Ląstelių transformacijos ir atrankos metodai

Ląstelių transformacija

Manipuliacija klonuojamais DNR fragmentais ir klonavimo vektoriais (restrikcija, ligavimas) vyksta

mėgintuvėlyje. Vėliau susiduriama su kita užduotimi – įterpti sukurtą rekombinantinę molekulę į
ląsteles šeimininkes. Klonavimo sėkmė daugiausia priklauso nuo šio proceso veiksmingumo. O
įterpimo metodo pasirinkimas priklauso nuo to, koks klonavimo vektorius yra pasirinktas klonuojant
ir nuo to, į kokias ląsteles jį pageidaujama įterpti.

Dažniausiai laboratorijoje rekombinantinei DNR įterpti naudojamos E. coli ląstelės nėra tokios
imlios, kaip F. Grifitso eksperimente panaudoti pneumokokai (žr. 3.4 sk.). Todėl laboratorijoje E. coli
ląsteles tenka auginti ir paveikti tam tikrais tirpalais, kad jos pasidarytų kompetentiškos (t. y. imlios,
galinčios priimti DNR iš išorės) (9.18 pav.). Ląstelės yra laikomos šaltame kalcio chlorido tirpale,
kuris paskatina ląstelių imlumą. Kodėl ir kaip tai vyksta dar ir šiandien nėra visiškai suprantama.
Vėliau ląstelės sumaišomos su DNR tirpalu, laikomos leduose ir, sukėlus temperatūrinį šoką (+ 42
°C), aktyvinamas DNR patekimas į ląstelę. Ląstelės paauginamos pripylus mitybinės terpės ir
galiausiai išsėjamos ant atrankios terpės, kurioje auga tik transformuotos ląstelės. Kaip jau minėta
anksčiau, transformacija nėra labai veiksmingas procesas. Sėkminga galima laikyti transformaciją,
jei mišinyje, turėjus 109 bakterijų ir 0,1 g plazmidinės DNR gaunama 1000 transformuotų bakterijų
kolonijų. Jeigu transformuojamas ligavimo mišinys – transformantų būna dar mažiau. Todėl buvo
kuriami ir kiti transformacijos metodai.

9.18 pav. Bakterijų temperatūrinė transformacija

Vienas naujesnių DNR įterpimo metodų – elektroporacija. Bakterijų ląstelės praplaunamos vandeniu
– pašalinami elektrolitai buvę augimo terpėje. Tada ląstelės kiuvetėje sumaišomos su DNR ir trumpai
paveikiamos aukštos įtampos elektriniu lauku. Membranoje susidaro laikinos skylės, pro kurias DNR
patenka į ląstelės vidų (9.19 pav.). Vėliau ląstelės auginamos mitybinėje terpėje ir išsėjamos ant
atrankios terpės. Elektroporacijos metodas taikomas ne tik bakterijų, bet ir eukariotų – augalų ir
gyvūnų ląstelėms. DNR įterpimas į bakterijas šiuo metodu yra veiksmingesnis. Be to, jis yra
nepakeičiamas, jei įterpti tenka ilgus (> 50 kb) DNR fragmentus, kurių neįmanoma įterpti
temperatūrinės transformacijos metodu.

9.19 pav. Elektroporacijos metu vykstantys pokyčiai ląstelių membranoje

Mikroinjekcija yra alternatyvus DNR įterpimo į ląsteles būdas dažniausiai taikomas gyvūnų
ląstelėms. Naudojama labai plona adata, pro kurią DNR tirpalas sušvirkščiamas tiesiai į branduolį
(9.20 pav.). Tam reikia specialios aparatūros – mikromanipuliatoriaus ir mikroskopo.

9.20 pav. DNR mikroinjekcija į ląstelės branduolį.

Ląstelė laikoma prisiurbta prie stiklinio vamzdelio
Transformuotų ląstelių atrankos metodai

Po transformacijos tarp milijonų netransformuotų ląstelių reikia atrinkti tranformuotas ląsteles,

turinčias rekombinantinę DNR. Paprastai klonavimo vektorius turi atrankos geną, kurio produktas
suteikia transformuotoms ląstelėms kokią nors naują ypatybę. Bakterijai – atsparumą antibiotikui
(ampicilinui, tetraciklinui ar kt.), augalui – atsparumą herbicidui (fosfotricinui) ar antibiotikui
(kanamicinui), gyvūnui – atsparumą toksiškiems junginiams (indolui, histidinolui) ar antibiotikui
(gentamicinui). Todėl, išsėjus transformacijos mišinį ant atrankios terpės, turinčios antibiotikų ar
kitokių toksinių junginių, netransformuotos ląstelės žūva, o auga tik transformuotos.

Svarbu atkreipti dėmesį, kad gana dažnai ligavimo reakcija (jos metu genas įterpiamas į klonavimo
vektorių) nėra veiksminga. DNR ligazė gali susiūti klonavimo vektoriaus galus. Tokiu atveju vėl
susidaro „tuščias“ klonavimo vektorius, neturintis įterpto geno. Transformacijos metu šis „tuščias“
vektorius pateks į ląsteles ir eksperimentatorius džiaugsis išauginęs daug transformuotų ląstelių.
Vėliau paaiškės, kad vektoriuje nėra įklonuoto geno. Todėl sukurti metodai, leidžiantys atskirti
transformuotas ląsteles, turinčias „tuščią“ klonavimo vektorių, nuo ląstelių, turinčių sėkmingai
sukonstruotą rekombinatinę DNR. Vienas iš tokių metodų – baltų ir mėlynų bakterijų kolonijų
atranka. Ją galima taikyti, jei naudojami klonavimo vektoriai, panašūs į pUC18. Šis vektorius turi
LacZ baltymo (kitaip – -galaktozidazės) geno dalį, kuris koduoja tik mažą subvienetą  (9.21 pav.).
Kitas fermento subvienetas – (omega) – yra koduojamas bakterijos chromosomoje.

Kai į ląsteles įterpiamas klonavimo vektorius, jose sintetinami abu baltymo subvienetai. Jie susijungia
ir susidaro aktyvus fermentas. Kolonijų atrankai naudojama mitybinė terpė, turinti spalvinį LacZ
substratą (cheminis junginys, vadinamas X-Gal). Jei ląstelėje yra aktyvus fermentas, jis skaldo X-Gal
junginį, susidaro melsvi reakcijos produktai. Jie nudažo bakterijų ląsteles melsva spalva. pUC18
klonavimo vektorius yra sukurtas taip, kad jo MCS sritis yra  subvieneto geno viduje. Įterpus šioje
vietoje klonuojamą geną  subvieneto genas sugadinamas. Po transformacijos ląstelėje nėra 
subvieneto, todėl nėra ir aktyvaus LacZ fermento. Todėl bakterijų kolonijos išlieka baltos. Taigi, balta
spalva nurodo, kad šios ląstelės turi rekombinantinę DNR.

9.21 pav. Mėlynų ir baltų kolonijų atranka

9.6. DNR bibliotekų konstravimas ir tikslinių genų paieška

DNR bibliotekų konstravimas

Iki šiol pateikti klonavimo pavyzdžiai buvo susiję su vieno konkretaus geno įterpimu į klonavimo
vektorių. Tai – paprastesnė užduotis, palyginus su problemomis, su kuriomis susiduriama, jei
informacijos apie tiriamą ir siekiamą klonuoti geną ir jo produktą yra mažai (arba iš viso nėra).
Pavyzdžiui, nežinoma geno DNR seka, nežinoma, kokios restrikcijos endonukleazės tinka jos
išsikirpimui. Įsivaizduokime, kad mokslininkas aptiko bakterijas, kurios labai efektyviai hidrolizuoja
riebalus. Galima spėti, kad bakterijos sintetina ir į aplinką sekretuoja baltymą, greičiausiai fermentą
lipazę, vykdančią riebalų hidrolizės reakciją. Būtų naudinga klonuoti šios lipazės geną, ištirti
fermento savybes – gal įmanoma jį sintetinti didesniais kiekiais ir panaudoti valymo priemonių
gamybai. Tyrėjas neturi jokios informacijos, kokia tai lipazė ir kokia jos geno seka. Tokiu atveju,
tenka išgryninti bakterijos genominę DNR, ją hidrolizuoti į fragmentus ir visus juos klonuoti.
Gaunama didžiulė rekombinantinę DNR turinčių transformantų, ląstelių su skirtingais fragmentais,
kolekcija. Ir joje teks ieškoti tos vienos ar kelių kolonijų, turinčių lipazės geną.

Rekombinantinės DNR kolekcija, sukurta klonavus visą organizmo genominę DNR, yra vadinama
DNR biblioteka. Konstruojant DNR biblioteką, turi būti klonuojami persiklojantys DNR fragmentai.
Kodėl? Įsivaizduokime, kad tyrėjas pasirinko genominės DNR hidrolizei restrikcijos endonukleazę
EcoRI. Tačiau ši restriktazė nėra tinkama, nes lipazės geno viduryje yra jos taikinys (bet tyrėjas apie
tai dar nežino). Todėl DNR bibliotekoje tarp tūkstančių transformantų bus keli, turintys
rekombinantinę DNR su viena geno puse ir keli su kita puse. Nepavyks klonuoti vientiso lipazės
geno. Štai todėl ir stengiamasi kurti persiklojančių fragmentų biblioteką. Tuo tikslu genominės DNR
hidrolizuojama nevisiškai (vykdoma trumpa restrikcijos reakcija) arba taikomi ne fermentiniai, o
fiziniai DNR hidrolizės metodai (DNR hidrolizė ultragarsu). Tada gaunami persiklojantys DNR
fragmentai (9. 22 pav.).

9.22 pav. DNR fragmentų bibliotekos

Kita svarbi bibliotekos ypatybė – jos dydis, t. y. kiek transformantų turi būti gauta, kad kiekvienas
genominės DNR fragmentas būtų įklonuotas. Tai priklauso nuo genominės DNR dydžio ir nuo
pasirinkto klonavimo vektoriaus talpos (kokio ilgio DNR fragmentą galima įterpti). Tarkime, lipazę
sintetinančios bakterijos chromosominės DNR ilgis yra ~ 4 x 106 bp. Jei klonuodami panaudosime
pUC18, kurios talpa yra ~ 4 kb, reikės gauti 1000 transformantų. Jei panaudosime kosmidę, kurios
talpa yra ~ 40kb – reikės gauti tik 182 transformantus (9.1 lentelė). Transformantų skaičius išauga
didėjant genominės DNR dydžiui. Žmogaus genominės DNR (3 x 109 bp) biblioteka kosmidėje turi
turėti mažiausiai 75 000 transfomantų. Maža to, įvertinus, kad bibliotekoje turi būti klonuojami
persiklojantys fragmentai, transformantų skaičius išauga dar keletą kartų.

Organizmas Genomo dydis, Klonavimo Vektoriaus talpa, DNR bibliotekos

bp vektorius bp dydis

Plazmidė pUC18 4000 1000

Bakterija 4 x 106 Fago Charon 40 22 000 182
Kosmidė 40 000 100
YAC 1 000 000 4
Plazmidė pUC18 4000 750 000
Žmogus 3 x 10 9 Fago Charon 40 22 000 136 363
Kosmidė 40 000 75 000
YAC 1 000 000 3000

9.1 lentelė. Įvairių organizmų genomų bibiliotekos dydžiai.

Tikslinių genų paieška

Tikslinių genų paieška genų bibliotekoje dažnai tampa sudėtingiausiu darbo etapu. Ypač jei duomenų
apie baltymo funkciją (ir geną) nėra daug. Paieška DNR bibliotekoje, sukurtoje klonuojant lipazės
geną, bus nesudėtinga. Nepaisant to, kad teks tikrinti tūkstančius transformantų, nesudėtinga sukurti
biocheminį testą bakterijų lipazės aktyvumui tirti ir aptikti ląsteles, kuriose šis aktyvumas padidėjęs
dėl klonuoto geno raiškos.

Šiuo sparčiu biotechnologijos metodų plėtros laikotarpiu, kai praeito šimtmečio pabaigoje prasidėjo
DNR sekoskaitos era, yra sukaupta daug duomenų apie įvairių organizmų genų DNR seką bei
baltymų pirminę (aminorūgščių seką) ir antrinę (sekos išsidėstymą erdvėje) struktūrą. Atlikus paiešką
duomenų bazėse, nesunku pastebėti, kad tą pačią funkciją atliekantys baltymai dažnai turi panašius
aminorūgščių sekos motyvus. Ypač tai pastebima baltymo srityse, kurios yra atsakingos už tam tikrą
funkciją – tai gali būti fermento aktyvus centras, porą membranoje sudaranti, su DNR sąveikaujanti
baltymo dalis. 9.23 pav. pateiktas bakterijų lipazių aminorūgščių sekos palyginimas. Jame matyti,
kad kai kurios lipazių sritys yra konservatyvios – nekintančios. Galima tikėtis, kad klonuotos lipazės
analogiškas baltymo fragmentas irgi turės tokią pat seką. Duomenų bazėse suradę palyginyje pateiktų
lipazių genų sekas, turėsime pradinę informaciją, kokia galėtų būti klonuotos lipazės DNR seka. Ją
žinant, galima pritaikyti įvairius metodus lipazės geno paieškai DNR bibliotekoje – kolonijų
hibridizaciją ar PGR.
S.bongori MIVKKRRGRRALRCLACLMACSFFINAAYAWQQEYIAEAAPGHTTERYTWDSDHQPNYND 60
S.enterica MIVRKCRGRRTLCCLAGLMACSFFINTTYAWQQEYIAEAAPGHTTERYTWDSDHQPNYND 60
C.youngae MIIRNSSGRQRLT-LASVVVCALSINTAYGWQQEYIVDAMSGHTAERYTWDSDHQPRYND 59
E.coli MIIKKSGGRWQLSLLASVVISAFFLNTAYAWQQEYIVDTQPGHSTERYTWDSDHQPDYND 60
E.fergusonii MIIKICSGRRALRVMASVMICPFFCTTAHAWQQEYIVDAQPGHNSERYTWDSDHQPDYDE 60
** ** * * ****** ** *********** *

S.bongori ILAERIQSTQNAAGPVLNLAVETPLDATSGISMGWNFPVSSYVTTGPVAALHYDGSTSSM 120

S.enterica ILAERIQSTQNTVGPVLSLADETPLDATSGISMGWNFPLSRRVTTGPVAALHYDGSTSSM 120
C.youngae ILEERIRSTQNVAGPVVNLADRSPMDTTSGMSMGWNFPLSRQVTTGPVAALHYDGSTTST 119
E.coli ILSQRIQSSQRALGLEVNLAEETPVDVTSSMSMGWNFPLYEQVTTGPVAALHYDGTTTSM 120
E.fergusonii ILAQRIHHSQNVPGLSVSLAEDSPLDDTHGVTLGWNFPLYGQVTTGPVAALHYDGTSAAV 120
** ** * * ** * * * ***** *************

S.bongori YNEYGDSATVLAFTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 180

S.enterica YNEYGDSATTLAFTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 180
C.youngae YNEFGDSATSITPTDPLWHASVSTLGWRVNSQFGDVRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 179
E.coli YNEFGDSTTTL--TDPLWHASVSTLGWRVDSRLGDLRPWAQISYNQQFGENIWKAQSGLS 178
E.fergusonii YNEFGDSAIVQ--TDPLWHASVSTLGWRVNSQYGDLRPWAQISYNQQFGDNLWKAQSGLN 178
*** *** **************** * ** ************* * *******
.
S.bongori RMTAASQEGNWLDVTVGADMLLNPHLAAYAAFSQAENSATDSDYLYTMGVSAKF 234
S.enterica RMTAGNQAGNWLDVTVGADVLLNPHLAAYAAFSQAENSATDSDYLYTLGVSARF 234
C.youngae RMTTAGQDGNWLDVTVGADMLLNSHMAAYAALSQAENSANSSDYMYTMGVSAKF 233
E.coli RMTATNQNGNWLDVTVGADMLLNQNIAAYAALSQAENTTNNSDYLYTMGVSARF 232
E.fergusonii RIIATTQNGNWLDVTVGADMLLNTNIAAYAALSQAENSTNNSDYLYTMGVSAKF 232
* * *********** *** ***** ***** *** ** **** *

* - žymi tokią pat aminorūgštį, pilkame fone – konservatyvios sritys

9.23 pav. Bakterijų lipazių aminorūgščių sekos palyginimas

9.7. Transgeninių organizmų kūrimo metodai, gyvūnų klonavimas

Iki šiol nagrinėti genų klonavimo pavyzdžiai buvo susiję su individualiomis ląstelėmis – bakterijomis
arba augalų, gyvūnų ląstelių kultūromis. Šiame skyriuje apžvelgsime, kaip kuriami transgeniniai
organizmai: kaip įterpiami svetimi genai į daugialąstį organizmą, kaip kuriami mutantai (įterpiamos
mutacijos genuose). Manipuliuoti organizmais eksperimentų metu yra sudėtingiau, tačiau tyrimai,
atlikti naudojant modelinius gyvūnų organizmus (peles, triušius), yra ypač informatyvūs.

Svarbu suvokti skirtumą tarp transgeninio ir klonuoto organizmo. Transgeninis organizmas gaunamas
įterpus naują geną. Net nesvarbu, ar genas bus kitos, ar tos pačios rūšies individo. Netgi įterpus to
paties organizmo pakeistą (įvedus mutaciją) geno kopiją, organizmą galima laikyti transgeniniu. Tuo
tarpu klonuotas organizmas – tai genetiškai identiška kopija. Geriausias klonavimo pavyzdys – avytė
Doli. Kiekvienas sodininkas, gebantis padauginti augalus auginiais, taip pat yra klonuotojas,
gaunantis identiškas savo mėgstamo augalo kopijas. Tik jo taikomi metodai yra paprasti. O kuriant
transgeninius organizmus ir klonuojant gyvūnus naudojamos sudėtingos DNR ir ląstelių
technologijos.
Transgeninių augalų kūrimas

Vienas paprasčiausių metodų kuriant transgeninius augalus – panaudoti bakteriją A. tumefaciens. Jos
Ti plazmidė – klonavimo vektorius, o pati bakterija – puikus įrankis DNR įterpti į augalo ląsteles (žr.
9.3 sk.). Klonavimo metu vietoj T-DNR tarp riboženklių įterpiamas pageidaujamas genas ir atrankos
genas (genas, lemiantis atsparumą antibiotikui kanamicinui). Šie parengiamieji klonavimo darbai gali
būti atliekami E. coli. Sukurta rekombinantinė plazmidė išgryninama ir įterpiama į A. tumefaciens.
Bakterija užkrečiamos augalo ląstelės. Atliekant klonavimo darbus laboratorijoje retai naudojamas
visas augalas. Dažniau – augalų ląstelės, pavyzdžiui, kaliaus kultūra. Transformuotos augalo ląstelės
atrenkamos auginant terpėje su kanamicinu (9.24 pav.). Tad atrankioje terpėje visos išaugusios
ląstelės turės rekombinantinę DNR. O vėliau manipuliuojant augalų hormonų kiekiu mitybinėje
terpėje galima aktyvinti šaknijimąsi ar ūglių formavimą ir užauginti transgeninį augalą, kurio visos
ląstelės turės įterptą svetimą geną koduojančią DNR.

Transgeninių augalų kūrimas yra kur kas paprastesnis nei transgeninių gyvūnų. Kodėl? Todėl, kad
bet kuri augalų ląstelė yra totipotentiška – ji gali regeneruoti į visą augalą. Praktiškai naudojami ir
kitokie DNR įterpimo į augalų ląsteles būdai – protoplastų (ląstelių, neturinčių ląstelės sienelių)
transformacija ar elektroporacija, mikroinjekcija, balistiniai metodai (ląstelių apšaudymas dalelėmis,
padengtomis rekombinantine DNR). Panaudojus šiuos metodus sukurta daugybė transgeninių augalų,
naudojamų maisto, pašarų gamybai ir kaip pramonės žaliava.

9.24 pav. Klonavimas augalų ląstelėse, panaudojant A. tumefaciens

Transgeninių gyvūnų kūrimas

Mokslinėje literatūroje transgeniniai organizmai skirstomi į dvi pagrindines grupes. Pirmas – knock
in variantas (nuo angl. knock in – „įkalti“), kai DNR fragmentas įterpiamas. Dažniausiai jis koduoja
tam tikrą geną. Kitas – knock out variantas (nuo angl. knock out – „išmušti“), kai DNR seka tam
tikroje srityje pažeidžiama ir genas inaktyvinamas (sukuriamas mutantas). Organizmai yra
diploidiniai – turi dvi chromosomų kopijas, vadinasi, ir po dvi kiekvieno geno kopijas. Galima sukurti
heterozigotinį knock out tipo gyvūną, kuriame bus sugadinta tik viena geno kopija, arba homozigotinį,
kuriame sugadintos abi seserinių chromosomų geno kopijos. Kai transgeno konstruktas įterpiamas į
lytinių ląstelių ar ką tik apvaisintos kiaušialąstės genomą, gyvūno palikuonys (kiekviena jų ląstelė)
paveldės transgeną.

Transgenezei dažniausiai naudojamos pelės, avys ir ožkos. Transgeniniai gyvūnai kuriami įvairiais
būdais. Aptarsime tris pagrindinius metodus: tiesioginę DNR injekciją, retrovirusinių vektorių ir
embrioninių kamieninių ląstelių kultūrų technologijas.

 DNR injekcija yra plačiausiai naudojamas transgeninių gyvūnų kūrimo metodas. DNR yra
įterpiama į spermatozoido branduolį prieš tai, kai per apvaisinimą jis susilieja su kiaušialąstės
branduoliu (9.25 pav.). DNR integruojasi į chromosomą atsitiktinėse srityse. Kiaušialąstė
auginama mėgintuvėlyje, kol pasidalija keletą kartų, paskui implanuojama į surogatinės motinos
gimdą. Gimęs jauniklis bus transgeninė heterozigota, visos ląstelės turės transgeną, tačiau
dažniausiai tik vienoje chromosomoje.

9.25 pav. Transgeninių gyvūnų kūrimas DNR injekcijos metodu ir naudojant retrovirusą

Nors procedūra atrodo nesudėtinga, realybėje yra gana komplikuota. Pirmiausia – tik iš nedidelės
dalies kiaušinėlių vystosi vaisius ir gimsta jauniklis. Dalis kiaušinėlių žūva injekcijos metu, kiti
nebesidalija, treti neprigyja gimdoje, o dar didelėje dalyje kiaušinėlių transgeno DNR neįsiterpia į
genomą ir gimsta paprasti jaunikliai. Dažnai kyla probemų ir dėl to, kad transgenas integruojasi į
genomą keliose vietose. Todėl kyla pavojus, kad per jo įsiterpimą bus sugadintas svarbus genas, o tai
gali turėti letalias pasekmes. Eksperimento metu atlikus DNR injekciją į 100 kiaušinėlių galima tikėtis
gauti keletą transgeninių jauniklių. Pirmas transgeninis šiuo metodu sukurtas gyvūnas buvo pelytės
milžinės, turinčios žiurkių augimo hormono geną (9.26 pav.). Vėliau – kiaulės, turinčios žmogaus
augimo hormoną. Jos augo greičiau ir turėjo mažesnį riebalinį audinį.

9.26 pav. Pelė milžinė ir normali pelytė

 Transgeniniams gyvūnams kurti naudojami ir retrovirusiniai klonavimo vektoriai. Procedūra yra

panaši į DNR injekcijos metodą (9.25 pav.). Pagrindinis skirtumas yra tas, kad transgenas turi būti
įklonuotas į retrovirusinį klonavimo vektorių ir supakuotas į virusus. In vitro virusais infekuojamas
8 ląstelių stadijos embrionas. Vėliau jis implantuojamas į gimdą. Ši technologija yra paprastesnė,
palyginus su DNR injekcijomis, nes infekciją ląstelės išgyvena lengviau nei injekciją. Tačiau
metodas turi ir trūkumų. Pirma, retrovirusiniai klonavimo vektoriai nėra talpūs (iki 10 kb), tad
neįmanoma įterpti ilgo DNR fragmento. Antra, kadangi infekuojamas 8 ląstelių embrionas, yra
didelė tikimybė, kad ne visos, o tik kelios ląstelės bus infekuotos. Tad gimęs jauniklis bus chimera:
dalis jo organizmo ląstelių bus transgeninės, o likusios – pirmykštės. Tačiau kryžminant
chimerinius jauniklius tarpusavyje gaunami heterozigotiniai ir homozigotiniai transgeniniai
gyvūnai. Tie, kurie turi transgeną lytinių ląstelių genome, susilauks palikuonio, kurio visų ląstelių
genomuose bus transgenas.

 Trečiasis transgeninių organizmų kūrimo būdas yra susijęs su embrioninių kamieninių ląstelių
technologijomis. Embrioninės kamieninės ląstelės yra išgryninamos iš blastocistos ir
kultivuojamos in vitro. Kadangi jos yra paimtos iš embriono ankstyvos vystymosi stadijos, jos dar
yra nespecializuotos, tačiau iš jų vėliau gali vystytis (kitaip – diferencijuotis) bet koks organizmo
audinys. Šios ląstelės naudojamos transgenams kurti. Kultivuojant in vitro jomis manipuliuojama
– įterpiama DNR, atrenkamos genetiškai modifikuotos ląstelės ir jos vėl injekuojamos į blastocistą
(9.27 pav.). Blastocista implantuojama į gimdą. Gimęs jauniklis bus heterozigotinė chimera.

Dalis jo kūno ląstelių, kilusių iš originalių blastocistos ląstelių, bus pirmykštės ir neturės transgeno.
Tačiau kitų audinių (išsivysčiusių iš injekuotųjų ląstelių su pakeistu genomu) ląstelės bus
transgeninės. Atlikus keletą palikuonių kryžminimų gaunami homozigotiniai transgeniniai
organizmai. Šis embrioninių kamieninių ląstelių metodas turi keletą pranašumų, palyginus su
anksčiau aptartais dviem metodais. Pirma, galima įterpti bet kokio ilgio DNR fragmentą. Antra,
kadangi DNR įterpimas ir transformuotų ląstelių atranka vyksta in vitro, tai padidina eksperimento
sėkmę ir sumažina naudojamų gyvūnų skaičių. Tačiau svarbiausias šio metodo pranašumas yra tai,
kad DNR įterpimą galima kontroliuoti, t. y. nukreipti šį įvykį į tam tikrą genomo sritį. Taip galima
ne tik įterpti DNR fragmentą koduojantį geną, bet ir atlikti tikslius pakeitimus genome: visiškai
išaktyvinti pasirinktą geną arba įvesti jo koduojamoje sekoje tam tikrą mutaciją. DNR fragmento
įterpimas ne į atsitiktinę genomo vietą, o į konkrečią sritį vyksta dėl homologinės rekombinacijos.
Į embrionines kamienines ląsteles įterpiamas transgenas yra sukonstruotas tam tikru būdu. Jame į
 genomą įterpiama sritis yra apsupta dviejų sekų, identiškų chromosomos sričiai, į kurią norima
įterpti transgeną (9.27 pav.). Šios sritys – lyg nuoroda. Įterpus DNR ląstelėje vyksta homologinė
rekombinacija, dėl jos transgenas yra įterpiamas į šią chromosomos sritį. Transformuotų ląstelių
atrankai į transgeno konstruktą įterpiami ir atrankos genai.

9.27 pav. Transgeninės pelės kūrimas naudojant embrioninių kamieninių ląstelių technologiją.
Vienas pagrindinių embrioninių kamieninių ląstelių technologijų trūkumų yra tai, kad šis metodas
tinkamas tik transgeninėms pelėms kurti, nes kitų rūšių gyvūnų embrioninių kamieninių ląstelių
technologijos dar nepakankamai išplėtotos.

Transgeniniai organizmai turi didžiulę praktinę reikšmę. Sukurti gyvūnai – įvairių terapijai
naudojamų junginių producentai. Didžiulę reikšmę turėjo įvairių ligų (vėžio) molekulinės genetikos
tyrimai, atlikti su modeliniais transgeniniais gyvūnais. Dideles viltis mokslininkai sieja su
transgeninių gyvūnų panaudojimo galimybėmis žmonių organų transplantacijos srityje. Vertinant
globaliu mastu, trangeninių gyvūnų panaudojimo potencialas yra beribis ir neįkainojamas maisto
pramonėje ir moksliniuose tyrinėjimuose. Tačiau visuomenė turi prisidėti prie diskusijos, kokia
tolesnė šių technologijų raida yra etiškai priimtina.

Transgeninių gyvūnų kūrimas ir naudojimas išryškino keletą neigiamų požiūrių, kuriuos išreiškė
įvairios visuomeninės grupės – kovotojai už gyvūnų teises, įvairios religinės bendruomenės. Jų
nuomonę atspindi šie teiginiai:

 amoralu kurti gyvūnus, kuriuos genetiniai defektai pasmerkia kančioms ir mirčiai (turima
omenyje įvairūs modeliniai žmonių ligų tyrimams naudojami gyvūnai);

 niekas, išskyrus tikrąjį architektą – Gamtą (ar patį Dievą), neturi teisės keisti tvarkos Žemėje;

 ne paskutinėje vietoje tenka kritika farmacinėms kompanijoms, kurių veiklos tikslas yra
didesnis pelnas. Šis tikslas lemia vis didesnį gyvūnų superproducentų alinantį išnaudojimą;

 bijomasi galimo atsitiktinio transgeninių gyvūnų ir normalių gyvūnų kryžminimosi pasekmių

natūraliose populiacijose.

Gyvūnų klonavimas

1996 metais Roslino tyrimų institute (Didžioji Britanija) buvo klonuota avis Doli. Tai yra pirma
laboratorijoje sukurta gyvūno genetinė kopija, gauta ne iš lytinės suaugusio individo ląstelės, o iš
specializuotos (kitaip – diferencijuotos) somatinės ląstelės.

Gyvūnų klonavimo technologijų plėtrą paskatino sukurtas ląstelės branduolio perkėlimo metodas.
Būtent šį metodą panaudojo 1996 metais K. Kembel ir I. Vilmutas iš Roslino instituto (9.28 pav.). Jie
išskyrė somatines ląsteles iš Finn Dorset veislės avies pieno liaukų ir jas augino in vitro. Šių ląstelių
branduolį mokslininkai perkėlė į škotų juodaveidžių veislės avies kiaušialąstę, prieš tai iš jos pašalinę
branduolį. Suliejus somatinės ląstelės branduolį ir bebranduolę kiaušialąstę prasidėjo kiaušialąstės
dalijimasis ir išsivystė embrionai – jie buvo implantuoti į surogatinę motiną. Iš viso atlikus 277
suliejimus buvo gauti 29 embrionai. Iš pastarųjų tik vienas vystėsi normaliai ir gimė avytė Doli. Šie
eksperimentai parodė, kad (esant tam tikroms sąlygoms) iš suaugusio organizmo diferencijuotos
ląstelės galima gauti visą gyvūną.
 9.28 pav. Gyvūnų klonavimas

Tačiau aviai Doli greitai išryškėjo senatvės požymiai ir ji, atsižvelgiant į jos rūšį, nugaišo neįprastai
anksti (2003 metais). Viena to priežasčių laikomas chromosomų telomerų trumpėjimas. Telomeros –
tai pasikartojančių DNR sekų ir baltymų kompleksas, esantis chromosomų galuose, atliekantis
apsauginę funkciją. Žinoma, kad ląstelėms besidalijant chromosomų telomeros nuolat trumpėja. Tai
yra natūralus procesas, vykstantis organizmo senėjimo metu. Kūdikių telomerų ilgis yra ~ 8 kb,
pagyvenusio žmogaus sutrumpėja iki 1,5 kb. Kai chromosomų galuose nelieka telomerų,
chromosomos susilieja, ląstelės nebesidalija ir žūva. Doli klonuoti parinktas branduolys buvo paimtas
iš 6 metų amžiaus avies ląstelės. Tad jau gimusi avis genetiškai buvo kaip 6 metų gyvūnas. Išgyvenusi
dar 6 metus, ji nugaišo būdama 12 metų, kaip įprasta tos veislės avims.

Organizmų klonavimą galima suskirstyti į dvi grupes, pagal tai, kokiu tikslu ši procedūra atliekama.
Jeigu tikslas yra sukurti orginalaus organizmo kopiją – reprodukcinis klonavimas. Jeigu tikslas yra
atkurti organizmo audinius (moksliniams tyrimams arba ligai gydyti) – terapinis klonavimas.
Pagrindiniai objektai yra avys ir galvijai dėl ketinimo pritaikyti juos žemės ūkyje ir terapinių baltymų
sintezei. Kiti gyvūnai – pelės, kiaulės, ožkos, šunys, triušiai, žiurkės, mulai, katės ir makaka (2007
metais) – taip pat buvo klonuoti panaudojus branduolio perkėlimo metodą. Reikšmingiausi
transgeninių ir klonuotų organizmų kūrimo darbai yra pateikti 9.29 pav. 2004 metais Pietų Korėjos
mokslininkai publikavo eksperimentų, per kuriuos teigė klonavę žmogaus embrioną, rezultatus.
Tačiau išaiškėjo, kad jų rezultatai buvo suklastoti. Organizmų klonavimas yra, ko gero,
prieštaringiausia sritis etiniu požiūriu. Vertinant moksliniu požiūriu, tai yra neabejotinai reikšmingos
technologijos, būtinos tolesnei mokslo raidai. Tačiau akivaizdu, kad pasaulyje dažnėjant įvairių
verteivų komerciniams pasiūlymams klonuojant „atgaivinti“ nugaišusius augintinius, reikia griežtos
priežiūros ir kontrolės, kaip šios technologijos bus taikomos ir kokia jų tolesnė raida.
9.29 pav. Reikšmingiausi transgeninių ir klonuotų organizmų kūrimo darbai
9.8. Ar laboratorijoje įmanoma sukurti gyvą ląstelę?

Šiame skyriuje buvo aptarti metodai, kaip galima sukurti transgeninį organizmą, turintį tik nedaug
pakeistą genomą – įterptą vieną geną (ar kelis genus), mutaciją gene. Manipuliacijoms yra
naudojamas natūralus individo genomas. Tačiau prieš keliolika metų amerikiečių mokslininkai,
vadovaujami J. K. Venterio, užsibrėžė tikslą sukurti gyvą ląstelę laboratorijoje mėgintuvėlyje (in
vitro). Ir jiems tai pavyko 2010 metais (taip pat žr. 8.1.). Tiesa, dirbtinė ląstelė nėra visiškai dirbtinė.
Jos komponentai: membrana, ribosomos, įvairūs struktūriniai baltymai ir fermentai pradinei dirbtinės
ląstelės veiklai buvo „pasiskolinti“ iš donorinės ląstelės. Tačiau visas genomas šiai ląstelei buvo
susintetinas cheminiu būdu ir įterptas į ląstelę. Ši ląstelė pavadinta Mycoplasma mycoides JCVI-
syn1.0. Jos genomas yra identiškas narūraliam bakterijos M. mycoides genomui (1 x 106 bp, koduoja
~ 1000 genų). Tam, kad per eksperimentus sintetinis genomas nebūtų supainiotas su tikruoju ir būtų
galima įrodyti, jog jis vis dėlto yra dirbtinis, į genomą buvo įterpta keletas tam tikrų DNR fragmentų,
pavadintų „vandens ženklais“. Dirbtinių ląstelių atrankai palengvinti buvo įterptas ir atsparumo
tetraciklinui genas (tetM) bei lacZ (9.30 pav.). Dirbtinės ląstelės sėkmingai funkcionavo: vyko DNR
ir baltymų sintezė, jos dalijosi. Kita ambicinga mokslininkų užduotis – sukurti minimalią ląstelę, kuri
turėtų mažiausią nepriklausomam gyvavimui būtinų genų kiekį ir panaudoti jos resursus energijos,
farmacinių ar pramoninių junginių gamybai.

9.30 pav. Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 kūrimo schema

9.9. Nukleorūgščių gryninimo pricipai

Vienas pirmųjų žingsnių, būtinų daugumai genų inžinerijos metodų, yra nukleorūgščių (DNR ar
RNR) gryninimas iš ląstelių. Apžvelgsime šios procedūros pagrindinius etapus (9.31 pav.).

Gryninimo procedūros pradžioje, nesvarbu, ar ląstelės yra bakterinės, ar eukariotinės, pirmiausia jos
atskiriamos nuo auginimo terpės. Dažniausiai – centrifuguojant ląstelių suspensiją. Vėliau reikia
ląsteles suardyti ir išlaisvinti jų komponentus.

Ardant ląsteles, naudojami įvairių detergentų, cheminių junginių ir fermentų tirpalai. Bakterijos
(tarkim, E. coli) apvalkalui suardyti yra naudojamas lizocimas, kuris ardo bakterijos apvalkalo
sudėtinę dalį – peptidoglikaną. EDTA (etilendiamintetracto rūgšties) tirpalas prisijungia dvivalenčius
katijonus (destabilizuoja ląstelės membraną) ir slopina viduląstelines deoksiribonukleazes
(sutrumpintai DNazes), kurios gali hidrolizuoti gryninamą DNR. Detergentas NDS (natrio
dodecilsulfatas) ištirpina vandenyje netirpius membranų lipidus. Mielių ląstelių sienelės ardomos
naudojant fermentą litikazę, hidrolizuojančią sienelės glikanus. Gyvūnų ląsteles galima suardyti
veikiant detergentais. Tačiau augalų ar gyvūnų audinių ląsteles gali tekti smulkinti homogenizatoriuje
ar trinti skystame azote, o kietus audinius – malti.

Suardžius ląstelių sieneles, išlaisvinamas visų viduląstelinių komponentų mišinys (DNR, RNR,
baltymai, angliavandeniai, kitos makro- ir mažos molekulės). Pirmiausia tenka pašalinti baltymus –
tarp jų gali būti nukleorūgštis hidrolizuojančių fermentų ir kitų baltymų, galinčių sąveikauti su
nukleorūgštimis (ir taip trukdyti tolesnėms procedūroms). Tam gali būti naudojamas fermentas
proteinazė K, hidrolizuojantis baltymus. Kartais atliekama mišinio ekstrakcija su fenoliu ir
chloroformu. Šie organiniai junginiai denatūruoja baltymus.

Galiausiai, mišinyje esančios nukleorūgštys iš tirpalo išsodinamos užpylus izopropanolio ar etanolio.

Nukleorūgščių nuosėdos sukoncentruojamos mėgintuvėlio dugne centrifuguojant. Pašalinus tirpalą
nuosėdos ištirpinamos nedideliame tūryje sterilaus vandens. Jeigu tolesnėms procedūroms yra
reikalinga DNR, RNR priemaišos pašalinamos pripylus ribonukleazės (sutrumpintai RNazės), kuri
hidrolizuoja RNR. Jei reikalinga tik RNR, DNR priemaišos pašalinamos pripylus DNazės, kuri
hidrolizuoja DNR. Laboratorijose išgrynintų nukleorūgščių tirpalai laikomi esant -20 °C temperatūrai.

9.31 pav. Nukleorūgščių gryninimo etapai

Išgryninus nukleorūgštis, gautą rezultatą visada reikia įvertinti kokybiškai: patikrinti jų vientisumą
elektroforezės agaroziniame gelyje metu (žr. 9.10 sk.) ir nustatyti koncentraciją. Labiausiai paplitęs
koncentracijos nustatymo metodas – nukleorūgščių tirpalo sugerties UV srityje (esant = 260 nm)
matavimas spektrofotometru. Yra žinoma, kad įprastomis sąlygomis DNR tirpalo, kuriame
dvigrandinės DNR koncentracija yra 50 g/ml, sugertis yra 1,0. Pamatavus nežinomos koncentracijos
DNR tirpalo sugertį, galima apskaičiuoti, kokia yra DNR koncentracija tirpale. Jei nežinomos
koncentracijos DNR tirpalo sugertis yra 0,067, koncentracija apskaičiuojama (50 x 0,067) / 1,0 = 3,35
g/ml.

9.10. Elektroforezė

Nukleorūgščių elektroforezė gelyje yra vienas pirmųjų ir iki šiol labai svarbių analizės metodų. Jos
metu DNR ar RNR molekulės yra atskiriamos gelyje pagal dydį. Šis metodas gali būti tiek kiekybinis,
tiek kokybinis. Dažniausiai naudojamas metodas yra nukleorūgščių elektroforezė horizontaliame
agaroziniame gelyje.

Agarozė yra linijinis angliavandenių polimeras (9.32 pav.), išskiriamas iš jūros dumblių. Ruošiant
gelį, agarozės tirpalas yra išlydomas karštoje vandens vonelėje ar mikrobangų krosnelėje. Tirpalas
supilamas į formą, įstatomos specialios šukos, kurios suformuos šulinėlius DNR mėginiams supilti
(9.32 pav.) Leidžiama jai atvėsti ir sustingti (panašiai kaip gaminama desertinė želė). Šukos
ištraukiamos geliui sustingus. Gelis įdedamas į elektroforezės tirpalu užpildytą elektroforezės
aparatą. DNR mėginiai užnešami į šulinėlius kartu su spalvotais dažais (dažnai vartojamas
bromfenolio mėlynasis). Jie pagelbsti stebint elektroforezės eigą, nes šie mėlynos spalvos junginiai
(kaip ir nukleorūgštys) juda elektros lauke. Kartu su tiriamaisiais DNR ar RNR mėginiais, į
agarozinio gelio gretimus šulinėlius supilami ilgio standartai. Tai yra žinomo ilgio DNR (ar RNR)
molekulių mišinys. Po elektroforezės tyrėjas, lygindamas savo tiriamo mišinio molekules su ilgio
standartais, gali tiksliai nustatyti, kokio ilgio molekulės buvo jo tiriamame mišinyje.

9.32 pav. Agarozinio gelio ruošimas ir elektroforezė

Įjungus elektros srovę neigiamai įkrautos nukleorūgštys elektros lauke juda anodo link. Molekulių
judėjimo greitis per agarozinio gelio porų tinklą priklauso nuo nukleorūgščių molekulių dydžio.
Dvigrandinės linijinės DNR molekulės juda gelyje greičiu, kuris yra atvirkščiai proporcingas jų
molelulinės masės logaritmui. Kuo molekulė trumpesnė (turi mažiau bp), tuo greičiau ji juda gelyje.
Kitaip gelyje juda žiedinės molekulės. Plazmidės yra kompaktiškos ir superspiralizuotos. Tokios
plazmidės judės gelyje greičiau, nei linearizavus jas restrikcijos endonukleaze.
Agaroziniuose geliuose elektroforezės metu išfrakcionuotos nukleorūgštys dažomos įvairiais
cheminiais junginiais, kurie, apšvietus gelį UV šviesa, fluorescuoja. Vienas dažniausiai naudojamų
junginių – etidžio bromido tirpalas. Šis dažas jungiasi prie DNR ir RNR ir įsiterpia tarp heterociklinių
bazių plokštumų (šis procesas vadinamas interkaliacija), o apšviestas UV švyti ryškiai oranžiškai
rausva spalva (9.32 pav.). Etidžio bromidas yra kancerogenas, todėl dirbant su jo tirpalais reikia
naudoti vienkartines pirštines. Gelis gali būti dažomas ir netoksiškais junginiais, suteikiančiais DNR
fragmentams spalvą: metileno mėlynuoju, kristalvioletu, Sybr Green.

Dažniausiai nukleorūgščių elektroforezės agaroziniame gelyje metodas yra taikomas DNR ar RNR
kokybinei analizei, fermentinių reakcijų (restrikcijos endonukleazių, polimerazės grandininės
reakcijos) produktams nagrinėti.

9.11. Restrikcinė (DNR hidrolizės) analizė ir jos taikymas

Restrikcinei analizei naudojami fermentai – restrikcijos endonukleazės, hidrolizuojančios DNR

molekules. Šių fermentų savybės jau buvo aptartos anksčiau. Naudoti restrikcijos fermentus yra labai
paprasta. Tiekėjo nurodytas fermento tirpalo kiekis įpilamas į DNR tirpalą, pripilama fermento
reakcijos buferio, kuriame yra jonų, būtinų fermentinei reakcijai bei tirpalo pH stabilizuojančių
medžiagų. Tada tirpalas laikomas optimalioje temperatūroje (dažniausiai 37 °C). DNR hidrolizės
produktai analizuojami elektroforezės agaroziniame gelyje metodu. Praktinį restrikcijos analizės
taikymą nagrinėsime dviem konkrečiais pavyzdžiais.

Pirmasis pavyzdys – restrikcinės analizės taikymas rekombinantinės DNR iš transformuotų ląstelių

analizei. Prisiminkime pelės dab2 geno kDNR klonavimą į vektorių pUC18 (9.10 pav., 9.2 sk.).
Klonavimo metu ne visada ligavimo reakcija yra veiksminga. DNR ligazė gali susiūti klonavimo
vektoriaus galus. Tokiu atveju vėl susidaro „tuščias“ klonavimo vektorius, neturintis įterpto tikslinio
geno. Transformacijos metu šis „tuščias“ vektorius pateks į ląsteles ir užaugs antibiotikui atsparios
bakterijų kolonijos. Išgryninus plazmidinę DNR iš kelių ar keliolikos kolonijų ir sukarpius ją
restrikcijos endonukleazėmis, galima nustatyti, kurios transformuotos ląstelės turi rekombinantinę
DNR. 9.33 pav. matyti, kad, hidrolizavus iš Nr. 1 kolonijos išskirtą plazmidinę DNR restrikcijos
endonukleaze EcoRI ir dviejų restriktazių EcoRI bei HindIII mišiniu, gaunami 2,7 kb ilgio DNR
fragmentai. Jie yra tokio pat ilgio, kaip būtų gauta hidrolizuojant klonavimo vektorių pUC18.
Vadinasi, ląstelių transformantų kolonija Nr. 1 neturi rekombinantinės plazmidės. Į šias ląsteles
transformacijos metu pakliuvo tuščias klonavimo vektorius. Tuo tarpu iš Nr. 2 kolonijos išskirtą
plazmidinę DNR hidrolizavus restrikcijos endonukleaze EcoRI, gaunama ilga rekombinantinė DNR
(6,7 kb), o hidrolizavus ją EcoRI ir HindIII mišiniu iškerpamas įklonuotas 3,6 kb ilgio DNR
fragmentas. Taip atlikus restrikcinę plazmidės analizę galima išsiaiškinti, iš kokio ilgio DNR
fragmentų ji yra sudaryta.

Prisiminkime, kad vieną metodą, tinkamą rekombinantinės DNR paieškai, jau aptarėme anksčiau –
tai baltų ir mėlynų kolonijų atranka (9.21 pav.).
9.33 pav. Plazmidės restrikcinė analizė
Kitas pavyzdys – restrikcijos fragmentų ilgio įvairovės tyrimai (angl. restriction fragment lenght
polymorphism, RFLP) DNR mutacijoms nustatyti. Šis metodas taikomas klinikinės diagnostikos
srityje nustatant genetines ligas, kurios išsivysto dėl įvairių mutacijų genuose. Jei mutacija įvyksta
DNR sekoje, kurioje sugadinamas (arba atvirkščiai, įvedamas naujas) restrikcijos endonukleazės
taikinys, mutaciją galima nustatyti restrikcijos endonukleaze hidrolizuojant paciento DNR. Pavyzdį
panagrinėsime remdamiesi konkrečiu genetinės ligos (pjautuvinės anemijos) pavyzdžiu.

Pjautuvinė anemija yra paplitusi tropiniuose ir subtropiniuose regionuose. Ja sergančių žmonių

raudonieji kraujo kūneliai yra neįprastos pjautuvo formos (nuo to ir kilęs ligos pavadinimas). Tokia
forma susidaro dėl neteisingos hemoglobino (žymimas HbS) erdvinės struktūros. Jį sudarančio 11
chromosomos  globino gene 6-ą aminorūgštį koduojančiame kodone įvyksta mutacija ir glutamo
rūgšties kodonas (GAG) pakinta į valino kodoną (GTG). Homozigotiniai individai miršta dar
vaikystėje, heterozigotiniai yra ligos nešiotojai. Restrikcijos endonukleazė MstII hidrolizuoja DNR
taikinį 5‘-CCTGAGG-3‘. Toks taikinys yra normalaus  globino gene. Pjautuvinės anemijos atveju
 globino gene (šiuo atveju žymima s) šis taikinys yra „sugadintas“ (5‘-CCTGTGG-3‘), todėl
restrikcijos endonukleazė šios sekos nehidrolizuoja. Mutaciją s gene galima nustatyti atlikus RFLP
analizę. Išgryninus paciento DNR ir padauginus PGR metodu s geną koduojantį DNR fragmentą,
PGR reakcijos produktai hidrolizuojami restrikcijos endonukleaze MstII (9.34 pav.). Išanalizavus
restrikcijos reakcijos produktus elektroforezės metu agaroziniame gelyje, pagal susidariusių DNR
fragmentų ilgius galima nustatyti, ar žmogus yra pjautuvinės anemijos mutacijos nešiotojas. 9.34
paveiksle yra pateiktas heterozigotinių sutuoktinių poros ir trijų jų vaikų RFLP tyrimo pavyzdys.

9.34 pav. Restrikcijos fragmentų ilgio įvairovės tyrimas pjautuvinei anemijai nustatyti
9.12. Nukleorūgščių hibridizacijos metodai

Nukleorūgščių elektroforezė agaroziniame gelyje yra metodas, skirtas išfrakcionuoti ir nustatyti

nukleorūgščių molekulėms pagal jų ilgį (bp skaičių). Naudojant kitą populiarų genų inžinerijos
metodą – nukleorūgščių hibridizaciją, galima nustatyti nukleorūgštis pagal jų pirminę nukleotidų
seką. Tai yra jautrus metodas, kurį naudojant galima aptikti rūpimas DNR molekules mišiniuose.
Hibridizacijos principas buvo nagrinėjamas 3.4 sk. Šiame skyriuje kolonijų hibridizacija buvo
panaudojama rūpimą rekombinantinę DNR su klonuotu lipazės genu turinčio transformanto paieškai
DNR bibliotekoje.

Kitas pavyzdys – Southerno hibridizacija, naudojama rūpimai DNR molekulei aptikti DNR molekulių
mišinyje. Nežinomos lipazės geną galima klonuoti ir nekuriant viso genomo DNR bibliotekos. Užuot
klonavus visus hidrolizuotus bakterijos genomo fragmentus, pirmiausia reikėtų aptikti lipazę
koduojantį DNR fragmentą hidrolizuotos genominės DNR fragmentų mišinyje Southerno
hibridizacijos metu ir atrankiai jį klonuoti. Tam reikia išgryninti bakterijos genominę DNR ir
hidrolizuoti ją restrikcijos endonukleaze. Reakcijos produktų mišinys kartu su DNR ilgio standartais
išfrakcionuojami agaroziniame gelyje ir DNR fragmentai pernešami ant membranos (9.35 pav.).
Panašiai kaip ir kolonijų hibridizacijos atveju, šie DNR fragmentai hibridizuojami su žymėtu zondu,
paruoštu naudojant žinomos lipazės geno DNR. Po autoradiografijos pagal radioaktyvaus zondo
sankaupos vietas nustatoma, kokio ilgio (kb) yra DNR fragmentas, turintis nežinomos lipazės geną.
Pakartojus bakterijos genominės DNR restrikciją ta pačia restrikcijos endonukleaze ir vėl
išfrakcionavus produktus agarozės gelyje, išgryninami būtent tokio ilgio DNR fragmentai. Jie
klonuojami į klonavimo vektorių. Tiesa, tikėtina, kad šiame mišinyje bus ir atsitiktinių tokio pat ilgio
DNR fragmentų, neturinčių lipazės geno. Tačiau klonavus atsirinkto ilgio DNR fragmentus surasti
rekombinantinę DNR su nežinomos lipazės genu tarp transformantų pavyks greičiau nei klonavus
viso genomo hidrolizės fragmentus.

9.35 pav. Southerno hibridizacija

9.13. Genų raiškos tyrimai

Vienas pagrindinių genų raiškos tyrimo metodų yra Northerno hibridizacijos metodas. Jo principai
buvo išnagrinėti 3.4 sk. Naudojant šį metodą, iš ląstelių išgryninus iRNR galima analizuoti, kaip
keičiasi konkretaus geno raiška (iRNR sintezė) esant įvairioms organizmo augimo sąlygoms. Tačiau
šiuolaikinės hibridizacijos technologijos yra išplėtotos ir apima visuminius tyrimus – tiriama ne vieno
geno iRNR, o viso organizmo genomo (arba tam tikros genų grupės) genų raiška. Tokie metodai yra
naudingi tada, kai siekiama nustatyti, kokie organizmo genai yra aktyvūs esant tam tikroms sąlygoms
(kokie genai yra svarbūs bakterijai infekcijos metu). Kokių genų iRNR yra aktyviai sintetinama tam
tikruose audiniuose ar ląstelėse (pvz. vėžinėse). Visuminiai raiškos tyrimai atliekami naudojant
mikrogardeles (angl. chips). Jose ant stiklo ar kitokio kieto nedidelio paviršiaus pasitelkiant robotus
išpilstomos ir pritvirtinamos genų kopijos – sintetiniai genų fragmentai, reprezentuojantys visus
tiriamo organizmo genus (9.36 pav.).

9.36 pav. DNR mikrogardelės nuotrauka (gamintojas – Affymetrix)

Mikrogardelių panaudojimo pavyzdys yra pateiktas 9.37 pav. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar
pasikeičia genų raiška žmogaus plaučių vėžinėse ląstelėse, lyginant jas su sveikomis plaučių
ląstelėmis. Iš vėžinių ir iš sveikų to paties paciento plaučių ląstelių išgryninus iRNR susintetinami
skirtingomis fluorescentinėmis žymėmis žymėti zondai. Zondai, susintetinti iš sveikų ląstelių
išskirtos iRNR pažymimi žaliai fluorescuojančia žyme, o zondai, susintetinti iš vėžinių ląstelių iRNR
– raudonai fluorescuojančia žyme. Zondų sintezei panaudojama atvirkštinė transkriptazė.

Gautų zondų mišinys atspindi iRNR įvairovę ląstelėse: jeigu geno A transkripcija vyksta ląstelėje,
nuo jo iRNR bus susintetintas zondas, o jeigu geno B transkripcija nevyksta, zondo nebus. Sveikų ir
vėžinių ląstelių zondų mišiniai sumaišomi ir hibridizuojami su mikrogardele, kurioje yra
imobilizuotos viso žmogaus genomo genų kopijos. Zondai prisijungia prie komplementarių genų
kopijų sekų. Hibridizacijos rezultatai įvertinami nuskenavus lazeriu, kuris pagal zondų žalios ir
raudonos fluorescencijos signalus fiksuoja, kiek kurio zondo kuriame taške (t. y. prie kurio geno
kopijos) prisijungė. Apskaičiavus signalų skirtumus sužinoma, kurie genai yra aktyviau, o kurie
silpniau transkribuojami vėžinėse ląstelėse. Genų raiškos palyginimas sveikose ir vėžinėse ląstelėse
leidžia suprasti, kas atsitiko vėžinėse ląstelėse, kodėl jos supiktybėjo, kaip pasikeitė šių ląstelių
biologija. Ir svarbiausia – surasti jų „silpną vietą“ – pritaikyti vaistus naikinant vėžines ląsteles.
 9.37 pav. Genų raiškos tyrimas naudojant DNR mikrogardeles

9.14. Polimerazės grandininė reakcija

Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodo, skirto DNR molekulėms in vitro padauginti,
principas buvo nagrinėjamas 3.4. sk. Pastaraisiais metais sukurta įvairių PGR metodo variantų, skirtų
įvairioms procedūroms palengvinti. Pavyzdžiui, PGR metodu galima padauginti DNR fragmentą ir
klonuoti jį į vektorių. Maža to, klonavimo procedūrą galima palengvinti į oligonukleotidinius
pradmenis įterpus restrikcijos endonukleazės taikinius. Tada PGR produktą reikia hidrolizuoti ta
restrikcijos endonukleaze ir įterpti į paruoštą klonavimo vektorių (9.38 pav.). PGR metodu galima
įterpti mutacijas į klonuotą geną. Pirmiausia sukuriami oligonukleotidiniai pradmenys su
pageidaujama mutacija, o vėliau PGR metu susintetinamas šią mutaciją turintis DNR fragmentas
(aprašyta 3.4 sk.).
 9.38 pav. PGR produkto su įterptais restrikcijos taikiniais klonavimas

Kiekybiniam nukleorūgščių nustatymui sukurti metodai, vadinami realaus laiko PGR (RT-PGR). Šių
metodų tikslas yra nustatyti reakcijos produktą kuo anksčiau – kai susidaro pirmieji amplikonai, o ne
pasibaigus PGR elektroforezės metu. Taip apskaičiuojama, kiek mėginyje buvo pradinės matricinės
DNR. Reakcijos produkto kiekio matavimams pasitelkiami įvairūs cheminiai junginiai, pvz. SYBR
Green. Kai jo įpilama į PGR reakcijos mišinį, šis junginys jungiasi prie dvigrandinės DNR ir
fluorescuoja (9.39 pav.). Todėl PGR metu apie susidarančių amplikonų kiekį galima spręsti iš
reakcijos mišinio fluorescencijos „realiu laiku“ – dar nepasibaigus reakcijai.
 9.39 pav. SYBR Green fluorescencija

PGR pirmuose cikluose, kai reakcijos produkto yra nedaug, SYBR Green fluorescencija yra maža.
Kuo didesnė yra matricos koncentracija reakcijos mišinyje, tuo ankstesniame cikle išryškėja mišinio
fluorescencija. Daugiau amplikonų susintetinama, todėl prisijungia daugiau SYBR Green ir mišinys
smarkiau fluorescuoja. Realaus laiko PGR naudojami specialūs PGR aparatai, galintys matuoti
fluorescenciją ir pateikiantys rezultatus grafikuose, kuriuose vaizduojamas fluorescencijos kitimas
PGR metu (9.40 pav.).

9.40 pav. Realaus laiko PGR fluorescencijos kreivės

PGR metodas plačiai naudojamas klinikinės diagnostikos ir teismo medicinos srityse. Apie tai
skaitykite 10.1, 10.2 ir 10.6 sk.
9.15. DNR sekoskaita, genomų sekoskaitos strategijos

Iki šiol nagrinėjome, kaip įvairiais būdais įklonuoti, išgryninti ir padauginti DNR fragmentus. Šiame
skyrelyje išsiaiškinsime, kaip nustatoma individualaus DNR fragmento ir viso genomo DNR seka.
Tai yra svarbus ir būtinas etapas genų inžinerijos darbuose – įsitikinti ir patvirtinti, kad klonuotas
teisingas DNR fragmentas, ar mutacija gene yra sėkmingai įterpta. Nežinomo DNR fragmento
sekoskaita atskleidžia naujos informacijos: iš DNR sekos galima iššifruoti geno koduojamo baltymo
aminorūgščių seką, o atlikus lyginamąją analizę su duomenų bazėse sukauptomis sekomis galima
numatyti ir geno produkto funkciją.

Automatinė sekoskaita

1975 metais F. Sengeris dideoksinukleotidiniu metodu (žr. 3.4 sk.) nustatė pirmąjį organizmo genomą
– tai buvo bakteriofagas X174 (genomo ilgis – 5 kb). Praėjusio amžiaus pabaigoje prasidėjo genomų
sekoskaitos era. 1996 metais buvo nustatytas mielių, 1997 m. – E. coli, 1998 m. – nematodų, 1999
m. – drozofilos, 2001 m. – žmogaus, 2002 m. – pelės, 2004 m. – žiurkės ir šuns, 2006 m. – bitės,
2007 m. – karvės, arklio, 2009 m. – kiaulės, 2010 m. – neandertaliečio, uodo, utėlės (ir t. t.) genomai.
Šį progresą lėmė automatinės sekoskaitos technologijų atsiradimas.

Automatinė sekoskaita panaudojo tą patį F. Sengerio principą. Tačiau keletas patobulinimų sumažino
eksperimentų savikainą ir padidino našumą. Vietoj radioaktyvių nukleotidų imta naudoti
fluorescuojančiomis žymėmis pažymėtus nukleotidus (9.41 pav.). Elektroforezės metu DNR
fragmentuose įjungtų nukleotidų fluorescuojančios žymės sužadinamos lazeriu, detektoriumi
registruojama jų išspinduliuota fluorescencija. Elektroforezės nereikia stabdyti, kiekvienas DNR
fragmentas išmatuojamas gelio pabaigoje, todėl galima nustatyti ilgas DNR sekas (~ 1 kb). Jeigu
kiekvienas ddNTP pažymėtas skirtinga fluorescentine žyme, reakciją galima vykdyti viename
mėgintuvėlyje, o fragmentus frakcionuoti viename takelyje – didėja našumas.

Be to, didžiulius elektroforezės gelius pakeitė mažytės kapiliarinės elektroforezės sistemos.

Galiausiai, detektoriaus išmatuoti fluorescuojančių žymių signalai akimirksniu apdorojami
kompiuterinėmis programomis ir kompiuterio ekrane virsta DNR seka. Šiuolaikinės automatinės
sekoskaitos sistemos, vienu metu analizuojančios 96 sekoskaitos reakcijų mišinius, per dieną gali
nustatyti fragmentų sekas, kurias sujungę gautume nepertraukiamą ~ 6 Mb ilgio DNR seką.

9.41 pav. Automatinė sekoskaita

Genomų sekoskaitos strategijos

Automatinės sekoskaitos technologijų plėtra pradėjo genomų sekoskaitos erą. 2001 metų vasarį dvi
besivaržančios mokslininkų grupės, atstovaujančios Tarptautiniam žmogaus genomo sekoskaitos
susivienijimui ir privačiai kompanijai „Celera“, paskelbė, kad nustatė žmogaus genomo (~ 3 Gb)
seką. Šiame didžiuliame projekte dalyvavo daugiau nei 18 valstybių mokslininkai. Vieno reakcijos
mišinio sekoskaitos metu naudojant to meto pažangiausias automatinės sekoskaitos technologijas
buvo galima nustatyti tik 1 kb ilgio DNR seką. Tad kaip buvo nustatyta didžiulio genomo DNR seka?

Žmogaus genomo sekoskaita buvo atlikta hierarchiniu šūvio metodu (angl. hierarchical shotgun
sequencing): nustatomos daugybės persiklojančių DNR fragmentų sekos, kurios vėliau surikiuojamos
į ilgus fragmentus ir chromosomas. Analizuojant šiuo metodu, žmogaus chromosomų DNR buvo
hidrolizuota restrikcijos endonukleazėmis į didelius fragmentus (~ 150 kb) ir gauti fragmentai
klonuoti į didelės talpos klonavimo vektorius – bakterijų dirbtines chromosomas BAC (9.42 pav.).

Šios ilgų DNR fragmentų bibliotekos klonai (kiekvienas individualiai) dar kartą buvo hidrolizuoti į
trumpesnius (5 kb) persiklojančius DNR fragmentus ir klonuoti į plazmidinį klonavimo vektorių. Iš
visų šios trumpų fragmentų DNR bibliotekos klonų išgryninus rekombinantinę DNR (naudojant
automatinės sekoskaitos sistemas) buvo nustatyta DNR seka. Sekoskaitos reakcijai būtinas pradmuo
buvo parinktas pagal klonavimo vektoriaus DNR. Paskui sekoskaitos rezultatai (DNR fragmentų
sekos) analizuoti kompiuterinėmis programomis, kurios surado persiklojančias sritis ir išrikiavo DNR
fragmentus į vieną ilgą nenutrūkstančią 150 kb ilgio DNR grandinę, atitinkančią BAC klono seką.
Taip išanalizavus kiekvieno BAC klono DNR, gauta vienos tirtosios žmogaus chromosomos seka.
Visas genomas gautas analogiškai išanalizavus kitas chromosomas.
 9.42 pav. Hierarchinis šūvio sekoskaitos metodas

Prisiminkite įdomius faktus, gautus išanalizavus žmogaus genomo DNR seką (3.2 lentelė, 3.4 sk.).
Žmogaus genomo sekoskaitos projektai buvo pagrindinė varomoji jėga, paskatinusi didžiųjų genomų
sekoskaitos technologijų plėtrą. Nuo to laiko sekoskaitos technologijos pažengė tiek, kad genomo
sekoskaita tapo ne metų, o dienos įvykiu8 (9.43 pav.). 2008–2010 metais ambicingas atrodė 1000
genomų projektas9, kurio tikslas buvo nustatyti 1000 žmonių genomų seką. Šiuo metu pradėti ir
vykdomi nauji projektai („Personal Genome Project“, „Cancer Genome Atlas“), kurių tiklas yra
sukaupti kuo daugiau duomenų ir iš jų suprasti, kaip genomas veikia, kodėl individų nedideli
nukleotidų sekos skirtumai lemia tokius stiprius fenotipinius skirtumus, kaip keičiasi genų raiška
įvairių ligų metu, kokia yra genetinių mutacijų reikšmė. Šiuos darbus paskatino naujų sekoskaitos
technologijų, vadinamų antrosios kartos sekoskaita, atsiradimas.

8 www.genomesonline.org
9 www.1000genomes.org
 9.43 pav. Genomų sekoskaitos sparta

Antrosios kartos sekoskaitos technologijos lėmė didelę spartą ir sąnaudų mažėjimą. Palyginus su
senąja automatine sekoskaita, antrosios kartos sekoskaitoje pritaikyta kitokia darbų schema.

Hidrolizuotų chromosomų fragmentai nėra klonuojami, nebekuriamos DNR bibliotekos in vivo.

Vietoj to, hidrolizuotos DNR fragmentai padauginami vienos (!) polimerazinės grandininės reakcijos
metu skysčių emulsijose ar pritvirtinus juos ant įvairių paviršių. Antra, vietoj F. Sangerio
dideoksinukletodinio sekoskaitos metodo įdiegti nauji fermentinių reakcijų metodai – pirosekoskaita
su DNR polimeraze, sekoskaita panaudojant ligazę ir kt. Trečia, vienu metu vykdoma šimtai
tūkstančių sekoskaitos reakcijų. Pati sekoskaita dabar užtrunka trumpiau nei gautų duomenų
apdorojimas.

9.44 pav. yra pavaizduotas pirosekoskaitos principas. Šis DNR sekoskaitos metodas remiasi
pirofosfatų (PPi) nustatymu. Pirofosfatai išsiskiria DNR sintezės metu, kai DNR polimerazė prijungia
naują nukleotidą prie DNR grandinės (9.44 pav.). Pirofosfatai nustatomi naudojant keletą fermentų.
ATP sulfurilazė sunaudoja pirofosfatus ATP sintezei. Susidariusį ATP hidrolizuoja liuciferazė.
Liuciferazės fermentinės reakcijos metu išsiskiria matoma šviesa, kurią matuoja detektorius. Jeigu
nukleotidas prijungiamas prie DNR grandinės, generuojama šviesa. Sekoskaitos metu nukleotidai
pilami į reakcijos mišinį paeiliui, apirazė hidrolizuoja DNR sintezei nepanaudotus nukleotidus.
Išmatavus šviesos signalus rezultatai gaunami pirogramos kreivių pavidalu – jose šviesos smailė
atitinka pripilto į reakcijos mišinį nukleotido prijungimą. Šios sekoskaitos metu nustatoma neilgo
DNR fragmento (200–300 nt) seka. Kadangi tuo pačiu metu mažuose pl (10-12 litro) talpos
šulinėliuose galima vykdyti ~ 400 000 reakcijų, per trumpą laiką gaunamas didžiulis sekoskaitos
duomenų kiekis (500 x 106 bazių/4 val).
 9.44 pav. Pirosekoskaitos principas

Ateities (ko gero, jau netolimos) trečiosios kartos DNR sekoskaitos technologijos dar kitokios. Jos
kuriamos vienos DNR molekulės sekai nustatyti. Iki šiol sekoskaitai buvo naudojamas to paties DNR
fragmento kopijų mišinys: automatinėje sekoskaitoje fragmentas padaugintas įklonavus į plazmides,
antrosios kartos sekoskaitoje fragmentas padaugintas PGR metodu. Ateities sekoskaitos metodams
kurti pasitelkiamos ypač jautrios detekcijos sistemos, gebančios išmatuoti vienos molekulės
fermentinės sekoskaitos reakcijos signalus: nedidelę fluorescenciją ar H+ išsiskyrimą. „Pacific
Biosciences“ kompanijos SMRT sekoskaitai (angl. Single Molecule Real-Time Sequencing)
naudojama mažos (zl, 10-21 litro) talpos šulinėliuose pritvirtinta DNR polimerazė ir nukleotidai,
pažymėti skirtingomis fluorescuojančiomis žymėmis (9.45 pav.). Per DNR sintezę, kai
komplementarus nukleotidas atsiduria DNR polimerazės aktyviame centre, jautri optinė sistema
išmatuoja fluorescenciją. Įjungus nukleotidą fluorescencinė žymė kartu su fosfatais yra nuskeliama
ir difunduoja šalin (9.45 pav.). Manoma, kad trečiosios kartos sekoskaitos technologijos atvers duris
į naują genomų tyrimų erą – genomiką moksliniams tyrimams, personalinei medicinai ir diagnostikai.
 9.45 pav. Trečiosios kartos SMRT sekoskaitos technologija

9.16. Baltymų raiška ir gryninimas kaip valdomo biotechnologinio proceso pavyzdys

Baltymai skiriasi aminorūgščių seka polipeptidinėje grandinėje, savo dydžiu, forma, erdvine
struktūra, izoelektriniu tašku, jonizacija ir kitomis savybėmis. Dėl šių skirtingų savybių juos galima
atskirti nuo kitų ląstelės komponentų, o jų mišinį suskirstyti į atskirus komponentus. Bakterijos
Escherichia coli ląstelėse būna daugiau nei 4000 skirtingų baltymų, jie sudaro apie 55  sauso šių
ląstelių svorio. Tačiau pasitelkus tinkamą gryninimo strategiją, iš šio mišinio galima išgauti vieno
norimo baltymo tirpalą. Juo gali būti ir mūsų norimas, ląstelei svetimas rekombinantinis baltymas.
Šio baltymo genas genų inžinerijos būdais butų įkeltas į tinkamą vektorių, vektorius įvestas į ląstelę
ir galiausiai ląstelės baltymų sintezės sistemos susintetintas taip pat, kaip sintetinami savi baltymai.
Genų klonavimo metodai ir vektorių įvedimas į ląsteles buvo aptarti anksčiau (9.1–9.5 sk.).

Kodėl reikia rekombinantinių DNR ir kodėl norime sintetinti, pavyzdžiui, archėjos baltymą bakterijos
E.coli ląstelėse? Tarkime, norime ištirti kokį nors archėjos, gyvenančios vandenyno dugne prie karštų
versmių, fermentą. Tegul tai bus RNR metiltransferazė, kurią vėliau planuojame panaudoti RNR sekų
norimose vietose metilinimui. Tiek tyrimams, tiek ir tolesniam panaudojimui mums reikės daug
gryno baltymo – metiltransferazės. Galėtume ją gryninti iš archėjos biomasės, bet tada, kaskart
pasibaigus turimam baltymo preparatui, reikėtų nerti į vandenyno gelmes „žvejoti“ archėjų. Galėtume
laboratorijoje sudaryti sąlygas, tinkamas mūsų archėjoms augti:100°C, 200 atmosferų slėgis ir
saugoti, kad į terpę nepatektų deguonies, nes jos yra griežtieji anaerobai. Sudėtinga. Tačiau galime
klonuoti iš archėjos genomo tik mums rūpimo baltymo geną, įkelti jį į E.coli vektorių, šį – į E.coli
ląsteles.Mūsų norimas baltymas sintetinamas E. coli auginant paprastose laboratorijos sąlygose
(37°C, be jokio papildomo slėgio).

Norime, kad tikslinio baltymo ląstelės susintetintų kuo daugiau – tada užteks tik vieną kartą
išsigryninti baltymą. Su gautu dideliu jo kiekiu galėsime atlikti daug eksperimentų. Kadangi baltymo
norime daug, prieš jį dedame „stiprų“ promotorių – tokį, prie kurio transkripcijos veiksniai jungiasi
stipriai ir lemia gausią transkripciją.Tačiau gausi tikslinio geno transkripcija ir transliacija sunaudoja
labai daug ląstelės resursų ir ji nebegali pakankamai jų skirti savo reikmėms – nebegali augti ir
dalintis. O mums juk reikia kuo daugiau ląstelių su kuo daugiau tikslinio baltymo. Todėl stiprūs
promotoriai dažniausiai yra indukuojami – įjungiami tik norimu momentu.

Taigi, pirmiausia, puikiose augti sąlygose priauginame daug rekombinantinių ląstelių biomasės.
Ląstelėms dauginantis, dauginasi ir įvesta rekombinantinė DNR. Kad daugintųsi ląstelės tik su
rekombinantine DNR, užtikrinama į terpę pridedant antibiotiko. Vektoriuje yra atitinkamas
atsparumo genas šiam antibiotikui, todėl tokios ląstelės jam atsparios. Rekombinantinės DNR
neturinčios (ar ją praradusios) ląstelės žūva. Todėl dauginasi tik rekombinantinę DNR turinčios
ląstelės. Tyrėjas iš šios biomasės gali gauti didelį kiekį rekombinantinės DNR arba jos baltyminį
produktą. Jei norime gauti savo tikslinį baltymą,pridedame reagento, kuris įjungia (indukuoja)
tikslinio geno raišką (žr. 8.4 sk.). Tam tikrą laiką ląsteles dar inkubuojame, jos gamina tikslinį
baltymą. Galiausiai ląsteles ardome ir iš ląstelių lizato gryniname savo baltymą (9.46 pav.). Tai –
paprasčiausias rekombinantinio baltymo raiškos pavyzdys. Baltymus sintetinti galima įvairiose kitose
laboratorinėse kultūrose: mielėse, žinduolių, vabzdžių ląstelėse, augaluose. Organizmas
pasirenkamas priklausomai nuo to, kokio baltymo mums reikia, kokie jo gene kodonai (bakterijos ir
eukariotai turi skirtingą įvairių kodonų naudojimo dažnį, nuo ko priklauso ir baltymo sintezės greitis).
Gali reikėti, kad baltymas būtų ne tik susintetintas, bet dar ir papildomai modifikuotas (glikozilintas
ir pan.). Dar galima genų inžinerijos būdais pridėti baltymui papildomų aminorūgščių, dėl kurių
sąveikos su specifiniais sorbentais palengvėtų gryninimo procesas (aprašyta žemiau). Galima pridėti
ir sekų, sąlygojančių baltymo išskyrimą į terpę – tada nereikės ardyti ląstelių, baltymą galima bus
gryninti tiesiai iš terpės. Kartais reikia, kad baltymo sintezė būtų lėtesnė ar ne tokia gausi. To reikia,
kad jis galėtų teisingai susisukti. Tada naudojami nestiprūs promotoriai, silpna indukcija, žemesnė
ląstelių auginimo temperatūra.

9.46 pav.Rekombinantinio baltymo raiška ir gryninimas

Žinoma, norimą baltymą galima gryninti ir iš natūraliai jį gaminančio organizmo. Baltymo kiekis,
kurį gamina ląstelė, priklauso nuo audinio tipo, organizmo išsivystymo stadijos ir ląstelės metabolinės
bei fiziologinės būsenos.

Baltymų gryninimas – tai daugiapakopis procesas, kurį gali sudaryti nuo keleto iki keliolikos stadijų:
  Biomasės auginimas;
 Biomasės (ląstelių) ardymas;
 Beląstelinio ekstrakto atskyrimas;
 Baltymų mišinio frakcionavimas (organiniais tirpikliais, druskomis ar ultrafiltravimu);
 Chromatografija (viena ar kelios stadijos) (9.47 pav.).

Baltymų gryninimo tikslas – gauti homogeninį preparatą, sudarytą tik iš vieno (mūsų norimo)
baltymo.

9.47 pav. Baltymų gryninimo principinė schema

Turint biomasę, iš kurios bus gryninamas baltymas, pirmiausia reikia suardyti ląsteles. Ardymo būdo
parinkimas priklauso nuo ląstelių prigimties ir tikslinio baltymo stabilumo, savybių (9.2 lentelė).
Biomasė gali būti suardoma mechaniškai – trinant ją stiklo rutuliukais, malant, spaudžiant dideliu
slėgiu per mažas ertmes (vadinamasis French presas). Nedideliam kiekiui biomasės suardyti
naudojamas ultragarsinis zondas (jis vibruoja aukštu dažniu). Mokslinėse laboratorijose
rekombinantinės E.coli ląstelės dažniausiai ardomos būtent šiuo būdu. Cheminiai ląstelių ardymo
būdai, palyginus su fiziniais, švelniau veikia ląsteles, veikiami tirpalai neįkaista. Ardant cheminiu
būdu dažniausiai ištirpdomi membranų lipidai. „Švelniausi“ yra fermentiniai ląstelių ardymo būdai.
Jie pagrįsti specifiniu hidrolizinių fermentų poveikiu ląstelių sienelėms, peptidoglikanui ar kitiems
ląstelę supantiems polimerams. Kadangi įvairių organizmų ląstelių sienelių sandara yra skirtinga, jos
ardomos skirtingais fermentais arba jų mišiniais. Lizocimu skaidomas bakterijų peptidoglikanas,
chitinazėmis – chitinas, gliukanazėmis – mielių gliukanai, celiulazėmis – augalų celiuliozė,
pektinazėmis – augalų pektinas.

Prieš ardymą ląstelės ar susmulkinti audiniai suspenduojami tirpaluose, į kurių sudėtį įeina
buferinėmis savybėmis pasižymintys junginiai. Atsižvelgus į gryninamo baltymo savybes, yra
palaikomas atitinkamas terpės pH. Taip pat į sudėtį įeina įvairių druskų (NaCl, KCl ir kt.) joninei
tirpalo jėgai palaikyti. Kad tikslinio baltymo neardytų viduląsteliniai fermentai, yra dedama
proteinazių slopiklių. Jei tikslinį baltymą ląstelės sekretuoja į terpę, ląstelių ardyti nereikia, tereikia
terpę atskirti nuo ląstelių. Tai paprasta padaryti centrifuguojant: ląstelės nusėda ant mėgintuvėlio
dugno, lieka terpė su tiksliniu baltymu. Žinoma, terpėje dar yra ir kitų baltymų bei medžiagų, todėl
iš terpės tikslinį baltymą irgi reikės gryninti.

Tam, kad baltymai nedenatūruotų, gryninimo stadijų metu temperatūra turėtų būti ne aukštesnė nei
4ºC. Ši taisyklė taikoma mezofilinių organizmų baltymams. Termofilinių organizmų (t.y. tokių, kurių
optimali augimo temperatūra yra 80ºC ir daugiau) baltymus galima gryninti kambario temperatūroje.
 9.2 lentelė. Ląstelių ardymo būdai

Suardžius ląsteles gaunamas mišinys, kurį sudaro baltymai, nukleorūgštys, polisacharidai, netirpūs
ląstelių fragmentai. Filtruojant arba centrifuguojant iš mišinio yra pašalinamos visos netirpios dalelės.
Gaunamas beląstelinis ekstraktas, kurį toliau galima frakcionuoti. Yra daug skirtingų beląstelinio
ekstrakto frakcionavimo būdų, o jų pasirinkimas priklauso nuo norimo išgryninti baltymo savybių.
Pasirenkama pagal tai, kurie metodai labiausiai tinka ir įgalina greičiausiai tikslinį baltymą atskirti
nuo kitų (9.3 lentelė).

9.3 lentelė. Baltymų frakcionavimo metodų parinkimas pagal baltymų savybes

Išsodinimo metodas

Vienas pirmųjų baltymų frakcionavimo metodų ilgą laiką buvo baltymų išsodinimas į nuosėdas
keičiant tirpiklio savybes. Dalis dabartinių frakcionavimo metodų yra pagrįsti nuosėdų susidarymu
nepažeidžiant baltymų struktūros (frakcionavimas druskomis, polimerais). Naudojant kitus
frakcionavimo metodus (frakcionavimas tirpikliais, pH frakcionavimas, termodenatūravimas)
susidaro baltymų nuosėdos, pažeidžiama baltymo natyvi struktūra. Tačiau kai kuriuos baltymus
galima vėliau renatūruoti. Baltymų išsodinimas pagrįstas jų tirpumu vandeniniuose tirpaluose.
Didinant tirpalo joninę jėgą, daugelio biopolimerų tirpumas didėja. Tačiau tik iki tam tikros kritinės
koncentracijos, kurią pasiekus, jie pradeda agreguotis ir iškrenta nuosėdomis. Išsodinimui dažnai
naudojamas amonio sulfatas. Pirmiausia druskos anijonai baltymo molekulę paverčia mažiau tirpia
dėl sąveikos su teigiamai įkrautomis aminorūgščių liekanomis. Tip pat baltymo molekulės
dehidratuojamos ir dėl hidrofobinės sąveikos sulimpa bei iškrenta į nuosėdas. Pagrindiniai šio
frakcionavimo būdo trukūmai –sunaudojamas didelis tirpalų kiekis, organiniai tirpikliai gali suardyti
gryninamo baltymo struktūrą.
Po išsodinimo amonio sulfatu ir ištirpinimo pasirinktame buferyje iš tirpalų turi būti pašalinta druska.
Vienas iš būdų tai padaryti – dializuoti tirpalą buferiu, kuriame druskų koncentracija maža (9.48
pav.). Dėl koncentracijos gradiento į buferį pereis dalis druskų (kol koncentracijos tirpale ir buferyje
susilygins). Kelis kartus pakeitus buferį, iš tirpalo pašalinsime beveik visas druskas.

9.48 pav. Dializės schema

Ultrafiltravimo metodas

Tai labai efektyvus ir dažnai taikomas baltymų frakcionavimo metodas naudojant pusiau pralaidžias
membranas iš celiuliozės, polisulfono ir kt. (9.49 pav.)

9.49 pav. Ultrafiltravimoschema

Svarbi tokių membranų savybė – mažas giminingumas baltymams. Baltymai neturi adsorbuotis prie
membranos paviršiaus. Šis metodas naudojamas tirpalų koncentravimui, baltymų atskyrimui pagal jų
molekulių dydį ir diafiltravimui – baltymų tirpalo mažo molekulinio svorio komponentų pakeitimui.
Chromatografijos metodas

Chromatografija – vienas analizės metodų, labai plačiai naudojamų šiuolaikinėje chemijoje ir

biochemijoje. Chromatografijos būdu įvairių medžiagų mišinį galima išskirstyti į atskiras
sudedamąsias dalis. Norint detaliau pažinti šį baltymų frakcionavimo metodą, būtų pravartu iš pradžių
susipažinti su pagrindiniais terminais (9.4 lentelė).

Analitė – tai medžiaga, kuri turi būti išskirta (išgryninta) iš mišinio chromatografijos metodu;
Analizinė chromatografija – metodas, naudojamas įvertinti medžiagos grynumui, jos fizinėms,
cheminėms ar biologinėms savybėms, nustatyti medžiagos koncentracijai;
Chromatograma – vizualus chromatografijos duomenų pateikimas;
Chromatografas – prietaisas (prietaisų kompleksas) chromatografijai;
Eliuentas – buferis ar tirpiklių mišinys, naudojamas analitėms išplauti iš kolonėlės;
Eliuatas – eliuentas, ištekantis iš kolonėlės ir turintis savyje ištirpusią analitę (medžiagą);
Judrioji fazė – eliuentas-tirpiklis, tirpiklių mišinys ar buferis, kuris juda per stacionariąją fazę;
Stacionarioji (nejudrioji) fazė – sorbentas ar nešiklis;
Ligandas – prie užpildo prijungtas (imobilizuotas) junginys, savitai sąveikaujantis su išskiriama
makromolekule ar kita medžiaga;
Preparatyvinė chromatografija – metodas, naudojamas išgryninti ir išskirti santykinai dideliam
analitės kiekiui.

9.4 lentelė Pagrindiniai chromatografijos terminai

Chromatografija– tai analizinės chemijos metodas, pritaikytas junginių išskyrimui iš mišinių, jų

gryninimui bei analizei (9.50 pav.). Baltymai dažnai frakcionuojami keliomis stadijomis. Kiekvieno
baltymo gryninimui parenkamas tinkamas chromatografijos metodas (ar keli, taikomi paeiliui).

Išskyrimas

• Analizuoti
• Identifikuoti

Mišinys Komponentai, sudedamosios dalys

• Išgryninti
• Nustatyti
kiekį

9.50 pav.Chromatografijos metodo apibendrintoji schema

Pirmasis chromatografinį medžiagų atskyrimo būdą 1903 m. savo tyrimuose pritaikė rusų kilmės,
(dirbęs Varšuvoje, o savo darbus publikavęs Vokietijoje) mokslininkas M. Cvetas. Norėdamas
išsiaiškinti chlorofilo sudėtį, jis šios medžiagos tirpalą praleido per stiklinį vamzdelį, užpildytą
kreidos milteliais ir gavo skirtingomis spalvomis nuspalvintus kreidos sluoksnius. Būtent iš šio
bandymo kilo metodo pavadinimas – chromatografija (gr. chromos – spalva, grafo – rašau).
Šiuolaikinė chromatografija nebūtinai susijusi su spalvomis, bet pavadinimas išliko. Skaičiuojama,
kad apie 60% visų laboratorijose atliekamų analizių yra atliekamos naudojant chromatografiją.

Dabar chromatografijos technika yra labai ištobulinta. Naudojamos automatizuotos sistemos,

padedančios išgryninti ne tik tam tikros cheminės struktūros junginius, atskirti enantiomerus (optinius
izomerus), bet ir analizuoti biologiškai aktyvias, labilias medžiagas: fermentus, nukleorūgštis,
antikūnus ir kt.

Chromatografija paremta tuo, kad įvairios skystos ir dujinės medžiagos skirtingai adsorbuojasi
(prilimpa, sąveikauja) ant kietų paviršių – sorbentų. Leidžiant medžiagų mišinį pro chromatografinę
kolonėlę – vamzdelį, užpildytą silikageliu ar kitais milteliais (sorbentais), – pirmiausia iš jo išeina
mažiausiai adsorbuojama medžiaga, o vėliausiai ta, kuri stipriausiai sąveikauja su sorbentu.

Šiuo metu žinoma labai daug chromatografijos rūšių: popieriaus, plonasluoksnė, skysčių, dujų,
afininė, aukšto slėgio, gelchromatografija ir kt. Trumpai kai kurias jų aptarsime.

1. Adsorbcinė (hidrofobinė) chromatografija – tai hidrofobinės sąveikos chromatografija,

kuri pagrįsta adsorbcijos principu. Netirpios medžiagos (nešikliai-adsorbentai) ant savo
paviršiaus geba sulakyti ištirpusias molekules (9.51pav). Tai – adsorbcijos procesas, pagrįstas
silpnais tarpmolekuliniais ryšiais.

9.51 pav. Absorbcinės chromatografijos pavyzdys.

Yra žinoma, kad 40–50 % išorinio baltymo paviršiaus yra nepolinis (hidrofobinis). Būtent ši baltymo
dalis ir sąveikauja su hidrofobiniais serbentais, todėl baltymų mišinius galima frakcionuoti
pasinaudojus biomolekulių hidrofobiškumo skirtumais. Sorbento hidrofobiškumas priklauso nuo
funkcinių grupių alifatinės grandinės ilgio (ar benzeno žiedo skaičiaus) ir funkcinių grupių kiekio ant
matricos.

2. Jonų mainų chromatografija –tai atskyrimo būdas, kuris remiasi baltymų atskyrimu pagal
krūvį, jonų pusiausvyra tarp joninio sorbento ir judriosios fazės (9.52 pav.).
 9.52 pav. Jonų mainų chromatografijos schema
Jonų mainų chromatografija yra vienas dažniausiai naudojamų chromatografijos būdų. Šiuo metodu
atskiriami ir gryninami baltymai, kitos biomolekulės. Dėl elektrostatinės sąveikos baltymai grįžtamai
sąveikauja su priešingo krūvio funkcinėmis grupėmis, kovalentiniais ryšiais prijungtomis prie
matricos. Matricomis būna įvairūs vandenyje netirpūs gamtiniai polisacharidai – celiuliozė,
dekstranas, agarozė ir sintetiniai polimerai – hidrofiliniai vinilpolimerai ir kt.

Chromatografinis gryninimas skirstomas į tris stadijas – jonitu užpildytos kolonėlės paruošimą,

baltymų sorbciją ir desorbciją. Baltymų atskyrimas vyksta sorbcijos ir desorbcijos metu. Geras
baltymų atskyrimas priklauso nuo pasirinktų sorbcijos sąlygų: jos turi būti tokios, kad tikslinis
baltymas adsorbuotųsi gerai, o kiti – nesąveikautų su matrica ar adsorbuotųsi tik silpnai. Nesorbuoti
baltymai pašalinami plaunant kolonėlę buferiniu tirpalu, naudotu kolonėlei paruošti. Desorbcijai
parenkamas kitas tirpalas – toks, kuris išardo prikibusių baltymų ir sorbento sąveiką. Dažnai
naudojamas gradientinis plovimas – per kolonėlę leidžiamo tirpalo joninė jėga ar pH keičiami
palaipsniui. Desorbcijos procesas priklauso nuo sorbcijos stiprumo – pirmiausia išplaunami
silpniausiai prie sorbento prikibę baltymai, vėliausiai – stipriausiai.
3. Giminingumo (afininė) chromatografija pagrįsta sąveika tarp ant stacionariosios fazės
imobilizuoto (įtvirtinto) specifinio ligando ir skystoje (judriojoje) fazėje esančio tikslinio
baltymo (9.53 pav.).
 9.53 pav. Giminingumo (afininės) chromatografijos schema
Afininė chromatografija skirstoma į:

 Bioafininę chromatografiją (naudojama sąveika tarp antikūnų ir antigenų);

 Grupinio specifiškumo chromatografiją (ligandas sorbuoja kelis junginius tiksliniame tirpale);

 Biomimikrinę chromatografiją (naudojami ligandai, kurie pagal savo struktūrą ir sąveikos

centrus yra artimi gamtiniams ligandams);
 Metalų chelatinę chromatografiją (sąveika tarp baltymų ir sorbentų vyksta susidarant
koordinaciniams ryšiams tarp sorbento su imobilizuotais metalų jonais ir baltymo, turinčio
kelių paeiliui išsidėsčiusių histidinų fragmentą – histidinų „inkarą“).

Šis frakcionavimo būdas yra labai atrankus, gaunami pakankamai gryni baltymai, o jų išeiga
dažniausiai būna labai didelė. Šis būdas idealiai tinka tada, kai sorbetas yra sujungtas su ligandu, kurį
gali specifiškai atpažinti tik gryninamas baltymas, o visos kitos biomolekulės su juo nesąveikauja.

4. Gelchromatografija– molekulės atskiriamos pagal dydį ar formą sieto principu, leidžiant

joms tekėti pro porėtus nešiklius (9.54 pav.).
 9.54 pav. Gelchromatografijos schema

Gelchromatografija yra naudojama, kai reikia tiriamąjį mišinį suskirstyti į dvi grupes: mažos
molekulinės masės ir didelės molekulinės masės molekules. Tai reikalinga, kai norima pašalinti
mažos arba labai didelės molekulinės masės priemaišas. Šis metodas taip pat naudojamas, kai reikia
suskirstyti baltymus pagal molekulinę masę, nustatyti tiriamojo baltymo apytikslę molekulinę masę.
Taip pat metodas naudojamas, jei reikia nustatyti, ar baltymas tirpale būna kaip monomeras, dimeras,
specifinis oligomeras.

9.17 Baltymų funkcijų tyrimo metodai

Baltymai organizme atlieka daugybę skirtingų funkcijų: katalizės, pernašos, struktūrinių ir kt. Galima
baltymus tirti po vieną – charakterizuoti tam tikro baltymo veikimo pobūdį ir katalizės mechanizmą.
Galima stebėti ir visus ląstelės baltymus – kaip jų kiekis, santykis skiriasi vystantis organizmui ar
atsiradus patologijai.

Kiekvienas ląstelės baltymas turi savo geną. Geno ir jo koduojamo baltymo galutinė funkcija
sutampa. Jie skirti tam, kad ląstelėje būtų atliekamas tam tikras darbas: katalizuojama reakcija,
atliekama struktūrinė funkcija ar panašiai. Genų (o kartu ir jų koduojamų pavienių baltymų) funkcijų
tyrimo metodai buvo išsamiai aprašyti 8.5 skyriuje.
Viso baltymų rinkinio tyrimai vadinami proteomika. Tai – tyrimų sritis, siekianti identifikuoti ir
charakterizuoti visus baltymus, produkuojamus ląstelėje, audinyje ar organizme. Tam reikalingos
didelio našumo technologijos. Visas ląstelės, audinio ar organizmo baltymų rinkinys vadinamas
proteomu. Organizmas turi vieną genomą, tačiau daug proteomų. Proteomas yra labai dinamiškas. Jis
kinta priklausomai nuo organizmo vystymosi, aplinkos poveikio ir ligų. Kiekvienas kūno audinys turi
savo proteomą. Proteomika tiria, koks baltymų rinkinys būdingas kokioms ląstelėms. Ji nagrinėja,
kaip šis rinkinys keičiasi kintant ląstelių būsenai: kokių baltymų kiekis didėja, kurių mažėja, kaip tie
baltymai tarpusavyje sąveikauja, kaip jie modifikuoti (fosforilinti, glikozilinti ir pan.).

Proteomo tyrimai įgalina identifikuoti baltymus, jų raiškos lygio pakitimus kontrolinėse ir ligos
pažeistose ląstelėse ar audiniuose. Tai suteikia mokslininkams galimybę atrasti naujų baltymų
žymenų diagnostikos tikslams ir naujų molekulinių taikinių vaistų kūrimui.

Du labai svarbūs metodai proteomikoje – baltymų elektroforezė ir masių spektrometrija. Taip pat
proteomikos tyrimuose (atrinktiems baltymams charakterizuoti) naudojami ir visi anksčiau paminėti
metodai.

Elektroforezė – krūvį turinčių (įkrautų) molekulių judėjimas elektriniame lauke (9.55 pav.).
Elektroforetinis įkrautų molekulių judrumas priklauso nuo molekulės krūvio, masės ir formos.

B)

A)

9.55 pav. Baltymų elektroforezės schema. (A) Mėginiai paruošiami, užnešami į elektroforezės gelį,
vykdoma elektroforezė. (B) Rezultatų pavyzdys: 1 takelis – po elektroforezės gelyje pasiskirstę
įvairios molekulinės masės baltymai, buvę viename mišinyje; 2 takelis – tiriamasis baltymas.
 Lygindami baltymų vietą pirmame ir antrame takeliuose, apytiksliai galime sužinoti tiriamojo
baltymo molekulinę masę.

Kiekvienas baltymas esant tam tikram pH krūvio neturi. Todėl, esant tokiam pH, baltymas
nemigruoja elektriniame lauke. Ši pH reikšmė vadinama baltymo izoelektriniu tašku, ji žymima pI.
Tam, kad elekroforezės metu visi baltymai įgautų neigiamą krūvį ir judėtų tik į vieną pusę, prieš
elektroforezę jie pakaitinami su detergentu natrio dodecilsulfatu (NDS). Tokio mėginių paruošimo
metu baltymai išsivynioja ir „aplimpa“ NDS molekulėmis. Kad NDS poveikis išliktų, jo yra ir
elektroforezės tirpale.

Vienas dažniausiai elektroforezei naudojamų gelių yra poliakrilamido gelis.Jis gaunamas maišant ir
polimerizuojant akrilamidą su N,N′-metil-bisakrilamidu ir polimerizaciją sukeliančiu cheminiu
katalizatoriumi. Gelio klampumas, elastingumas, tvirtumas ir porų dydis priklauso nuo
poliakrilamido kiekio tirpale ir nuo jo susiuvimo laipsnio – nuo pridėto N,N′-metil-bisakrilamido
kiekio. Poliakrilamido gelis yra stabilus ir inertiškas. Jis neabsorbuoja baltymų (nesąveikauja stipriai
su jais), yra atsparus pH ir temperatūros pokyčiams, netirpsta daugelyje tirpiklių. Atlikus
elektroforezę, baltymai gelyje yra nudažomi Kumasi mėlio dažu ar sidabro druskomis (9.56 pav.).

9.56 pav.Po elektroforezės gelis su baltymais nudažytas Kumasi mėlio dažu

Elektroforezė yra labai paprastas, greitas ir jautrus metodas baltymų savybių tyrimui. Šiuo būdu
galima nustatyti apytikslę baltymo molekulinę masę, kiekį preparate, preparato grynumą, kitų
baltymų priemaišas. Elektroforezės būdu galima frakcionuoti ir palyginti baltymų mišinius. Galima
juos tirti esant skirtingoms ląstelių fiziologinėms būsenoms, galima tirti baltymų grynumą skirtingų
gryninimo stadijų metu, nustatyti baltymų fizikines savybes – izolelektrinį tašką, dydį, krūvį ar
subdalelinę sudėtį. Elektroforezė dažniausiai naudojama kaip analitinis metodas, rečiau kaip
preparatyvinis metodas.

Proteomikoje svarbi baltymų elektroforezės atmaina – dvikryptė elektroforezė. Kai tiriame šimtų ar
tūkstančių baltymų mišinį, kai kurių baltymų elektroforetinis judrumas gali sutapti arba būti labai
panašus. Todėl šie baltymai po paprastos elektroforezės bus vienoje juostelėje, jų negalėsime atskirti.
Dvikryptės elektroforezės metu baltymai gelyje išskirstomi pagal du požymius – mažesnė tikimybė,
kad du ar daugiau baltymų pagal abu požymius sutaps. Baltymai pirmiausia išskirstomi gelyje pagal
vieną požymį (pavyzdžiui, pI). Gelyje sudaromas pH gradientas ir baltymai nustoja judėti ties
kiekvieno jų pI atitinkančiu pH. Tai vadinama izoelektriniu fokusavimu. Po to gelis pasukamas 90°
kampu ir baltymai vėl išskirstomi – šįkart, pavyzdžiui, pagal molekulinę masę. Gaunamas savotiškas
baltymų „žemėlapis“ (9.57 pav.). Lyginant tokius rezultatus iš kontrolinio ir tiriamojo mėginio,
galima pamatyti, kurių baltymų kur daugiau, o kur mažiau. Kadangi reikia palyginti daugybę taškelių,
tam yra sukurtos specialios kompiuterinės programos. Jos virtualiai nuspalvina skirtingų mėginių
gelius skirtingomis spalvomis ir uždeda vieną ant kito. Taip išryškėja dėmelių rašto skirtumai (9.57B
pav.).

Nustačius, kurių baltymų kiekis kinta (pavyzdžiui, tiriamos ligos atveju), tuos baltymus galima
išpjauti, išgryninti iš gelio ir identifikuoti – nustatyti jų aminorūgščių seką, funkciją. Galiausiai –
galbūt net pasiūlyti, kaip galima būtų gydyti atitinkamą ligą. Pavyzdžiui, nustačius, kad ligą sukelia
per didelė tam tikro baltymo raiška, galima ieškoti tam baltymui atrankių slopiklių.

A) B)

9.57 pav. Dvikryptė baltymų elektroforezė. (A) Dviejų mėginių rezultatai. Pažymėtas baltymas,
kurio raiška skiriasi mėginiuose. Jis bus išpjautas ir išgrynintas iš gelio, bei identifikuotas masių
spektrometrijos metodu. (B) Virtualiai sutapatinti dviejų mėginių rezultatai. Vienas mėginys
nuspalvintas oranžine spalva, kitas – mėlyna. Sutampančios dėmelės – juodos.

Baltymų masių spektrometrijos metodu galima nustatyti tikslią baltymo molekulinę masę.
Sudėtingesnis metodo variantas – peptidų masių pirštų antspaudų (angl. Peptide mass fingerprinting)
metodas leidžia nustatyti tikslią baltymo seką. Žinant baltymo seką, tolesniems tyrimams galima
naudoti visus pavieniams baltymams tirti skirtus metodus.

9.18. Imunofermentiniai tyrimo metodai ir jų taikymas medicinos diagnostikoje bei

moksliniuose tyrimuose

Imunofermentiniai tyrimo metodai remiasi antikūno–antigeno specifine sąveika.

Svarbios sąvokos:

Antikūnai – baltymai, kuriuos gamina organizmas ir kurie atpažįsta bei neutralizuoja svetimos
kilmės biomolekules;
 Antigenas –molekulė, kurią atpažįsta antikūnai ir kuri sukelia imuninį atsaką;
Afiniškumas– sąveikos stiprumas tarp antigeno ir antikūno;
Epitopas (arba antigeninis determinantas) –antigeno dalis, kurią atpažįsta antikūnai.

Antikūnai, jų sandara ir sąveikos su antigenu atrankumas

Visi antikūnai yra baltymai, vadinami imunoglobulinais.Antikūnai atpažįsta svetimas biomolekules

(antigenus) ir su jais sudaro imuninius kompleksus. Komplekso susidarymas vyksta dėl vandenilinių,
joninių ryšių, hidrofobinės ir Van der Valso sąveikų. Sąveika yra atranki – tam tikras antikūnas
atpažįsta tik tam tikrą antigeną.

Imunoglobulino molekulės (9.58 pav.) – tai glikoproteinai, sudaryti iš vieno ar daugiau subvienetų.
Kiekvienas subvienetas turi keturias polipeptidines grandines: dvi sunkiąsias (H) ir dvi lengvąsias
(L). Sunkiosios ir lengvosios grandinės yra sujungtos tarpusavyje nekovalentiniais ryšiais bei
kovalentiniais disulfidiniais tilteliais. Sudaromas L2H2 simetriškas tetrameras. Jo forma panaši į Y
raidę. H ir L grandinės turi kintančias (variabilias) sritis – kiekvienas antikūnas šioje polipeptidinės
grandinės vietoje turi kitokias aminorūgščių sekas. Variabiliosios sritys išsidėsto Y „viršūnėlėse“ ir
suformuoja dvi antigeną surišančias vietas. Kadangi kiekvieno antikūno sekos čia skirtingos,
kiekvienas antikūnas gali atpažinti kitokį antigeną.

9.58 pav. Imunoglobulino molekulės struktūra

Antikūnai gali atrankiai sąveikauti su daugeliu skirtingų antigenų: su makromolekulėmis, mažais

cheminiais junginiais ir kt. Antikūno ir antigeno sąveika yra grįžtama. Antigeno dalis, kurią atpažįsta
antikūnai, vadinama epitopu arba antigeniniu determinantu. Skirtingi determinantai gali būti
atpažįstami pagal seką (linijiniai) arba molekulės formą (konformaciniai). Antigeno–antikūno
afiniškumas dažnai yra išreiškiamas kaip disociacijos konstanta (KD). Dauguma antikūnų,
susidariusių pirminio imuninio atsako metu, turi KD, varijuojančią nuo 10-6 iki 10-9 M. Po pakartotinės
imunizacijos tuo pačiu antigenu (antrinio imuninio atsako metu) sąveika sustiprėja – KD tampa nuo
10-8 iki 10-11 M. Afiniškumo sustiprėjimas yra vadinamas afiniškumo brendimu – atrenkamos
stipriausiai su antigenu sąveikaujančios antikūnų sekos. Kiekvienas antikūnas, priklausomai nuo
klasės, gali prijungti nuo 2 iki 10 epitopų, jei identiški epitopai yra arti vienas kito (pvz. ląstelės
paviršiuje).

Imunofermentinė analizė (IFA)

IFA (angl. ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) yra vienas jautriausių metodų antigenams
ar antikūnams aptikti.

Ant mikroplokštelės šulinėlių paviršiaus imobilizuojamas antigenas ir tiriamame serume ieškoma

antikūnų prieš šį antigeną. Galima daryti ir atvirkščiai – tada ant plokštelės šulinėlių paviršiaus
imobilizuojami antikūnai, o analizės metu ieškoma specifinių antigenų. Užpylus mėginio, ant
šulinėlių paviršiaus susidaro antikūno–antigeno kompleksas. Prie antikūno–antigeno komplekso yra
prijungiamas antrinis antikūnas. Jis atpažįsta pirmąjį antikūną, arba tą patį antigeną. Tačiau šis
antikūnas turi chemiškai arba genų inžinerijos būdu prijungtą žymę – fermentą, katalizuojantį
spalvinę reakciją. Galiausiai į šulinėlį pridedama bespalvio substrato, kurį prijungtasis fermentas
verčia į spalvą turinčią medžiagą. Jei spalva atsiranda, vadinasi, mėginyje buvo ieškomojo antigeno
ar antikūno. Jei ieškomo antigeno (ar antikūno) nebuvo, su fermentu sulietasis antikūnas neturėjo su
kuo sąveikauti. Todėl jis buvo nuplautas ir spalvinė reakcija nevyko (9.59 pav.). IFA spalvinei
reakcijai naudojami įvairūs fermentai: krienų peroksidazė, šarminė fosfatazė, β-D-galaktozidazė,
gliukozės oksidazė, acetilcholinesterazė, jaučio kepenų katalazė ir kt. Tirpale esant tinkamam
substratui, visi jie katalizuoja spalvines reakcijas.
 9.59 pav. IFA schema (antigeno detekcija) ir rezultatų pavyzdys.

Skiriami trys IFA metodo variantai:

1. Netiesioginė IFA
Ant plokštelės šulinėlių paviršiaus imobilizuojamas antigenas. Serumas ar kitas mėginys, turintis
pirminio antikūno (Ak1), pilamas į plokštelės šulinėlius. Inkubacijos metu susidaro antigeno–
antikūno kompleksas. Po inkubacijos visi laisvi antikūnai nuplaunami. Į šulinėlį įpilama antrinio
antikūno (Ak2), kuris jungiasi prie pirminio antikūno. Laisvas Ak2vėl nuplaunamas. Pridedama
bespalvio indikatoriaus, palaukiama. Spalvinė reakcija sustabdoma stipria rūgštimi. Šulinėlyje
atsiradusios spalvos intensyvumas matuojamas spektrofotometru, įvertinamas optinis tankis (9.60
pav.). Taip nustatomas antigeno arba pirminio antikūno kiekis.

9.60 pav. Netiesioginė imunofermentinė analizė

2. „Sumuštinio“ IFA

Nuo netiesioginės IFA šis metodas skiriasi tuo, kad ant šulinėlio paviršiaus imobilizuojami antikūnai.
Į šulinėlį pridedama antigenų, dar vėliau – antrinių antikūnų, kurie jungiasi prie antigenų, taip
sudarydami tarsi sumuštinį (9.61 pav.). Pagal spalvinės reakcijos intensyvumą nustatomas antigeno
kiekis.

3. Konkurencinė IFA

9.61 pav. „Sumuštinio“ IFA

Pirmiausia antikūnai inkubuojami antigenų turinčiame mėginyje (pirminiame tirpale). Antigenų–
antikūnų mišinys perkeliamas į plokštelės šulinėlius, kuriose yra imobilizuota antigenų. Kuo daugiau
antigenų yra pirminiame tirpale, tuo mažiau laisvų antikūnų lieka imobilizuotiems antigenams.
Vyksta konkurencija. Su laisvu antigenu kompleksą sudarę antikūnai išplaunami. Šulinėlyje surišti
antikūnai nustatomi pasitelkiant antrinius antikūnus ir spalvinę reakciją (9.62 pav.). Šiuo atveju, kuo
daugiau antigenų buvo tiriamajame tirpale, tuo blankesnis gaunamas spalvinis signalas.
 9.62 pav. Konkurencinė imunofermentinė reakcija

Imunofermentinės analizės (IFA) taikymas diagnostikoje

IFA metodas labai plačiai taikomas diagnostikoje ir moksliniuose tyrimuose, pavyzdžiui:

1. Donorinio kraujo patikrinimas, ar jame nėra:

a. ŽIV –tikrinamas anti-ŽIV antikūnų buvimas
b. Hepatito C ir B – tikrinamas ir antikūnų, ir antigeno buvimas

2. Hormonų lygio matavimas

a. Anabolinių steroidų nustatymas
b. Ovuliacijos laiko nustatymas pagal liuteinizuojančio hormono (LH) lygį
c. Žmogaus chorioninio gonadotropino nustatymas – nėštumo testas (žr. toliau)

3. Infekcijų atpažinimas:
a. ŽIV, sifilis, chlamidijos
b. Hepatitas B ir C
c. Laimo liga
d. Erkinis encefalitas
e. Galvijų leukemijos viruso atpažinimas

4. Alergenų atpažinimas maiste ir namų dulkėse;

5. Toksinų matavimas užterštame maiste;

6. Uždraustų narkotinių medžiagų atpažinimas (kokaino, opiatų ir kt.).

Nėštumo testas, jo veikimas

Nėštumo testu nustatomas žmogaus chorioninis gonadotropinas (ŽCG) (9.63 pav.). Tai –
baltymas, kurį po apvaisinimo pradeda sintetinti besiformuojanti placenta. Jį aptikti šlapime
galima ne anksčiau kaip 7–10 dieną po pastojimo. ŽCG nustatomas naudojant šiam hormonui
atrankius antikūnus. Šlapimo mėginys užnešamas testo juostelės pradžioje. Čia ŽCG suriša jam
atrankūs laisvi antikūnai (pavadinkime Ak1). Skystis sunkiasi membrana toliau, kartu keliauja ir
susidaręs ŽGC-antikūno kompleksas arba tik laisvi antikūnai, jei mėginyje ŽGC nebuvo. Taip
tirpalas pasiekia vietą, kur taip pat yra ŽCG atrankūs antikūnai, tačiau šie - imobilizuoti (Ak2). Jie
sąveikauja su ŽGC ir taip „pagauna“ anksčiau susidariusį ŽGC-antikūno kompleksą. Sąveikos
metu prie imobilizuotų antikūnų prijungta spalvinė žymė pakeičia spalvą. Jei mėginyje ŽCG nėra,
laisvieji antikūnai (Ak1) šioje vietoje nesurišami. Toliau membranoje yra kontrolinė sritis. Joje
imobilizuoti antriniai antikūnai (Ak3), kurie atpažįsta pirmuosius laisvuosius antikūnus (Ak1). Čia
susidaranti spalvota juostelė reiškia, kad analizė įvyko sėkmingai: skystis ir laisvieji antikūnai
migravo per testinę sritį iki kontrolinės srities. Neigiamo atsakymo atveju susidaro tik viena
spalvota juostelė – kontrolinė. Teigiamu atveju susidaro dvi juostelės, nes laisvųjų antikūnų būna
daug ir ne visi jie sudaro kompleksą su ŽCG. Todėl ne visi laisvieji antikūnai sulaikomi testinėje
srityje, dalis jų patenka ir į kontrolinę sritį. Jei neišryškėja kontrolinė juostelė, vadinasi, kažkas su
testu negerai – jo rezultatai neaiškūs, nepatikimi.
Nėštumo testo rezultatas gaunamas per 3–5 minutes, tikslumas – daugiau nei 95 procentai.

9.63 pav. Nėštumo testas

Literatūros sąrašas:

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
 http://expasy.org/tools/
 Lewin, B. Genes IX ed. 2008 Jones & Bartlett publ.
 Griffiths, A. et al. Introduction to genetic analysis IX ed. 2008 New York: W. H. Freeman
 Hyde, D. R. Introduction to genetic principles 2009 New York: McGraw-Hill
 Nicholl D.S.T. An introduction to genetic engineering. 3rd. ed. 2008 Cambridge univ. Press
 Watson et al. Molecular Biolgy of the Gene. VI ed. 2008 Cold Spring Harbour Lab Press
 S.B. Primrose R.M. Twyman R.W. Old. Principles of Gene Manipulation and Genomics 8th
ed., 2011. Wiley
 Lehninger, „Biochemistry“ 5ed.
 Protein Methods", 2nd Edition by Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki and Stuart J.
Edelstein (1996) Published by Wiley Publishers ISBN 0-471-11837-0.
 Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY,
USA.
 Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB.
 Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA.
 http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handboo
k.pdf.
 http://biotech.about.com/od/protocols/a/ProteinPurify.htm
 http://ebookbrowse.com/i/introduction-to-chromatography-pdf (daug .pdf knygų)
 http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Ion_exchange_chromatography.pdf
 http://www.4shared.com/document/3JaPOGLj/IntroductiontomodernLiquidChro.html
10. Praktinis genų inžinerijos taikymas
10.1. Paveldimų ligų ankstyva diagnostika, su tuo susijusios bioetinės problemos
Paveldimos ar genetinės ligos yra sunkūs susirgimai, ypač dažni vaikystėje. Ligų prevencijos ir
kontrolės centro duomenimis, JAV vidutiniškai vienas iš 33 naujagimių gimsta su rimtais defektais.
Apskaičiuota, kad beveik trečdalis vaikų susirgimų yra susiję su genetinėmis problemomis. Tai –
pagrindinis veiksnys, sąlygojantis vaikų mirtingumą. Tačiau kai kurios ligos progresuoja ir
pasireiškia tik brandžiame amžiuje. Moksliniai tyrimai parodė, kad genetinės ligos išsivysto dėl
dviejų pagrindinių problemų: chromosomų pakitimų arba genų mutacijų. Dideli chromosomų
pokyčiai – triploidijos (trys chromosomų rinkiniai) ar tetraploidijos (keturi chromosomų rinkiniai)
turi labai rimtų pasekmių. Dėl jų anksti įvyksta savaiminiai persileidimai. Mažesni pokyčiai –
aneuploidijos (pavienių chromosomų perteklius ar trūkumas) ir tam tikrų chromosomų sričių
delecijos, duplikacijos yra gana dažni. Jie lemia įvairias paveldimas ligas. Chromosomų skaičiaus
pakitimai yra apibūdinti 10.1 lentelėje.

Pakitimas Žymėjimas Sindromas Dažnis

Autosominių chromosomų skaičiaus pakitimai

Trisomija 13 chr. 47, 13+ Patau sindromas 1:12500–1:22000

Trisomija 18 chr. 47, 18+ Edvardo sindromas 1:6000–1:10000

Trisomija 21 chr. 47, 21+ Dauno sindromas 1:800

Lytinių chromosomų skaičiaus pakitimai

Trūksta Y arba X 45, X Ternerio sindromas 1:3000 (mergaičių)

Papildoma X 47, XXX Tripletas X 1:1200 (mergaičių)

Klinefelterio
Papildoma X 47, XXY 1:500 (berniukų)
sindromas

Papildoma Y 47, XYY Jakobso sindromas 1:1000 (berniukų)

10.1 lentelė. Genetines ligas lemiantys chromosomų skaičiaus pakitimai - aneuploidijos

Kita genetinių pakitimų grupė – genų mutacijos – taip pat lemia sunkias paveldimas ligas. Kai
kurios ligos yra detaliai apibūdintos: žinomas jų paveldėjimo pobūdis (mutacija dominuojanti ar
recesyvinė, autosominė ar susijusi su lyties chromosomomis). Gali būti žinomas ligos dažnis,
charakterizuotas mutuotas genas (10.2 lentelė).
 Paveldima liga Dažnis Ligos ypatybės
Autosominės recesyvinės ligos
Cistinė fibrozė 1:200–1:2500 plaučių ir kasos pažeidimai dėl
(europidai) chlorido jonų pernašos per
membraną sutrikimų

Tai-Sakso liga 1:3000 (Europos žydai) neurologinė degeneracija,

aklumas ir paralyžius

Pjautuvinė anemija 1:50–1:100 (Afrikoje) neįprasti raudonieji kraujo

kūneliai dėl β-globino struktūros
pakitimų

Fenilketonurija 1:2000–1:5000 protinio vystymosi sutrikimai dėl

fenilalanino kaupimosi

α1 antitripsino stoka 1:5000–1:10000 plaučių ir kepenų pažeidimai

Autosominės dominuojančios ligos

Hantingtono liga 1:5000–1:10000 demensija, motorikos ir protinės
veiklos sutrikimai

Šeimyninė 1:500 širdies ligos

hipercholersterolemija
Krūties vėžys BRCA1 ir 2 1:800 (1:100 Europos dažnas krūties ir kiaušidžių vėžys
žydai)

Šeimyninė retinoblastoma 1:14000 tinklainės vėžys

Ligos, susijusios su X chromosma

Ducheno raumenų distrofija 1:3000-1:4000 raumenų nykimas

Hemofilija A/B 1:10000 kraujo krešėjimo sutrikimai

Mitochondrijų ligos
Leberio regos nervo nežinomas aklumas dėl regos nervo
neuropatija pažeidimo

10.2 lentelė. Genų mutacijų sukeliamos ligos

Ankstyvajai genetinių ligų diagnostikai pasitarnauja genų inžinerijos metodai. Tiriamieji individai
gali būti sutuoktinių pora (siekiant išsiaiškinti, ar nėra kokių nors genų mutacijų nešiotojai) arba dar
negimęs kūdikis (prenatalinė diagnostika). Panagrinėsime genų inžinerijos metodų panaudojimo
galimybes dažniausios chromosomų anomalijos – 21-osios chromosomos trisomijos (Dauno
sindromo) ankstyvam nustatymui.
Citogenetiniai tyrimai yra plačiai naudojami prenataliniam Dauno sindromo nustatymui.
Populiariausias – kariotipo testas, kurio metu yra ištiriamas chromosomų rinkinys. Besidalijančių
ląstelių metafazines chromosomas galima analizuoti mikroskopu. Tam paimamas vandenmaišio
skysčio mėginys, kuriame yra vaisiaus ląstelių. Jos keletą dienų auginamos specialioje terpėje. Po to
ląstelės fiksuojamos ant mikroskopavimo stiklelio, suardomos, ląstelių nuolaužos nuplaunamos.
Chromosomos yra bespalvės, todėl jos dažomos specialiu dažu – Giemsa. Dažas prisijungia prie DNR
fosfatų bei sričių, turinčių daug A ir T. Nudažytos chromosomos analizuojamos pro mikroskopą. Jos
atrodo kaip juodai–baltai dryžuotos juostelės (10.1 pav.). Pirmiausia skaičiuojama, kiek chromosomų
yra ląstelėje (turėtų būti 46). Vėliau, pagal būdingą kiekvienos chromosomos dryžių vaizdą,
identifikuojamos visos 22 poros, X ir Y chromosomos. Tyrimas užtrunka 10–14 dienų.

10.1 pav. Dauno sindromu sergančios mergaitės chromosomų, dažytų Giemsa dažu, vaizdas

Ląstelių kariotipo tyrimai yra plačiai naudojami. Pastaruoju metu populiarėja greitesni molekuliniai
metodai – fluorescencinė DNR hibridizacija, sutrumpintai vadinama FISH (angl. fluorescence in situ
hybridization). Šio tyrimo metu yra nustatomas 21-osios chromosomos skaičius ląstelėje. Ląstelės iš
vandenmaišio skysčio apdorojamos panašiai kaip kariotipo analizei. Tačiau ląstelių nereikia auginti,
todėl tyrimas yra greitesnis (trunka 24–48 val.). FISH analizei paruošiamas fluorescencine žyme
pažymėtas DNR zondas, kuris hibridizacijos metu prisijungia prie 21 chromosomos (10.2 pav.).
Hibridizacijos rezultatai analizuojami fluorescenciniu mikroskopu – stebima, kiek fluorescencijos
signalų yra ląstelėje. Trys fluorescencijos taškai liudija apie 21 chromosomos trisomiją.
 10.2 pav. Dauno sindromo tyrimas FISH hibridizacijos metodu

Kitas greitas metodas – kiekybinė fluorescencinė PGR (angl. quantitative fluorescent PCR, QF-
PCR). Jos metu padauginamos tam tikros 21-osios chromosomos sritys, kurios turi trumpų sekų
pasikartojimus (apie tandeminius pasikartojimus žr. sk. 8.3 ir 10.6). Kad būtu lengviau analizuoti bei
įvertinti QF-PGR produktų ilgį (ir kiekį) kapiliarinės elektroforezės metu, PGR naudojami
fluorescencinėmis žymėmis pažymėti pradmenys. Normaliu atveju, po PGR gaunami du produktai –
kiekvienas nuo skirtingos 21-osios chromosomos. Jei pasikartojimų skaičius produktuose yra
skirtingas, susidarę PGR produktai bus skirtingo ilgio. Tačiau jų kiekis bus vienodas.
Dauno sindromo atveju, jei pasikartojimų skaičius chromosomose skirtingas, PGR metu susidarys 3
skirtingo ilgio produktai. Jeigu iš trijų chromosomų dvi yra identiškos (pasikartojimų skaičius yra
vienodas), PGR metu susidarys 3 produktai, bet dviejų produktų (susintetintų nuo identiškų
chromosomų) ilgis bus vienodas – elektroforezės metu jie atrodys kaip viena juostelė. Tačiau
įvertinus visų PGR produktų kiekį, gaunamas santykis 2:1, o tai reiškia, kad yra trys produktai: du
vienodo ilgio ir vienas kito ilgio. Šiai greitai analizei naudojama iš vandenmaišio skysčio ar choriono
gaurelių mėginių išgryninta DNR. Klinikinėse laboratorijose naudojami komercinių kompanijų
paruošti detekcijos rinkiniai, kuriuos naudojant QF-PGR vienos reakcijos metu galima nustatyti 13,
18, 21 ir X, Y chromosomų aneuploidijas.
 10.3 pav. Dauno sindromo nustatymas kiekybinės fluorescencinės PGR metodu

Daug tikimasi iš tobulėjančių DNR mikrogardelių technologijų, jų pritaikymo galimybių

diagnostikos tikslams. Manoma, kad DNR mikrogardelės dėl tyrimo greitumo, tikslumo ir galimybės
vieno tyrimo metu nustatyti ne vieną, o daugybę anomalijų taps genetinių diagnostinių tyrimų
auksiniu standartu. Apie mikrogardelių panaudojimą genų raiškos tyrimams jau buvo rašyta (žr.(8.5
ir 9.13 sk.). Kai kuriose išsivysčiusiose šalyse chromosomų pakitimų tyrimai, tarp jų ir 21-osios
chromosomos trisomijos, atliekami naudojant DNR mikrogardeles. Tiesa, tai nėra rutininiai
klinikiniai tyrimai. Dauguma jų yra tiriamojo pobūdžio, siekiant ištobulinti metodą ir paruošti
rekomendacijas. Šie tyrimai dar kartais vadinami lyginamąja genomų hibridizacija. Jos metu
tiriamojo individo DNR yra palyginama su sveiko žnogaus DNR, tokiu būdu aptinkamos
chromosomų anomalijos.
Anomalijomis gali būti chromosomų dalinės duplikacijos ar delecijos, jų skaičiaus pakitimai
tiriamajame mėginyje. Tiriamojo individo DNR ir sveiko žmogaus DNR išgryninama ir pažymima
skirtingai fluorescuojančiomis žymėmis. Tada DNR sumaišomos ir hibridizuojamos su DNR
mikrogardele, kurioje imobilizuoti 30–50 bp ilgio žmogaus genomo koduojančių ir nekoduojančių
sričių fragmentai (10.4 pav.). Prie šių fragmentų vienodai turėtų prisijungti tiek sveiko, tiek tiriamojo
mėginio DNR. Jei tiriamajame mėginyje yra trys 21-osios chromosomos, jų fragmentų hibridizacijos
mišinyje yra daugiau nei sveiko žmogaus. Tad prie mikrogardelėje imobilizuotų 21-osios
chromosomos fragmentų prisijungs daugiau tiriamojo mėginio DNR. Todėl tiriamojo mėginio DNR
koncentracija (taigi ir fluorescuojančios žymės koncentracija) tuose mikrogardelės taškuose bus
didesnė.
 10.4 pav. Lyginamoji genomų hibridizacija naudojant DNR mikrogardeles

Modernūs, greiti ir patikimi diagnostikos metodai keičia paprastuosius klinikinius tyrimus. Retėja
neteisingos diagnozės atvejai. 15–20 nėštumo savaitę atliekami paprastieji Dauno sindromo
diagnostiniai kraujo testai. Jų metu nustatomi nėštuminis plazmos baltymas A (PAPP-A), estriolis bei
žmogaus chorioninis gonadotropinas (hCG). Tačiau testų tikslumas yra tik ~ 94 %, o ~ 5 %
prognozuojamų Dauno sindromo atvejų yra klaidingi. Šiuolaikiniai, DNR tyrimo technologijomis
paremti diagnostiniai metodai yra tikslesni. Tačiau ankstyvoji diagnostika iškėlė bioetinių problemų.
Prie jų aptarimo turi prisijungti gydytojai, mokslininkai ir visuomenė. Kiekvienas nustatytas
genetinio pakitimo atvejis konkrečiam žmogui iškelia svarbų klausimą: ką daryti, kaip gyventi toliau?
Nesunku įsivaizduoti, kaip jaučiasi šeima, sužinojusi, kad laukiasi vaikelio, kuriam diagnozuotas
Dauno sindromas. Kokį sprendimą ji priims, kaip pasielgs – ir kaip tą sprendimą priims visuomenė?
Lietuvos Higienos instituto Sveikatos informacijos centro duomenimis, 2008 m. gimė 27, 2009 m.
– 40, o 2010 m. – 46 kūdikiai su Dauno sindromu. Tai sudaro 0,9–1,5 % iš 1000 gimimų. Dauguma
moterų, kurių nešiojamam vaikui prenatalinės diagnostikos metu buvo nustatytas Dauno
sindromas, neturėjo palaikymo, gyvenimiškos patirties ar bijojo rizikuoti, todėl nutraukė nėštumą.
Vokietijoje kompanija „LifeCodexx“ įdiegė Dauno sindromo diagnostikos metodą, paremtą antrosios
kartos DNR sekoskaita. Tam iš motinos kraujo yra išskiriamos vaisiaus ląstelės ir išgryninama DNR.
2012 metų vasarą kompanija planuoja šį analizės metodą (jo kaina bus ~ 1200 eurų) pateikti
Vokietijos prenatalinio tyrimo centrams. Jau šiandien Vokietijoje 90–95 % nėščiųjų, sužinojusios
apie 21-osios chromosomos trisomiją, nutraukia nėštumą. Baiminamasi, kad įdiegus naująjį metodą,
tokių atvejų dar padaugės.
Ankstyvoji Dauno sindromo diagnostika yra glaudžiai susijusi su nėštumo nutraukimo problema.
Bendrąja prasme, ši problema – nutraukti nėštumą ar ne (kokiais motyvais bei argumentais
remiamasi) – yra vienas svarbiausių bioetikos klausimų. Jis visada vertinamas prieštaringai.
Kodėl? Tai yra pasaulėžiūros ir vertybių pasirinkimo klausimas. Šios problemos vertinimas
priklauso nuo to, kas (ir kokiame kontekste) ją vertina. Vienas požiūris remiasi sampra ta, pagal
kurią žmogaus gyvybė yra esminė vertybė, už kurią negali būti nieko svarbesnio. Taigi, gyvybės
išsaugojimas yra pirminė kiekvieno asmens ar piliečio pareiga. Kito požiūrio šalininkai teigia, kad
gyvybė pati savaime nėra absoliutus gėris. Tačiau visavertis gyvenimas, o tiksliau gyvenimo
kokybė, yra matas, kuriuo turėtume matuoti gyvybės vertę. Nėštumo nutraukimo šalininkai teigia,
kad, esant galimybei rinktis tarp sveiko ir apsigimusio kūdikio, būtų neprotinga rinktis pastarąjį – kur
kas išmintingiau būtų pamėginti „dar kartą“. Dažnas žmogus, žinodamas apie neįgalumo keliamus
rūpesčius ir užjaučiantis tėvus bei būsimą kūdikį, nenorėtų, kad į pasaulį būtų sąmoningai paleistas
vaikas, pasmerktas kančiai.
Kita bioetinių problemų diskusijų sritis yra susijusi su individualių žmonių genomo sekoskaita ir
genomo analizės rezultatų panaudojimu. Tobulėjant DNR sekoskaitos technologijoms, nebetoli ta
diena, kai žmogaus genomo sekoskaita diagnostikos tikslams bus ne ką sudėtingesnė už branduolių
magnetinio rezonanso tyrimą. Iškyla pavojus, kad įdarbinimo metu ar sveikatos draudimo
kompanijose žmonės gali būti diskriminuojami pagal savo genomo duomenis, jei analizės rezultatai
prognozuoja sunkias genetines ligas.
Apibendrinant, šiuolaikiniai DNR tyrimo technologijomis paremti diagnostiniai metodai atveria
naujas ligų gydymo galimybes: ankstyva terapija, geriausio gydymo metodo (galbūt tinkamiausio
vaisto) parinkimas. Dėl to gerėja gyvenimo kokybė, ilgėja žmonių gyvenimo trukmė.

10.2 Infekcinių ligų diagnostika ir prevencija, naujų vakcinų kūrimas

Infekcinių ligų diagnostika ir prevencija
Ilgą laiką klinikinėse laboratorijose pagrindinis metodas, naudojamas infekcijų sukėlėjų (ypač
bakterijų) nustatymui, buvo sukėlėjų auginimas terpėse ir tolimesnis jų apibūdinimas. Iš sergančio
audinio (ar organizmo skysčio) paimtas mėginys perkeliamas ant kietos agarizuotos mitybinės terpės,
turinčios mikroelementų, angliavandenių ir baltymų, būtinų bakterijų augimui. Mėginys laikomas
termostatuose (~37 °C) tol, kol užauga bakterijų kolonijos. Vėliau, ištyrus bakterijų biochemines
savybes, nustatoma, kokia tai bakterija: Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus. Ištyrus bakterijų atsparumą antibiotikams, parenkamas vaistas infekcinės
ligos gydymui. Iki šiol metodas yra nepakeičiamas „auksinis standartas“ klinikinėse laboratorijose.
Tačiau jis turi vieną esminį trūkumą: ligos sukėlėjo išauginimas, jo identifikacija ir apibūdinimas
užtrunka nuo kelių parų iki savaičių. Daugeliu atvejų, kai infekcinė liga progresuoja staigiai, toks
ilgas tyrimo rezultato laukimas gali turėti neigiamų pasekmių.
Pastarąjį dešimtmetį ištobulėjus PGR ir nukleorūgščių hibridizacijos metodams, klinikinėse
laboratorijose imti taikyti molekuliniai patogenų detekcijos metodai. Dauguma jų remiasi infekcijos
sukėlėjo DNR ar RNR nustatymu. Šie metodai yra jautrūs ir žymiai greitesni – tyrimas atliekamas (ir
rezultatai gaunami) per keletą ar kelioliką valandų.

Infekcijų sukėlėjų diagnostikai naudojamus nukleorūgščių tyrimo metodus galima suskirstyti į tris
grupes:

 Tiesioginiai metodai, kurių metu sukėlėjo DNR ar RNR aptinkama be dauginimo procedūros;
  Detekcijos signalo padauginimo metodai;

 Metodai, kurių metu yra padauginama ieškomojo sukėlėjo DNR.

Naudojant tiesioginius detekcijos metodus, paruošiami infekcijos sukėlėjo nukleorūgštims (DNR ar

RNR) komplementarūs zondai, žymėti fluorescuojančiomis molekulėmis. Tada atliekama
fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH). Hibridizacijos zondų taikiniais paprastai yra patogenų
ląstelėse gausiai aptinkamų ribosominės RNR (rRNR) sritys. Jų sekos yra savitos kiekvienai bakterijų
ir patogeninių grybų rūšiai. Tiriami tepinėlių, audinių pjūvių, biopsijos, kraujo mėginiai. Jie
imobilizuojami ant mikroskopavimo stiklelio ir atliekama hibridizacija. Hibridizacijos rezultatai
analizuojami fluorescenciniu mikroskopu. 10.5 pav. pateiktas tokio tyrimo pavyzdys. Šio tyrimo
metu per kelias valandas nustatoma, ar kraujo mėginyje yra patogeninių Candida genties grybų.
Naudojami trys skirtingomis fluorescuojančiomis molekulėmis pažymėti zondai, komplementarūs C.
albicans, C. tropicalis ir C. krusei rRNR. Tai leidžia tyrimo metu nustatyti Candida rūšį.

10.5 pav. Candida genties grybų nustatymas fluorescencinės in situ hibridizacijos (FISH) metodu

Aukščiau aprašytas tiesioginis detekcijos metodas aptinka gausias rRNR (ribosominės RNR)
molekules. Hibridizacijai naudojami zondai paprastai turi prijungtą tik vieną fluorescuojančią
molekulę. Tad jeigu zondas patogeno ląstelėje turėtų tik vieną taikinį, prie zondo prijungtos
fluorescuojančios žymės nebūtų įmanoma aptikti paprastais metodais. Jei prie tūkstančių ląstelės
rRNR molekulių prisijungia daugybė zondų, jų fluorescenciją ląstelėje galima aptikti fluorescenciniu
mikroskopu.
Šis tiesioginis detekcijos metodas tinka ne visiems patogenams. Kai kurie virusai – hepatito C
(HCV), žmogaus imunodeficito (ŽIV), hepatito B (HBV) virusai neturi jokių gausių taikinių. Jų
genomas – viena ar kelios RNR molekulės. Šių patogenų aptikimui naudojami hibridizacijos metodai,
kurių metu detekcijos signalai yra dirbtinai padauginami (10.6 pav.). Hibridizacija vyksta
„sumuštinio“ principu. Pirmiausia iš mėginio išskirtų RNR mišinys yra supilamas į hibridizacijos
plokštelės šulinėlius, prie kurių paviršiaus yra prijungti oligonukleotidai – patogenų RNR molekulių
gaudyklės. Dėl komplementarios sąveikos patogenų RNR prisijungia prie šių gaudyklių. Po to į
šulinėlius pilama specialių oligonukleotidų, vadinamų „prailgintojais zondui“. Jie komplementariai
sąveikauja su viruso RNR, o prie jų sekų vėliau komplementariai jungiasi žymėmis pažymėtų įvairių
zondų mišinys. Kaip žymės naudojamos fermentų molekulės, kurias galima aptikti pagal jų
katalizuojamą fermentinę reakciją. Jei prie zondo prijungta peroksidazė, į šulinėlį pripylus jos
substrato (luminolo) vyksta oksidacijos–redukcijos cheminė reakcija. Reakcijos metu išsiskiria
matoma šviesa. Jei šulinėlyje nustatoma fermentinės reakcijos metu išsiskyrusi šviesa, į šį šulinėlį
įpiltame mėginyje buvo viruso RNR.

10.6 pav. Hepatito C viruso nustatymas signalo padauginimo metodu

Trečioji metodų grupė, kurių metu yra padauginama ieškomojo sukėlėjo DNR, yra dažniausiai
naudojama infekcijos sukėlėjų detekcijai. Taq DNR polimerazė PGR metu padaugina tiriamojo
patogeno DNR milijardus kartų (2n kartų, kur n – PGR ciklų skaičius). Yra sukurti dauginės PGR
(angl. multiplex PCR) metodai, kurių metu į vieną reakcijos mišinį įpilama kelių pradmenų poros
(viena pora skirta E. coli, kita – Salmonella, trečia – P. aeruginosa DNR dauginimui). Vienos
reakcijos metu galima mėginyje nustatyti iš karto kelis patogenus.
Patogenų detekcijai dažniausiai yra naudojamas realaus laiko PGR (angl. real time, RT-PCR).
Reakcijos produktų susidarymą realiuoju laiku galima stebėti pripylus į reakcijos mišinį prie
dvigrandinės DNR besijungiančių fluorescuojančių junginių (SYBRGreen). Šie fluorescuojantys
junginiai nėra atrankūs, jie sąveikauja su bet kokia dvigrandine DNR. Tad visada išlieka pavojus, kad
PGR metu pradmenys neteisingai prilips prie dalinai nekomplementarios DNR matricos sekos (bus
susintetinti neteisingi produktai). Tokių produktų susidarymas gali būti klaidingai interpretuojamas
kaip tikrojo taikinio DNR buvimas tiriamajame mėginyje. Todėl patogenų detekcijai dažniau
naudojamas RT-PGR metodas. Jo metu, produktų susidarymas stebimas naudojant
fluorescuojančiomis molekulėmis žymėtus zondus. Toks būdas yra tikslesnis. Šie zondai dėl
komplementarios sąveikos jungiasi prie reakcijos metu sintetinamo produkto DNR sekos, tada
prietaisas išmatuoja reakcijos mišinio fluorescenciją. Tokį detekcijos metodą panagrinėsime
nagrinėdami meticilinui atsparios bakterijos Staphylococcus aureus aptikimą.
S. aureus (kitaip dar vadinamas auksiniu stafilokoku) yra plačiai paplitusi bakterija. ~ 30 % sveikų
žmonių yra jos nešiotojai ant odos ir nosiaryklėje. Daugumai žmonių ji nepavojinga. Tačiau dėl
įvairių priežasčių nusilpus imuninei sistemai, šios bakterijos gali sukelti infekciją: kraujo užkrėtimą,
žaizdų infekciją, infekcinį endokarditą, plaučių uždegimą. Todėl S. aureus bakterijos ypač pavojingos
kūdikiams bei ligoninėse, kur didelė pacientų dalis priklauso įvairioms rizikos grupėms. Tyrimų
duomenimis, įvairioms rizikos grupėms priklausančių pacientų mirtingumas nuo šios bakterijos
sukeltos infekcijos gali siekti 15–60 %.
Sudėtingoms auksinio stafilokoko sukeltoms infekcijoms gydyti ilgą laiką buvo naudojami β-laktamų
klasės antibiotikai. Jie prisijungia ir slopina bakterijos fermentą PBP, dalyvaujantį bakterinio
apvalkalo sintezėje. Kai bakterijos aplinkoje yra β-laktamų, šis fermentas slopinamas. Apvalkalo
sintezė nevyksta, bakterijų augimas sustabdomas. Tačiau pastarąjį dešimtmetį S. aureus
antimikrobinė terapija tapo neveiksminga, nes bakterijos įgijo atsparumą antibiotikams. Atsparumas
bakterijose atsirado dėl to, kad į jų ląsteles pateko ir į chromosomą buvo integruota DNR seka,
koduojanti β-laktamams nejautraus bakterijų apvalkalo sintezės fermento geną. Jis vadinamas mecA
(10.7 pav.) Manoma, kad šį geną koduojantį DNR fragmentą bakterijai atnešė ir „padovanojo“
bakteriofagai. Populiariausiam β-laktaminiam antibiotikui – meticilinui atsparios S. aureus bakterijos
(sutrumpintai vadinamos MASA) išplito visame pasaulyje. Europos atsparumo antibiotikams
stebėsenos sistemos EARSS duomenimis, 14 % 2010 m. Lietuvos ligoninėse išskirtų S. aureus
bakterijų buvo atsparios meticilinui. Pietų Europos šalyse (Ispanijoje, Italijoje, Graikijoje) meticilinui
yra atsparios ~ 50 % S. aureus padermių.

10.7 pav. Meticilinui jautrios ir atsparios S. aureus bakterijos

Susiklosčius tokiai situacijai, kai S. aureus infekcijos gydymas meticilinu tapo (daugeliu atveju)
nebeįmanomas, iškilo greitos detekcijos poreikis. Identifikuoti reikia ne tik patį patogeną, bet ir
nustatyti, ar jis atsparus meticilinui. Tai atliekama realaus laiko PGR metodu, naudojant
fluorescuojančiomis molekulėmis žymėtus zondus. Jie jungiasi prie reakcijos metu sintetinamų mecA
ir nuc genų DNR. Nuc genas koduoja S. aureus nukleazę. Šį geną turi visos S. aureus rūšies padermės,
nepriklausomai nuo jų atsparumo. Tačiau mecA geną turi tik meticilinui atsparios bakterijos.
Nustatymo schema yra pateikta 10.8 pav. Analizei naudojami zondai yra žymėti dviem molekulėmis:
fluoroforu 5‘ gale ir fluoroforo fluorescencijos gesikliu 3‘ gale. Kadangi zondai yra neilgi (~ 20 nt),
arti fluoroforo esantis gesiklis slopina fluoroforo fluorescenciją. Reakcijos metu Taq polimerazė
sintetina DNR ir fiziškai priartėja prie matricos sekos. Zondas taip pat yra prilipęs prie matricos sekos.
Taq polimerazė hidrolizuoja zondo fosfodiesterinius ryšius. Tada fluoroforas difunduoja nuo
matricos ir, nutolęs nuo gesiklio, fluorescuoja. PGR prietaisas matuoja reakcijos mišinio
fluorescenciją kiekvieno ciklo metu. Kai reakcijos produktų mecA ir nuc ima daugėti, prie jų prilimpa
vis daugiau zondo molekulių. Sintezės metu hidrolizuojama vis daugiau zondo, atpalaiduojama
daugiau fluoroforo ir mišinio fluorescencija vis didėja. Kadangi tyrimui naudojami skirtingais
fluoroforais žymėti zondai (mecA zondas – fluorescuojančiu raudonai, o nuc zondas – žaliai), pagal
reakcijos mišinio fluorescenciją sprendžiama apie mecA ir nuc genų buvimą. Jei nustatyta raudona ir
žalia fluorescencija – tiriamajame mėginyje buvo meticilinui atspari S. aureus, jei tik žalia –
meticilinui jautri S. aureus.
 10.8 pav. Meticilinui atsparių S. aureus (MASA) bakterijų nustatymas tikro laiko PGR metodu
Pastaraisiais metais, kai antibiotikų vartojimas vis didėja, bakterijų atsparumas antibiotikams taip pat
išaugo. Šį reiškinį lėmė atsparumą antibiotikams lemiančių genų (panašiai, kaip MASA atveju)
paplitimas bakterijose. Minėti genai koduoja fermentus, kurie hidrolizuoja antibiotikus (β-laktamazės
hidrolizuoja β-laktamus) arba fermentus, kurie modifikuoja antibiotikus. Nukleotidtransferazės,
acetiltransferazės ar fosfotransferazės prijungia atitinkamai nukleotidines, acetilines ar fosfatines
grupes prie aminoglikozidinių antibiotikų (kanamicino, streptomicino, gentamicino). Taip
modifikuoti antibiotikai yra nebeaktyvūs. Kai kurie genai koduoja baltymus nešiklius. Nešikliai
išmeta antibiotikus iš ląstelės į aplinką (chloramfenikolą šalinantys kanalai). Genai gali koduoti
baltymus, kurie yra nejautrūs antibiotikui ir gali atlikti antibiotiko taikinio funkcijas ląstelėje (S.
aureus mecA geno produktas sintetina bakterijos apvalkalą).
Šie genai dažnai yra lokalizuoti plazmidėse, kurios bakterijų konjugacijos metu sparčiai plinta tarp
bakterijų. Todėl antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų gydymas tapo didžiule problema.
Ypač sunkus daugiaatsparių – atsparių net kelių klasių antibiotikams (β-laktamams,
aminoglikozidams, chinolonams, makrolidams) bakterinių sukeltų infekcijų gydymas, kai nebelieka
terapijai tinkamų vaistų. Todėl vis dažniau susigriebiama, kad reikia vykdyti įvairias prevencijos
priemones: mažinti antibiotikų vartojimą ligoninėse ir poliklinikose, šviesti ir ugdyti atsakingą
visuomenę. Lietuviams būdingi labai dažni savigydos atvejai, kai antibiotikai iš įvairių „sutaupytų
resursų“ vartojami netinkamai. Taip pat svarbu vykdyti atsparių bakterijų paplitimo stebėsenos
programas.
Jungtinės Karalystės ligoninėse nuo 1990-ųjų metų meticilinui atsparių S. aureus bakterijų nuolat
daugėjo (10.9 pav.). 2003 metais buvo imtasi įvairių priemonių: sugriežtinta dezinfekcijos procedūra
ir kontrolė ligoninėse, įdiegta antibiotikų skyrimo ir vartojimo kontrolė, imta molekuliniais metodais
tikrinti visus į ligonines atvyksius pacientus (ar jie nėra MASA nešiotojai). Jei tyrimo rezultatas buvo
teigiamas, buvo imamasi griežtų priemonių, kad bakterijos nebūtų išplatintos – pacientas buvo
guldomas į atskirą palatą ir gydomas. Griežta politika davė svarių rezultatų: per 5 metus MASA
bakterijų žymiai sumažėjo.

10.9 pav. MASA bakterijų dinamika Jungtinės Karalystės ligoninėse 1990–2010 metais

Tačiau pati efektyviausia infekcinių ligų prevencinė priemonė yra vakcinacija. Vakcinos lėmė, kad
pasaulyje ir Lietuvoje išnyko raupai, baigia išnykti poliomielitas, tymai ir raudoniukė. Ėmus
vakcinomis valdyti tokias ligas kaip stabligė, difterija, kokliušas, ženkliai sumažėjo naujagimių
sergamumas šiomis ligomis.

Naujų vakcinų kūrimo procesas

Šiuolaikiniai biotechnologijos metodai išplėtė vakcinų kūrimo galimybes. Senosios vakcinos dažnai
būdavo inaktyvintų (dažniausiai užmuštų) ar susilpnintų mikrobų preparatai, turintys antigenų.
Mikrobai stimuliuoja imuninę sistemą tam, kad antigenas būtų atpažintas ir „įsimintas“. Vėlesnio
organizmo susidūrimo su gyvu patogenu metu, imuninė sistema aktyvinama ir gamina antikūnus prieš
pažįstamą svetimą baltymą – antigeną. Tokios anksčiau buvo gripo, choleros, hepatito A, polio,
pasiutligės, raudoniukės, tymų, kiaulytės vakcinos.
Biotechnologijų dėka, pastaruoju metu paplito subvienetinės vakcinos (kartais jos dar vadinamos
rekombinantinėmis). Tai – preparatai, turintys išgrynintą patogeno antigeną. Dažniausiai jais būna
įvairūs bakterijų ar virusų apvalkalo paviršiaus baltymai. Subvienetinės vakcinos gaunamos klonavus
antigeno geną į klonavimo vektorių, įterpus jį į ląsteles (E. coli, mieles ar gyvūnų ląstelių linijas) ir
aktyvinus geno koduojamo baltymo sintezę. Suardžius ląsteles, baltymas antigenas išgryninimas,
sukoncentruojamas ir paruošiama vakcina. Toks vakcinų kūrimo metodas turi daugybę privalumų.
Pirmiausia, jis pigus, nes galima gauti labai daug baltymo iš genų inžinerijos metodais sukurtų
superproducentų. Antra, vakcina yra visiškai saugi, nes jos preparate visai nėra patogeninių bakterijų
ar virusų likučių, galinčių iš karto išprovokuoti infekciją. Šiuo metodu buvo sukurta hepatito B
vakcina (viruso paviršiaus baltymo HBsAg geną įterpus į mielių ląsteles), kiaulių gripo H1N1 viruso
vakcina (viruso paviršiaus baltymą hemagliutininą klonavus ir išgryninus iš ląstelių kultūrų), gimdos
kaklelio vėžio sukėlėjo papilomos vakcina (viruso kapsidės baltymus klonavus ir išgryninus iš mielių
ir ląstelių kultūrų).
Visos vakcinos (tiek senosios inaktyvuotų ir susilpnintų mikroorganizmų, tiek subvienetinės) dažnai
turi vieną trūkumą – susiformavęs imuninis atsakas kartais yra silpnas ar trumpalaikis. Todėl
reikalingos pakartotinės imunizacijos. Imuninis atsakas yra žymiai efektyvesnis, jei organizmas iš
tikrųjų susidūrė su patogenu, kuris (nors ir neilgai) dauginosi, jo antigenus imuninė sistema gerai
„įsidėmėjo“ ir sunaikino. Tokią situaciją stengiamasi atkurti panaudojus gyvas rekombinantines
vakcinas. Patogeno antigenus koduojantys genai yra įterpiami į sveikatai nepavojingus
mikroorganizmus: naudojamos susilpnintos Salmonella bakterijos padermės, virusai. Dažnai
naudojamas Vaccinia virusas. Jo genomas – didelė 190 kb ilgio dvigrandinė DNR. Šis virusas,
patekęs į šeimininko ląsteles, dauginasi citoplazmoje. Jis pats koduoja visus DNR replikacijai ir
transkripcijai būtinus genus. Vaccinia viruso infekcija sveikam žmogui nesukelia jokių simptomų.
Istoriškai šis virusas yra daug nusipelnęs žmonijai. XIX–XX amžiuje Vaccinia virusai buvo
panaudojami imunizacijai. Buvo pastebėta, kad imuninis atsakas, susidaręs po Vaccinia infekcijos,
apsaugojo žmones nuo raupų, kuriuos sukelia šiam virusui giminingi Variola genties virusai. Kuriant
gyvas rekombinantines vakcinas infekcijų sukėlėjų antigenų genai įterpiami į Vaccinia genomą
(10.10 pav.). Sukurti rekombinantiniai virusai panaudojami imunizacijai. Po imunizacijos,
besidauginant virusui šeimininko ląstelėje, vyksta ir įterpto infekcijos sukėlėjo baltymo (kuris
aktyvuoja šeimininko imuninę sistemą) sintezė. Tokios gyvos rekombinantinės vakcinos dažniau
naudojamos gyvūnams. Europoje naudojama pasiutligės vakcina laukiniams gyvūnams, kai laukuose
išmėtomas masalas kartu su vakcina. Ji yra paruošta naudojant Vaccinia virusą, į kurio genomą
įterptas pasiutligės sukėlėjo Lyssavirus antigeno genas.

10.10. pav. Gyvų rekombinantinių vakcinų kūrimas

Ateityje daug tikimasi iš naujų technologijų – DNR vakcinų. Žinoma, kad antigeną koduojančios
DNR (dažniausiai rekombinantinės plazmidės pavidalu) injekcija stimuliuoja organizmo imuninę
sistemą ir suformuoja imuninį atsaką prieš koduojamo geno baltymą. Tikėtina, kad DNR patenka į
organizmo ląsteles, o jose susintetintas svetimas antigenas yra sekretuojamas į aplinką arba
eksponuojamas ląstelių paviršiuje (padedant audinių suderinamumo kompleksui MHC). Taip
aktyvinami limfocitai, prasideda antikūnų gamyba. Susidaro ir atminties ląstelės, kurios atpažins
tikąjį patogeną ateityje ir aktyvuos imuninę sistemą kovai su juo (10.11 pav).
Nors rekombinantinė plazmidė ir nesireplikuoja ląstelėse, tačiau laikino jos buvimo pakanka baltymo
sintezei. Svarbiausia, kad joje klonuoto geno iRNR transkripcija būtų veiksminga bei iRNR būtų
stabili. Dėl to, priešais klonuotą geną įterpiamas eukariotinių ląstelių RNR polimerazės promotorius
bei iRNR poliadenilinimui būtinos DNR sekos. Vienas tokio metodo privalumų yra paprastas
vakcinos įterpimo į organizmą būdas. Dažniausiai tam naudojami biolistiniai įrankiai, kurie smulkias
inertines daleles, padengtas DNR molekulėmis, iššauna į odos paviršiaus ląstelių vidų.

10.11 pav. DNR vakcinų veikimo mechanizmas

Reikia pripažinti, kad nuo 2006 m. DNR vakcinų technologijos tebėra kūrimo etape ir dar teks
išspręsti daug klausimų, kol jos bus taikomos žmonių vakcinavimui. Šiuo metu žinoma vienintelė
praktiškai naudojama prevencinė DNR vakcina yra Vakarų Nilo viruso vakcina. Ji skirta arklių
imunizavimui. Paskelbti duomenys apie gerus rezultatus, naudojant paukščių gripo viruso vakciną.
Dalis DNR vakcinų tyrimų pasuko ne įprastų prevencinių vakcinų, o gydomųjų vakcinų kūrimo
kryptimi. Tikimasi sukurti DNR vakciną vėžio, autoimuninių ligų ir alergijų gydymui. Manoma, kad
galima sukurti asmeninę DNR vakciną vėžio gydymui. Paėmus paciento vėžinio audinio mėginį,
galima išgryninti DNR, vėžinių ląstelių antigenus koduojančius genus įterpti į klonavimo vektorių ir
juo imunizuoti pacientą. Tyrimų rezultatai rodo, kad antigenai aktyvina imuninę sistemą, kuri pradeda
naikinti antigenus turinčias vėžines organizmo ląsteles. 2011 metais vyko DNR vakcinų, skirtų
prostatos, krūties, kiaušidžių, gimdos kaklelio, šlapimo pūslės, plaučių vėžio, B ląstelių limfomos,
sarkomos, melanomos gydymui klinikiniai bandymai.
DNR vakcinų kūrimas autoimuninių ligų gydymui siekia priešingo rezultato: ne aktyvinti, o slopinti
imuninę sistemą, kuri autoimuninės ligos metu elgiasi neteisingai ir naikina savo organizmo ląsteles.
I tipo diabetas ir išsėtinė sklerozė yra pavojingiausios autoimuninės ligos. Pirmuoju atveju, imuninė
sistema atakuoja insuliną sintetinančias kasos beta ląsteles, antruoju atveju – nervinio audinio
dendrocitus, gaminančius mieliną. Kita ypač dažna liga – reumatoidinis artritas, kai imuninė sistema
atakuoja sąnarių ląsteles. Autoimuninių ligų gydymo DNR vakcinomis idėja gali atrodyti paradoksali:
kaip gali metodas, kuriuo imuninė sistema aktyvuojama, veikti priešingai? Atsakymas glūdi imuninės
sistemos veiklos pobūdyje – ji gali būti ir tolerantiška. Sveikame organizme formuojantis imuninės
sistemos T ir B ląstelėms, jos yra „supažindinamos“ su savais organizmo antigenais ir „išmokomos“
juos toleruoti. Autoimuninės ligos išsivysto tada, kai šie mechanizmai sutrinka. Moksliniai tyrimai
parodė, kad injekavus rekombinantinę DNR, koduojančią organizmo antigeno (kurį imuninė sistema
klaidingai laikė svetimu) geną, imuninė sistema šio geno koduojamą baltymą atpažįsta kaip savą. Ji
„persiprogramuoja“ ir nustoja naikinti šį savą antigeną turinčias organizmo ląsteles.
Kita labai perspektyvi sritis yra vadinamųjų „valgomųjų vakcinų“ kūrimas. Infekcijų sukėlėjų
antigenų genai (naudojant klonavimo vektorius ir A. tumefaciens bakteriją) yra įterpiami į augalų
genomą – sukuriami transgeniai augalai (10.12 pav.). Dažniausiai tam naudojamos bulvės ir bananai.
Auginant šiuos augalus, ląstelėse vyksta įterpto geno raiška, sintetinamas antigenas. Tyrimai parodė,
kad suvalgius tokį transgeninį augalą, augalo ląstelės sienelės apsaugo antigeną nuo skrandžio
virškinimo fermentų, o žarnyne antigenas išlaisvinamas. Žarnyne jis patenka į limfinį audinį, kur
aktyvuoja imuninę sistemą. Jau atlikti pirmieji hepatito B ir enterotoksikogeninės E. coli vakcinų
bulvėse, pasiutligės vakcinos pomidoruose bandymai. Tikėtina, kad šių vakcinų gamybos, laikymo
ir imunizacijos kaštai bus žymiai mažesni. Kasmetinei visos planetos kūdikių imunizacijai hepatito
B vakcina užtektų 80 ha plote užaugintų transgeninių bulvių. Tačiau iškyla dozavimo problema, nes
dozė turi būti nei per didelė nei per maža. Tenka įvertinti imunizuojamo asmens amžių, kūno svorį,
suvalgomos vakcinos dydį ir baltymų kiekį joje.
 10.12 pav. Valgomosios vakcinos transgeniniame augale kūrimas

10.3. Žmogaus genų terapija ir jos galimybės

Daug genetinių ligų pastaraisiais dešimtmečiais (ir net šimtmečiais) buvo sėkmingai gydoma
pritaikius tinkamą terapiją. Įvairios terapijos buvo atrastos klaidų ir bandymų (ar tiesiog visiško
atsitiktinumo) dėka. Dažniausiai genetinės ligos simptomai būdavo tik palengvinami. Tačiau
žinojimas, kokia mutacija kokiame gene lemia ligą, suteikia plačias galimybes. Pirmiausia, žinant,
koks baltymas yra mutuotas, galima ieškoti atrankių vaistų. Jie padėtų „gelbėti“ biocheminę situaciją
ląstelėse ar audiniuose ir gydyti ligą. Antra, molekuliniams ligos tyrimams galima sukurti modelinį
transgeninį gyvūną (pvz. pelytę, turinčią analogišką mutaciją). Jei jokios priemonės negelbsti, galima
bandyti įterpti į organizmą normaliai veikiantį geną – taikyti genų terapiją. Svarbu pastebėti, kad genų
terapija atliekama manipuliuojant sergančio individo somatinėmis ląstelėmis. Todėl mutuotas tėvų
genas lytinio dauginimosi metu bus perduotas individo palikuonims. Naudojant šiuolaikines
technologijas, nebūtų sudėtinga manipuliuoti ir reprodukcinėmis ląstelėmis – taikyti lytinių ląstelių
terapiją. Tačiau tokią terapiją dauguma pasaulio mokslininkų ir gydytojų laiko neetiška – iš esmės tai
būtų tobulų žmonių rasės kūrimas. Ypač kritiškai vertinamos lytinių ląstelių genomo manupuliacijos,
kurių metų siekiama ne taisyti, o patobulinti būsimojo individo savybes – tobulinimoji (angl.
enhancement) genų terapija.
Principas, naudojamas įterpti terapinius genus, nesiskiria nuo įprasto vektoriaus įterpimo į ląsteles
klonavimo metu. Pagal DNR įterpimo pobūdį, genų terapijos metodus galima susikirstyti į dvi grupes:

 Pirmoji (vadinama in vivo). Terapinis genas įterpiamas į sergančio organizmo paveiktą audinį.
Ši terapija tinka audinių – plaučių, kasos, raumenų, ląstelių defektams gydyti.

 Antroji (vadinama ex vivo). Defektyvios ląstelės pirmiausia išskiriamos iš organizmo. Jos

auginamos mitybinėse terpėse in vitro, įterpiamas terapinis genas, atrenkami transformantai
ir ląstelės injekuojamos atgal į organizmą (10.13 pav.). Ši terapija ypač tinka kraujo ląstelių
genetinių defektų gydymui.

10.13 pav. Genų terapija in vivo ir ex vivo

Genų terapijoje dažniausiai naudojami žmonių virusų pagrindu sukurti klonavimo vektoriai
(adenovirusų klonavimo vektoriai). Adenovirusai sukelia kvėpavimo takų infekcijas. Tačiau
klonavimui naudojami defektyvūs virusai. Jie nesukelia ligos, nes dalis jų genomo yra pašalinta, o
vietoje to yra įterptas terapinis genas. Įterpus į žmogaus ląsteles tokią rekombinantinę DNR, ji
ląstelėse bus tik laikinai. Tai yra metodo trūkumas (bet kartu ir privalumas). Privalumas – bet koks
galimas neigiamas rekombinantinės DNR sukeltas efektas bus laikinas ir grįžtamas. Trūkumas –
ilgalaikiam gydymui genų terapiją tenka periodiškai kartoti. Jau atlikta daug klinikinių bandymų
naudojant adenovirusinius vektorius genų terapijai. Sėkmingiausi rezultatai buvo gauti gydant cistinę
fibrozę.
Cistinė fibrozė yra genetiškai paveldima autosominė recesyvinė liga. Jos gydymas yra sudėtingas,
vidutinė ligonių gyvenimo trukmė 35 m. Liga išsivysto dėl mutacijos cftr gene (genas yra 7
chromosomoje). Cftr genas koduoja membraninį baltymą – laidumo reguliatorių (10.14 pav.).
Reguliatorius yra kanalas, pro kurį (mainais su vandeniu) chlorido jonai per plazminę membraną
pernešami į epitelines ląsteles. Dėl baltymo mutacijos, sergančiuose asmenyse sutrinka vandens
sekrecija iš epitelio ląstelių. Dėl to sutrinka gleivių apykaita plaučiuose, kepenyse, organai palaipsniui
pažeidžiami. Kai kuriuose regionuose vienas iš 2000 europidų (baltųjų rasės) naujagimių serga šia
liga, o 1 iš 25 yra nešiotojai (heterozigotos). 2011 m. Lietuvoje buvo 104 žmonės, sergantys cistine
fibroze (iš jų 52 vaikai). Vyriausiam iš jų – 29 metai, vidutinė gyvenimo trukmė ~ 18 m. Įtariama,
kad sergančiųjų yra ir daugiau, nes kartais liga klaidingai diagnozuojama kaip astma. 2011 m. pusės
metų medikamentinio gydymo kursas Lietuvoje kainavo ~ 23 000 litų.
Iš viso yra žinoma ~ 1400 cftr geno mutacijų, tačiau ~ 70 % sergančiųjų aptinkama F508 mutacija
– 508-osios aminorūgšties fenilalanino delecija. Pacientai, kurių abu aleliai yra mutuoti, neturi
funkcionalaus CFTR baltymo. Baltymas po sintezės nesudaro teisingos erdvinės struktūros,
neįsiterpia į membraną ir neatlieka savo funkcijos.

10.14 pav. Epitelinių ląstelių CFTR kanalas – membraninis laidumo reguliatorius

Cistinės fibrozės in vivo genetinei terapijai, cftr genas buvo įterptas į adenoviruso klonavimo vektorių
ir rekombinantiniais virusais aerozolinės inhaliacijos metu infekuotas pacientas (10.15 pav.).
Adenovirusų, kaip klonavimo vektorių, naudojimas nuo 1999 metų buvo pradėtas vertinti kritiškai,
kai vienas pacientas po genų terapijos mirė. Įtariama, kad mirties priežastis buvo stipri imuninės
sistemos reakcijos į adenovirusą.

10.15 pav. Cistinės fibrozės

terapija in vivo metodu,
naudojant adenovirusų
klonavimo vektorių

Su adenovirusais artimai susijusių adeno-asocijuotų virusų pagrindu sukurti vektoriai buvo sėkmingai
panaudoti įgimtam aklumui gydyti. Leberio kongenitalinė amaurozija (sutrumpintai LCA) yra reta
(1:100 000) genetinė liga, kuri išsivysto dėl mutacijos žmogaus rpe65 gene. Šis genas koduoja akies
epitelio fermentą, būtiną retinolio (susidarančio iš vitamino A) hidrolizei. Dėl rpe65 mutacijos, akies
epitelyje retinolio koncentracija yra per didelė ir jis pradeda naikinti tinklainės fotoreceptorius.
Kūdikiai gimsta visiškai akli arba su didele regėjimo negalia. 2007 metais grupė amerikiečių
mokslininkų iš Pensilvanijos įterpė į adeno-asocijuotų virusų klonavimo vektorių rpe65 geną ir
injekavo į šia liga sergančių pacientų tinklainę (10.16 pav.). Per dvi savaites pacientų regėjimas ėmė
atsistatyti. Kuo pacientas buvo jaunesnis, tuo rezultatai buvo geresni.

10.16 pav. In vivo genų terapija aklumui gydyti

Kita klonavimo vektorių alternatyva genų terapijai – retrovirusų vektoriai. Pagrindinis šių virusų
skiriamasis bruožas – jų genomas yra RNR molekulė. Po infekcijos, atvirkštinė transkriptazė
susintetina DNR, kuri yra įterpiama į ląstelės šeimininkės genomą. Klonavimui naudojami
defektyvūs virusai. Iš jų genomo yra pašalinti viruso dauginimuisi būtini genai, tačiau virusų DNR
vis tiek gali integruotis į ląstelės šeimininkės genomą. Tokiu būdu, įterpus terapijos geną galima
tikėtis, kad jo raiška ilgai bus pastovi, o ląstelei pasidalijus terapinį geną turės ir dukterinės ląstelės.
Retrovirusų vektoriai buvo panaudoti 2009 m. adrenoleukodistrofijos (sutrumpintai ALD) ex vivo
gydymui Prancūzijoje. Adrenoleukodistrofija – paveldima liga, susijusi su X chromosoma, ja serga
berniukai. Šios ligos metu pažeidžiamas nervinio audinio mielinas. Ląstelėse, peroksisomų
membranose nėra nešiklio, kuris gabena fermentą, būtiną ilgų riebalų rūgščių hidrolizei. Kraujyje
padidėjęs riebalų rūgščių kiekis destabilizuoja mieliną ir išprovokuoja centrinės nervų sistemos
uždegiminę demielinizaciją. Populiariausias gydymas – speciali dieta ir kaulų čiulpų tranplantacija,
tačiau pacientai miršta ankstyvoje vaikystėje. Prancūzijoje kasmet gimsta ~ 35 vaikai su ALD
sindromu (ligos dažnis 1:42000). Terapijai buvo išskirtos pacientų kraujodaros kamieninės ląstelės,
jos augintos in vitro. Tada šios ląstelės transformuotos lentiviruso pagrindu sukurtu klonavimo
vektoriumi, turinčiu veiklų nešiklio geną. Atrinkus transformuotas ląsteles, jos suleistos atgal
pacientams (10.17 pav.). Po dviejų metų nustatyta, kad demielinizacijos procesas sustabdytas,
ląstelėse buvo aptiktas veiklus genas ir jo produktas.
 10.17 pav.
Adrenoleukodistrofijos ex
vivo terapija, naudojant
retrovirusų klonavimo
vektorių

Naudojant retrovirusinius klonavimo vektorius, iki 2011 m. buvo atlikta virš 350 klinikinių bandymų.
Nepaisant kai kurių sėkmingų rezultatų, retrovirusų pagrindu naudojamų vektorių naudojimas turi ir
trūkumų. Pirmiausia, naudojami klonavimo vektoriai yra sukurti iš patogeninių virusų. Nors
klonavimui naudojami defektyvūs variantai, bijomasi, kad virusai gali sukelti nepageidaujamus
efektus (ypač susidūrę su normaliais virusais). Antra, retrovirusų infekcijos metu DNR integruojasi į
genomą atsitiktinėse vietose. Visada yra pavojus, kad integracijos metu gali būti pažeistas koks nors
kitas ląstelei gyvybiškai būtinas genas. Tokių atvejų žinoma. Vienų klinikinių bandymų metu, kai
retrovirusų klonavimo vektorius buvo sėkmingai panaudotas genetinio imunodeficito gydymui,
dviems pacientams netikėtai buvo diagnozuotos leukemijos.
Svarbu pabrėžti, kad kartais sunkias ligas sukelia ne tik genų mutacijos, bet ir per didelė genų raiška.
Taip nutinka kai kurių onkologinių ligų metu. Didelė ląstelės ciklo reguliacijai svarbių genų raiška
lemia ląstelių supiktybėjimą – nevaldomą jų dalijimąsi. Tokiu atveju būtų naudinga atrankiai
sumažinti organizmui kenkiančio geno raišką. Tai galima padaryti pritaikius RNR nutildymo
metodus. Jeigu į ląstelę įterpsime į miRNR panašią nedidelę dvigrandinę RNR (kurios seka būtų
komplementari geno, kurio raišką norima slopinti, iRNR), galima tikėtis, kad ląstelės molekulinė
nukleazių Dicer ir RISC sistema nutildys geną (8 sk.).
Maždaug prieš 10 metų buvo pradėti pirmieji mėginimai šį metodą taikyti žmogaus imunodeficitą
sukeliančio viruso (ŽIV) infekcijos (2010 m. ja sirgo ~ 34 milijonai planetos gyventojų) gydymui.
Žinoma, kad ŽIV infekuoja T limfocitus, turinčius paviršiuje baltymą, vadinamą CD4. Patekęs į T
limfocitą, virusas dauginasi ir nužudo šias imuninės sistemos ląsteles. Todėl žmogus nebetenka
galimybės apsisaugoti nuo įvairių kitų infekcijų sukėlėjų. ŽIV infekcijos gydymui buvo naudojama
tokia strategija: į retrovirusinį klonavimo vektorių buvo įterpta DNR seka, komplementari (kitaip dar
vadinama priešprasminė) ŽIV viruso RNR. Šiuo konstruktu ex vivo buvo transformuoti pacientų,
sergančių imunodeficito sindromu, T limfocitai (10.18 pav.). Modifikuoti limfocitai injekuoti atgal
pacientams. Tikėtasi, kad ŽIV virusui infekavus limfocitą, sintetinantį priešprasminę dvigrandinę
RNR, pastaroji prisijungs prie viruso RNR ir bus aktyvuotos Dicer ir RISC nukleazės,
hidrolizuojančios RNR. Tokiu būdu, bus slopinamas viruso dauginimasis, o limfocitas galės atlikti
savo normalias funkcijas. Daug mokslininkų grupių įvairiose šalyse atlieka klinikinius bandymus ir
tikisi šiuo metodu pagerinti ŽIV infekuotų pacientų terapiją. Nors modifikuotų limfocitų injekcijas
reikia periodiškai kartoti, džiaugiamasi, kad tai padeda stabilizuoti pacientų T limfocitų kiekį.

10.18 pav. ŽIV inekcijos gydymas RNR nutildymo metodu

Manoma, kad šiuo metu RNR nutildymo technologijos yra geriausias būdas genų, kurių raiška yra
per didelė, slopinimui. Artimiausiais metais tikimasi sulaukti teigiamų rezultatų.
Genų terapija kol kas neatskleidė viso savo potencialo, tačiau neabejojama didžiulėmis jos
galimybėmis. Bandoma ieškoti veiksmingesnių ir saugesnių DNR įterpimo į ląsteles būdų, siekiama
išvengti virusinių klonavimo vektorių šalutinių efektų.

10.4 Biofarmacijos pramonė ir farmacinių preparatų kūrimas moderniosios biotechnologijos

metodais
Žmonės gyvuosius organizmus – gyvūnus ir augalus – nuo seno naudoja savo poreikiams: maisto,
aprangos, statybinių medžiagų, dažų, kitų cheminių junginių (ir vaistų) gamybai. Iki 1980 metų
naujos mikrobų, augalų ir gyvūnų veislės buvo gaunamos tik dirbtinės selekcijos metodais.
Rekombinantinės DNR technologijos sukėlė revoliuciją šioje srityje. Įterpus rekombinantinę DNR į
mikrobus, augalus, gyvūnus (ar pakeitus jų genomo sekas), galima sukurti visiškai naujas veisles,
kurios sintetins žmogui naudingus junginius. Tokie junginiai vadinami rekombinantiniais.
Pirmasis tokio pritaikymo pavyzdys buvo rekombinantinio insulino gamyba (1977 m.) – žmogaus
insulino geno įterpimas į E. coli ląsteles. Nuo to laiko daugiau kaip 100 žmogaus baltymų, naudingų
klinikinei terapijai, sintetinama bakterijose, mielėse, augalų ar gyvūnų ląstelių kultūrose,
transgeniniuose augaluose ar gyvūnuose (kai kurie pavyzdžiai pateikti 10.3 lentelėje). Sintetinti
galima ne tik rekombinantinius baltymus. Įterpus genus, kurių produktai (pvz. fermentai) pakeičia
ląstelės metabolinių kelių biocheminius procesus, ląstelė sintetina naujus junginius: biologiškai
aktyvias chemines medžiagas, vitaminus.

Produktas Sintetinančios ląstelės ar Terapija

organizmas
gyvūnų ląstelių kultūros,
VIII veiksnys hemofilija A
transgeninė avis
gyvūnų ląstelių kultūros,
IX veiksnys hemofilija B
transgeninė pelė, avis
gyvūnų ląstelių kultūros,
Audinių plazminogeno aktyvatorius miokardo infarktas
E. coli
Hirudinas S. cerevisiae trombozė
Insulinas S. cerevisiae, E. coli diabetas
E. coli, transgeninė pelė,
Žmogaus augimo veiksnys (hGF) hGF stoka
transgeninis tabakas
Folikulus stimuliuojantis hormonas gyvūnų ląstelių kultūros nevaisingumas
Skydliaukės hormonas teripatatidas E. coli osteoporozė
Tirogenas gyvūnų ląstelių kultūros skydliaukės vėžys
Liutropinas α gyvūnų ląstelių kultūros nevaisingumas
gyvūnų ląstelių kultūros,
Eritropoetinas anemija
transgeninė pelė, triušis
Granuliocitus ir makrofagus
E. coli neutropenija
stimuliuojantis veiksnys
Interferonas α E. coli, transgeniniai ryžiai hepatitas B ir C
gyvūnų ląstelių kultūros, E.
Interferonas β išsėtinė sklerozė
coli
Interleukino-1 receptoriaus reumatoidinis
E. coli
antagonistas artritas
Proleukinas E. coli inkstų karcinoma
α1 antitripsinas transgeninė pelė, avis α1 antitripsino stoka
kraujo krešėjimo
Antitrombinas transgeninė ožka
mažinimas
Cistinės fibrozės laidumo
transgeninė pelė cistinė fibrozė
reguliatorius
transgeninė pelė, transgenis kepenų cirozė,
Žmogaus serumo albuminas
tabakas ir bulvė nudegimai
Antikūnai transgeninis tabakas įvairi

10.3 lentelė. Kai kurie žmogaus rekombinantiniai biofarmaciniai baltymai

Biofarmacijai svarbių baltymų sintezė

Paprastų rekombinantinių baltymų sintezei dažnai naudojamos E. coli ar S. cerevisiae ląstelės. Tačiau
šiose ląstelėse nevyksta baltymų glikozilinimas. Todėl glikozilintų baltymų sintezei naudojamos
žinduolių (žiurkėno, pelių, žmogaus) ląstelių kultūros. 1982 metais buvo sukurta pirmoji transgeninė
pelytė, kuri sintetino žmogaus augimo hormoną. Nuo to laiko buvo sukurta ~ 100 transgeninių
gyvūnų, kurių ląstelės rekombinantinius baltymus (α1 antitripsiną, β interferoną, eritropoetiną,
cistinės fibrozės laidumo reguliatorių) sekretavo į organizmo skysčius, dažniausiai – į pieną. Tam
baltymų genas buvo klonuojamas už pieno liaukose aktyvaus promotoriaus, sukurtas konstruktas
panaudojamas transgeninio gyvūno (pelės, avies, ožkos ar triušio) kūrimui.
Vienas sėkmingiausių transgeninių gyvūnų buvo avytė Treisė (1990-1997), kurios piene buvo
sekretuojamas α1 antitripsinas (30g/l). Šis pienas buvo naudojamas minėto baltymo stokojančių
pacientų gydymui. Iki šiol praktiškai naudojamas iš transgeninės ožkos pieno gryninamas
rekombinantinis antitrombinas, naudojamas kraujo krešėjimui mažinti. Ateityje tikimasi sukurti
veiksmingas rekombinantinių baltymų sekrecijos vištų kiaušiniuose ir šilkverpių lervų kokonuose
technologijas.
Kita rekombinantinių baltymų produkcijos alternatyva yra augalai. Pirmi bandymai pavyko jau 1990
metais, kai buvo sukurti transgeniniai augalai, sintetinantys žmogaus kraujo serumo albuminą.
Tyrimų pradžioje dažniau buvo naudojamas tabakas – DNR įterpimo technologijos į šį augalą buvo
labiau išvystytos. Tačiau pamažu siekiama pereiti prie kitų rūšių: javų, vaisių, daržovių, nes šie
augalai gali būti tiesiogiai vartojami maistui. Plėtojami transgeninių augalų, sintetinančių žmogaus
antikūnus, kūrimo metodai. Į šių augalų genomą yra įterpiami žmogaus imunoglobulinų genai.
Suvalgius augalą, turintį antikūnų prieš tam tikrą patogeną, yra aktyvinamas pasyvusis imuniškumas.
Šis apsaugos būdas funkcionuoja trumpai, tačiau yra tinkamas kai pacientui reikia skubios pagalbos
(įgėlus gyvatei) ar paciento imuninė sistema pati negali produkuoti antikūnų. Neseniai Amerikoje
buvo pradėti iš transgeninio tabako gautų antikūnų prieš bakteriją Streptococcus mutans klinikiniai
bandymai. S. mutans yra dantų ėduonies sukėlėjas, nuo jo kenčia daugybė žmonių. Klinikinių tyrimų
metu nustatyta, kad antikūnų preparatu padengus dantis, antikūnai prisijungia prie bakterijų ir trukdo
joms prisitvirtinti prie dantų. Todėl bakterijos pamažu pašalinamos iš burnos ertmės, nebeprogresuoja
dantų ėduonis.

Metabolinių kelių konstravimas

Kai 1940 m. prasidėjo penicilino iš Penicillium grybų gamyba, antibiotiko išeiga buvo keli µg iš 1
litro užaugintos kultūros. Vaisto poreikis buvo didesnis, nei buvo įmanoma jo gauti. Kadangi nieko
nebuvo žinoma apie penicilinio sintezei svarbius fermentus (ir patį biocheminių reakcijų mechanizmą
grybų ląstelėse), paprasčiausias būdas gauti pajėgesnius antibiotiko producentus buvo mutagenizuoti
Penicillium ląsteles. Po mutagenezės buvo atsirenkami kandidatai, kuriuose dėl įvairių mutacijų
antibiotiko sintezė padidėjo. Mutagenezės–atrankos ciklai buvo kartojami daug kartų – tol, kol
antibiotiko išeiga pasiekė keliasdešimt gramų iš 1 litro užaugintos kultūros.
Šiuolaikinės biotechnologijos metodai leistų šią problemą spęsti kitaip – greitai ir veiksmingai.
Manipuliuojant DNR, galima būtų padidinti penicilino sintezėje dalyvaujančių fermentų raišką:
padidinti iRNR transkripciją (įterpti priešais genus promotorių sekas, kurias veiksmingai atpažintų
RNR polimerazė), padidinti baltymų sintezės veikmingumą (įterpti į geną sekas, kurias atpažįsta ir
prie kurių baltymo sintezės metu prisijungia ribosomos). Būtų tikslinga padidinti ir baltymų, kurie
yra atsakingi už susintetinto penicilino sekreciją iš ląstelės į aplinką, raišką. Tada šis junginys būtų
greičiau pašalintas iš ląstelės.
Vitamino A pirmtako β-karoteno sintezė ryžiuose yra puikus realaus metabolinio kelio konstravimo
pavyzdys. Vitaminas A yra reikalingas visoms žmogaus organizmo ląstelėms (ypač epitelio, skatina
keratinocitų augimą), tačiau ypatingai reikšmingas regėjimui – jis įeina į regėjimo pigmento opsino
sudėtį. Vitamino A trūkumas sukelia aklumą. Tai ypatingai dažna problema mažai išsivysčiuosiose
šalyse. Vitamino A žmonės gauna su maistu iš gyvulinės kilmės produktų, tačiau ląstelės gali
vitaminą A susintetinti ir pačios, jei gauna β-karoteno (jo yra daug kai kuriuose vaisiuose ir
daržovėse). Įvairiose grūdinėse kultūrose, kurios sudaro neturtingų šalių gyventojų pagrindinę
raciono dalį, β-karoteno yra mažai.
β-Karotenu turtinguose vaisiuose ir daržovėse, jo sintezę iš dviejų geranilgeranilo fosfato molekulių
katalizuoja fermentai. Javų grūduose yra geranilgeranilo fosfato. Tačiau juose nėra fermentų, būtinų
β-karoteno sintezei. Transgeniniai „auksiniai ryžiai“ buvo sukurti į jų genomą įterpus trūkstamus β-
karoteno sintezes fermentų genus (apie juos skaitykite 10.13 sk.). Manoma, kad šie ryžiai pasaulinėse
rinkose turėtų pasirodyti 2013 m.

10.5. Transgeninių organizmų panaudojimas žmonių ligų tyrimams

Jau buvo aptartas transgeninių organizmų – vakcinų ar biofarmacijoje naudojamų biologiškai aktyvių
medžiagų (terapinių baltymų ir kitų cheminių junginių) producentų panaudojimas. Kita svarbi
transgeninių gyvūnų panaudojimo sritis yra žmogaus ligų modelinių organizmų kūrimas ir jų
panaudojimas ligų patogenezės mechanizmų tyrimams. Dėl galimo realaus pavojaus gyvybei ir
sveikatai, genetikai ir mokslininkai neatlieka mokslinių tyrimų su pacientais. Griežtai reglamentuoti
ir kontroliuojami klinikiniai bandymai su žmonėmis atliekami tik tada, kai žinoma, jog vaistas
nesukels pavojaus žmogui. Tai atliekama tik ištyrus vaisto poveikį in vitro ląstelių kultūrose ir
gyvūnams. Populiariausias modelinis organizmas, naudojamas žmonių genetinių ligų tyrimams, yra
pelė. Žinant konkrečią geno mutaciją, sukeliančią žmogaus ligą, galima sukurti transgeninę pelę,
kurios analogiškame gene būtų įterpta tokia pat mutacija. Tai padaryti nesudėtinga pritaikius
transgeninių pelių kūrimo metodus (jie aptarti 9.7 sk.).
Pirmosios transgeninės pelės ligų modeliai buvo sukurti įvairių vėžio formų tyrimams. Transgeninės
pelės buvo sukurtos DNR injekcijos būdu į lytines ląsteles įterpus dominuojančius onkogenus
(„knock in“ transgenai). Vėliau sukurtos kitų dominuojančių genetinių ligų transgeninės pelės:
Alzhaimerio ir Hantingtono ligos (10.19 pav.), Vernerio sindromo tyrimams.
 10.19 pav. Hantingtono ligos modelis – transgeninės pelytės. Hantingtono liga – paveldimas
neurodegeneracinis sutrikimas. Jos metu sintetinamas mutantinis baltymas hantingtinas, skatinantis
neuronų degeneraciją. Dėl to prasideda demencija, raumenų koordinacijos sutrikimai,
silpnėja pažinimas.

Recesyvinių genetinių ligų tyrimams (jų metu genas dažniausiai yra mutuotas) kuriami pelių „knock-
out“ mutantai. Pirmasis tokio tipo modelis buvo hipoksantino–guanino fosforiboziltransferazės
mutantas HPRT nepakankamumui tirti. Vėliau sukurti kiti modeliai: cistinės fibrozės, Martino–Belo
sindromo, talasemijos, mitochondrinės kardiopatijos, įvairių vėžio formų, išsivystančių dėl genų
inaktyvacijos, tyrimui. Yra sukurti peliukai, turintys žmogaus chromosomų pakitimams analogiškus
pakeitimus – žmogaus 21 chromosomos genų analogų trisomija peliukuose (Dauno sindromo
modeliuose).

10.6. DNR tyrimo metodų panaudojimas teismo medicinoje

Įvairių gyvenimiškų situacijų sprendimui, teismo medicinoje dažnai iškyla tikslaus žmogaus
identifikavimo (tiriant įkalčius, identifikuojant nusikaltimų ar katastrofų aukas) ar giminystės ryšių
(dažniausiai – tėvystės) nustatymo problema. Asmenų tapatybės nustatymui praktikoje taikomi DNR
tyrimai.
Didelė žmogaus genomo dalis nekoduoja genų. Šiose nekoduojančiose srityse yra įvairaus ilgio sekų
pasikartojimai. Pasikartojančios sekos eina viena paskui kitą be intarpų, todėl vadinamos
tandeminėmis. Tapatybės nustatyme pasitarnauja genomo trumpų (iki 10 bp) pasikartojančių sekų
(angl. short terminal repeats, STR) analizė. Nėra žinoma šių pasikartojančių sekų reikšmė. Nustatyta,
kad STR paplitę visose chromosomose, dėl pasikartojimų kiekio jų ilgis varijuoja tarp individų
(matyt, taip nutinka dėl DNR polimerazės „praslydimo“ DNR sintezės metu).
Kaip STR analizė pritaikoma tapatybės individualizavimui? PGR metodu padauginamos
homologinių chromosomų STR sritys. Parenkami pradmenys, savitai „limpantys“ prie DNR sekų,
supančių trumpas pasikartojančias sekas. Homologinių chromosomų porą vaikai paveldi iš tėvų –
vieną chromosomą iš tėvo, vieną iš motinos. PGR reakcijos produktai išfrakcionuojami
elektroforezės metodu ir analizuojami. Pagal tai, kiek yra bendrų PGR produktų tarp tėvų ir vaikų,
sprendžiama apie individų genetinį panašumą. 10.20 pav. pateiktas tėvystės nustatymo pavyzdys.
Palyginkite šeimos ir pusbrolio DNR analizės rezultatus. Kuo daugiau STR sričių (dar vadinamų
lokusais) išanalizuojama, tuo tikslesni yra tyrimai.
 10.20 pav. Trumpų pasikartojančių sekų analizė tėvystės nustatymui
Genetiniai STR tyrimai teismo medicinoje anksčiausiai buvo pradėti Didžiojoje Britanijoje.
Paradoksalu, tačiau 1986 m. remiantis pirmojo tyrimo rezultatais įtariamasis buvo ne apkaltintas
nusikalstama veika, o išteisintas. 1995 metais buvo įkurta Didžiosios Britanijos Nacionalinė DNR
duomenų bazė, 1998 – CODIS duomenų bazė (JAV), kurioje šiuo metu sukaupta daugiau nei 6
milijonai DNR STR analizės rezultatų. Iki 2005 m., remiantis nuteistųjų ir įkalčių DNR STR analizės
rezultatais, JAV kaltinamasis nuosprendis buvo panaikintas ir į laisvę buvo išleisti 164 asmenys,
neteisingai apkaltinti nusikalstamos veikos įvykdymu. 1994 m. buvo tiriami 4 STR lokusai. Šiuo metu
Europoje ir JAV tiriama ~ 15 STR lokusų (10.21 pav.). Jų skaičių planuojama dar padidinti (JAV iki
20-ies).
 10.21 pav. Chromosomų STR lokusai, naudojami tyrimams teismo medicinoje
STR analizei naudojami komerciniai rinkiniai su fluorescuojančiomis žymėmis pažymėtais PGR
pradmenimis. Tyrimo procedūra yra panaši, kaip anksčiau aprašytas kiekybinis fluorescencinis PGR
metodas Dauno sindromo nustatymui (10.1 sk.). Atliekama PGR produktų kapiliarinė elektroforezė
ir kompiuterinė duomenų analizė. 10.22 pav. pateikti kraujo pėdsakų iš nusikaltimo vietos STR
analizės rezultatai (kitaip – profiliai), gauti panaudojus komercinės kompanijos Applied Biosystems
AmpFlSTR rinkinį. Naudojant šį rinkinį, yra padauginama 10 lokusų. Lyginant aukos kraujo ir kraujo
pėdsakų nuo mašinos bagažinės durelių mėginių STR lokusų analizės profilius, paaiškėjo, kad
daugumos lokusų produktų ilgiai yra skirtingi. Vadinasi, DNR tiramuosiuose mėginiuose yra ne to
paties asmens. Ant mašinos bagažinės durelių kraujas yra ne aukos, o kito asmens, galbūt,
nusikaltėlio. Tikimybė, kad skirtingi mėginiai (tiriant šiuo metodu) atsitiktinai sutaps, yra 1 iš 10 12.
Tačiau žinoma faktų, liudijančių atsitiktinį sutapimą. Didžiojoje Britanijoje (1999 m.) ir JAV (2008
m.) DNR, rastos ant įkalčių ir su nusikaltimu nesusijusių žmonių, STR profiliai sutapo. Taip nutiko,
kadangi išvados buvo padarytos remiantis tik 6 STR lokusų analize.
STR tyrimai daug pasitarnauja ir kitose srityse – paleontologijos tyrinėjimuose, tiriant pirmykščių
genčių giminystės ryšius ir migracijos žemynuose kryptis, rūšių evoliuciją.
 10.22 pav. Kraujo mėginių DNR STR analizė teismo medicinoje

10.7. Aplinkos priežiūra ir biotechnologijos

Biotechnologija vadinama taikomoji mokslo sritis, pagrįsta gamtos ir inžinerinių mokslų pasiekimais,
leidžiančiais pritaikyti gyvus organizmus, jų dalis, ląsteles (ar ląstelių molekulinius kelius) gamyboje
ar kituose procesuose. Biotechnologija yra labai dinamiška ir lanksti sritis, todėl jos pasiekimai tapo
svarbūs gyvas sistemas naudojančių taikomųjų šakų (žemės ūkio, maisto pramonės, medicinos,
aplinkos apsaugos, išteklių saugojimo) vystymuisi (10.23 pav.).

10.23 pav. Biotechnologijos pritaikymas įvairiose žmogaus veiklos srityse

Intensyviai vystantis pramonei, daugelis šalių neišvengiamai susidūrė su aplinkos apsaugos
problemomis. Joms spręsti buvo būtina įstatymiškai nustatyti taršos standartus ir reikalavimus taršos
kontrolei gerinti. Kaip atsakas į sparčią industrializacijos bei urbanizacijos keliamą taršą ir gamtos
išteklių naudojimą, apie 1980 m. pradėjo intensyviai plėtotis aplinkos biotechnologijų kryptis. Ši
kryptis dažnai vadinama „baltąja“ biotechnologija. Ji apibrėžiama kaip biotechnologijos taikymas
pramonėje ir aplinkosaugoje. Aplinkos biotechnologijos nėra išskirtinai naujausiųjų laikų pasiekimas.
Nemažai šios srities metodų buvo naudojami gerokai anksčiau – tai kompostavimas, nuotekų valymas
ir kt. Ankstyvuoju vystymosi periodu, aplinkos biotechnologijos buvo paremtos chemine inžinerija.
Tačiau vystantis gyvybės mokslams, ypač svarbus vaidmuo teko biochemijos, mikrobiologijos,
molekulinės biologijos pasiekimams bei metodams.

Žmogaus veikla ir vis didesni vartojimo mastai lemia nuolat augančią oro (CO, CO2, NOx, SO2,
halogeninių elementų junginiai, kietosios dalelės), vandens (cheminė, biologinė tarša, naftos ir jos
produktų nuotėkiai), dirvožemio (pavojingų atliekų laidojimas, pesticidų naudojimas) taršą,
vienkartinių ir sunkiai biodegraduojančių gaminių naudojimą. Mokslinės studijos ir tyrimai parodė,
kad kai kurie iš paminėtų teršalų gali būti nesunkiai ir saugiai utilizuojami panaudojus
biotechnologines priemones – mikroorganizmus, augalus ir gyvūnus. Veikiant prognozuojamiems
biotiniams ar abiotiniams veiksniams, teršalai nukenksminami trimis būdais (10.24 pav.):

 Mineralizacija;
 Transformacija;
 Imobilizacija

10.24 pav. Aplinkos taršos šaltiniai ir taršą šalinantys veiksniai

Išskiriamos bent keturios pagrindinės aplinkos biotechnologijos kryptys (10.25 pav.):

 Išmetamų į aplinką teršalų nustatymas (panaudojant biosensorius ir biomonitoringą);

 Taršos prevencija gamybos procesuose (gamybos procesų ar atskirų jų žingsnių technologijas

keičiant modernia biotechnologija paremtą maisto, tekstilės, farmacinių preparatų gamybą);

 Taršos kontrolė;
  Remediacija (užterštų zonų valymas).

10.25 pav. Pagrindinės aplinkos biotechnologijos interesų kryptys ir jų tarpusavio sąsajos

10.8. Mikroorganizmų panaudojimas mažinant aplinkos taršą ir nustatant teršalus

Laikoma, kad visos gyvybės formos gali pasitarnauti aplinkos biotechnologijai. Tačiau didžiausio
susidomėjimo sulaukė mikroorganizmai ir kai kurie augalai. Bendras terminas „mikroorganizmai“
apima prokariotus (bakterijas, archėjas) ir dalį eukariotų domeno (mielės, mikroskopiniai grybai,
pirmuonys, verpetės).

Mikroorganizmai, būdami gausiausia Žemės gyvų organizmų grupė, yra aptinkami net ir
atšiauriausiose gyvybės egzistavimui vietose. Tačiau (kaip ir visos kitos gyvybės formos) jie
neišvengiamai susiduria su nuolat į aplinką išmetamais naujais sintetiniais ksenobiotiniais junginiais.
Mikroorganizmai (ypač bakterijos) labai greitai kolonizuoja užterštas teritorijas. Mikroorganizmai
dėl greitos evoliucijos įgijo milžinišką atsparumo bei metabolinį potencialą. Tai leidžia jiems
išgyventi ir klestėti toksiškoje aplinkoje (nuolat esant esant agresyvių ksenobiotikų). Šis didžiulis
mikroorganizmų katalitinis potencialas buvo pagrindinė priežastis, lėmusi platų jų pritaikymą
bioremediacijos (užterštos aplinkos valymo) srityje.

Mikroorganizmai gali gyvuoti ir kaip pavienės ląstelės, ir grupėmis (kaip mišrios bendrijos). Tokių
bendrijų tyrimai ypač aktualūs aplinkos biotechnologijų sritims, kaip aktyvus biologinis nuotekų
valymas. Jo efektyvumas labai priklauso nuo aktyviojo dumblo. Aktyvųjį dumblą sudaro mišri
mikroorganizmų bendrija ir nuotekų dalelės. Gyvų organizmų panaudojimas teršalų valymui iš
aplinkos yra pagrįstas jų gebėjimu metabolizuoti aplinkai kenksmingas medžiagas:

 Bakterijos ir mikroskopiniai grybai naudojami sudėtingos struktūros molekulių degradacijai iki

(visiškai ar santykinai) netoksiškų produktų. Grybai geba skaidyti tokias organines molekules,
kurių kiti organizmai dažniausiai neįveikia.

 Dumbliai ir augalai dažniausiai naudojami mineralinėms medžiagoms (tokioms, kaip azotas,

fosforas, siera) bei metalų jonams absorbuoti iš aplinkos.
  Pirmuonys toleruoja dešimtis ir šimtus kartų didesnes sunkiųjų metalų jonų (Cd2+, Cr6+, Cu2+,
Hg2+, Pb2+) koncentracijas nei bakterijos, todėl yra potencialūs šių metalų nukenksminimo
mechanizmų tyrimų objektai.

Bioremediacijos technologijose naudojami aerobiniai ir anaerobiniai mikroorganizmai. Siekiant gauti

kuo didesnę remediacijai tinkamų mikroorganizmų įvairovę, naudojami tradiciniai bei modernūs
metodai. Tai – mikroorganizmų izoliatų gavimas iš natūralių konglomeratų, mutagenų panaudojimas
(siekiant gauti mutantus), genų inžinerijos būdu konstruojami genetiškai pakeisti mikroorganizmai ir
kt. Šiais metodais kuriami mikroorganizmai, gebantys metabolizuoti naujus sunkiai degraduojamus
teršalus. Be to, gerinamas mikroorganizmų išgyvenamumas, gebėjimas kolonizuoti užterštas zonas ir
stiprinamas jau turimas ksenobiotikų degradavimo aktyvumas.

Mikroorganizmų pritaikymas bioremediacijos procesuose yra labai platus. Jų panaudojimu pagrįsti

biologinio vandens valymo procesai (aktyvusis dumblas), teršalų valymas iš natūralių ir dirbtinių
vandens telkinių (lagūnų, tvenkinių, pelkių), metalų (tokių, kaip auksas) išgavimas iš rūdų, biodujų
reaktoriai, biofiltrai. 10.4 lentelėje pateikta glausta konkrečių mikroorganizmų panaudojimo
bioremediacijai apžvalga.

Vienas geriausių mikroorganizmų panaudojimo ksenobiotikų bioremediacijai pavyzdžių – bakterijų

atliekamas pesticidų skaidymas. Šiuolaikinis žemės ūkis neįsivaizduojamas be pesticidų. Iš jų
plačiausiai naudojami įvairūs morfolino (fungicidai), parationo ir kitų organinių fosfatų (insekticidai)
bei benzimidazolo (fungicidai) dariniai. Jie skirti pagerinti žemės ūkio kultūrų produktyvumui.
Tačiau šie junginiai prisideda ir prie bendro aplinkos užterštumo didėjimo – dažniausiai sunkiai
biodegraduoja. Taršos kontrolės strategijos, naudojančios fizikocheminius metodus, neretai dar
labiau apsunkina šios problemos sprendimą dėl ribotų panaudojimo galimybių. Dėl šios priežasties,
mikroorganizmai, gebantys skaidyti ksenobiotikus, dažus bei plastikus, bioremediacijos procesuose
tapo nepakeičiami. Tokie mikroorganizmai sukurti taikant rekombinantines DNR technologijas
(sukurti metaboliniai keliai) arba atrankos būdu.

Vienas didžiausių mikroorganizmų panaudojimo pranašumų yra plataus spektro pesticidų ir kitų
ksenobiotikų degradacijos in situ (pvz. dirvožemyje) galimybė. Gausūs tyrimai ir studijos parodė, kad
dirvožemyje paskleisti specialiai paruošti mikroorganizmai geba visiškai suskaidyti jame esančius
insekticidus, herbicidus ir fungicidus. Geriausiai ištirti ir dirvožemyje esančių pesticidų
bioremediacijai naudojami mikroorganizmai yra bakterijų Pseudomonas sp. A3, P. putida, P.
aeruginosa, Serratia marinorubra izoliatai. Izoliatai naudojami gryni arba mišiniuose su kitais
mikroorganizmais. Šie bakterijų variantai taip pat gali būti naudojami ir pesticidais užterštų
nutekamųjų vandenų valymui. Kitas bakterijų pritaikymo bioremediacijai pavyzdys – genetiškai
modifikuoto atspariausio radiacijai žinomo organizmo (bakterijos Deinococcus radiodurans)
panaudojimas toluenui ir gyvsidabrio jonams šalinti iš stipriai radioaktyvių branduolinių reaktorių
atliekų.
 Mikro-
Tipas Forma Pavyzdys Panaudojimo galimybės
organizmai
Skaido angliavandenius, sunkiąją alyvą, pieno pramonės
Kokai Sferos pavidalo Streptococcus atliekas
Skaido sunkiąją alyvą, valo chlorpirifosu (insekticidas)
Lazdelės pavidalo Bacillus subtilis užterštus dirvožemius
Bacilos Vibrio cholera
Spiralės pavidalo Sunkiųjų metalų bioremediacija
Spirillum volutans
Kapsulę turinčios Sphaeratilus
Filamentų pavidalo Oksiduoja geležį į geležies oksidus (Sphaeratilus nutans,
bakterijos Leptothrix Crenothrix) bei manganą į mangano oksidų (Leptothrix).
(gelžbakterės) (Gram-neigiamos)
Crenothrix
Kai kurios
Turi žiuželius Caulobacter Aptinkama nedaug organinių medžiagų turinčiame vandenyje
proteobakterijos

Bakterijos Gallionella
G. ferruginea aptinkama Fe turtinguose vandenyse; oksiduoja
Fe2+ į Fe3+. Gali gyventi vandens tiekimo sistemose

Gyvena dirvoje ir vandenyje, reikalingas vieną C atomą

Pumpuruojančios Filamentų ar hifų Hyphomicrobium turintis anglies šaltinis (pvz., metanolis)
bakterijos pavidalo

Rhodomicrobium Fototrofinis mikroorganizmas

Šliaužti gebančios Filamentų pavidalo Oksiduoja sulfidus
Beggiatoa, Thiothrix (H2S → S0)
bakterijos (Gram-neigiamos)
Turi žiuželį Obligatiniai aerobai, parazituoja kitų gramneigiamų bakterijų,
Bdellovibrio sp. B. bacteriovorus gyvenančių dirvoje ar vandenyje, periplazminėje ertmėje
Gram-neigiamos)
Įvairių bakterijoms
Crenarchaeota Įvairūs (hiper-)termofilai,
būdingų formų,
Archėjos Euryarchaeota
pasitaiko nebūdingos
psichrofilai, acidofilai, Prokariotiniai organotrofai, chemoautotrofai
Korarchaeota alkalifilai, halofilai
formos (keturkampio)
 Phycomycetes („vandens
Gyvena ant sausumos ir vandens augalų ir gyvūnų
pelėsiai“)
Aukšliagrybiai –
Ascomycota (pvz., Kai kurių rūšių mielės yra nepakeičiamos maisto pramonėje
Neurospora crassa, (vyno, alaus, kepinių gamyba) bei heterologinių baltymų
Neseptuotų hifų, Saccharomyces sintezėje.
Grybai formuojančių micelį, cerevisiae)
pavidalo Papėdgrybiai –
Svarbūs medienos skaidymui, nes geba skaidyti celiuliozę ir
Basidiomycota (Pvz. ligniną.
Agaricus, Amanita)
Grybšiai – Fungi
imperfecti (Pvz. Gali sukelti augalų ligas
Penicillium, Aspergillus)
Eukariotai Chlorophyta
(žaliadumbliai),
Plaukiojantys arba
Chrysophyta
prisitvirtinę Vieni svarbiausių vandens ekosistemų pirminių gamintojų,
(auksadumbliai),
vienaląsčiai, tinkami nuotekų tvenkiniams valyti. Kai kurie minta
Dumbliai Euglenophyta,
daugialąsčiai, siūlų ar heterotrofiškai, panaudodami egzogeninės kilmės organines
Pyrrophyta, Rhodophyta medžiagas.
kaspino pavidalo, gali
(raudondumbliai),
būti kolonijiniai
Phaeophyta
(rudadumbliai)
Sarcodina (sarkodiniai),
Mastigophora Svarbūs visuomenės sveikatos požiūriu, taip pat nutekamųjų
Vienaląsčiai vandenų valymo procesuose. Dauguma atsparūs išdžiūvimui,
Pirmuonys (žiuželiniai), Ciliophora badui, aukštai temperatūrai, deguonies stygiui bei
mikroorganizmai
(blakstienotieji), dezinfekcinėms priemonėms, esančioms nuotekų vandenyje.
Sporozoa (sporagyviai)
Spiralės, briaunainiai,
Nei prokariotai, nei Augalų, gyvūnų,
Virusai su lipidiniu voku ar be Kai kurie iš jų yra taršos indikatoriai
eukariotai bakterijų virusai
jo, sudėtiniai (fagai)

10.4 lentelė. Mikroorganizmų, kuriuos galima panaudoti bioremediacijai, apžvalga

Ne mažiau svarbi problema yra pats taršos nustatymas (detekcija). Taršos nustatymui ir ilgalaikiui
jos stebėjimui jau seniai panaudojami biologiniai metodai. Tai – tam tikrų augalų, gyvūnų ir
mikroorganizmų rūšių spektro vertinimas, indikatorinių rūšių individų skaičiavimas, deguonies,
metano ar kitų indikatorinių komponentų kiekio nustatymas vandenyje. Greta šių taršos nustatymo
būdų vis labiau įsigali biojutikliais (biosensoriais) pagrįsti metodai.

Biojutikliais vadinami biofizikiniai prietaisai, gebantys aptikti tam tikrą medžiagą – įvairius cukrus,
baltymus, hormonus, teršalus ar aplinkos toksinus. Techniškai biojutikliai apibrėžiami kaip analitiniai
prietaisai, turintys įtvirtintą biologinį komponentą

Biosensorinės sistemos susideda iš biologinės ir elektroninės dalių, kurios dažniausiai būna kartu
patalpintos ant mikrolusto. Biologiniais tokių sistemų komponentais gali būti fermentai, antikūnai,
nukleorūgštys, membranos, neurosiuntiklių (neuromediatorių) receptoriai, atskiros ląstelių organelės
ar pačios ląstelės. Atitinkamas biologinis komponentas biojutiklyje įtvirtinamas (imobilizuojamas)
tam tikrame substrate. Po sąveikos su jutiklio atpažįstama medžiaga atsiradęs biologinės sistemos
atsakas yra paverčiamas elektriniu signalu. Signalas sustiprinamas ir išmatuojamas elektronine ar
optine biojutiklio dalimi (10.26 pav.).

10.26 pav. Biojutiklio schematinis vaizdas

Biologinius komponentus biojutiklyje galima įtvirtinti cheminiais arba fiziniais metodais. Chemiškai
ląstelės ar jų dalys gali būti tvirtinamos kovalentiškai prie substrato prijungiant jų funkcines grupes.
Be to, galima kelias funkcines grupes turinčių molekulių tilteliais sujungti gretimai esančių biologinių
komponentų ar ląstelių funkcines grupes. Taip suformuojamas tarpusavyje sujungtų (angl. cross-
linked) ląstelių tinklas. Iš fizikinių ląstelių tvirtinimo prie substrato metodų žinomiausi yra
adsorbcija (fizinis prikibimas dėl joninių, polinių, vandenilinių ar hidrofobinių substrato ir ląstelių
sąveikų) ir ląstelių „įkalinimas“ cheminiuose, biologiniuose geliuose ar polimeruose (alginato,
karagenino, agarozės, kolageno, poliakrilamido geliuose, chitosano, polivinilalkoholio,
polietilenglikolio, poliuretano polimeruose).

Biojutikliais teršalų kiekio kitimas gali būti įvertinamas ne tik kokybiškai, bet ir kiekybiškai. Šio tipo
metodams būdingas ypač didelis tikslumas ir jautrumas. Biojutiklius galima sukonstruoti taip, kad jie
būtų labai atrankūs (selektyvūs) tam tikrai medžiagai arba priešingai – galėtų aptikti platų spektrą
įvairių komponentų. Pavyzdžiui, plataus spektro herbicidams upių vandenyse nustatyti gali būti
panaudojant dumblių pagrindu pagaminti biojutikliai. Aplinkos sukeliamas stresas organizmams gali
būti įvertinamas kaip augalų chlorofilo optinių savybių pokytis biojutiklyje.
Aplinkos taršos monitoringui pritaikytuose biojutikliuose dažnai naudojami mikroorganizmai, kurie,
esant kontaktui su ieškoma medžiaga, vykdo kokią nors reakciją. Vykdomos reakcijos produktus
galima nustatyti elektronine ar optine biojutiklio dalimi. Dažniausiai tokių reakcijų metu yra
išspinduliuojama šviesa. Praktikoje naudojami natūraliai aptinkami ir genų inžinerijos būdu
sukonstruoti švytintys (luminescuojantys) mikroorganizmai. Pagal veikimo pobūdį, bakteriniai
biojutikliai gali būti teigiamo arba neigiamo veikimo. Teigiamo veikimo bakteriniuose biojutikliuose
šviesa išspinduliuojama po atitinkamos medžiagos kontakto su bakterijomis. Neigiamo veikimo
biojutikliuose bakterijos šviesą spinduliuoja tik iki tol, kol susiduria su atitinkama medžiaga – ji
sustabdo liuminescencinę reakciją. Pirmuoju atveju biojutiklyje registruojamas šviesos atsiradimas,
antruoju – spinduliavimo slopinimas.

Dažniausiai teigiamo veikimo biojutikliai konstruojami netoksiškų jutiklio bakterijoms medžiagų

nustatymui, o neigiamo veikimo biojutikliais nustatomi pačioms bakterijoms nuodingi junginiai.
Liuminescencija tokiuose jutikliuose mažėja dėl toksinio detektuojamos medžiagos poveikio
bakterijų metabolizmui (10.27 pav.). Jungtinėse Amerikos Valstijose šviesą spinduliuojančios
bakterijos jau sėkmingai naudojamos toksiškų halogenintų aromatinių angliavandenilių
(polichlorinto bifenilo, heksachlorbenzeno) detekcijai lauko sąlygomis.

10.27 pav. Pseudomonas fluorescens bakterijų lux operono bioliuminescencijos priklausomybė nuo
toksinės medžiagos koncentracijos (nuotrauka iš http://www.abdn.ac.uk)

Kai kurių svarbių aplinkos taršos monitoringui ir kontrolei biojutiklių įvairovė apibendrinta žemiau:

 Dujų biojutikliai naudojami aplinkoje nustatyti sieros dioksidui (SO2), metanui (CH4),
anglies dioksidui (CO2). SO2 biojutikliuose naudojamos Thiobacillus bakterijos, metanas
aptinkamas imobilizuotomis Methylomonas bakterijomis, anglies dioksidui nustatyti
naudojamos specialios Pseudomonas linijos.

 Imunojutikliai (dar vadinami imunoelektrodais) naudojami mažoms teršalų

koncentracijoms nustatyti. Pesticidams saviti antikūnai gali nustatyti mažas triazino
junginių (herbicidas), malationo (anksčiau vadinto karbofosu; insekticidas) ar karbamatų
(insekticidas) koncentracijas.

 BOD (angl. biological oxygen demand – biologinis deguonies suvartojimas) biojutikliai –

plačiai naudojami taršai organinėmis medžiagomis nustatyti. Taršos dydis nustatomas
inkubuojant mikroorganizmus 5 paras 1 litre tiriamojo vandens. Tačiau biojutiklyje
naudojant mieles Trichosporon cutaneum, tarša organiniais junginiais nustatoma per 15
min.
  Kitos paskirties biojutikliai – grafito elektrodai su Cyanobacterium ir Synechococcus. Jie
naudojami matuoti teršalų (pvz. herbicidų) sukeltam elektronų pernašos slopinimui
fotosintezės metu. Fenoliui ir jo dariniams nustatyti naudojami biojutikliai su bulvių ar
grybų fermentu fenolio oksidaze. Tuo pačiu principu sukonstruoti ir biojutikliai
polichlorintiems bifenilams ir chlorintiems angliavandeniliams aptikti, o jutikliai su jaučio
eritrocitų acetilcholino esteraze naudojami organinio fosforo komponentams vandenyje
nustatyti.

10.9. Buitinių nuotekų biologinio valymo procesas, biotechnologinis jo patobulinimas

Viena iš neišvengiamų industrializacijos pasekmių buvo didelis kiekis įvairiais teršalais užteršto
vandens. Išskiriami du pagrindiniai nuotekų šaltiniai – žmonių gyvenamosios veiklos sukuriamos
buitinės nuotekos ir gamybos pramonės atliekomis užterštas vanduo. Išsivysčiusiose šalyse
(pavyzdžiui, Jungtinėje Karalystėje) pramonės atliekomis užteršto vandens tūris yra 7 kartus didesnis
nei gyventojų buitinės nuotekos.

Biologinis nuotekų valymas buvo sugalvotas ir pradėtas naudoti XX a. pradžioje. Šiuo metu,
efektyvus biologinis valymas yra vienas svarbiausių etapų nuotekų apdorojimo procese. Paprastai,
biologinio nuotekų valymo baseinuose naudojamos natūraliai gamtoje egzistuojančios bakterijos.
Tačiau naudojamos daug didesnės nei gamtinės bakterijų koncentracijos (valymo įrenginiuose
mikroorganizmų koncentracija siekia 1,8–10 g/l). Valymo įrenginiuose naudojamos bakterijos (kartu
su tam tikrų rūšių pirmuonimis bei kitais mikroorganizmais) dažniausiai apibendrintai vadinamos
aktyviuoju dumblu (angl. activated sludge). Valymo metu aktyviojo dumblo mikroorganizmai
nedidelės molekulinės masės organines molekules panaudoja mitybai, kartu didėja jų biomasė.
Proceso rezultatas – išvalytas vanduo, kuris paprastai yra išleidžiamas į upes ar jūras.

Nepaisant biologinio nuotekų valymo principo paprastumo, vienas didžiausių iššūkių yra šio proceso
kontrolė. Įtakos valymo efektyvumui turi daug veiksnių. Svarbiausi – valymo baseine nuolatos
kintanti mikrofloros sudėtis, besikeičianti įtekančių nuotekų sudėtis. Įtekančios nuotekos gali skirtis
savo chemine sudėtimi, pH, temperatūra bei tėkmės greičiu. Be to, buitinių atliekų apdorojimo
baseinai liūčių metu gali stipriai patvinti. Pramoninių nuotekų apdorojimo baseinuose didelę įtaką
daro neirios cheminės medžiagos. Jas mikroorganizmai skaido ypač lėtai. Be to, nuodingos
medžiagos gali slopinti aktyviojo dumblo bakterijų gyvybinę veiklą (arba jas iš viso nužudyti). Tokiu
atveju, vanduo iš valymo baseinų tekėtų neišvalytas, kol nebūtų atnaujintas aktyviojo dumblo
mikroorganizmų funkcionavimas.

Iš valymo įrenginių ištekančio išvalyto vandens sudėtį reglamentuoja tarptautinės ir Nacionalinės

aplinkos apsaugos institucijos. Europos Sąjungos pagrindiniai dokumentai, reglamentuojantys
nutekamųjų vandenų valymo principus, yra ES direktyva „Dėl miesto nuotekų valymo" (1991 m.) ir
vėliau priimta Bendroji vandens politikos direktyva (2000 m.). Įvairiais teisės aktais
reglamentuojama taršos prevencija, nustatomos ištirpusių organinių anglies junginių (BOD arba COD
įverčiai), azoto, fosforo ir kitų eutrofikaciją sukeliančių junginių koncentracijų ribos išvalytuose
nutekamuosiuose vandenyse. Taip pat yra reglamentuojamos didžiausios leistinos žinomų toksiškų
cheminių medžiagų koncentracijos. Pastaruoju metu, nutekamuosiuose vandenyse padaugėjus
nežinomų nuodingų medžiagų, Europoje pradėti taikyti įvairūs testai bendram išvalyto vandens
toksiškumui įvertinti. Stebėtina, tačiau tiesioginių toksiškumo įvertinimo testų naudojimas įtekančio
į valymo baseinus nuotekų toksiškumui nustatyti nėra reglamentuotas įstatymais. Kaip minėta, kai
kurios medžiagos gali turėti neigiamos įtakos biologinio valymo baseinuose esančio aktyviojo
dumblo efektyvumui.
Didžiąją dalį teršalų buitinių nuotekų vandenyje sudaro organiniai anglies junginiai. Jie gali būti
ištirpę arba smulkių, netirpių dalelių pavidalo. Apie 60 % šių junginių yra netirpios formos, o
maždaug pusę šio kiekio sudaro dalelės, kurios dėl dydžio gali savaime nusėsti iš suspensijos.
Likusios kietosios dalelės yra 1 nm – 100 μm skersmens, todėl lieka koloidinio būvio ir yra
adsorbuojamos ant aktyvųjį dumblą sudarančių bakterijų dribsnių.

Didžioji organinių medžiagų dalis yra lengvai biodegraduojama vandenyje. Ji sudaryta iš baltymų,
angliavandenių, riebalų bei jų darinių. Vidutinis anglies, azoto ir fosforo (C:N:P) santykis buitiniuose
nutekamuosiuose vandenyse kinta nuo 100:17:5 iki 100:19:6. Toks santykis yra beveik optimalus
aktyviojo dumblo bakterijų augimui. Reikia paminėti, kad gamybos pramonės nutekamieji vandenys
savo teršalų sudėtimi labai įvairuoja. Pavyzdžiui, alaus ir popieriaus gamybos metu susidariusiose
nuotekose beveik nėra azoto ir fosforo junginių. Todėl šių grupių junginių į tokias nuotekas reikia
pridėti specialiai – kad būtų pasiektas optimalus aktyviojo dumblo mikroorganizmų augimas,
užtikrinantis tinkamą vandens išvalymo efektyvumą.

Siekiant kontroliuoti nuotekų baseine vykstančius biologinius procesus, svarbu žinoti organinių
junginių kiekį įtekančiame vandenyje. Egzistuoja trys pagrindinės matavimo metodikos. Pirmasis
metodas, vadinamas Bendrosios organinės anglies (angl. Total Organic Carbon, TOC) nustatymu,
yra analitiškai paprasčiausias. Jo metu išgarinamas vanduo, likęs kietas likutis visiškai oksiduojamas
labai aukštoje temperatūroje ir įvertinamas susidariusio CO2 kiekis. TOC tyrimo silpnoji vieta yra ta,
kad oksidacijos metu į CO2 formą pereina ir stabilūs anglies junginiai, kurie negali būti suskaidomi
biologiškai.

Organinė anglis taip pat gali būti oksiduojama chemiškai. Tyrimo metu, pavyzdys kaitinamas
koncentruotoje sieros rūgštyje su kalio dichromatu, o oksiduotos anglies kiekis nustatomas pagal
reakcijoje dalyvavusį kalio dichromato kiekį. Analizės rezultatas paprastai išreiškiamas deguonies (o
ne anglies) vienetais ir vadinamas cheminiu deguonies suvartojimu (angl. Chemical Oxygen
Demand, COD). Tai yra taip pat analitiškai paprastas metodas. Tačiau, kaip ir TOC analizės metu, į
įvertį patenka ir biologiškai neoksiduojamos anglies junginių formos. Kita vertus, kai kurie
aromatiniai komponentai (tokie, kaip benzenas, toluenas ir kai kurie piridino junginiai), kuriuos gali
skaidyti bakterijos, COD analizės metu yra tik dalinai oksiduojami. Apibendrinant, galima teigti, jog
COD metodas parodo didesnį anglies junginių kiekį nei tas, kuris gali būti realiai suskaidomas
aktyviojo dumblo mikroorganizmų.

Šiuo metu plačiausiai naudojamas 5 dienų biologinio deguonies suvartojimo testas (angl. 5-day
Biological Oxygen Demand, BOD5). BOD5 testo metu tam tikras indas užpildomas reikiamu tiriamų
nutekamųjų vandenų tūriu. Į jį įleidžiamas apibrėžtas paruoštų mikroorganizmų kiekis, matuojamas
tokios sistemos deguonies suvartojimas per 5 dienas. Per šį laiką visi biodegraduojami organiniai
junginiai yra sunaudojami. Vandenyje ištirpusio deguonies kiekis sumažėja, nes dalis deguonies yra
sunaudojama biooksidacijos procesų metu. BOD5, kaip ir COD testo, didžiausias trūkumas yra
biodegraduojamos anglies kiekio išreiškimas deguonies, o ne anglies vienetais. Nepaisant to, šis testas
yra vertingas tiriant išvalyto nuotekų vandens sudėtį prieš jį išleidžiant į natūralius vandens telkinius.
BOD5 metodas nėra tinkamas valymo proceso kontrolei, nes tam būtina žinoti įtekančio nuotekų
vandens sudėtį (o BOD5 testui atlikti reikalingos 5 dienos). Šiuo metu yra sukurta kur kas greitesnė
BOD5 testo atmaina, vadinama BODST (angl. Biological Oxygen Demand Short-term Test), kurioje
panaudoti efektyvesni mikroorganizmai (tarp jų ir mielės), leidžiantys testą atlikti per 30 min. ar
kelias valandas.

BOD5 testo įverčiai visada yra mažesni nei COD testo reikšmės. Taip yra dėl 2 priežasčių:

 Aktyviojo dumblo bakterijos negali skaidyti kai kurių organinių komponentų, kurie sėkmingai
oksiduojami COD analizės metu;
  BOD testo metu dalis anglies junginių yra ne oksiduojami, o įjungiami į naujai atsirandančių
mikroorganizmų biomasę.

BOD5/COD santykis priklauso ir nuo nuotekų sudėties: buitinėms nuotekoms šis santykis yra 0,5 –
0,6. Išvalyto vandens santykis artimas 0,2 reikšmei, nes išvalytame vandenyje lengvai skaidomi
organiniai junginiai jau būna suardyti. Jame lieka tik komponentai, sunkiai skaidomi bakterijų
(vadinami „sunkiuoju BOD“, angl. hard BOD). Jie oksiduojami tik cheminės oksidacijos metu. Taigi,
skirtingi užteršto vandens komponentai skaidomi nevienodu greičiu: mažos molekulinės masės
junginiai pradedami šalinti iš karto (jų skaidymas trunka apie 1–2 valandas) ir vadinami „lengvuoju
BOD“ (angl. soft BOD). Didesnės molekulinės masės ir kompleksiniai junginiai skaidomi kelias paras
(ir ilgiau), todėl gali likti nesuskaidyti (tai vadinama „sunkiuoju BOD“).

Aktyvusis dumblas, esantis nutekamųjų vandenų aeracijos baseinuose, yra sudarytas iš tarpusavyje
bekonkuruojančių mikroorganizmų komplekso. Dominuojantys organizmai šioje ekosistemoje yra
bakterijos – jų aktyviajame dumble priskaičiuojama iki 300 rūšių. Aptinkama tiek autotrofų, tiek ir
heterotrofų. Heterotrofams priklausančios bakterijos aktyviajame dumble dominuoja. Jos minta
išskirtinai organinėmis medžiagomis. Autotrofų rūšių yra santykinai nedaug. Be to, šios grupės
bakterijos dauginasi lėčiau nei heterotrofinės, todėl jų kiekis aktyviajame dumble yra nedidelis. Tarp
aktyviojo dumblo autotrofų vienos svarbiausių yra chemoautotrofinės nitrifikuojančios bakterijos,
šalinančios iš nutekamųjų vandenų NH4+ (amonio) jonus.

Didžioji dalis mikroorganizmų tinkamai aeruojamuose nutekamųjų vandenų biologinio valymo

baseinuose yra susitelkę į dribsnių pavidalo granules (10.28 pav.), nors dalis jų visada laisvai
plaukioja valomame vandenyje. Tokie bakterijų dribsniai (agregatai) yra sudaryti negyvų organinių
polimerų. Manoma, kad polimerai yra juose gyvenančių mikroorganizmų sekrecijos produktai. Šie
mikroorganizmų dribsniai yra porėtos struktūros ir pakankamai mechaniškai atsparūs, kad nesuirtų
dėl nuolat vykstančio vandens judėjimo aeracijos baseinuose. Tokių agregatų dydis svyruoja nuo 10
μm iki 1 mm.

10.28 pav. Aktyviojo dumblo bakterijų agregatas. Ruda spalva rodo tankiausiai mikroorganizmų
apgyvendintas zonas. „Dribsnio“ kraštuose matyti filamentinės bakterijos (Ray Kenny nuotrauka)

Bakterijos būna išsidėsčiusios tiek agregato išoriniame, tiek vidiniuose paviršiuose. Vidutinio dydžio
aktyviojo dumblo agregate būna susitelkę po kelis milijonus bakterijų. Vidinėje bakterijų „dribsnio“
dalyje esančios bakterijos susiduria su aprūpinimo deguonimi problema: efektyviam skaidymui
deguonies koncentracija agregato viduje turi būti ≥6 mg O2/l. Kad ši koncentracija būtų užtikrinama
didelio agregato viduje, aplinkiniame vandenyje turi būti palaikoma bent 1,2–2,0 mg O2/l deguonies
koncentracija. O2 koncentracijai aeracijos baseine nukritus žemiau 2,0 mg O2/l, bakterijų agregato
viduje susidaro deguonies stygius. Todėl ši sritis yra kolonizuojama fakultatyvinių anaerobų.
Išorinėje agregato dalyje įsivyrauja aukštesnio trofinio lygmens mikroorganizmai – pirmuonys ir
verpetės, mintantys bakterijomis ir kietosiomis nutekamųjų vandenų dalelėmis.

Kaip ir visose ekosistemose, aktyviajame dumble tarp mikroorganizmų yra dinaminė pusiausvyra.
Todėl dominuojančios bakterijų rūšys gali keistis priklausomai nuo nutekamųjų vandenų sudėties
pokyčių.

Įprastai valymo įrenginiuose nuotekų vanduo valomas keliais etapais:

 Pirmiausiai atliekamas išankstinis nuotekų valymas, kurio metu vanduo teka per grotas
(atrinkimo etapas), sulaikančias stambias šiukšles. Vėliau vanduo dažniausiai leidžiamas per
smėlio ir žvyro gaudyklę, atliekama išankstinė aeracija, kurios metu gali būti pašalinama
dalis riebalų.

 Pirminis (mechaninis) valymas (nuskaidrinimas) paremtas sedimentacijos ir flotacijos

reiškiniais. Šio etapo metu pašalinamos nusėdančios bei išplaukiančios dalelės.

 Antrinis valymas susideda iš kelių žingsnių: jo metu cheminiais ar fizikiniais metodais

(panaudojant koaguliantus – kreidą ar kalkes) sukeliamas likusių kietųjų dalelių sukibimas
bei sedimentacija. Apdorojamos ir iš ankstesnių etapų likusios kietosios medžiagos.

 Biologinio valymo metu, aktyviojo dumblo mikroorganizmai aeracijos baseine (angl.

aerotank) absorbuoja ir suskaido ištirpusias medžiagas. Be to, vyksta vandens pirminis ir
antrinis nuskaidrinimas: pirminio nuskaidrinimo metu aktyviojo dumblo pirmuonys
sunaikina dalį laisvai plaukiojančių bakterijų. Antrinio nuskaidrinimo metu, antriniuose
nusodintuvuose vyksta aktyviojo dumblo granulių atskyrimas nuo išvalyto vandens bei jų
grąžinimas į aeracijos baseiną. Šiuo metu antrinio nusodinimo etapas atliekamas tame
pačiame aeracijos baseine. Pirmą kartą tokia konstrukcija buvo panaudota 1940 m. JAV.

 Dezinfekcijos metu sunaikinami likę patogeniniai organizmai. Gali būti atliekamas vandens
chloravimas, ozonavimas, vanduo leidžiamas per smėlio filtrus su pastovia elektros srove ir
kt.

Aeracijos baseinų aktyviojo dumblo bakterijų granulės savo periferinėje dalyje turi siūliškas išaugas,
sudarytas iš filamentinių bakterijų. Šios filamentinės bakterijos gali išlįsti iš granulės paviršiaus. Jei
toks filamentų augimas yra intensyvus, tarp gretimų granulių gali susiformuoti filamentiniai tilteliai,
apribojantys atskirų granulių nepriklausomą judėjimą (10.29 pav.). Ir atvirkščiai – granulės,
neturinčios filamentinių bakterijų skeleto, dėl aeracijos sukeltos turbulencijos gali subyrėti į
smulkesnius agregatus. Jie kartais susikaupia į sferos pavidalo bakterijų gumulus, negausiai
apgaubtus užląstelinio polimero. Be to, tam tikromis sąlygomis, bakterijų granulės gali iš viso
nesiformuoti – bakterijos plūduriuoja laisvos arba sukibusios į labai smulkius agregatus.

Visi apžvelgti atvejai susiję su valymo sistemų valdymo problemomis:

 Deflokuliacija vadinamas reiškinys, kai bakterijos savaime nesudaro agregatų (arba

agregatams susidaryti trukdo labai intensyvi aeracijos sukelta nuotekų turbulencija). Dėl šios
priežasties iš baseino ištekantis vanduo būna drumstas. Be to, nuolat prarandamos skaidymą
atliekančios bakterijos. Deflokuliacija gali atsirasti dėl netinkamos aeracijos sukelto ištirpusio
deguonies stygiaus arba dėl per didelio nuosėdų kiekio. Abu šie reiškiniai gali vykti vienu
 metu. Taip pat deflokuliaciją gali lemti per mažas pH arba tam tikros nuodingos medžiagos
įtekančių nuotekų vandenyje. Problemos sprendimas – tinkamas aeracijos režimo parinkimas.

 Smulkios ir kompaktiškos bakterijų granulės. Taip nutinka tuomet, kai granulės turi mažai
užląstelinio polimero, laikančio bakterijų populiaciją kartu. Tuomet granulės yra netvirtos ir
augimo metu (dėl aeracijos) skyla į smulkesnius agregatus. Tokie smulkūs agregatai prastai
nusėda aeracijos baseine – kartu su ištekančiu vandeniu prarandama bakterijų biomasė. Tokia
situacija dažniausiai susiklosto dėl ilgo vandens buvimo aeracijos baseine laiko. Pavyzdžiui,
taip gali nutikti didelėse aeracijos sistemose, kuriose aktyvusis dumblas senesnis nei 5–6
dienos. Taip pat smulkios granulės gali susidaryti ir didelio našumo sistemose, apdorojančiose
cheminės ir farmacijos pramonių pagaminamas nuotekas. Jose gausu nuodingų chemikalų,
slopinančių filamentinių bakterijų, sutvirtinančių bakterijų granulę, augimą.

 Putojimas kartais gali būti susijęs su nuotekų vandenyje esančiais sunkiai biodegraduojamais
detergentais. Dėl jų susiformuoja retų putų sluoksnis. Stipresnis putojimas (suformuojantis
storą putų sluoksnį) dažniausiai būna nulemtas kitų priežasčių. Viena iš stipraus putojimo
priežasčių – Nocardia genties grybo hifai, išsiraizgantys nuotekų paviršiuje ir kartu su
putomis suformuojantys stabilų paviršinių putų sluoksnį. Putų gaudyklės dažniausiai būna
neefektyvios dideliam putų tūriui sulaikyti. Kartais situacijai pagerinti yra naudojami
putojimą mažinantys chemikalai ar paviršiaus chloravimas. Dažniausiai putojimo problema
sprendžiama mažinant aktyviojo dumblo amžių. Tai pasiekiama padidinus nuotekų srauto
greitį. Nocardia hifai išplaunami iš sistemos.

10.29 pav. Aktyviojo dumblo bakterijų agregatai, tarpusavyje sukibę filamentinių bakterijų
formuojamais tilteliais (Ray Kenny nuotrauka)

 Perteklinis filamentų formavimasis. Šis reiškinys atsiranda filamentinėms bakterijoms

išaugus iš granulės vidinės dalies į jos paviršių. Taip susiformuoja filamentiniai tilteliai tarp
gretimų granulių. Susiraizgęs filamentų tinklas pradeda veikti kaip filtras, į kurį įsivelia
smulkios nuotekų dalelės, todėl ištekantis vanduo tampa ypač skaidrus. Sukibusios granulės
nusėda prasčiau, o iš jų susiformavęs dumblas būna ne toks kompaktiškas, difuzinis. Šio
reiškinio rezultatas – antrinio nusodinimo metu paviršiuje plaukiojantis aktyvusis dumblas.
Šiuo atveju, kartu su ištekančiu išvalytu vandeniu prarandamos bakterijų granulės.
Filamentinių bakterijų perteklius dažniausiai siejamas su valymo sistemos sąlygų pasikeitimais. Tai
gali būti dumblo kiekio pokyčiai, maisto medžiagų bei deguonies koncentracijos nuotekose
svyravimas. Filamentinėms bakterijoms (palyginus su kitomis granulę formuojančiomis
bakterijomis) būdingas mažesnis BOD ir lėtesnis savitas maksimalus augimo greitis. Tačiau jos
pasižymi didesniu giminingumu substratui. Esant mažesnėms substrato koncentracijoms jos turi
didesnį pranašumą prieš granulę formuojančias bakterijas.

Galimi keli problemos sprendimo būdai – nuotekų tėkmės greičio keitimas, įtekančių nuotekų BOD
keitimas ir suspenduotų kietųjų dalelių koncentracijos keitimas. Pastarasis yra inžineriškai
patogiausias ir pasiekiamas keičiant dumblo kiekį aeracijos baseine.

Idealus BOD:N:P santykis yra 100:5:1. Jei azoto arba fosforo stinga, filamentinės bakterijos
dažniausiai nustelbia granules formuojančias bakterijas. Didelės angliavandenių koncentracijos
(kurios atsiranda alaus ir maisto gamybos pramonės nuotekose) taip pat sudaro geras sąlygas
susidaryti filamentinių bakterijų pertekliui, kadangi sukuria maisto medžiagų disbalansą. Tokiais
atvejais siūloma taikyti respirometrijos metodus. Jie leidžia nustatyti maisto medžiagų kiekius
nuotekose, reikalingus geriausiam dumblo funkcionavimui pasiekti. Tuomet trūkstamų mitybinių
komponentų pridedama tiesiai į aeracijos baseiną.

Mažos deguonies koncentracijos taip pat gali paskatinti filamentinių bakterijų peraugimą – joms taip
pat būdingas didesnis giminingumas deguoniui. Ši filamentų pertekliaus forma gali būti koreguojama
įvertinus kritinę aktyviojo dumblo funkcionavimui reikalingą deguonies koncentraciją.

Vienas plačiausiai vandens valymui naudojamų mikroorganizmų yra Pseudomonas genties

bakterijos, gebančios metabolizuoti platų spektrą cheminių junginių. Tarp jų yra aromatiniai junginiai
(toluenas, naftalenas), sotieji angliavandeniliai. Kitos bakterijų rūšys geba skaidyti įvairius pesticidus
ir kitokias ksenobiotines medžiagas.

Panaudojus selekcijos in vitro metodus, išskirti bakterijų kamienai, gebantys biotransformuoti naftos
produktus, įvairius fenolio darinius. Tikimasi, kad panaudojus genetines manipuliacijas bus sukurti
transgeniniai mikroorganizmai, leisiantys visiškai išvalyti pesticidais ir kitokiais teršalais užterštus
vandenis bei gruntą.

Šiuo metu azoto turinčios medžiagos (baltymai, karbamidas) iš nuotekų dažniausiai šalinamos
panaudojant amonifikuojančias, nitrifikuojančias ir denitrifikuojančias bakterijas. Tokio azotinių
medžiagų skaidymo galutinis produktas paprastai yra nitratai. Jie, patekę į natūralius vandenis,
sukelia eutrofikaciją – stiprų dumblių biomasės padidėjimą ir žūtį. Dumblių žūtis sukelia negyvą
biomasę skaidančių aerobinių bakterijų populiacijos augimą, deguonies trūkumą vandenyje. Dėl šios
priežasties azoto ir fosforo junginių skaidančių mikroorganizmų biotransformacijos kelių
tobulinimas yra viena pagrindinių veiklos sričių.

Kita biologinio vandens valymo problema yra nuotekose esantys sunkieji metalai. Jie privalo būti
pašalinti iš nuotekų, tačiau patys yra toksiški biologinį valymą atliekančiai mikroflorai. Natūraliai
gamtoje egzistuojantys mikroorganizmai metalų kaupimui ir biotransformacijai naudoti netinkami.
Gamtinių populiacijų mikroorganizmų ląstelės priešinasi sunkiųjų metalų pasisavinimui iš aplinkos
(dėl jų toksiškumo). Problemą pavyko išspręsti atradus metalotioneinus – stuburinių ir bestuburių
gyvūnų baltymus, svarbius šių gyvūnų metalų homeostazei palaikyti (bei apsisaugoti nuo toksinio
sunkiųjų metalų poveikio).

Metalotioneinai yra nedidelės molekulinės masės (6000–10000 Da), siera turtingi (cisteino >20 %)
baltymai, kuriems būdingas stiprus giminingumas Cu, Ag, Au, Zn ir Hg. Šie metalus prijungiantys ir
aukštai temperatūrai atsparūs baltymai aptinkami visuose stuburinių gyvūnų audiniuose. Minėtus
baltymus indukuoja įvairūs metalai, sąveikaujantys su baltymais tiolinėmis jungtimis.
Metalotioneinai gali būti naudojami ir kaip Zn (bei kitų metalų) saugyklos, leidžiančios palaikyti
reikiamą viduląstelinę šių metalų koncentraciją. Neįprastai didelis cisteino kiekis šiuose 61–63
aminorūgščių baltymuose leidžia prisijungti 7 Zn arba 12 Cu atomų. Gyvūninis genas, koduojantis
metalotioneniną, genų inžinerijos metodais buvo įterptas į bakterijų genomą ir klonuotas. Tokiomis
bakterijomis padengti paviršiai yra tinkami sunkiesiems metalams kaupti, valant jais užterštas
nuotekas.

Taip pat, nuotekoms valyti gali būti naudojamos transgeninės aktyviojo dumblo Pseudomonas genties
bakterijos (P. lemoignei). Jos turi įterptas rekombinantines plazmines su salicilato ar polifenolių
oksidazės genais, leidžiančiais iš nutekamųjų vandenų pašalinti įvairių pramonės šakų (popieriaus
gamybos, naftos produktų apdorojimo, farmacijos, tekstilės, kosmetikos, chemijos pramonės)
gaminamus toksiškus fenolio darinius.

10.10. Nykstančių rūšių apsauga ir išnykusių organizmų atkūrimo galimybės

Biologiniais ištekliais vadinama biologinė augalų, gyvūnų, grybų individų (o kartu ir jų genų)
įvairovė. Ji yra svarbi ne tik rūšių (kaip taksonominių vienetų) išsaugojimui, bet ir žmogaus
reikmėms. Biologinė įvairovė – nepakeičiamas šaltinis vaistų, maisto, pašarų, statybos, aplinkos
apsaugos reikmėms. Vystantis pramonei bei augant šalių ekonomikoms, nepaliaujamai didėja taršos
mastai. Vis intensyviau kertami miškai, sausinamos šlapynės, nuolatos mažėja rūšims egzistuoti
tinkamų buveinių. Ypač šios problemos akivaizdžios besivystančiose šalyse. Vakarinėje Afrikos
dalyje esančioje Nigerijoje iškirsta apie 90 % ten augusių drėgnųjų atogrąžų miškų. Panaši situacija
yra visoje tropinėje Afrikos žemyno dalyje, drėgnųjų atogrąžų miškų kirtimas ten nepaliaujamai auga.
Tropinėje Azijoje ir Centrinėje Amerikoje miškų kirtimas mažiau intensyvus, šiuo metu kirtimo
mastai nebedidėja.

Siekiant išsaugoti biologinę įvairovę turi būti pasiekta pusiausvyra tarp biologinių išteklių naudojimo
ir jų apsaugos. Tokiu atveju būtų išsaugotos natūralios ekosistemos. Jos (nors ir pakitusios) tebeturėtų
pakankamai išteklių patenkinti žmonijos maisto ir kitokius poreikius. Biologinės įvairovės
išsaugojimas itin svarbus ir ekologiniu aspektu. Tai – potvynius, eroziją, dykumėjimą, nuošliaužas ir
uraganus kontroliuojantis veiksnys. Be to, jis prisideda prie reikiamos vandens kokybės, klimato
būklės palaikymo.

Nors modernioji biotechnologija yra labai jaunas mokslas (jo istorija tesiekia kelias dešimtis metų),
sunku pervertinti jos svarbą tiriant biologinių išteklių išsaugojimo galimybes. Efektyvus augalų
genetinių išteklių išsaugojimas gali būti pasiektas derinant dvi pagrindines išteklių saugojimo
strategijas – in situ (natūraliose buveinėse) ir ex situ (kolekcijose ar saugyklose). Išsaugojimo metodų
ir technologijų pasirinkimas priklauso nuo išsaugojimo tikslų, rūšies dauginimosi sistemos, jos
genetinių ypatybių, sėklų ypatumų. Kita vertus, dažnai rūšies išsaugojimo strategijos pasirinkimą
nulemia finansavimo galimybės, esama infrastruktūra ir atitinkamų technologijų prieinamumas.

Augalų bioįvairovės išsaugojimas

Nemažą dalį laukinių augalų sunku dauginti naudojant dirbtines sistemas – per mažai žinoma (o
dažnai ir visai nežinoma) apie tokių augalų dauginimosi ypatumus. Kita vertus, nemaža dalis augalų
rūšių yra poliploidinės ar aneuploidinės (arba produkuoja sėklas su ypač mažu kiekiu endospermo).
Šių problemų sprendimui vis dažniau pasitelkiamos biotechnologinės priemonės – augalų audinių ar
ląstelių kultūros, kurios naudojamos pramoniniam identiškų augalų gavimui (klonavimui) ar
išsaugojimui in vitro.

Augalų in vitro išsaugojimas taikomas tiems augalams, kurie:

 Pasižymi dideliu heterozigotiškumu, todėl gali būti dauginami tik vegetatyviškai, o ne

sėklomis;

 Augalai, kurie sunkiai subrandina sėklas (pvz. žydi tik sulaukę tam tikro amžiaus);

 Augalai, kurie neišaugina gyvybingų sėklų arba kurių sėklos greitai praranda daigumą;

 Yra hibridinės augalų rūšys.

Mikropadauginimu vadinamas vegetatyvinio dauginimo in vitro būdas. Jis naudojamas greitai (ir
dideliais kiekiais) padauginti augalus. Dauginant šiuo metodu, iš nedidelio augalo eksplanto
regeneruojama daug augalų mažoje erdvėje.

Mikrodauginimas gali būti atliekamas keliais būdais:

 Dauginimas pažastiniais pumpurais. Tinkamas rūšims, formuojančioms pažastinius

pumpurus ir reaguojančioms į išorinius auksinus terpėje, padauginti. Pumpurai sterilinami ir
perkeliami į mitybinę terpę su santykinai mažomis auksinų ir citokininų koncentracijomis. Tai
skatina pumpuro meristemų funkcionavimą (motininiame augale jį nuslopina apikalinis
dominavimas). Tolesniuose etapuose didinamas hormonų kiekis bei keičiamas jų santykis,
kol gaunama didžiausia mikroūglių išeiga. Auksinų kiekis parenkamas taip, kad prie ūglių
nesiformuotų kalius. Kadangi citokininai stabdo rizogenezę (šaknų formavimąsi), ši
technologija reikalauja atskiro rizogenezės etapo. Ūglių pamatinės dalys tam tikrą laiko tarpą
veikiamos auksinais ir perkeliamos į rizogenezei palankią mitybinę terpę.

 Dauginimas pridėtiniais ūgliais. Jis pagrįstas ūglių de novo susidarymu iš bet kurių augalo
somatinių ląstelių. Augalas geba palankiomis sąlygomis atauginti trūkstamus organus. Ši
augalų savybė neretai sutinkama gamtoje – tokiu būdu geba natūraliai daugintis begonijos,
sanpaulijos, kai kurie svogūniniai augalai.

 Ūglių ir somatinių embrionų (embriodų) regeneravimas iš kaliaus kultūrų. Jis susideda

iš kelių etapų:

1. Kaliaus indukcija;
2. Ūglių arba somatinių embrionų regeneravimas iš kaliaus (didinant terpėje citokininų dalį);
3. Viso augalo regeneravimas iš indukuoto ūglio (paskatinant rizogenezę) arba somatinio
embriono.

Metodas turi du svarbius trūkumus – kalius ilgainiui praranda gebėjimą regeneruoti. Be to,
regenerantams būdingas somakloninis kintamumas – regeneravę augalai nėra genetiškai
identiški eksplanto donorui. Nepaisant šių trūkumų, embriodų formavimas iš kaliaus kultūrų
leidžia gaminti dirbtines sėklas. Dirbtinės sėklos – somatiniai embrionai, įvilkti į specialios
sudėties gelį (netoksišku natrio alginato geliu hidratuotos dirbtinės sėklos) arba apvelti
vandenyje tirpiomis dervomis (somatiniai embrionai iki tam tikro lygio desikuojami). Taip
gaunamos desikuotos (išdžiovintos) dirbtinės sėklos. Šis metodas leidžia dauginti augalus,
kurių sėklos labai sunkiai dygsta arba turi defektyvų endospermą.
Visos mikrodauginimo atmainos pagrįstos augalų ląstelių totipotentiškumu – gebėjimu regeneruoti
visą organizmą. Mikrodauginimo metodai, palygus su kitais dauginimo metodais, patrauklūs tuo, kad
leidžia padauginti selekciškai labai vertingus (elitinius) motininius augalus santykinai greitai ir
dideliais kiekiais. Šiuo metodu dauginama daugiau nei 1000 augalų rūšių, įskaičiuojant daugiau nei
100 rūšių miško medžių. Be to, išvengiama augalų karantinavimo dėl ligų ir kenkėjų etapo (in vitro
gauti augalai nuo šių biotinių veiksnių yra atriboti).

Augalų genofondą in vitro saugoti galima naudojant dvi strategijas: pirmoji paremta augalų perkėlimu
į in vitro kultūrą ir jų gyvybinių procesų sulėtinimu, antroji paremta in vitro kultūrų gyvybinių
procesų sustabdymu.

Vienas labiausiai paplitusių augalų ex situ išsaugojimo būdų yra užšaldymas (krioišsaugojimas). Šis
metodas pagrįstas visišku gyvybinių procesų sustabdymu. Šaldant gali būti saugomos augalų sėklos
ar jų audiniai – eksplantai. Užšaldytų sėklų saugojimo metodas tinka tik toms augalų rūšims, kurių
sėklos ištveria šaltį ir prieš tai atliekamą desikaciją – džiovinimą (tokių augalų rūšių sėklos vadinamos
angl. orthodox seeds). Augalai, kurių sėklos yra neatsparios desikacijai ar žemai temperatūrai (angl.
recalcitrant seeds), gali būti saugomi sulėtinus šių struktūrų gyvybinius procesus: izoliuotų gemalų,
ląstelių suspensijų, protoplastų, kaliaus kultūrų, žiedadulkių, dulkinių ar ūglių viršūnėlių pavidalu.

Krioišsaugojimas yra vienintelis saugojimo metodas, leidžiantis išvengti nuolatinio genetinio

kintamumo tikrinimo procedūrų. Šalčiu sustabdžius gyvybines reakcijas, vienintelis galimas
genetinio variavimo šaltinis yra spontaninės mutacijos, priklausančios nuo bendrojo aplinkos
radiacijos lygio. Krioišsaugojimas susideda iš kelių etapų:

1. Eksplanto izoliavimas ir paveikimas krioprotektoriais – medžiagomis, kurios apsaugo

ląsteles nuo žūties dėl stambių ledo kristalų susidarymo užšaldymo metu. Dažnai tam
naudojamas dimetilsulfoksidas (DMSO), etilenglikolis, glicerolis bei prolinas (mažesnėmis
nei 10 % koncentracijomis).

2. Laipsniškas užšaldymas iki suskystinto azoto temperatūros (-196 °C). Dažniausiai taikomas
dvifazis užšaldymo būdas. Pirmosios fazės metu temperatūra greitai sumažinama iki 0 °C,
eksplantas palaikomas šioje temperatūroje kurį laiką. Antrosios šaldymo fazės metu
temperatūra greitai sumažinama iki galutinės audinio laikymo temperatūros.

3. Eksplanto saugojimas skystame azote neribotą laiką.

4. Greitas eksplanto atšildymas (paprastai tai atliekama įmerkus užšaldytą eksplantą į 30–40
°C temperatūros vandenį) ir gyvybinių procesų atkūrimas.

Šiuo metodu saugant biologinius pavyzdžius, labai svarbu yra tinkamai parinkti užšaldymo greitį,
krioprotektoriaus rūšį, krioprotektoriaus pašalinimo iš ląstelės laiką, atšildymo greitį bei temperatūrą.

Kita saugojimo metodų grupė yra pagrįsta eksplantų gyvybinių procesų sulėtinimu. Tai pasiekiama
in vitro kultūroje keičiant aplinkos sąlygas. Saugant augalus ląstelių kultūrose, neišvengiamas yra
somakloninio kintamumo reiškinys, todėl šiuo būdu gauti augalai privalo būti patikrinami. Be to,
eksplantai in vitro sąlygomis auga santykinai greitai, todėl jie turi būti periodiškai subkultivuojami –
perkeliami į naują mitybinę terpę (terpė turi būti keičiama kas kelias savaites). Saugant genetinius
išteklius in vitro, nepristabdžius jų gyvybinių procesų, transplantus būtina palaikyti nuolatinėje
augimo fazėje. Kad būtų išvengta nuolatinės subkultivacijos, naudojami keli augimo procesų
sulėtinimo būdai:

 Sumažinama druskų koncentracija mitybinėje terpėje;

  Sumažinama aplinkos temperatūra;
 Į terpę pridedama kultūrų augimą slopinančių medžiagų (osmotikų, augimo reguliatorių);
 Keičiamas apšvietimo režimas;
 Keičiama atmosferos sudėtis (mažinama deguonies koncentracija);
 Kultūra dalinai izoliuojama nuo atmosferos (padengiant plonu mineralinės alyvos sluoksniu).

Derinant šiuos metodus, įmanoma pasiekti, kad ląstelių kultūras būtų galima subkultivuoti vos 1 kartą
per metus.

Gyvūnų bioįvairovės išsaugojimas

Gyvūnų bioįvairovės išsaugojimas taip pat apima in situ ir ex situ metodų grupes. Pagrindinis in situ
metodų uždavinys yra mažų populiacijų (o kartu ir genetinės įvairovės, kuri tokiose populiacijose
labai maža) didinimas, neiškeliant individų iš gyvenamosios teritorijos. Tai atliekama kryžminant
atkuriamos populiacijos individus su tos pačios rūšies (ar artimo porūšio) individais. Siekiant
efektyviai padidinti populiaciją, svarbu žinoti, kad populiacija nyksta būtent dėl mažos genetinės
įvairovės. Ypač svarbu ir tai, kad kryžminimui naudojami individai iš svetimos populiacijos būtų
gyvenę panašiomis sąlygomis. Be to, donorinės populiacijos individai iš atkuriamos populiacijos turi
būti pašalinami kiek įmanoma anksčiau, kad jų aleliai nenustelbtų atkuriamosios populiacijos alelių
(t. y. kad nepasireikštų genetinis „užtvindymas“ (angl. genetic swamping). Pageidautina iš pradžių
atlikti bandomuosius kryžminimus ex situ, kad būtų galima prognozuoti gelbėjimo programos
efektyvumą.

Vienas išsamiausiai aprašytų populiacijos didinimo in situ pavyzdžių yra Amerikos pumos porūšio –
Floridos pumos (Puma concolor coryi) individų skaičiaus atkūrimo darbai. 1970 m. manyta, kad šio
porūšio pumos išnyko, tačiau vėliau labai nedideliame areale buvo surasti 20–25 išlikę individai
(10.30 pav.). Šiems individams buvo būdingi kituose porūšiuose neaptinkami nukrypimai – širdies ir
kraujagyslių defektai, kriptorchidizmas, prasta spermos kokybė (75 % nenormalių spermatozoidų),
didelis jauniklių mirtingumas, didelis suaugusių individų mirtingumas nuo infekcinių ligų. Nustatyta,
kad populiacijos genetinė įvairovė yra labai nedidelė – pasireiškė įvaisos (inbridingo) depresija.

10.30 pav. Dabartinės ir ankstesnės Floridos pumų populiacijos arealo ribos

(paveikslas iš http://pictures-of-cats.org/Florida-Panther)

1995 m. pradėtas vykdyti Floridos pumų populiacijos didinimas (angl. population augmentation), dar
žinomas kaip genetinis „gelbėjimas“ (angl. genetic rescue). Į Floridos pumų gyvenamas vietas buvo
paleistos 8 artimo šioms pumoms porūšio – Teksaso pumų (Puma concolor stanleyana) patelės. Iš jų
5 susikryžmino su Floridos pumų patinais. Hibridų išgyvenamumas stipriai padidėjo, o pumų
populiacija išaugo. Taip buvo padidintas populiacijos heterozigotiškumas, sumažėjo žalingų požymių
dažnis.

2003 m. likusios gyvos Teksaso pumų patelės iškeltos iš Floridos pumų užimamos teritorijos, kad
būtų sustabdytas Teksaso pumų alelių plitimas atkuriamoje Floridos pumų populiacijoje. Nustatyta,
kad 20–30 % dabartinės populiacijos genofondo sudaro Teksaso pumos genai. Yra nuomonių, kad
tokia introdukuotų genų dalis yra per didelė ir įvyko genetinis „užtvindymas“.

Dabar Floridos pumų populiaciją sudaro iki 100 individų, tačiau pumų mirtingumas vis dar tebėra
didelis. Paradoksalu, tačiau taip yra dėl per didelio Floridos pumų populiacijos tankio. Tinkamų
pumoms gyventi vietų plotas nepasikeitė, nes pumų užimamas arealas yra tankiai apgyvendintas
žmonių. Jeigu nebus padidinti pumoms tinkamų gyventi teritorijų plotai, populiacijos didinimo
priemonės taip pat neduos norimų rezultatų – populiacijos narių skaičius nepasieks reikiamo dydžio,
vėl pradės reikštis įvaisa ir genetinė erozija.

Ex situ išsaugojimo metodai paremti natūraliu ar pagalbinėmis priemonėmis atliekamu gyvūnų

veisimu nelaisvėje. Iš biotechnologijomis paremtų metodų gyvūnų rūšims išsaugoti dažniausiai
taikomi šie:

 Krioišsaugojimas. Procedūra panaši į taikomą augalams: įvairūs eksplantai – ląstelės,

audiniai, gametos (oocitai, sperma), DNR yra saugomi užšaldyti biobankuose.

 Dirbtinis apsėklinimas. Metodas taikomas dažniausiai ūkiuose arba kitiems nelaisvėje

auginamiems gyvūnams veisti. Surinkta rinktinių patinų sperma reikalui esant gali būti
sukoncentruojama ir saugoma užšaldyta. Atšildyta sperma gali būti apvaisinamos patelės jų
ovuliacijos metu.

 Intracitoplazminė spermos injekcija. Tai technologija, leidžianti apvaisinimui naudoti

judėjimo defektų turinčius ar nesubrendusius spermatozoidus. Procedūros metu
mikromanipuliatoriais in vitro atliekama paruoštų spermatozoidų mikroinjekcija tiesiogiai į
subrendusį oocitą. Tuomet atrenkami kokybiški normaliai besivystantys embrionai.

 Dirbtinis apvaisinimas in vitro bei klonavimas. Embrionų gavimas in vitro paremtas

ankstyvos ontogenezės stadijos embrionų dalijimu ir klonavimu, žymenimis pagrįstos
atrankos panaudojimu bei embrionų genų inžinerija. Ši technologija taikoma ir klonuojant
gyvūnus – į kiaušialąstę su pašalintu branduoliu įterpiamas klonuojamos gyvūnų rūšies
somatinės ląstelės branduolys, naujai suformuota ląstelė aktyvinama elektros iškrova.
Pradėjęs vystytis embrionas įsodinamas surogatinei motinai. Šios technologijos panaudojimas
kol kas yra ypač ribotas. Pirmiausia, taip yra dėl labai menko procedūros efektyvumo:
klonuojant naminius galvijus, didžiausias pasiektas klonavimo efektyvumas siekia 10 %,
kiaules – iki 6 %. Dažniausiai šis dydis nesiekia 1 %. Be to, susiduriama su didelėmis klonuotų
embrionų vystymosi anomalijomis in uterus ir postnataliniu periodu.

Žinoma daug (ir įvairių) klonuotų gyvūnų sveikatos sutrikimų: kai kurie iš jų konstatuoti kelioms
rūšims (kardiovaskuliarinės sistemos sutrikimai, placentos defektai ir kt.), kiti būdingi tik konkrečiai
rūšiai (pelių nutukimas, avių pilvo sienos defektai ir kt.). Tam tikro fenotipinio sutrikimo sunkumas
taip pat įvairuoja tarp rūšių – paprastai pelių, ožkų ir kiaulių klonams pasireiškia lengvesnės sutrikimų
formos negu avims ir galvijams.

Vienas dažniausiai pasitaikančių klonuotų gyvūnų sveikatos sutrikimų yra didelių palikuonių
sindromas (angl. Large Offspring Syndrome, LOS). Sindromas būdingas klonuotiems galvijams,
avims. Būdingi simptomai yra stipriai padidėjusi naujagimių kūno masė (didesnė 2–5 kartus) ir
įvairaus laipsnio vidaus organų pakenkimai. Manoma, kad sindromas nėra tiesiogiai susijęs su
klonavimu, jį sukelia manipuliacijos su embrionais in vitro. LOS simptomai (žymus kūno masės
padidėjimas, kūno sienos bei kaulų–raumenų sistemos defektai) primena žmogaus Beckwith-
Wiedemann sindromą (BWS). Šia liga susirgti didesnė tikimybė vaikams, gimusiems po apvaisinimo
in vitro.

Taip pat paplitęs defektas yra didelis prenatalinis klonų mirtingumas, būdingas visoms rūšims ir
galintis įvykti įvairiose vaisiaus vystymosi stadijose. Ankstyvų vystymosi stadijų embrionai
dažniausiai žūva dėl placentos defektų: kai kuriais atvejais tai nutinka dėl placentos vystymosi
sutrikimų. Žūtis gali būti ir dėl placentomegalijos, nulemtos spongiotrofoblasto išvešėjimo (pelėms).
Išsiaiškinus placentos vystymosi anomalijas būtų labai padidintas klonavimo efektyvumas. Be to,
sumažėtų dėl šių anomalijų atsirandančių kitų sutrikimų (kardiovaskuliarinės ir kvėpavimo sistemos
pažaidos), kurie, manoma, atsiranda ne dėl genetinių pažeidimų, o būtent dėl placentos defektų.

Klonuotų gyvūnų vystymosi sutrikimų priežastys gali būti suskirstytos į genetines ir epigenetines.
Apie genetines priežastis žinoma nedaug. Fenomenalu, bet klonavimo technologijos vystosi
nepalyginamai sparčiau už sutrikimų priežasčių ir galimos jų prevencijos paieškas. Viena iš genetinių
klonų vystymosi ir sveikatos sutrikimų priežasčių yra poliploidija. Atlikus jaučio somatinių ląstelių
branduolių perkėlimą į bebranduolį oocitą, identifikuota 3N (2,6±0,5 %), 4N (10,0±3,1 %), 5N ir >5N
ploidiškumo (0,5±0,2 %) blastocistų. Nustatyta ir įvairių chromosominių aberacijų. Taip pat
pastebėta, kad 50 % rekonstruotų jaučio embrionų būdingi centrosomų padėties ir/arba skaičiaus
nukrypimai pirmame rekonstruotos ląstelės dalijimosi cikle.

Kita klonų sveikatos sutrikimų genetinė priežastis yra heteroplazmija – rekonstruotų embrionų
citoplazmoje aptinkama bent 2 tipų mtDNR (oocito ir į jį įterpiamo svetimo branduolio). Svetimas
branduolys paprastai būna perkeliamas su dalimi savo ląstelės citoplazmos, todėl atsiranda branduolio
DNR ir mtDNR konfliktas.

Trečioji genetinė klonuotų gyvūnų defektų priežastis yra jų chromosomų telomeros. 1999 metais, kai
aviai Doli buvo 2 metai, fenotipiškai ji niekuo nesiskyrė nuo kontrolinių jos amžiaus avių. Nepaisant
to, telomerų ilgio analizė parodė, kad Doli telomeros buvo sutrumpėjusios (19 kb) palyginus su
kontrolinių gyvulių telomeromis (23 kb). Tokios trumpos (19 kb) ilgio telomeros buvo identifikuotos
ir 6 metų amžiaus avies – branduolio donorės pieno liaukų ląstelėse. Buvo iškelta mintis, kad
klonuoto gyvūno telomeros yra trumpesnės (t. y. gyvūnas jau gimsta pasenęs), nes vystosi iš
somatinės ląstelės branduolio. Kita vertus, buvo atlikta bandymų, kurių metu (kaip branduolio
donoras) naudotos ląstelės, kultūrose nugyvenusios apie 95 % savo gyvenimo trukmės (t. y. labai
„pasenusios“ donorės). Iš jų buvo klonuoti 6 sveiki veršeliai, kurių telomeros buvo net ilgesnės nei
kontrolinių gyvulių (klonuotų – 20,1 kb, kontrolinių – 18,3 kb). Pasenusių ląstelių (iš kurių klonuoti
veršeliai) branduolio donorių telomeros buvo 15,2 kb ilgio. Taip buvo parodyta, kad klonų telomerų
ilgis dažniausiai nesiskiria nuo kontrolinių individų ir nebūtinai koreliuoja su gyvūno amžiumi. Be
to, telomeros klonuose gali būti netgi pailgėjusios. Daug mokslininkų grupių, dirbančių su
rekonstruotomis galvijų blastocistomis, apvaisinimo in vitro ir branduolių persodinimo sistemomis,
ankstyvose embrioninio vystymosi stadijose identifikavo telomerazės aktyvumą. Toks telomerazės
aktyvumo padidėjimas blastocistos stadijoje gali paaiškinti, kodėl daugumos klonų telomeros yra
normalaus ilgio (kaip įvyksta somatinio branduolio rejuvenilizacija).

Gausybės studijų metu išsiaiškinta, kad klonų, turinčių įvairių fenotipinių defektų, palikuonys yra
normalaus fenotipo, tad dabar visas dėmesys skiriamas epigenetikai. Išsiaiškintos kelios epigenetinio
perprogramavimo sutrikimų priežastys. Tai – histonų modifikacijų, DNR metilinimo ir genų
imprintingo sutrikimai. Nustatyta, kad rekonstruotų embrionų (jiems būdingas normalus
epigenotipas) dalis atitinka pasiekusių blastocistos stadiją embrionų dalį.
DNR metilinimas svarbus daugeliui ląstelinių procesų – DNR replikacijai, svetimos DNR
inaktyvinimui, genų imprintingui, audiniams specifinių genų raiškai, patelių X chromosomos
inaktyvinimui. Klonuotų gyvūnų DNR metilinimo sutrikimai būdingi ne visoms rūšims. Jų nebuvo
konstatuota kiaulėms, o tai gali paaiškinti, kodėl vienoms gyvūnų rūšims būdingi lengvesnio laipsnio
fenotipiniai sutrikimai nei kitoms. DNR metilinimas ypač svarbus žinduolių vystymuisi, pradedant
gametų formavimusi, baigiant ląstelių diferenciacija.

Kita intensyviai tiriama epigenetinių pažaidų grupė klonuotuose gyvūnuose yra imprintingo
sutrikimai. Imprintingo būdu žymėtų genų raiška dažnai vyksta tik tam tikroje vystymosi stadijoje
arba audinyje. Kai kurie sutrikimai, atsirandantys po klonavimo procedūros, primena sindromus,
atsirandančius sutrikus imprintingui. Manoma, kad genų imprintingo pažaidos gali atsirasti dėl
neoptimalių embrionų kultivavimo sąlygų. Ištyrus genų raiškos profilius klonuotose blastocistose,
nustatyti kai kurių svarbių vystymosi genų (karvėms Fgf4, Igf2r, IL6, pelėms Oct4) reaktyvacijos
pažeidimai. Šių genų funkcionavimo sutrikimai gali lemti daugelio kitų raidos genų disfunkciją.
Klonuotuose avių ir jaučių embrionuose (blastocistos stadijoje) buvo konstatuotas neįprastas IGF2-
H19 (BWS) ir Igf2R hipometilinimas. Svarbu ir tai, kad imprintingo sutrikimai yra labai individualūs
(t. y. labai priklauso nuo genotipo).

Dėl išvardintų priežasčių didelę nesėkmę patyrė ir bandymas atkurti Pietų ir Pietryčių Azijoje
gyvenančių ir nykstančių gaūrų (Bos frontalis, sin. B. gaurus) populiaciją klonavimo būdu.
Persodinus gaūro epitelio ląstelių branduolius į karvės (Bos taurus) kiaušialąstes, buvo sukurti 692
rekonstruoti embrionai: 81 embrionas išsivystė iki blastocistos stadijos, 42 iš jų buvo persodinti 32
surogatinėms motinoms (karvėms). Aštuonioms karvėms vystėsi nėštumas, pagimdė tik viena – gimė
klonuotas gaūro naujagimis, tačiau jis nudvėsė po dviejų dienų dėl dizenterijos. DNR analizė parodė,
kad gimusio gaūro jauniklio mtDNR kilusi iš B. taurus, o branduolinė – iš B. gaurus. Šiuo metu
moksliniais tikslais yra klonuota ir daugiau laukinių gyvūnų (tarp jų ir pilkasis vilkas panaudojus
kalės kiaušialąstes). Tačiau kol kas laukinių gyvūnų klonavimai yra daugiau mokslinių tyrimų
projektai nei efektyvios nykstančių gyvūnų rūšių išsaugojimo programos.

2011 metais, eksperimento metu pavyko gauti tokių beveik išnykusių rūšių – šiaurinio plačialūpio
raganosio porūšio ir beždžionės drilo (Mandrillus leucophaeus) kamienines ląsteles iš somatinių
ląstelių. Atradimas sutiktas su dideliu entuziazmu, tačiau bandymai iš tokių kamieninių ląstelių gauti
gametas ir taip išspręsti beišnykstančių rūšių atkūrimo problemą buvo nesėkmingi. Be to, net ir
sėkmės atveju būtų susidurta su jau aptartomis klonavimo problemomis. Vis dėlto, šio metodo
ištobulinimas leistų ne tik atkurti nykstančių gyvūnų populiacijas. Jis taip pat būtų tinkamas ir
išnykusių rūšių atkūrimui iš išlikusių pavyzdžių.

Vienas iš bandymų atkurti visiškai išnykusią rūšį buvo atliktas 1999 m. Buvo bandoma atkurti
sterblinį Tasmanijos tigrą Tilaciną (Thylacinus cynocephalus), dar vadinamą Tasmanijos vilku.
Tilacinai visiškai išnyko1936 m., kai Australijos Hobarto zoologijos sode nudvėsė paskutinis tilacino
rūšies individas. Ši rūšis išnyko dėl intensyvios medžioklės, ligų bei tinkamų gyvenamųjų teritorijų
sunaikinimo. Visi žinomi tilacino eksponatai iš muziejų, universitetų ir privačių kolekcijų buvo
nufotografuoti ir suregistruoti Tarptautinėje tilacino pavyzdžių duomenų bazėje. 1999 m. buvo
nutarta pabandyti atkurti tilaciną iš turimų eksponatų ir pavyzdžių. Apžiūrėti pavyzdžiai buvo
įvertinti. Manyta, kad jie turėtų būti tinkami išskirti DNR bei tolimesnėms klonavimo
manipuliacijoms atlikti. 2002 m. iš muziejuje laikytų Tilacino pavyzdžių buvo išskirta DNR. Tačiau
po trejų metų bandymų konstatuota, kad tokia DNR tolesniems darbams netinka, nes yra per stipriai
fragmentuota ir degradavusi, be to, užteršta grybelių ir pelėsių DNR priemaišomis.

2008 metais iš 100 metų senumo spirite užfiksuoto tilacino pavyzdžio buvo išskirta DNR. Iš jos į
pelės embrioną sėkmingai įterptas kolageno genas Col2A1, stebėta šio geno raiška. Genomo dalių
analizė padėjo geriau suprasti evoliucijos procesą, o sėkminga šio eksperimento baigtis leistų tikėtis,
kad (kada nors) šiuo metodu galėtų būti atkuriamos seniai išnykusios rūšys. Panaudojus iš šio tilacino
pavyzdžio išskirtą DNR buvo sėkmingai atlikta mtDNR sekoskaita. Siekiant tikslumo, kiekvienoje
mtDNR pozicijoje esanti azotinė bazė nepriklausomų eksperimentų metu buvo sekvenuojama
vidutiniškai po 50 kartų. mtDNR sekos nustatymas leido patikslinti tilacino padėtį evoliuciniame
medyje ir patvirtino ypač mažą išlikusių tilacino pavyzdžių genetinę įvairovę, buvusią prieš pat šios
rūšies išnykimą. Paskatinti mtDNR sekoskaitos sėkmės, mokslininkai bandys nustatyti ir branduolio
genomo seką. Šiuo metu tilacino klonavimo programa iš esmės yra sustabdyta, tačiau tęsiami
pavienių genų klonavimo darbai.

10.11. Biotechnologija žemės ūkyje ir maisto pramonėje

Pageidaujamų savybių augalų ir gyvūnų gavimas klasikinės selekcijos ir moderniosios
biotechnologijos metodais

Tūkstančius metų žmonės sėjo įvairias žemės ūkio kultūras ir naudojo jų derlių maistui. Buvo
intuityviai atrenkami geresnėmis savybėmis pasižymintys augalų variantai. Mitybinių išteklių
poreikis augo visą žmonijos vystymosi laiką. Tačiau dar niekada maisto poreikis nedidėjo taip
sparčiai, kaip šiuo metu. Augant žmonių kiekiui, atsirado būtinybė greitai ir efektyviai tobulinti žemės
ūkio kultūrų savybes. Šiuolaikiniai biotechnologiniai metodai leidžia gerokai padidinti pasėlių
derlingumą, kurti augalus, natūraliai atsparius ligoms ir kenkėjams, pagerinti maistinių kultūrų
maistines ir skonines savybes. Vieni labiausiai biotechnologijos metodais tobulinamų augalų yra
sojos, kukurūzai, medvilnė, rapsai (kanola), papajos, pomidorai, moliūgai. Maisto pramonėje
naudojami fermentai (sūrių gamybai), mielės (duonos ar alaus gamybai) taip pat dažniausiai
gaminami naudojant biotechnologinius metodus.

Biotechnologijos taikymas žemės ūkiui ir maisto pramonei suteikia tokius pranašumus:

 Mažesnis poveikis aplinkai – kuriami augalai, atsparūs kenkėjams ir ligoms (ypač

virusinėms, su kuriomis kovoti nėra efektyvių priemonių, išskyrus augalų sunaikinimą).
Nustatyta, kad augalų atsparumas virusams atsiranda tuomet, kai augale vykdoma viruso
kapsidės baltymų genų raiška. Manoma, kad viruso transgenų raiška augale vyksta tik iki
RNR, o ne iki baltymo lygmens. Kadangi daugelis augalus parazituojančių virusų priklauso
RNR virusams, augalo infekcijos metu gali susiformuoti dvigrandinės RNR. Jos dėl RNR
interferencijos (angl. RNAi) degraduojamos – taip augalas nesuserga virusine liga. Vienas
geriausių šios krypties pavyzdžių yra transgeninė papaja, atspari daugiausiai žalos papajų
derliui darančiam parazitui – papajų dėmėtligės virusui.

Taip pat intensyviai kuriami augalai atsparūs vabzdžiams ir jų lervoms. Tai pasiekiama
įterpiant įvairias Cry geno (iš Bacillus thuringiensis) versijas į augalo genomą. Šio geno raiška
nulemia baltymo, vadinamo Bt toksinu, sintezę visame augale ar atskirose jo dalyse. Dalinė
šarminė šio baltymo proteolizė (pro-toksino virtimas į toksiną) vyksta vabzdžių lervų
virškinamajame trakte. Aktyvus baltymas prisijungia prie virškinamojo trakto ląstelių
receptorių ir sukelia ląstelių membranų perforaciją, taigi ir lervos žūtį. Ligoms atspariems
augalams auginti reikia mažesnių kiekių pesticidų, o herbicidams atsparūs augalai leidžia
mažiau alinti dirvožemį mechaninio kultivavimo priemonėmis.

 Didesnis pasėlių derlingumas. Biotechnologiniais metodais konstruojami augalai, atsparūs

ne tik biotiniams, bet ir abiotiniams veiksniams (dideliam dirvožemio druskingumui,
sunkiesiems metalams, sausroms, užtvindymui ir kt.). Tai leidžia gauti geresnius maistinių
kultūrų derlius.
  Geresnių skoninių savybių ir šviežesnis maistas. Vienas šios krypties pavyzdžių yra
saldesnės paprikos ir lėčiau nokstantys pomidorai, kurie gali išlikti švieži ilgesnį laiką.

 Intensyvesnė žemdirbystė. Ji leidžia užauginti daugiau maisto žaliavų mažesniame plote.

Manoma, kad iki 2050 m. žmonių skaičius Žemėje perkops 9 mlrd. Siekiant patenkinti maisto
poreikius (ir neišplėsti dabartinių žemės ūkio paskirties plotų), biotechnologijos panaudojimas
įgaus vis didesnę svarbą. Kita vertus, didžiausias žmonių populiacijos augimas pastebimas
neturtingose ar besivystančiose šalyse. Joms brangios biotechnologinės žemės ūkio gerinimo
priemonės dažniausiai yra neįperkamos.

 Saugesnis vartoti maistas. Biotechnologija suteikia galimybę atidžiau kontroliuoti

patogeninius mikroorganizmus maiste bei pašaruose. Tai leidžia sumažinti apsinuodijimų
skaičių. Vienas pavyzdžių – kukurūzuose aptinkamų patogeninių grybelių išskiriami
mikotoksinai (aflatoksinai, sterigmatocistinas iš Aspergillus sp., fumonizinas, vomitoksinas ir
trichotecenai iš Fusarium moniliforme ir F. graminearum, ochratoksinai ir citrininas iš
Penicillium sp.). Panaudojus tokius kukurūzus maistui ar pašarams, aflatoksinai sukelia
apsinuodijimą. Šių toksinių kiekis yra kontroliuojamas maisto kontrolės tarnybų (Lietuvoje
kontrolę atlieka Nacionalinis Maisto ir Veterinarijos Rizikos Vertinimo Institutas). Tačiau
biotechnologiniai metodai leidžia sukonstruoti augalus mažiau tinkamus šiems patogenams
veistis (keičiant augalų metabolitų sintezę ir pasiskirstymą, didinant atsparumą atitinkamiems
parazitams).

 Geresnės maistinės vertės ir naujų savybių turintys maisto produktai. Biotechnologija

suteikia naujų galimybių kuriant modernias augalų veisles – besėklius arbūzus, melionus,
vynuoges, mažus vaisius vedančius avokadus, daugiau baltymų, vitaminų, antioksidantų,
mineralinių medžiagų turinčius vaisius bei daržoves (geležimi ir β-karotenu praturtinti ryžiai,
geresnį cis- ir trans- riebalų santykį turinčios aliejinės kultūros). Taip pat kuriami augalai,
turintys mažiau alergenų (žemės riešutai, kviečiai). Atskira kryptis yra valgomųjų vakcinų
kūrimas – imunogeniškų antigenų sintezė transgeniniuose vaisiuose ar daržovėse (pvz.
bananuose) galėtų būti neinvazinė alternatyva tradicinei vakcinacijai.

Biotechnologija gali daryti didelę įtaką žmonių buičiai: biotechnologinėmis priemonėmis galima
reguliuoti maisto kokybę, maisto prieinamumą, ūkininkų, auginančių žemės ūkio produktus, sveikatą,
ekonominį statusą, aplinkos būklę.

Pirmasis transgeninis augalas sukurtas 1983 m. Genetiškai modifikuotus augalus pramoniniams

tikslams dideliais kiekiais leista auginti apie 1990 m. 1994 m. parduotuvių lentynose pasirodė pirmieji
genetiškai modifikuoti lėčiau nokstantys FlavrSavr pomidorai. Tarptautinės biotechnologijų taikymo
žemės ūkyje priežiūros tarnybos (angl. International Service for the Acquisition of Agri-biotech
Applications) duomenimis, 2006 m. biotechnologinių manipuliacijų būdu gauti augalai buvo
auginami 22 šalyse, 102 mln. hektarų plotuose, iš kurių 64 % užėmė sojos, 38 % – medvilnė, 18 % –
rapsai (kanola), 17 % –kukurūzai.

Klasikinės selekcijos istorija siekia tūkstančius metų: jau nuo seniausių laikų žmonės savo veikla
keitė savo gyvenamąją aplinką, jaukino ir augino laukinius gyvūnus bei augalus nuolat atrinkdami
geresnėmis savybėmis pasižyminčius individus. Moksliškai pagrįsta dirbtinė gyvūnų ir augalų
atranka tapo įmanoma tik XIX a., Ch. Darwinui paskelbus savo darbus apie natūraliąją atranką ir
evoliuciją. Ypač reikšmingą postūmį šioje srityje suteikė paveldimumo dėsnių atradimas ir
suformulavimas.

Selekcija pažodžiui reiškia atranką, tačiau dabar ji suprantama kaip kompleksinis mokslas, siekiantis
padidinti žemės ūkio gamybos produktyvumą. Norint selekcijos būdu išvesti gyvūnų ar augalų veislę,
svarbu atsižvelgti į kelis aspektus – selekcijai pasirinktų individų skirtingumą, pageidaujamų
požymių paveldimumo ypatumus, aplinkos įtaką pageidaujamų požymių susiformavimui. Be to,
svarbu iš anksto numatyti atrankos strategiją.

Pagrindiniai selekcijos uždaviniai yra naujų veislių kūrimas arba esamų veislių gerinimas. Augalų ir
gyvūnų selekcijos metodai yra panašūs – tai hibridizacija (kryžminimas) ir po jos vykstanti atranka.
Kryžminimo metu derinami pageidaujami skirtingų individų požymiai (naujų genetinių kombinacijų
gavimas), o atrankos etapu pageidaujamos naujos požymių kombinacijos yra įtvirtinamos. Selekcinio
darbo metodai ir gaunami rezultatai labai priklauso nuo organizmų dauginimosi formos – lytinio ir
nelytinio dauginimosi. Šiuo aspektu augalų ir gyvūnų selekcijos metodai skiriasi.

Kadangi augalams būdingos įvairios dauginimosi formos (lytinis dauginimasis – savidulka,

kryžmadulka, įvairios vegetatyvinio dauginimosi atmainos), jiems taikomi atrankos metodai irgi
įvairūs, priklauso nuo dauginimosi tipo. Išskiriamos dvi pagrindinės atrankos strategijos – masinė ir
individinė.

Pirmuoju atveju, iš kryžminant gautos pradinės medžiagos atrenkama grupė individų, turinčių
dominančias požymių kombinacijas. Toks atrankos būdas gali būti vienkartinis (taikomas tik
pirmojoje kartoje) arba daugkartinis (atranka atliekama keliose vėlesnėse kartose). Šis būdas
dažniausiai taikomas gerinant vietines prastai derančias veisles. Masinė atranka paprastai taikoma
kryžmadulkiams augalams (pvz. rugiams). Metodo trūkumas – negalima gauti genotipiškai
homogeniškos medžiagos, todėl šiuo būdu gautoms veislėms dažniausiai reikia pakartotinės atrankos.

Individinė atranka (kuri taip pat gali būti vienkartinė arba daugkartinė) yra atskirų norimomis
savybėmis pasižyminčių individų atrinkimas iš bendros hibridų populiacijos. Metodas dažniausiai
taikomas savidulkiams augalams (pvz. avižoms, kviečiams, miežiams). Vieno savidulkio individo
palikuonys yra vadinami grynąja linija. Individinės atrankos rezultatas – atskiros grynosios linijos.
Esant savidulkai, vyksta homozigotizacijos procesas, todėl šiuo atrankos būdu gautoms veislėms
būdingas didelis genotipinis ir fenotipinis stabilumas.

Augalų bei gyvūnų selekcijoje svarbus yra įvaisos panaudojimas. Įvaisos rezultatas yra grynosios
linijos, kurioms būdingas didelis homozigotiškumo laipsnis. Kadangi daugelis žalingų alelių yra
recesyvios prigimties, daugelio jų homozigotizacija grynosiose linijose sumažina individų
gyvybingumą bei produktyvumą. Tačiau įvaisos būdu individuose stabiliai įtvirtinami ir tam tikri
pageidaujami požymiai. Gautos grynosios linijos su įtvirtintais pageidaujamais požymiais galiausiai
yra kryžminamos tarpusavyje taip iš karto sumažinant kenksmingą įvaisos įtaką. Neretai pavyksta
gauti ir ypač didelio derlingumo augalus.

Šis fenomenas vadinamas heterozės efektu. Jo esmė – ypač didelis pirmos hibridų kartos
gyvybingumas ir derlingumas, pralenkiantis ne tik įvaisines linijas, bet ir tas tėvines formas, kurios
buvo naudojamos įvaisinėms linijoms išvesti. Manoma, kad taip nutinka todėl, kad daugelis genų
pirmojoje tokių hibridų kartoje būna heterozigotinėje padėtyje (pasireiškia vadinamasis heterozigotų
pranašumas). Toliau tarpusavyje kryžminant hibridus, kuriems būdinga heterozė, jos efektas
vėlesnėse kartose blėsta. Todėl, siekiant praktikoje panaudoti heterozės efektą, reikia auginti tik F1
hibridus. Jų sėklos gaunamos nuolatos tarpusavyje kryžminant grynąsias įvaisines linijas.
Heterozigotiniai augalų individai taip gali būti dauginami ir vegetatyviškai, jeigu toks dauginimas
pasirodo ekonomiškai geresnis.

Atrankos efektyvumas tuo didesnis, kuo įvairesnė pradinės medžiagos genetinė įvairovė. Tai gali būti
pasiekiama, pavyzdžiui, kryžminant skirtingos geografinės kilmės individus. Jei pradinės medžiagos
genetinė įvairovė nedidelė, tuomet atranka yra mažai efektyvi.
Produktyvesni augalai gali būti gaunami ieškant didesnio ploidiškumo individų. Jie retkarčiais
atsiranda spontaniškai dėl mejozės (susidaro ne haploidinės gametos) ar apvaisinimo klaidų
(kiaušialąstė apvaisinama ne vieno spermio). Kartais poliploidai gali būti gaunami augalus auginant
iš pasenusių sėklų. Kadangi didesnis ploidiškumas lemia didesnius augalų organus, dauguma
dabartinių žemės ūkio augalų yra poliploidai (beje, kaip ir nemaža dalis laukinių rūšių).
Alopoliploidai (poliploidai, gaunami suliejus skirtingus genomus) tradiciniais selekcijos metodais
gali būti gaunami atliekant tolimąją lytinę hibridizaciją. Jos panaudojimas yra ypač ribotas dėl rūšių
kryžminimosi barjerų egzistavimo.

Apibendrinant selekcijos principus, reikia atkreipti dėmesį į tai, kad selekcinis principas remiasi
ilgamete individų atranka bent keliose kartose. Selekcijos procesas yra daug laiko reikalaujantis
užsiėmimas. Be to, kryžminant individus su pageidaujamais požymiais didelę įtaką hibridų savybėms
turi ir kombinacinis kintamumas. Taigi, be pageidaujamos kelių požymių kombinacijos, gaunamas ir
kitų požymių derinio persigrupavimas – galutinį selekcijos rezultatą prognozuoti yra sudėtinga ar net
neįmanoma.

Rekombinantinių DNR technologijų sukūrimas ir jų ištobulinimas leidžia izoliuoti atskirus genus ir

perkelti juos (o kartu ir pageidaujamą savybę) į norimą organizmą. Atsirado galimybė operuoti
atskirais požymiais, o ne ištisais požymių kompleksais, kaip tai daroma klasikinėje selekcijoje. Tapo
įmanoma įveikti vykstant evoliucijai susiformavusį genetinės informacijos mainų tarp rūšių barjerą
(jis yra vienas pagrindinių trukdžių klasikinėje selekcijoje). Be to, biotechnologijų panaudojimas
leidžia labai sutrumpinti naujų savybių turinčių individų gavimą – išvengiama atrankos daugelyje
kartų. Pirmas transgeninis augalas buvo sukurtas 1983 m. Nuo to laiko transgeninių augalų
konstravimas, panaudojant genų inžinerijos metodus, įgavo labai plačius mastus. Sukonstruota
daugybė naujų augalų veislių bei producentų, sintetinančių įvairias medžiagas, naudojamas
farmacijos ir maisto pramonėje.

Išskiriamos dvi pagrindinės genų įterpimo į augalus metodų grupės: mechaninis (biolistinis) DNR
įterpimo į ląstelę būdas ir agrobakterinė augalinių ląstelių transformacija. Mechaninis DNR įterpimas
į ląstelę atliekamas panaudojant genų patrankas (angl. gene gun), kuomet ant inertiško nešiklio (pvz.
aukso dulkių) adsorbuota DNR suspaustu heliu mechaniškai įšaunama į augalo ląsteles. Mechaniniam
DNR įterpimui į augalų ląsteles gali būti naudojama ir ant adatiškų silicio karbido kristalų adsorbuota
DNR. Ji į ląsteles patenka kristalams mechaniškai praduriant ląstelių sieneles. Tuomet atliekama
transformuotų ląstelių atranka. Į ląsteles patekusioje DNR visada yra iš anksto įterpiamas ir atrankai
naudojamas genas–žymuo. Jo raiška vyksta tik sėkmingai transformuotose ląstelėse. Tokie genai–
žymenys paprastai lemia ląstelių atsparumo antibiotikams ar kitoms medžiagoms atsiradimą, todėl
atrankos terpėse su šiomis medžiagomis gali augti tik transformuotos audinio ląstelės. Galiausiai
transformuotos ląstelės suformuoja kalių, iš kurio vėliau regeneruojamas visas augalas.

Kitas augalų transformacijos būdas paremtas natūraliai gamtoje augalus parazituojančių dirvožemyje
gyvenančių agrobakterijų (Agrobacterium tumefaciens) atliekamu genų perdavimo mechanizmu.
Agrobakterijose aptinkama savitos struktūros ir paskirties Ti plazmidė (angl. tumor inducing – auglių
atsiradimas). Ši plazmidė dviskilčiuose augaluose sukelia auglių vystymąsi – augalo audinių
išvešėjimą. Ti plazmidė yra dvigrandinė žiedinė DNR, sudaryta iš dviejų struktūriškai ir funkciškai
besiskiriančių dalių – T ir vir (10.31 pav.). Didelė vir regione esančių genų dalis užtikrina bakterijoms
Ti plazmidžių suteikiamą virulentiškumą. vir dalyje esantys genai yra prokariotams būdingos
struktūros, sutelktos į operonus. Ti plazmidės T dalis (angl. transfer – perkelti) yra apie 10–30 kb
dydžio. Ji iš abiejų pusių apsupta 25 nt ilgio pasikartojančių beveik identiškų sekų – kairiojo ir
dešiniojo riboženklių (angl. border). Ti plazmidės T dalyje yra genai, atsakingi už auksino, citokinino
(fitohormonai, sukeliantys augalo audinių hipertrofiją) bei vieno iš opinų (savitų aminorūgščių –
arginino darinių, kuriais minta agrobakterijos) biosintezę augale. Agrobakterinės infekcijos metu į
augalo ląsteles iš bakterijos į augalo genomą pernešama ir integruojama tik T-DNR sritis. Ši dalis ir
yra atsakinga už auglio vystymosi indukciją augaluose. T srityje esantys genai yra eukariotams
būdingos sandaros, kiekvienas genas turi savo individualų promotorių ir yra pritaikytas funkcionuoti
augalo ląstelėse.

10.31 pav. A. tumefaciens Ti plazmidės struktūra

Pagal tai, kokį opiną Ti plazmidės sintetina ir metabolizuoja, jas galima suskirstyti į 3 grupes:
nopalino, oktopino ir agropino plazmides. Infekavusios augalą ir integravusios savo Ti plazmidės T
dalį į augalo genomą, agrobakterijos augale sukelia auglio, kuris gamina opinus, vystymąsi. Opinai
agrobakterijoms tarnauja kaip azoto ir anglies šaltinis. Patys augalai opinų nenaudoja.

Augalų agrobakterinė transformacija pagrįsta tuo, kad Ti plazmidės vir srities genų koduojami
baltymai perneša bet kokią tarp riboženklių esančią T-DNR: pakeitus Ti plazmidės T dalį norimais
transgenais, šie įvedami ir integruojami į augalo genomą. Be to, auglį sukeliančių genų pašalinimas
iš T dalies apsaugo augalą nuo kenksmingo plazmidės poveikio. Šiuo metu transgeniniuose
augaluose, skirtuose maistui, uždrausta naudoti atrankos genus, lemiančius transformantų atsparumą
antibiotikams. Todėl šie žymenys tam tikromis genetinėmis sistemomis po transformantų atrankos
yra pašalinami.

Ti plazmidė yra didelė ir netinkama tiesioginiam darbui in vitro, todėl tikslinių genų įterpimas
atliekamas rekombinacijos in vivo būdu. Iš pradžių sukonstruojama E. coli plazmidžių pagrindu
integracijai skirta struktūra – tiksliniai ir atrankai skirti genai patalpinami tarp T-DNR riboženkliams
homologiškų sekų. Tokia plazmidė konjugacijos metu iš E. coli įterpiama į agrobakterijas. E. coli
plazmidė agrobakterijose nesireplikuoja. Todėl (auginant jas ant selektyvios terpės) lengvai
atrenkamos agrobakterijos, kuriose E. coli plazmidė rekombinavo su Ti plazmide – Ti plazmidė įgavo
geną, koduojantį atsparumą selekcijai naudotam antibiotikui. Gaunamos modifikuotos Ti plazmidės,
kuriose T genai pakeisti transgenais ir atsparumą antibiotikams suteikiančiais genais. Ši sistema dar
vadinama kointegracinių vektorių sistema.

Šiuo metu sukurta ir kitokių sistemų darbui su Ti plazmide. Viena iš tokių yra dviejų
besireplikuojančių plazmidžių sistema, dar vadinama binarinių vektorių sistema. Į vieną iš
pagalbinių plataus spektro plazmidžių, besireplikuojančių tiek E. coli, tiek agrobakterijose, įterpiama
vir dalis, į kitą plazmidę – T dalis, turinti transgenus. E. coli bakterijose, dėl in vivo rekombinacijos,
pirmos plazmidės T dalis perkeliama į antrąją plazmidę (turinčią vir dalį). Pastaroji galiausiai
konjugacijos arba transformacijos būdu įterpiama į agrobakterijas.

Agrobakterinės transformacijos metodo pranašumai yra jo paprastumas, tikslus genų pernešimas,

didelis transformacijos dažnis, retas transgeno nutildymas, galimybė įterpti didelius DNR fragmentus
(>150 kb). Pasitelkus agrobakterijas, galima transformuoti mieles, Aspergillus šeimos pelėsinius
grybus, net žinduolių ląsteles. Trūkumai – sunkumai transformuojant vienaskilčius augalus bei
galimybė įterpti genus tik į genominę DNR. Chloroplastų genomas (cpDNR) modifikuojamas tik
mechaninio įvedimo būdais.
Egzistuoja ir didelė grupė virusų pagrindu sukurtų vektorių augalams transformuoti. Jie naudojami
stipriai laikinajai genų raiškai gauti heterologinių baltymų ar kitokių medžiagų sintezėje. Augalų
transformacijai galima panaudoti protoplastų sistemą. Jos pranašumas – galima taikyti bakterijoms
tinkamus paprastus transformacijos būdus: elektroporaciją ar veikimą PEG (polietilenglikolio)
tirpalu.

Bendrieji gyvulių selekcijos principai tokie pat kaip augalų, tačiau yra tam tikrų skirtumų. Kadangi
gyvuliai dauginasi tik lytiniu būdu, jiems netinka selekcijos formos, susijusios su savidulka ir
vegetatyviniu dauginimusi. Be to, gyvulių selekcijoje sunku gauti masinę medžiagą. Todėl kiekvienas
atskiras individas yra vertingas, o palikuonių taip būna santykinai nedaug. Dirbant gyvulių selekcijos
srityje ypač svarbi yra gyvulių eksterjero požymių (išorinių formų visuma, kūno sudėjimas, kūno
matmenų santykiai) apskaita. Daugelio svarbių ūkinių požymių vystymasis yra susijęs su tam tikru
kūno sudėjimu, kraujotakos ir kvėpavimo sistemų ypatumais. Todėl gyvulių selekcijoje ypač svarbu
atsižvelgti į atskirų požymių koreliaciją.

Išskiriami du pagrindiniai gyvulių kryžminimo metodai – negiminingas ir giminingas kryžminimas

(autbridingas ir inbridingas). Parenkant tėvus, svarbu žinoti jų genealogiją. Gyvulių, kaip ir augalų,
selekcijoje giminingas kryžminimas paprastai būna naudojamas tik kaip vienas etapų heterozei gauti.
Taip pat, gyvulių selekcijoje (nors ir ribotais mastais) taikoma ir tolimoji lytinė hibridizacija. Taip
gaunami mulai (kumelės ir asilo hibridai), dvikuprių ir vienkuprių kupranugarių hibridai. Tiek
gyvūnų, tiek augalų tolimoji lytinė hibridizacija mūsų laikais taikoma labai retai – ją išstūmė žymiai
pranašesni biotechnologiniai ląstelių suliejimo metodai.

Genetiškai modifikuotų gyvūnų kūrimas galėtų atnešti didelę naudą žemės ūkiui ar medicinai.
Transgeninių gyvūnų kūrimas prasidėjo prieš keletą dešimtmečių, pagrindiniai jų konstravimo
principai buvo sukurti daugiau kaip prieš dvidešimt metų (ir mažai pakito iki šiol). Kuriant
transgeninius gyvūnus ir siekiant išvengti gyvūnų kankinimo, labai svarbūs įstatymai,
kontroliuojantys ir reglamentuojantys darbo su gyvūnais principus.

Pagrindiniai transgeninių gyvūnų konstravimo metodai sukurti remiantis pelių modeliu. Transgenai į
gyvūnų ląsteles dažniausiai įterpiami elektroporacija ar virusiniais vektoriais. Transformacijai tinka
ankstyvojo embrioninio vystymosi stadijos: zigota, 4–8 ląstelių stadijos embrionas, genetiškai
modifikuotų embrionių kamieninių (EK) ląstelių (angl. embryonic stem cells) įterpimas į blastocistą.
Pats veiksmingiausias gyvūnų transformacijoje yra blastomerų pakeitimas EK ląstelėmis blastocistos
stadijoje.

Galimybė in vitro auginti ir dauginti EK ląsteles labai supaprastino genų modifikavimo technologijas.
Šios ląstelės kilusios tiesiogiai iš blastocistos. Jos gali būti dauginamos (bei pervežamos) kaip ląstelių
kultūra. EK ląstelės yra pluripotentinės – gali vystytis į visų tipų ląsteles, jeigu įšvirkščiamos į
blastocistą. Į tokias ląsteles įvairiais transformacijos metodais (virusiniais vektoriais, elektroporacija
ir kt.) galima įterpti reikalingus genus, atrinkti ląsteles, kuriose vyksta transgeno raiška, o jas
padauginus perkelti į pelės blastocistą. Galiausiai, gyvybingi taisyklingai besivystantys embrionai yra
įsodinami į hormonais paruoštos patelės – surogatinės motinos gimdą. Pažymėtina, kad tik zigotos ar
lytinių ląstelių transformacija leidžia gauti gyvūnus, transgeną turinčius visose savo organizmo
ląstelėse. Visais kitais atvejais gaunami mozaikiniai individai, kurių organizmai sudaryti iš didesnių
ar mažesnių skirtingo genotipo plotų – kuo ankstesnėje vystymosi stadijoje atlikta transformacija, tuo
didesni bus transgeną turintys kūno regionai.

10.12. Transgeninių gyvūnų panaudojimas žemės ūkyje

Nors visuomenėje didžiausio atgarsio ir diskusijų sulaukia klausimai, susiję su genetiškai
modifikuotų augalų naudojimu maistui, pašarams (ir kt.), biotechnologiniais metodais taip pat
tobulinamos ir maistui (bei kitoms reikmėms) auginamų gyvulių savybės. Be jau minėto transgeninių
gyvulių panaudojimo biofarmacijos produktų gamybai (antikūnų, kraujo sudėtinių dalių gamybai,
organų ksenobiotinėms transplantacijoms), transgeniniai gyvūnai kuriami ir kitiems tikslams.
Biotechnologiniais metodais tobulinamas gyvulių kūno sudėjimas ir vidinės sandaros ypatumai,
pieningumas, vilnos kiekis ir savybės, atsparumas ligoms ir kai kuriems abiotiniams veiksniams.

Parodyta, jog transgeninėms kiaulėms, kurioms genų inžinerijos metodais sustiprinta augimo
hormono sintezė, būdingi geresni ekonomiškai svarbūs požymiai – spartesnis augimas, maisto
įsisavinimas, kūno riebalų/raumenų santykis. Augimo hormono sintezė sustiprinta prie žmogaus
metalotioneino promotoriaus prijungus kiaulių augimo hormono geno struktūrinę dalį. Skirtingai nuo
ankstesnių panašaus pobūdžio bandymų, pastarasis nesukėlė sunkių transgeninių gyvūnų sveikatos
sutrikdymų. Nustatyta, jog kiaulės, turinčios į žmogaus insuliną panašaus augimo veiksnio I geną
turi mažiau riebalų ir didesnę raumenų masę (jų mėsa sveikesnė, nes yra liesesnė už įprastų kiaulių).
Sveikesnę mėsą turinčios kiaulės sukurtos ir kitokiu būdu – panaudojus špinatų desaturazės transgeną.
Jis padidina nesočiųjų riebalų rūgščių kiekį kiaulienoje. Nepaisant sėkmingų rezultatų, komercinis
tokių transgeninių gyvulių auginimas kol kas neįgyvendintas dėl visuomenės skeptiškai vertinamo
GMO naudojimo maistui.

Kita biotechnologijos kryptis gyvulininkystėje yra pieningumo ir pieno sudėties keitimas. Kadangi
pieno fizikochemines savybes didžiąja dalimi lemia jame esančio baltymo kazeino atmainų
tarpusavio santykis, šis baltymas galėtų būti pagrindinis transgenezės taikinys. Tai leistų kryptingai
keisti pieno savybes. Tyrimai su transgeninėmis pelėmis parodė, kad šiuo būdu iš tiesų įmanoma
keisti pieno savybes. Tačiau gyvūnams dažnai išsivysto įvairių sveikatos sutrikimų. Kol kas tokie
sutrikimai yra ribojantis veiksnys stambesnių žemės ūkio gyvulių su pakeistomis pieno savybėmis
kūrimui.

Naudojantis biotechnologiniais metodais, siekiama sukurti galvijus, duodančius „hipoalergišką“

pieną (šie gyvuliai turi išveiklintą pieno alergeną β-laktoglobuliną koduojantį geną). Taip pat
siekiama sukurti pieną, neturintį laktozės. Norima susilpninti arba išveiklinti (angl. knock-out, knock-
down) α-laktalbumino geną – šio geno koduojamas baltymas yra vienas pagrindinių veikėjų pieno
cukraus laktozės sintezės kelyje. Be to, siekiama sukurti naujagimiams pritaikytą pieną (su žmogaus
laktoferinu), ilgiau nerūgstantį pieną, kurio sudėtyje yra didesnis kiekis lizocimo ir kt.

Naudojantis transgeninių pelių modeliu, nustatyta, kad išveiklintą α-laktalbumino kopiją

hemizigotinėje padėtyje turintys gyvūnai savo piene sintetina 50–85 % mažiau laktozės. Tačiau
homozigotinių pagal šį išveiklintą geną pelių pienas pasirodė esantis per tirštas ir netinkamas
jauniklių maitinimui. Kol kas pieno modifikavimo galimybės plačiausiai tiriamos pasinaudojant pelių
modeliais. Didesnių žemės ūkiui svarbių transgeninių gyvulių kūrimą riboja teisiniai bioetiniai
suvaržymai, tačiau ir šios srities tyrimai nestovi vietoje. Vienas pavyzdžių – transgeninės kiaulės,
turinčios jaučio laktalbumino transgeną. Jis lemia didesnę laktozės koncentraciją piene bei didesnę
pieno išeigą (o tuo pačiu ir geresnį paršiukų išgyvenamumą bei vystymąsi). Taigi, net ir pieno
pramonės atžvilgiu neperspektyvių gyvulių pieno sudėties keitimas gali būti naudingas didinant
bendrąjį žemės ūkio našumą.

Dar viena žemės ūkiui svarbi genetiškai modifikuotų gyvūnų kūrimo kryptis yra vilną auginančių
gyvulių savybių keitimas. Parodyta, kad transgeninių avių, kurių odoje vyksta insulino augimo
veiksnio (IGF1) raiška, vilnos išeiga yra 6 % didesnė nei įprastų avių. Be to, tokioms avims beveik
neišsivysto rimtesnių sveikatos ar reprodukcinės sistemos sutrikimų. Vilnos išeigą galima padidinti
atstačius kai kurių aminorūgščių (cisteino, kurio biosintezė įprastai žinduoliuose nevyksta)
biosintezę. Tačiau kol kas pastangos šioje srityje nebuvo pakankamai vaisingos.
Bandomi kurti ir draugiški aplinkai transgeniniai gyvuliai. Pavyzdžiui, sukurtos transgeninės kiaulės,
seilių liaukose sintetinančios bakterinę fitazę, leidžiančią suvirškinti su augaliniu maistu gaunamus
fitatus. Organinis fosforas, esantis fitatų sudėtyje, yra sunkiai įsisavinamas, todėl su mėšlu patekęs į
dirvožemį yra suskaidomas bakterijų. Susidarę neorganiniai fosforo junginiai gali patekti į gruntinius
vandenis bei kauptis dirvožemyje. Transgeninės kiaulės, gebančios skaidyti fitatus, ne tik sumažina
aplinkos taršą fosforo junginiais (mėšle esančio fosforo kiekis dėl to sumažėja iki 75 %), bet ir geba
organizmą papildomai aprūpinti fosforu. Tokios aplinkai draugiškos kiaulės artimiausiu metu
planuojamos pradėti auginti Kanadoje.

Labai svarbi žemės ūkio gyvulių savybė yra jų atsparumas ligoms. Atsparumui pagerinti naudojamos
kelios transgenezės strategijos. Iš jų perspektyviausios – MHC komplekso, T-limfocitų receptorių,
imunoglobulinių, limfokinų ar savitą atsparumą ligoms lemiančių genų perkėlimas į ekonomiškai
svarbius žemės ūkio gyvulių organizmus.

Siekiant padidinti kiaulių atsparumą ligoms, į jų genomą buvo įterptas graužikų Mx1 genas, lemiantis
atsparumą gripui. Tačiau šio baltymo raiškos transgeninėse kiaulėse gauti nepavyko. Taip pat
bandoma sukurti gyvulius, nesergančios prionų sukeliamomis ligomis – jaučių spongioformine
encefalopatija (dar vadinama kempinlige), avių skrepi (angl. scrapie) ir kt. Tam yra kuriami gyvuliai
su išveiklintu priono lokusu. Iš pradžių bandyta gauti priono geno defektą turinčias avis, tačiau tokie
ėriukai žuvo netrukus po gimimo. Kiek sėkmingesni bandymai gauti priono geno defektą turinčius
galvijus. Šie galvijai galėtų ne tik pasitarnauti kaip tyrimo modelis tiriant žmogaus spongioforminės
encefalopatijos vystymąsi, bet taip pat būtų svarbūs mažinant prionligių nešiotojų skaičių fermose.

Sumažinti pieninių galvijų pieno liaukos ligų dažnį galima padidinant lizocimo kiekį piene.
Lizocimas neleidžia piene vystytis uždegimus sukelti galinčioms bakterijoms. Panašiomis
bakteriostatinėmis ir baktericidinėmis savybės pasižymi ir žmogaus daugiafunkcis baltymas
laktoferinas. Jis geba ir pernešti geležį, todėl šio baltymo raiška karvės pieno liaukose ne tik padarytų
karvės pieną tinkamesnį kūdikių mitybai (dėl jame esančio didesnio geležies kiekio), bet ir sumažintų
tešmens infekcijų dažnį. Taip pat parodyta reikšminga bakterinio baltymo lizostafino įtaka auksinio
stafilokoko (Staphylococcus aureus) sukeliamo mastito (tešmens uždegimo) profilaktikai. Sukurtos
lizostafiną į pieną išskiriančios transgeninės karvės, atsparios minėto tipo mastitui.

10.13. Genetiškai modifikuotų augalų išskirtinės savybės, jų kūrimo istorijos ir naudojimo

problemos
Javų savybių gerinimas prasidėjo vos tik šie augalai imti domestikuoti – augintojai atrinkdavo ir
sėdavo geriausias savybes turinčių augalų sėklas. Laikoma, kad žemdirbystė vystėsi kaip kultūrinės
evoliucijos dalis, o žmonių domestikuoti javai po pasaulį išplito iš kelių ar keliolikos (skirtingi
autoriai nurodo nuo 8 iki 12) skirtingų domestikacijos centrų Azijoje (Artimieji rytai, Pietų bei
Šiaurės Kinija), Amerikoje (Pietų Amerika, Centrinė Meksika, dabartinės JAV rytinė dalis), Afrikoje
(žemiau Sacharos esančios teritorijos) ir vakarinės Ramiojo vandenyno salose (Naujoji Gvinėja).

Pirmoji žemdirbystės revoliucija (vadinama „neolito revoliucija“) prasidėjo maždaug 8000 m. prieš
Kristų, kai žmonės perėjo nuo pasisavinamojo ūkio prie gamybinio. Artimuosiuose Rytuose pradėta
kultivuoti augalus ir jaukinti gyvulius. Nuo pat pradžių žemdirbystės praktikavimas buvo susijęs
natūraliais gamtiniais energijos ir maisto medžiagų ciklais, kuriuos žmonės panaudojo kurdami
agroekosistemas.

Vis tobulėjančios augalų auginimo ir veisimo technologijos leido sukurti naujas, prie savitų kiekvieno
regiono aplinkos sąlygų bei įvairių veiksnių keliamo streso geriau pritaikytas (ir todėl lengviau
kultivuojamas) javų veisles. Be to, geresniam derliui gauti pradėti naudoti pesticidai, herbicidai ir
dirbtinės trąšos, užtikrinantys didelį veislių derlingumą. Per pastaruosius 60 metų augalų veislių
kūrėjai sėkmingai kūrė ir tobulino didelio derlingumo veisles, praturtindami jas naudingais genais.
Tokių genų šaltinis neretai būdavo laukiniai augalai. Visi šie žemdirbystės pasiekimai bendrai yra
vadinami „žaliąja revoliucija“ (angl. green revolution), arba „antrąja žemdirbystės revoliucija“,
leidusia smarkiai padidinti žemės ūkio produktyvumą visame pasaulyje. Tačiau nuolatos tebeauganti
žmonių populiacija ir mažėjantys tinkamos žemdirbystei žemės plotai verčia ieškoti būdų, kaip kurti
dar didesnį derlių duodančias žemės ūkio kultūrų veisles. Šiuo metu vyksta „trečioji žemdirbystės
revoliucija“ – „genų revoliucija“ (angl. gene revolution; neatsitiktinai šis sąskambis panašus į green
revolution). „Genų revoliucija“ turi didelį potencialą kuriant naujos kartos augalus, atsparius
abiotiniams stresams, patogenams ir vabzdžiams. Ji paremta genų inžinerijos ir biotechnologijos
pasiekimais, leidžiančiais kurti ne tik atsparesnius aplinkos poveikiui augalus, bet ir maistingesnius
ar naujų sveikatinančių savybių turinčius augalus (auksiniai ryžiai, praturtinti β-karotenu).

Terminas „žalioji revoliucija“ pirmą kartą buvo panaudotas apie 1930 m., žemės reformoms Rytų
Europoje apibūdinti. Mūsų laikais šis terminas paprastai vartojamas apibūdinti žemės ūkio permainas,
vykusias 1950–1960 m. Po Antrojo pasaulinio karo žmonių skaičius Pietų Azijos šalyse pradėjo augti
ypač sparčiai. Dėl to padidėjo šių šalių skurdas ir atsirado didelis maisto stygius. Šiose šalyse
užauginamų kviečių ir ryžių derlius buvo santykinai mažas dėl primityvios žemdirbystės praktikos.
Javų veislės buvo tinkamos auginti tik lokaliai, tam tikrose vietovėse esančiomis sąlygomis, o ne
visuose tinkamuose regionuose. Itin derlingų veislių, modernių ūkininkavimo metodų naudojimas
(cheminės trąšos, pesticidai, darbų mechanizavimas) labai pagerino javų produktyvumą įvairiose
pasaulio šalyse. Taigi „žalioji revoliucija“ pagerino maisto kiekį visame pasaulyje – buvo išvengta
didelio masto bado.

„Žaliosios revoliucijos“ pradininku ir palaikytoju laikomas amerikietis dr. Normanas Borlaugas.

Mokslininko iniciatyva jo paties sukurtos javų veislės, modernios žemės ūkio technologijos bei
patobulinti auginimo metodai buvo pradėti naudoti Indijoje, Meksikoje ir Pakistane, o vėliau ir
Kinijoje bei Afrikoje. N. Borlaugas pats gyvendavo šiose šalyse ir padėdavo šių naujovių progresui.
Apskaičiuota, kad jo dėka visame pasaulyje buvo išgelbėta daugiau nei 1 mlrd. žmonių gyvybės. 1970
m. N. Borlaugui buvo įteikta Nobelio taikos premija.

Vienas esminių pasiekimų, sukėlusių „žaliąją revoliuciją“, buvo intensyvus javų tręšimas
azotinėmis trąšomis. Tačiau didelis azoto kiekis ne tik pagausindavo grūdų derlių, bet ir skatino iki
tol naudotų javų veislių stiebų ilgėjimą. Tokie aukštesni augalai buvo nepakankamai atsparūs
išgulimui ir nenulaikydavo varpų su sunkesniais grūdais. Kitas esminis šios revoliucijos laimėjimas
buvo pusiau žemaūgių kviečių ir ryžių veislių sukūrimas. Pusiau žemaūgiai kviečiai buvo sukurti
Japonijoje dar XIX a. pabaigoje, sukryžminus pusiau žemaūgių kviečių veislę Daruma su keliomis
labai derlingomis JAV žieminių kviečių veislėmis. Šio eksperimento rezultatas buvo ypač derlinga
pusiau žemaūgė kviečių veislė Norin 10. Vėliau JAV mokslininkai Norin 10 sukryžmino su vietine
veisle Brevor ir 1954 m. šį hibridą atidavė tuo metu Meksikoje gyvenusiam N. Borlaugui. Ten jis (su
kolegomis) iš šio hibrido sukūrė dar kelias naujas pusiau žemaūgių kviečių veisles, iš kurių labiausiai
pasisekusi buvo veislė 8156 – tai buvo N. Borlaugo 8156-asis kryžminimas! Vėliau ši ir kitos veislės
buvo išsiųstos auginti į Indiją ir kitas besivystančias šalis.

Pusiau žemaūgių ryžių kūrimas vyko panašiu metu kaip ir kviečių veislių tobulinimas. Ryžių
žemaūgiškumo genas buvo lokalizuotas ir identifikuotas Kinijos ryžių veislėje Dee-geo-woo-gen
(DGWG), kuri Taivano mokslininkų buvo sėkmingai panaudota kuriant pusiau žemaūgių ryžių veislę
Taichung Native-1 (TN-1). Kryžminant Dee-geo-woo-gen su Indonezijos veisle Peta (aukšta gerai
deranti veislė iš Indonezijos), Tarptautiniame ryžių tyrimų institute (angl. International Rice
Research Institute) Filipinuose buvo sukurta pusiau žemaūgė veislė IR-8 (10.32 pav.). Iš šių abiejų
ryžių veislių (TN-1 ir IR-8) vėliau buvo sukurta daugybė ryžių porūšio indica veislių, auginamų
tropiniuose ir subtropiniuose regionuose.
Pusiau žemaūges ryžių veisles taip pat kūrė ir kiti mokslininkai JAV, Japonijoje ir Kinijoje. Visos
šios pusiau žemaūgės veislės labai derlingos, palyginus su iki tol augintomis tradicinėmis. Veislės
buvo tinkamos auginti drėkinamuose plotuose, naudojant chemines trąšas bei pesticidus. Jos
pasižymėjo daug geresniu derlingumu, paprastesne agrotechnika. Naujosios ryžių veislės leido
sėkmingai panaudoti užmirkusius ir užliejamus žemės plotus. Iš tokių teritorijų gaunamas ryžių
derlius buvo 5 kartus didesnis palyginus su tradicinėmis, po vandeniu sodinamomis ryžių veislėmis.
Dėl „žaliosios revoliucijos“, ypač derlingos pusiau žemaūgės kviečių ir ryžių veislės šiuo metu užima
atitinkamai 84 ir 74 % žemdirbystei tinkamų plotų. Irigacija (drėkinimas) išaugo daugiau nei 2 kartus,
o trąšų sunaudojimas padidėjo daugiau nei 30 kartų. Šių pasikeitimų pasekmė – ryžių ir kviečių
derliaus padidėjimas nuo 127 mln. tonų 1960 m. iki 760 mln. tonų 2000 m.

10.32 pav. Ryžių veislė IR-8 ir jos tėvinės formos – veislės Peta ir Dee-geo-woo-gen (DGWG)
(nuotrauka iš International Rice Research Institute)

Nors laikoma, kad „žalioji revoliucija“ 1950 m. prasidėjo Meksikoje, jos ištakomis galima laikyti
1930–1940 m. JAV ūkininkų sėkmingai išvestų hibridinių gerokai produktyvesnių kukurūzų veislių
sukūrimą. Tuomet šios revoliucijos banga išplito iš JAV į Meksiką ir Indiją (1950 m.), Pakistaną ir
Filipinus (atitinkamai 1950 m. ir 1970 m.), o vėliau pasiekė ir Kiniją (1980 m.). 1960 –2000 m.
nemažai kitų šalių (Afganistanas, Indonezija, Iranas, Kenija, Malaizija, Marokas, Šri Lanka,
Tailandas, Tunisas ir Turkija) taip pat pradėjo taikyti panašią žemdirbystės technologiją, veisles.
Šalys sulaukė panašių, sėkmingų rezultatų.

Vienas ryškiausių „žaliosios revoliucijos“ pavyzdžių yra Indijos žemės ūkio persitvarkymas. Po
1950-ųjų metų, Indijai atgavus nepriklausomybę nuo Didžiosios Britanijos, joje buvo užauginamas
labai prastas javų derlius. Buvo nemažai manančių, kad Indija pati nesugebės išmaitinti savo
gyventojų populiacijos. Tačiau naujų Meksikoje išvestų žemaūgių didelio derlingumo javų
introdukcija leido vien Punjabo valstijoje užauginti 2–3 kartus didesnį derlių nei buvo užauginamas
visoje Indijoje iki tol. Šis „stebuklas“ suteikė tvaraus žemės ūkio augimo vilčių, todėl naujosios javų
veislės buvo pradėtos auginti ir kituose aplinkiniuose regionuose.

Bendradarbiaujant JAV Fordo fondui ir Indijos vyriausybei, buvo pradėti importuoti kviečių grūdai
iš Tarptautinio kukurūzų ir kviečių gerinimo centro (angl. International Maize and Wheat
Improvement Centre) Meksikoje, skirti auginti Indijos ūkių laukuose. Netrukus Indija pati ėmė
vykdyti revoliuciją, kurdama naujas javų veisles, plėtodama drėkinimo sistemas ir naudodama
agrocheminius preparatus (chemines trąšas ir medžiagas kenkėjų kontrolei). Visų šių pastangų
rezultatas buvo įspūdingas: bendras grūdų derlius išaugo nuo 74 mln. tonų 1960 m. iki 100 mln. tonų
1980 m. ir 134 mln. tonų 1990 m. Šių dienų Indijoje (kuri po nepriklausomybės atgavimo buvo
priversta importuoti maisto žaliavas savo žmonėms išmaitinti) užauginamas perteklinis javų derlius
yra eksportuojamas į užsienio šalis.
Svarbu atkreipti dėmesį, kad „žalioji revoliucija“ nebuvo vienkartinis javų savybių pagerinimas. Šis
reiškinys išliko tęstinis ir tapo ilgalaike tendencija, peraugusia į antrąją revoliucijos bangą – „genų
revoliuciją“, mūsų laikais įgaunančią vis didesnį mastą. Esminis skirtumas tarp pirmosios ir antrosios
revoliucijos bangų, yra augalų kūrimo strategijos:

 Pirmoji banga („žalioji revoliucija“). Jos metu augalų veislės buvo kuriamos ieškant
natūralių ar dirbtinai indukuotų mutacijų. Augalų atrankai daugiausiai naudoti klasikiniai
selekcijos metodai – kryžminimas ir palikuonių atranka, kartojama bent keliose kartose.
Vienas didžiausių šio etapo pasiekimų buvo žemaūgiškumo genų panaudojimas. Augalų
aukštis yra tiesiogiai susijęs su fitohormonų (ypač giberelinų, GA) koncentracija augaluose:
sumažėjus giberelino GA1 kiekiui gaunami mažesnio ūgio augalai. Nustatyta, kad daugelis
žaliosios pirmosios bangos metu gautų žemaūgių veislių yra giberelinų biosintezės kelio
komponentų mutantai.

 Antroji banga („genų revoliucija“). Tai – biotechnologijų ir DNR manipuliacijos procedūrų

pritaikymas maistui gerinti.

Per pastaruosius porą dešimtmečių žemės ūkio kultūrų tyrimai pagal finansavimo pobūdį palengva
persikėlė iš viešojo sektoriaus į privatųjį. Tokį posūkį nulėmė bent trys tarpusavyje susijusios
priežastys:

 Išplėtota ir sustiprėjusi intelektualinių teisių į inovatyvių augalų kūrimą sistema;

 Didžiulis molekulinės biologijos ir genų inžinerijos (daug lėšų reikalaujančios sritys)
atradimų poreikis;

 Šiuolaikinio žemės ūkio plėtra tampa vis tarptautiškesnė ir atvira.

Visos išvardintos priežastys paskatino privataus kapitalo susidomėjimą šios srities tyrimais. Tarp
1960 m. ir 1980 m. privačios investicijos į augalų savybių gerinimo tyrimus buvo menkos (ypač
besivystančiose šalyse). Pasaulyje trūko efektyvių nuosavybės teisių apsaugojimo mechanizmų. Ši
situacija pasikeitė apie 1990 m. sukūrus kryžmadulkių žemės ūkio kultūrų (kukurūzų) hibridus, kai
atsirado patikima įstatymų bazė. Ji leido tinkamai apsaugoti nuosavybės teises į dirbtinai
sukonstruotus genus ir genetiškai modifikuotus augalus.

Didelės tarptautinės agrocheminių preparatų kompanijos buvo pirmieji investuotojai į transgeninius

javus. Viena priežasčių, kodėl ši sritis sukėlė būtent agrochemijos milžinų susidomėjimą, buvo
toliaregiškas suvokimas apie ateityje didėsiančią pesticidų paklausą transgeniniams augalams auginti
ir palaikyti. Šios kompanijos augalų gerinimo verslą pradėjo greitai supirkdamos tuo metu
egzistavusias sėklų gamybos ir platinimo firmas (iš pradžių išsivysčiusiose, vėliau ir besivystančiose
šalyse).

Norint suprasti privataus sektoriaus investicijų į šiuolaikinio žemės ūkio tyrimus mastą, užtenka
palyginti viešojo ir privataus sektoriaus indėlį į metinį žemės ūkio tyrimų biudžetą. Besivystančiose
šalyse 10 didžiausių tarptautinių moderniosios biologijos srities korporacijų bendros išlaidos žemės
ūkio vystymui ir tyrimams siekia apie 3 mlrd. JAV dolerių. Tuo tarpu vienos didžiausių tarptautinių
viešojo sektoriaus žemės ūkio technologijų tiekėjo Konsultacinės tarptautinių žemės ūkio tyrimų
grupės (angl. Consultative Group on International Agricultural Research) per metus žemės ūkio
tyrimams išleidžiamų lėšų dydis siekia 300 mln. JAV dolerių – 10 kartų mažiau. Geriausiai viešojo
sektoriaus žemės ūkio inovacijų programos finansuojamos Brazilijoje, Kinijoje ir Indijoje. Čia
kiekvienos jų metinis biudžetas žemės ūkio technologijoms vystyti yra kiek mažesnis nei 0,5 mlrd.
JAV dolerių.
Pagrindinis komercinės augalų genų inžinerijos prioritetas šiuo metu yra herbicidams bei vabzdžiams
atsparių augalų kūrimas. Pagrindiniais genetinių modifikacijų taikiniais išlieka keturios žemės ūkio
kultūros – sojos, kukurūzai, rapsai (kanola) ir medvilnė. Be šių pagrindinių genetiškai modifikuotų
kultūrų, Kinijoje nedideliais kiekiais dar kuriami ir auginami virusams atsparūs pomidorai ir pipirai,
lėčiau nokstantys pomidorai, neįprastų spalvų petunijos.

Didžioji dalis genetiškai modifikuotų augalų yra sukurti didelių tarptautinių korporacijų. Jie auginami
besivystančiose valstybėse ir yra skirti daugiausiai Šiaurės Amerikos reikmėms. Šiuo aspektu
išsiskiria Kinija. Ji yra vienintelė besivystanti šalis, auginanti savo pačios viešojo sektoriaus
investicijų sukurtas transgenines veisles. Kitose šalyse genetiškai modifikuotos žemės ūkio kultūros
yra tiesiog importuojamos (arba pritaikomos vietinėms sąlygoms, panaudojus importuotas veisles).

Priešingai nei „žaliosios revoliucijos“ technologijos, transgenezės technologijos yra platinamos

rinkos ekonomikos principais. Dažniausiai tai daroma per komercinę tarptautinių biomedicininės
pakraipos firmų partnerystę. Ši sistema puikiai tinka komerciškai perspektyvioms inovacijoms gerai
išsivysčiusiose šalyse, tačiau nelabai tinka besivystančioms šalims reikalingoms inovacijoms
(komerciškai nepatrauklių žemės ūkio kultūrų, augalų požymių), būtinoms neturtingiems
ūkininkams, kurti ir platinti. Kadangi didžioji dalis transgeniniams augalams skirtų lėšų ateina būtent
iš privataus sektoriaus, sunku tikėtis, kad viešasis sektorius išgalėtų adekvačiai dotuoti verslui
nepatrauklių transgeninių kultūrų kūrimą.

Be to, didžioji dalis privataus kapitalo sukoncentruota į vos kelių kultūrų – sojų, kukurūzų, rapsų ir
medvilnės savybių gerinimą. Privataus sektoriaus indėlis į dviejų svarbiausių pasaulyje maistinių
kultūrų – ryžių ir kviečių savybių tobulinimą yra santykinai nedidelis. Vienas iš ryškiausių „genų
revoliucijos“ laimėjimų yra auksinių ryžių (angl. golden rice) sukūrimas. Šie ryžiai buvo skirti kovai
su vitamino A avitaminoze: kasmet nuo šio vitamino stokos pasaulyje apanka 250–500 tūkst. vaikų,
o 2,2 mln. žmonių (daugiausai Pietryčių Azijoje ir Afrikoje) dėl šios priežasties kasmet miršta.

10.33 pav. β-karoteno sintezės kelias auksiniuose ryžiuose

Ryžių augalai geba sintetinti vitamino A pirmtaką β-karoteną savo žaliuosiuose audiniuose. Tačiau
šios medžiagos sintezė nevyksta endosperme – sėklos raidos metu β-karoteno sintezės kelias yra
blokuojamas (10.33 pav.). Geranilgeranil–difosfato sintezė ryžių endosperme vyksta, tačiau jame
nevyksta fitoeno sintetazės raiška. Todėl blokuojamos visos tolesnės β-karoteno biosintezės
reakcijos. Kuriant auksinius ryžius (jie sukurti 1999 m.) buvo panaudotas fitoeno sintetazės genas iš
narcizų. Siekiant supaprastinti vėliau vykstančių reakcijų kelią, į ryžius iš dirvožemio bakterijos
Erwinia herbicola buvo perkeltas genas crtI. Jis koduoja vieną baltymą, funkciškai pakeičiantį trijų
endogeninių baltymų grandinės atliekamas reakcijas (tai leido supaprastinti biocheminį sintezės
kelią). Panaudojus agrobakterinę transformaciją buvo gauti pirmosios kartos auksiniai ryžiai. Juose
β-karoteno sintezė nebuvo intensyvi: paaiškėjo, kad sintezės greitį ribojantis veiksnys yra „lėta“
narcizų fitoeno sintetazė. Todėl ji buvo pakeista analogišku genu iš kukurūzų. Toks patobulinimas
leido sukurti antrosios kartos auksinius ryžius, kuriuose β-karoteno sintezė vyko gerokai efektyviau:
1 g pirmosios kartos auksinių ryžių turi 6 μg β-karoteno, o antrosios kartos – 25 μg (10.34 pav.)

10.34 pav. Narcizų fitoeno sintetazės pakeitimas kukurūzų homologu leido padidinti β-karoteno
kiekį ryžių grūduose 4 kartus (nuotrauka iš Report from the Bertebos Conference in Falkenberg, Sweden).

Genų inžinerijos metodais taip pat sukurtos ir transgeninės žemaūgės ryžių linijos. Tam panaudota
giberelino sintezės kelių inžinerija. Aktyvaus giberelino GA3 homeostazė augale priklauso nuo GA3
oksidazės, sintetinančios GA3 iš jo pirmtako GA20, bei GA2 oksidazės – ji aktyvų GA3 paverčia
neaktyviu GA8 (10.35 pav.). Siekiant sumažinti aktyvaus GA3 giberelino kiekį augale, galima slopinti
GA3 oksidazės veiklą arba sustiprinti GA3 skaidančios GA2 oksidazės veikimą. Pasirinkus pastarąjį
GA3 kiekio mažinimo kelią, prie konstitutyviai (nuolatos) veikiančio aktino geno promotoriaus buvo
prijungtas GA2 oksidazės genas. Tačiau neretai tokiems transgeniniams augalams pasireiškė itin
stipraus GA3 deficito požymiai – labai žemas ūgis, nesugebėjimas žydėti ir subrandinti grūdų.
Prijungus GA2 oksidazės geną prie GA3 oksidazės promotoriaus, GA2 oksidazės biosintezė buvo
nuosaikesnė – augalai taip pat buvo mažesnio ūgio, tačiau sugebėjo normaliai žydėti ir subrandinti
grūdus.

10.35 pav. Giberelino sintezės kelių inžinerija gauti žemaūgius ryžius.

A – aktyvaus giberelino GA3 homeostazės palaikymo augale schema ir fenotipiniai padariniai,

prijungus ryžio (Oryza sativa) GA2 oksidazės geno struktūrinę dalį prie aktino (Act::OsGA2ox1) bei
GA3 oksidazės (OsGA3ox2::OsGA2ox1) promotorių.
B – tipiški Act::OsGA2ox1 transformantų fenotipai (WT – laukinis tipas, angl. Wild Type), A-13, A-
7 ir A-16 – skirtingo sunkumo fenotipinės giberelino sintezės sutrikdymo pasekmės.

C – augalai, nesugebantys suformuoti žiedynų.

Augalų transgenezės srityje susidomėjimo sulaukė ir kiti fitohormonai, ypač etenas. Jis yra dujinis
augalų hormonas, reguliuojantis senėjimo procesus, vaisių nokimą, vandens balanso reguliavimą,
sėklų dygimą ir kt. Genų inžinerijos metodais gauti augalai, kurių eteno receptoriai yra nejautrūs
etenui. Tokie modifikuoti pomidorai gerokai lėčiau noksta, o dekoratyvinių augalų (šiuo metu yra
sukurtos transgeninės etenui nejautrios petunijos) žydėjimas trunka daug ilgiau (lėtesnis žiedo
audinių senėjimas).

Nemažai genų inžinerijos darbų atlikta ir didinant javų atsparumą grybelinėms ligoms. Vienas
geriausių pavyzdžių – miežių Mlo lokuso izoliavimas ir įterpimas į neatsparias miežių veisles. Mlo
lokuse esantys skirtingi recesyviniai mlo aleliai suteikia atsparumą įvairių mikromicetų rasių
sukeliamoms grybinėms ligoms. Taip jos apsaugomos nuo atitinkamų mikromicetų rasių.

Panašiai naudojama avr/R sistemos komponentų inžinerija augaluose. 1942 m. Haroldas Floras
pasiūlė specifinį augalų sąveikos su patogenais modelį, vadinamą „genas prieš geną“ (angl. gene-
for-gene) modeliu. Remiantis šiuo modeliu, augalo atsparumas (šeimininko ir patogeno
nesuderinamumas) pasireiškia tada, jei augalas–šeimininkas koduoja R baltymą (angl. Resistance),
kuris atitinka patogeno koduojamą avirulencijos veiksnį avr. Esant tokiam atitikimui, šeimininko
audiniuose greitai aktyvuojami įvairūs atsakai ir infekcija sustabdoma.

Šis mechanizmas užtikrina ne bendrą atsparumą kuriai nors patogeno rūšiai, o tik atskiroms tos
rūšies rasėms. R baltymai yra labai įvairūs savo savybėmis ir aktyvumu: dauguma jų yra
daugiafunkciai. Jiems būdinga greitesnė evoliucija, leidžianti prisitaikyti prie besikeičiančių
patogenų rasių. Tradicinės selekcijos metodais į augalus įterpiami pavieniai R genai greitai tampa
neefektyvūs, nes patogenai greitai adaptuojasi – auginama kultūra vėl tampa jautri atitinkamai rasei.
Todėl šiuo metu kuriami transgeniniai augalai, turintys bent kelis R genus, užtikrinančius atsparumą
kelioms patogeno rasėms iš karto.

Pasinaudojus minėtu modeliu buvo sukurti transgeniniai ryžiai, atsparūs ryžiniam deguliagrybiui
(Magnaporthe oryzae). Jis yra vienas pagrindinių ryžių derlių mažinančių biotinių veiksnių. Taip pat
sukurti ryžiai, turintys receptorinės Ser/Thr baltymų kinazės geną Xa21, lemiantį ryžių atsparumą
bent 29 ryžių rūdis sukeliantiems Xanthomonas oryzae pv. oryzae izoliatams (ši liga gali sunaikinti
iki pusės viso ryžių derliaus).

Atskirą genetiškai modifikuotų augalų grupę sudaro vabzdžiams atsparūs Bt augalai, turintys Cry
transgeną. Didžioji dalis šiuo metu užauginamų kukurūzų yra transgeniniai Bt augalai (JAV,
Kanadoje ir Argentinoje Bt kukurūzai sudaro daugiau nei 80 % viso kukurūzų derliaus). Panaši
situacija yra su medvilne (JAV, Kinijoje ir Australijoje daugiau nei 90 % užauginamos medvilnės yra
genetiškai modifikuota Bt medvilnė).

Biotechnologiniais metodais sukurti ir tebekuriami abiotiniams stresams (ypač vandens deficitui)

atsparūs augalai. Augaluose svarbų vaidmenį atlieka abscizo rūgštis (ABA), dar vadinama streso
hormonu. Ji indukuoja abiotinio streso atsakus, ypač susijusius su vandens deficitu. Pats vandens
deficitas augaluose gali susidaryti dėl skirtingų priežasčių – sausros, didelio druskingumo, žemos
temperatūros ir kt. Tačiau molekuliniu lygmeniu atsakas į visus šiuos stresus vyksta beveik tuo pačiu
keliu. ABA sintezės ir degradavimo biocheminių kelių modifikavimas gali būti panaudojamas
kelioms iš pirmo žvilgsnio skirtingoms problemoms spręsti. Sustiprinus ABA biosintezę buvo gauta
transgeninė medvilnė. Ji yra atsparesnė sausrai (o tai ypač aktualu, nes medvilnė yra labai jautri
vandens stygiui).

Kai kurie genetiškai nepakeisti maistiniai augalai apskritai netinka vartoti maistinėms reikmėms.
Tokie yra rapsai (Brassica napus). Maistiniam aliejui spausti plačiai naudojami rapsai gamtoje
neegzistuoja – laukinių rapsų aliejus maistui netinkamas, nes šiame aliejuje esanti eruko rūgštis
sukelia širdies ligas. Problema buvo išspręsta per 20 metų. Dviejų genų mutacijomis laukiniame rapse
sustabdyta eruko rūgšties sintezė. Laikui bėgant, genetinėmis manipuliacijomis rapsų sėklose nuo 10
 iki ≥85  padidintas oleino rūgšties kiekis (tai mononesočioji riebalų rūgštis, dar vadinama omega-
9), o sočiųjų riebalų rūgščių kiekis sumažintas nuo 15  iki 5 . Toks GMO rapsas yra vadinamas
CANOLA: šis terminas sugalvotas 1978 m. ir yra anglų kalbos žodžių Canadian Oil, Low Acid
akronimas. JAV rapsai pagal svarbą yra antri po sojų – iš jų išspaudžiama 68  viso aliejaus, 3-iojoje
vietoje yra palmių aliejus.

10.14. Ekologinis genetiškai pakeistų organizmų kultivavimo aspektas, nekontroliuojamo

plitimo pavyzdžiai ir apsaugos būdai
Išskiriami du svarbiausi galimo GMO poveikio aplinkai aspektai:

• Tiesioginis GMO poveikis (galimas invazyvumas, toksiškumas, biotinių veiksnių atsparumo

transgenui išsivystymas, dirvožemio bioįvairovės sumažėjimas);

• Netiesioginis poveikis (žemės ūkio technologijų pokyčiai, kenkėjų kontrolės strategijos

pasikeitimai).

Tiesioginis GMO poveikis bioįvairovei ir aplinkai gali atsirasti dėl pačių GMO „pabėgimo“ iš jų
auginimo plotų arba dėl horizontaliosios genų pernašos (iš GMO į laukines rūšis), susiformuojant
piktžolių ir GMO hibridams. Vienas iš GMO auginimo kliuvinių yra galimas jų invazyvumas –
genetiškai modifikuotų augalų arba jų hibridų gebėjimas išplisti už pirminių pasėlių laukų ir tapti
piktžolėmis arba invazyviomis rūšimis kitų rūšių arealuose. Transgenų plitimą iš genetiškai
modifikuotų augalų į aplinką labai palengvina vienas augalų dauginimosi ypatumų – žiedadulkių
(kuriose yra ir transgenas) formavimas.

Siekiant išsiaiškinti, kaip toli gali nuskristi žiedadulkės su transgenais, viename Australijos regione
(kuriame genetiškai modifikuoti augalai niekada nebuvo auginti) buvo pasėti ir auginti herbicidamas
atsparūs transgeniniai rapsai. Aplinkiniuose laukuose auginti herbicidams neatsparūs augalai.
Rapsams subrandinus sėklas buvo tikrinama, kiek herbicidams atsparių individų išauga iš sėklų,
surinktų herbicidams neatsparių rapsų laukuose ir kokiu atstumu nuo genetiškai modifikuotų rapsų
laukų šie herbicidams atsparūs augalai susiformavo. Paaiškėjo, kad toliausiai nuo GMO laukų
pasklidusios žiedadulkės numigravo šiek tiek mažiau nei 3 km. Siekiant išvengti transgenų plitimo į
aplinką per žiedadulkes, bandoma kurti augalus, kuriems būtų būdingas uždaras žydėjimo būdas
(neišsiskleidžiant žiedui) – kleistogamija. Tai mechaniškai užkirstų kelią žiedadulkių dispersijai.

Su GMO žiedadulkėmis susijusi ir kita problema. Bt (vabzdžiams atsparių) transgeninių augalų

žiedadulkėse taip yra vabzdžiams nuodingo Bt toksino, kuris gali nužudyti ir vabzdžius–
apdulkintojus. Didelis skandalas kilo 1996 m., kai JAV Ilinojaus valstijos pasididžiavimas – būriai
didelių drugių monarchų (Danaus plexippus) žuvo jų lervoms mitus karpažolėmis, ant kurių galbūt
buvo Bt kukurūzų žiedadulkių. Nors po kelerių metų buvo pripažinta, kad tai negalėjo būti masinės
monarchų žūties priežastis (dėl per menko žiedadulkių kiekio ant toliau nuo Bt augalų laukų augančių
karpažolių lapų), buvo pasiūlytas šios problemos sprendimo būdas – toksinų transgenus įterpti ne į
branduolio DNR, o į chloroplastų cpDNR (t. y. chloroplastomą). Kadangi formuojantis augalų
žiedadulkėms chloroplastai į jas nepatenka, tokios žiedadulkės yra nenuodingos transgeninius
augalus lankantiems vabzdžiams. Be to, tokiu būdu kartu išvengiama ir transgenų plitimo per
žiedadulkes. Tačiau chloroplasto DNR genų inžinerija yra gana kebli, nes cpDNR transformacija dėl
ribotų transformacijos metodų pasirinkimo yra sudėtingesnė už branduolio DNR transformaciją.

Bijoma ir naudingų vabzdžių (ypač gyvenančių dirvoje) bioįvairovės sumažėjimo genetiškai

modifikuotų Bt augalų laukuose. Lauko bandymuose dvejus metus iš eilės tyrus >370 nariuotakojų
rūšių ir individų skaičiaus dinamiką, reikšmingų skirtumų tarp genetiškai modifikuotos ir įprastinės
medvilnės laukuose gyvenančių nariuotakojų bendrijų nenustatyta. Kita vertus, įprastinę medvilnę
augimo metu reikia purkšti dideliais pesticidų kiekiais, nes šią kultūrą itin puola kenkėjai. Taigi, Bt
medvilnės ekosistemos tikriausiai yra netgi saugesnės nei įprastinės medvilnės.

Taip pat nuogąstaujama ir dėl atsparumo herbicidams išplitimo transgeniniams augalams

kryžminantis su genetiškai artimais laukiniais augalais (pvz. rapsas su svėre) ir taip susiformuojant
vadinamosioms superpiktžolėms. Genetinės informacijos perdavimas iš GMO piktžolėms nebuvo
aprašytas iki 1996 m. Nuo to laiko masinis atsparių herbicidui Roundup (glifosatui) augalų kūrimas
paskatino šiam herbicidui atsparių piktžolių atsiradimą. Aprašyta glifosatui atspari paprastoji
komelina (Commelina communis), baltoji balanda (Chenopodium album) bei vijoklinė rūgtis
(Polygonum convolvulus).

JAV žemės ūkio paskirties plotuose, kuriuose dominuoja glifosatui atsparūs pasėliai, jau yra
išsivysčiusios ekonominius nuostolius atnešančios glifosatui atsparių piktžolių ambrozijos (Ambrosia
artemissifolia, A. trifida), amaranto (Amaranthus palmeri, A. rudis, A. tuberculatus), konizos
(Conyza) ir svidrės (Lolium) rūšys. Panaši situacija yra Argentinoje ir Brazilijoje, kuriose plinta
glifosatui atsparios alepinio sorgo (Sorghum halepense; šiuo metu Argentinoje aptinkamas 10 000 ha
plote), euforbijos (Euphorbia heterophylla) rūšys. Šiuo metu iš viso 16 rūšių augalų yra oficialiai
pripažintos superpiktžolėmis, atspariomis glifosatui. Šios piktžolės sutinkamos 75 % visų genetiškai
modifikuotų pasėlių plotų. Vienas problemos sprendimo būdų – kurti augalus, atsparius kitiems
herbicidams.

Europoje transgeniniai augalai auginami labai menkai, čia susiduriama su itin dideliu tradicinės
žemdirbystės pasipriešinimu. Viena priežasčių, lemiančių didelį genetiškai modifikuotų augalų
populiarumą Amerikoje, yra žemės ūkio struktūros skirtumai: JAV ir kitose Amerikos šalyse pasėlių
laukai yra neblogai izoliuoti nuo gamtos, o Europoje žemės ūkis yra susiliejęs su gamta. Be to,
Europoje egzistuoja žemės ūkio produktų perteklius.

Nustatyta, kad virusams atsparūs augalai skatina naujų virusų atsiradimą, atsparumo mechanizmų
įveikimą ir pagreitina virusų evoliuciją. Šios problemos sprendimas (bent jau dalinis) galėtų būti
atsparumo virusams sukūrimas, į augalus įterpiant savitų antikūnų genus (arba naudojant RNR
interferencijos reiškinį virusų destrukcijai augaluose). Taip pat galimi ir nenumatyti,
neprognozuojami reiškiniai, atsirandantys dėl genetinio ir fenotipinio kintamumo, nelauktų požymių
pasireiškimas dėl genetinės rekombinacijos.

Nepaisant aptartų problemų, GMO nauda neabejotina. Gaunama mažesnė aplinkos tarša, nuo
mechaninės kultivacijos sukeltos erozijos mažiau kenčia dirvos struktūra, padidėja derlius, galima
išvalyti užterštas teritorijas, pigiau ir efektyviau sintetinamos biologiškai aktyvios medžiagos ir kt.
Svarbiausia suprasti, kad nei biotechnologijų keliami pavojai, nei nauda nėra absoliutūs – šiuo
aspektu ypač svarbų vaidmenį vaidina griežta kontrolė, įstatymų bazės kūrimas bei tobulinimas.
Literatūros šaltiniai:

 Bechor O, Smulski DR, Van Dyk TK, LaRossa RA, Belkin Sh. Recombinant
microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli
bearing fabA_::lux fusions. Journal of Biotechnology. 2002;94:125-32.
 Boari G, Mancini IM, Trulli E. Technologies for Water and Wastewater Treatment. Options
Méditerranéennes. 1997;31:261-87.
 Brooker RJ. Genetics. Analysis and Principles (3rd ed.). McGraw-Hill, 2009.
 Buyukgungor H, Gurel L. The Role of Biotechnology on the Treatment of Wastes. African
Journal of Biotechnology. 2009;8(25):7253-62.
 Davies PS. The Biological Basis of Wastewater Treatment. Strathkelvin Instruments Ltd,
2005.
 Gavrilescu M. Environmental Biotechnology: Acievements, Opportunities and Challenges.
Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology. 2010;4(1):1-36.
 Griffiths, A. et al. Introduction to genetic analysis IX ed. 2008 New York: W. H. Freeman
 Hargrove T, Coffman WR. Breeding History. Rice Today. 2006;34-8.
 Hyde, D. R. Introduction to genetic principles 2009 New York: McGraw-Hill
 http://expasy.org/tools/
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
 Johnson WE, Onorato DP, Roelke ME, Land ED, Cunningham M, Belden RC, McBride R,
Jansen D, Lotz M, Shindle D, Howard J, Wildt DE, Penfold LM, Hostetler JA, Oli MK,
O’BrienSJ. Genetic Restoration of the Florida Panther. Science. 2010;329:1641-5.
 Kav NNV, Yajima W, Sharma N, Srivastava S, Krishnaswamy S. Crop Improvement (The
“Gene” Revolution). Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS).
 Kumar A, Bisht BS, Joshi VD, Dhewa T. Review on Bioremediation of Polluted
Environment: A Management Tool. International journal of environmental sciences.
2011;1(6):1079-93.
 Lei Y, Chen W, Mulchandani A. Microbial Sensors. Analytica Chimica Acta . 2006;
568:200-210.
 Lewin, B. Genes IX ed. 2008 Jones & Bartlett publ.
 Lindqvist AK, Verba T. Golden Rice and Other Biofortified Food Crops for Developing
Countries – Challenges and Potential. Åke Barklund, Secretary General and Managing
Director, KSLA, 2009.
 Mikelonis A. Genetic Modification to Create Fungal Resistant Cereal Crops. MMG 445
Basic Biotechnology eJournal. 2006;2:40-45.
 Misner S, Curtis C, Whitmer E. Biotechnology and Food. College of Agriculture and Life
Sciences, University of Arizona (Tucson, AZ). 2008:1-2.
 Nicholl D.S.T. An introduction to genetic engineering. 3rd. ed. 2008 Cambridge univ. Press
 Pandey G, Jain RK. Bacterial Chemotaxis toward Environmental Pollutants: Role in
Bioremediation. Applied and environmental microbiology. 2002;68(12):5789-95.
 Pandya MT. Biotechnology Applications in the Treatment of Industrial Wastewater. Water
& Wastewater Asia. 2006;48-51.
 Pimm SL, Dollar L, Bass Jr OL. The Genetic Rescue of the Florida Panther. Animal
Conservation. 2006;9:115-22.
 Pingali P, Raney T. From the Green Revolution to the Gene Revolution: How will the Poor
Fare? ESA Working Paper. 2005;05-09:1-15.
 Pinstrup-Andersen P, Cohen MJ. Agricultural biotechnology: risks and opportunities for
developing country food security. International Journal of Biotechnology. 2000;2:145-63.
 Pinstrup-Andersen P, Cohen MJ. Modern Biotechnology for Food and Agriculture: Risks
and Opportunities for the Poor. In: Agricultural biotechnology and the poor. Persley GJ and
 Lantin MM (eds). Proceedings of an international conference, The World Bank.Washington
DC, 2000.
 Rančelis V. Augalų genetika. Technologija, Kaunas, 2008.
 S.B. Primrose R.M. Twyman R.W. Old. Principles of Gene Manipulation and Genomics
8th ed., 2011. Wiley
 Singh JS, Abhilash PC, Singh HB, Singh RP, Singh DP. Genetically Engineered Bacteria:
an Emerging Tool for Environmental Remediation and Future Research Perspectives. Gene.
2011;480(1-2):1-9.
 Sisikumar CS, Papinazath T. Environmental Management: Bioremediation of Polluted
Environment. Proceedings of the Third International Conference on Environment and
Health, Chennai, India, 2003.
 Sliesaravičius A, Stanys V. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Kaunas,
2005.
 Sreenivasulu N, Schnurbusch Th. A Genetic Playground for Enhancing Grain Number in
Cereals. Trends in Plant Science. 2012;17(2):91-101.
 Tonukari NJ, Omotor DG. Biotechnology and food security in developing countries.
Biotechnology and Molecular Biology Reviews. 2010;5(1):13-23.
 Uyoh EA, Nkang AE, Eneobong EE. Biotechnology, Genetic Conservation and sustainable
Use of Bioresources. African Journal of Biotechnology. 2003;2(12):704-9.
 Waines JG, Ehdaie B. Domestication and Crop Physiology: Roots of Green-Revolution
Wheat. Annals of Botany. 2007;100:991-8.
 Watson et al. Molecular Biolgy of the Gene. VI ed. 2008 Cold Spring Harbour Lab Press
11.Biomolekulių chemija
11.1.DNR ir RNR elektrinis krūvis, cheminės savybės

Cheminė DNR ir RNR sandara ir struktūra išsamiai buvo aptartos bendrojoje dalyje, todėl čia tik
prisiminkime pagrindinius teiginius ir daugiau dėmesio skirkime nukleorūgščių cheminėms
savybėms. Cheminės savybės yra svarbios atliekant mokslinius tyrimus ir taikomos praktinėje
veikloje. Nukleorūgštys (DNR ir RNR) – tai polinukleotidinės grandinės. Jos sudarytos iš daugybės
nukleotidų, vienas paskui kitą sujungtų į ilgą grandinę.

Nukleotidą sudaro (11.1 pav.):

1. Heterociklinė azotinė bazė (adeninas – A, citozinas – C, guaninas – G, timinas – T, uracilas

– U).
2. Penkis anglies atomus turintis angliavandenis ribozė. DNR molekulėje ribozės 2‘ padėtyje
prisijungę tik vandenilio atomai, RNR molekulės ribozės 2‘ padėtyje vienas vandenilio
atomas pakeistas -OH grupe.
3. Fosforo rūgšties liekana.

A G

C U T
A) B)

11.1 pav. A) nukleotido sandara; B) nukleobazės

 Ribozė su baze (be fosfato liekanos) vadinama nukleozidu.

 Bazės (ir atitinkami nukleotidai) DNR sekoje būna A, G, C ir T, o RNR – A, G, C ir U.

 Polinukleotidinė grandinė susidaro jungiantis vieno nukleotido ribozei su kito nukleotido

fosfatu. Taip susidaro vadinamasis fosforibozės karkasas, turintis 5’ → 3’ kryptį.

 Dvi antilygiagrečios polinukleotidinės grandinės sąveikauja komplementariomis bazių

poromis ir sudaro dvigrandinę antrinę struktūrą. Ji dėl konformacinių, hidrofobinių ir
elektrostatinių sąveikų susisuka į spiralę (11.2 pav.).
11.2 pav. Dvigrandinę DNR sudaro dvi antilygiagrečios grandinės, kurias kartu palaiko sąveika tarp
komplementarių nukleobazių: citozinas sudaro tris vandenilines jungtis su guaninu, o adeninas
sudaro dvi vandenilines jungtis su timinu. Fosforibozės karkasas per visą DNR ilgį yra vienodas.

Krūvis. Kadangi fosfato liekanos pKa≈2, neutralaus pH sąlygomis polinukleotidinė grandinė turi
neigiamą krūvį. Tad nukleorūgštys – polielektrolitai, turintys didelį krūvio tankį molekulės paviršiuje
ties fosfodiesterinėmis grupėmis. Jas stabilizuoja sąveika su katijonais ir vandens molekulėmis. Kai
DNR yra tirpale in vitro, fosfatų krūvį neutralizuoja metalų (dažniausiai Na+) jonai. Vienvalenčiai
šarminių metalų katijonai prie nukleorūgščių jungiasi nespecifiškai ten, kur didžiausias neigiamo
krūvio tankis. Taip pat su nukleorūgštimis sąveikauja ir paprasti organiniai katijonai – protonuotos
formos aminai ir kt.

Jeigu dvigrandinė DNR ištirpinama dejonizuotame vandenyje (vandenyje be druskų), grandinės gali
atsiskirti (denatūruoti) net 0 °C temperatūroje. Tokiomis sąlygomis išyra ir tRNR tretinė struktūra.
Tai vyksta dėl padidėjusio elektrostatinio atostūmio tarp neigiamai įkrautų grandinių. DNR
dvigrandinę struktūrą stabilizuoja monovalentiniai katijonai, jei jų koncentracija didesnė nei 1 mM.
Kintant molekulės konformacijai, kinta krūvio tankis molekulės paviršiuje. Vadinasi, kinta ir
molekulės sąveika su katijonais.

Todėl nuo druskų koncentracijos tirpale priklauso visi procesai, kuriuose vyksta nukleorūgščių
konformacijos pokyčiai: denatūracija/lydymasis, pusiausvyra tarp B ir Z-DNR formų (žr. skyrelį
„Spiralės konformacijos“). Skaičiavimai rodo, kad DNR molekulėje būna neutralizuota ~80 %
krūvių. Jeigu neutralizuojami visi krūviai (sumažinus pH), nebelieka tarpmolekulinio atostūmio ir
molekulės gali nespecifiškai agreguoti – DNR iškrenta nuosėdų pavidalu.

Dvivalenčiai Mg2+ katijonai prisijungia specifinėse RNR molekulių vietose ir yra itin svarbūs
fiziologiškai aktyvios jų konformacijos sudarymui bei palaikymui. Skirtingose tRNR gali būti nuo 3
iki 5 vietų, kuriose stipriai surišamas Mg2+ (KA ~10 μM). In vivo dalį nukleorūgščių krūvio
neutralizuoja su jomis sąveikaujantys teigiamai įkrauti baltymai. Teigiamų ir neigiamų krūvių sąveika
yra funkciškai svarbi įvairiems su DNR/RNR sąveikaujantiems baltymams (transkripcijos
veiksniams). Tokių baltymų paviršiuje, sąveikaujančiame su nukleorūgštimi, būna teigiamai įkrautų
aminorūgščių.

Kadangi nukleorūgštys yra neigiamai įkrautos, jos elektroforezės metu juda teigiamo elektrodo link.
Judėdamos mechaninį pasipriešinimą suteikiančioje terpėje – agarozės (arba poliakrilamido) gelyje
– elektroforezės metu jos išsidėsto priklausomai nuo dydžio (11.3 pav.). Naudojant ilgio standartus
taip galima nustatyti savo tiriamų molekulių ilgį. Šia nukleorūgščių savybe remiamasi daugybėje
įvairių biochemijos, genų inžinerijos eksperimentinių metodų.

A) B)

11.3 pav. DNR elektroforezė agarozės gelyje. A) schema; B) eksperimento rezultato nuotrauka

Stekingo sąveika. Susidarant nukleorūgščių antrinei struktūrai, hidrofobinės nukleobazės

nukreipiamos į struktūros vidų. Per aromatines π-elektronų sistemas jos sąveikauja viena su kita savo
plokštumomis (π−π sąveika). Toks bazių ar bazių porų išsidėstymas viena ant kitos dar vadinamas
stekingu (angl. stacking). Interkaliacija – tai tokia sąveika, kai plokščios aromatinės molekulės
įsiterpia į DNR dvigrandinę spiralę tarp heterociklinių bazių porų (11.4 pav.). Dažniausiai
interkaliuoja aromatiniai katijonai. Jų teigiamas krūvis padidina giminingumą nukleorūgštims, nes
sąveikauja su karkaso fosfatais.

11.4 pav. Etidžio bromido interkaliacija DNR

Vienas iš seniausiai žinomų ir dažniausiai naudojamų DNR dažų – etidžio bromidas(11.4 pav.). Šis
junginys sugeria 302 nm ir 366 nm bangos ilgio UV šviesą ir silpnai fluorescuoja rožine spalva (590
nm). Etidžio bromido fluorescencija gerokai išauga, kai jis įsiterpia tarp DNR heterociklinių bazių.
Etidžio bromidas buvo sukurtas kaip antimikrobinis agentas. Tačiau vėliau nustatyta, kad (dėl savo
polinkio įsiterpti į DNR) jis yra stiprus mutagenas ir kancerogenas.

Interkaliuojantys junginiai gali sukelti DNR pažaidas: trūkius, neteisingų ar papildomų nukleotidų
įterpimą replikacijos metu, bazių, bazių porų ar nukleotidų iškritas ties interkaliavimo vieta. Taip pat
jie gali stabdyti transkripciją. Dėl to dažnai interkaliuojantys junginiai yra mutagenai ir kancerogenai.
Kadangi jie ypač stipriai veikia besidalijančias (intensyviai DNR replikuojančias ląsteles), šie
junginiai pasižymi ir antinavikinėmis bei antiseptinėmis savybėmis. Todėl interkaliuojantys su DNR
junginiai plačiai taikomi medicinoje ir moksliniuose tyrimuose (11.5 pav.).
 A)
B)

C)

11.5 pav. Medicinoje naudojamiinterkaliuojantys junginiai: A) doksorubicinas (preparatas nuo

vėžio, stabdo transkripciją); B) elipticinas (preparatas nuo vėžio, stabdo transkripciją); C)
proflavinas (akridino darinys antiseptikas. Kiti akridino dariniai taip pat veikia
kaip antiseptiniai ir chemoterapiniai preparatai).

Spiralės konformacijos. Dvigubajai DNR spiralei būdingi tam tikri parametrai: spiralės sukimosi
kryptis, bazių skaičius spiralės vijoje, bazių poros storis ir kt. Struktūrinių tyrimų metu aptiktos trys
pagrindinės DNR spiralių šeimos. A-DNR ir B-DNR yra dešiniojo sukimo spiralės, o Z-DNR –
kairiojo sukimo spiralė (11.6 pav.). Skirtingų DNR spiralių parametrus lemia deoksiribozės ir
glikozidinės jungties konformacijų skirtumai nukleotiduose.

11.6 pav. Dvigubųjų DNR spiralių tipai. A, B ir Z tipų atominiai modeliai.

Viršuje – vaizdas iš spiralės ašies galo, apačioje – iš šono.

Pagrindinė DNR forma fiziologinėmis sąlygomis yra B formos dviguba spiralė. Ji ir yra „standartinė“
DNR spiralė, apie kurią jau šnekėjome anksčiau ir kurios forma jau yra tapusi plačiajai visuomenei
atpažįstamu simboliu. B-DNR bazių poros yra statmenos spiralės, einančios per heterociklinių bazių
centrą, ašiai. Vidutinis bazių poros (bp) posūkis yra 36°, todėl spiralės periodas yra 10 bp, o spiralinės
vijos aukštis – 34 Å. Spiralė yra apie 20 Å skersmens ir sudaro du skirtingo pločio griovelius.
Platesnis griovelis vadinamas didžiuoju, o siauresnis – mažuoju (angl. major and minor groove) (11.7
pav.).
 11.7 pav. B tipo DNR spiralės matmenys

Kituose DNR spiralės tipuose griovelių forma gali stipriai keistis (netgi tapti išgaubimu, o ne
grioveliu). Tačiau dėl nuoseklumo šios spiralės vietos vis tiek vadinamos taip pat, kaip ir B tipo
spiralėje.

Tiriant pirmuosius kietos kristalinės formos DNR pavyzdžius rentgeno spindulių difrakcijos metodu,
atrasta A tipo DNR spiralė. Vėliau nustatyta, kad DNR įgyja A formą, kai ji mažai hidratuota (tirpale
esant etanolio ar panašių medžiagų). A-DNR struktūros hidrofobiniai regionai yra atsukti į tirpiklį
(kitaip, nei B-DNR struktūros). Dvigrandinė RNR bei RNR–DNR hibridai egzistuoja A formos ir
fiziologinėmis sąlygomis dėl 2‘OH grupės įtakos (prisiminkite, kad DNR jos neturi). Ši forma turi
didesnę ertmę spiralės viduryje, iš tiek pat bp susidaro trumpesnė spiralė. Didysis griovelis yra siauras
ir labai gilus, o mažasis – labai seklus.

Tiriant (dG-dC)n sekas didelės joninės aplinkos sąlygomis (2,5 M NaCl ar 0,7 M MgCl2), pastebėtas
kairiojo sukimo spiralės susidarymas. Šios struktūros fosfodiesterinis karkasas išsidėsto zigzago
forma, todėl ji buvo pavadinta Z-DNR. Šiuo atveju spiralė siaura ir ištempta. Jos mažasis griovelis
toks gilus, kad apima spiralės ašį. Ten, kur turėtų būti didysis griovelis, yra išgaubtas paviršius.
Kadangi šiai DNR formai susidaryti būtina specifinė seka bei tam tikros aplinkos sąlygos, jos
biologinė reikšmė neaiški. Nustatyta, kad Z formos spiralė gali susidaryti supakuotoje į chromosomas
DNR, ypač jei citozinai yra metilinti 5-ojoje padėtyje. Taip pat rasti baltymai, atrankiai
sąveikaujantys su Z-DNR. Tai rodo galimą Z-DNR buvimą tam tikruose genomo regionuose ir
fiziologinėmis sąlygomis.

Nukleorūgščių cheminės savybės. Nukleorūgštys dalyvauja cheminėse reakcijose, kurios būdingos

jas sudarantiems komponentams: (deoksi)ribozei, heterociklinėms bazėms, fosfodiesterinėms
jungtims.

Nukleorūgščių cheminės reakcijos gali būti naudojamos nukleorūgščių sekos nustatymui, antrinių ir
tretinių struktūrų analizei, sąveikos su baltymais (ar kitais ligandais) tyrimui. Tiriant nukleorūgštis ir
jų komponentus svarbios cheminės reakcijos, kurios vyksta vandeniniuose tirpaluose. Reakcijos su
aplinkoje aptinkamais ar ląstelėje susintetinamais junginiais dažnai sukelia DNR pažaidų. Jos neretai
yra mutacijų priežastis. Žinoma nemažai antibiotikų ir vėžiui gydyti skirtų preparatų, kurie veikia
chemiškai modifikuodami nukleorūgštis.
Hidrolizė

Nukleorūgščių hidrolizę iki monomerinių komponentų gali katalizuoti specialūs fermentai –

nukleazės. Jos hidrolizuoja tiek DNR, tiek RNR. Yra savitų fermentų: DNAzės hidrolizuoja DNR,
RNAzės – RNR. Cheminę fosfodiesterinių jungčių hidrolizę gali katalizuoti rūgštys arba šarmai.
DNR fosfodiesterinė jungtis šarminėmis sąlygomis yra stabili. RNR molekulėje fosfodiesterinės
jungtys (šildant RNR su šarmu) lengvai hidrolizuojamos iki nukleotidų.

Tai aiškinama vidumolekuline 2’ -OH grupės ataka į greta esantį 3’-fosfatą. Ši reakcija ypač lengvai
vyksta šarminėje terpėje, kai 2’-OH deprotonizuojama. Reakcija labai efektyvi, nes atakuojanti 2’ -
OH grupė yra arti atakuojamos fosfodiesterinės jungties (11.8 pav.). Kaitinant DNR arba RNR
rūgštyje glikozidinė jungtis skyla lengviau nei fosfodiesterinė ir susidaro laisvos heterociklinės bazės.

11.8 pav.RNR šarminė hidrolizė

Alkilinimo reakcijos

Glikozidinė jungtis gali susilpnėti ir dėl cheminės bazių modifikacijos. Alkilintos bazės, tokios
kaip 7-metilguaninas, 1-metiladeninas ar 3-metiladeninas, lengvai atskyla nukleorūgštis šildant
silpnai šarminėje aplinkoje. Be to, kai kuriais atvejais alkilintos bazės praranda galimybes sudaryti
kanonines bazių poras (A–T, G–C). Dėl šių priežasčių dauguma alkilinančių junginių yra
kancerogenai (sukeliantys vėžį junginiai): jie sukelia DNR pažaidas ir, galiausiai, mutacijas.

Su nukleofilais lengviausiai reaguoja pirimidinų C6 ir C4 atomai. Epigenetikos tyrimuose naudojama

reakcija su bisulfitu (11.9 pav.). Metodas leidžia nustatyti, kurie citozinai DNR sekoje yra metilinti.
Kaip ir kiti nukleofilai, bisulfitas (hidrosulfito anijonas) atakuoja citozino C6 atomą ir susidaro
citozino sulfonatas. Bisulfitui prisijungus prie C6 padėties, C4 padėtis aktyvinama reakcijai su
nukleofilais (vandeniu). Citozinas deamininamas, susidaro uracilas. Reaguojant 5-metilcitozinui, jo
metilgrupė stipriai sumažina dvigubos jungties tarp žiedo penktojo ir šeštojo anglies atomų aktyvumą
reakcijoje su bisulfitu. Tai leidžia atrankiai modifikuoti DNR esančius nemetilintus citozinus.

11.9 pav.Citozino virsmas į uracilą reakcijoje su bisulfito jonais.

 Reakcija vyksta trimis etapais: 1) citozino 6-sulfoninimas silpnai rūgštinėje terpėje;
2) hidrolizinis citozino sulfonato deamininimas;
3) uracilo sulfonato desulfoninimas šarminėje terpėje.

Nukleofilas atakuoja pirimidinų C6 padėtį vykstant daugeliui fermentinių reakcijų. Pavyzdžiui,

selektyviai prijungiant metilgrupę prie žiedo C5 atomo. Fermento aktyviajame centre esanti cisteino
-SH grupė atakuoja pirimidino C6 poziciją. Susidaro tarpinis kovalentinis kompleksas tarp fermento
ir substrato. Tai aktyvina C5 padėtį ir čia nuo kofaktoriaus pernešama metilgrupė. Įvykus pernašai
fermento ir substrato kovalentinis kompleksas išardomas. Toks veikimo mechanizmas būdingas DNR
citozino 5-metiltransferazėms (metilinančioms citoziną iki 5-metilcitozino) ir timidilato sintazei
(sintetina dTMP iš dUMP) (11.10 pav.).

11.10 pav. DNR citozino metiltransferazė sudaro kovalentinį ryšį su substratu. Taip aktyvinamas
kitas citozino atomas, jis gali priimti metilo grupę. Po metilo grupės pernašos kovalentinė jungtis
tarp baltymo ir substrato išardoma.

Heterociklinės bazės reaguoja su įvairiais anglies ir azoto elektrofilais. Elektrofilai atakuoja

heterociklinių bazių nukleofilinius centrus – cikle esančius azoto atomus, egzociklines amino- ir
karbonilo grupes. Reakcijose su anglies elektrofilais susidaro alkilintos heterociklinės bazės.
Atliekant mokslinius tyrimus, alkilinimo reakcijos naudojamos DNR ir baltymų sąveikai bei DNR
struktūrai tirti.

Kai kurie alkilinantys reagentai reaguoja ne tik su heterociklinėmis bazėmis, bet ir su fosfodiesteriniu
karkasu. Susidaro fosfotriesteriai. Šarminėje aplinkoje fosfotriesterinės jungtys lengvai hidrolizuojasi
skylant polinukleotidinei grandinei.

Su DNR sąveikaujantys baltymai ar kitokie ligandai gali apsaugoti savo taikinį nuo DNR
modifikuojančių cheminių reagentų. Vienas iš metodų, dažnai naudojamų baltymo ir DNR sąveikos
tyrimams, yra vadinamasis pėdsakų (angl. footprint) metodas. Baltymo kompleksas su tiriama DNR
(radioaktyviu fosforu pažymėta viena DNR grandinė) veikiamas cheminiu reagentu švelniomis
sąlygomis taip, kad DNR grandinė vidutiniškai būtų modifikuota vienoje vietoje. Po modifikacijos
reakcijos DNR skeliama ties modifikacijų vietomis. Susidarę fragmentai frakcionuojami
poliakrilamidiniame gelyje (11.11 pav.). Lyginant kontrolinį ir tiriamąjį pavyzdžius nustatomos
mažai reaktyvios (apsaugotos) DNR sritys nukleotido tikslumu.

11.11 pav. DNR ir baltymo sąveikos tyrimas pėdsakų metodu

Reakcijos su metalais

Dvivalenčio gyvsidabrio druskos (acetatas, chloridas) reaguoja su uridino ir citidino C5 atomais,

susidarant kovalentinei C–Hg jungčiai. Reaguoja nukleotidai, viengrandinės ar dvigrandinės
DNR/RNR. Susidaro atitinkami gyvsidabrio organiniai junginiai. Jie gali būti naudojami pirimidinų
su pakaitais prie C5 atomo sintezei, nes gyvsidabris penktojoje pirimidinų padėtyje yra lengvai
pakeičiamas. Šie junginiai lengvai paverčiami paladžio organiniais junginiais, kurie leidžia
regiospecifiškai prijungti nesočiąsias sistemas (11.12 pav.). Gyvsidabris yra lengvai pakeičiamas
vandeniliu (vandenilio izotopais žymėtų junginių sintezei) ar halogenais.

11.12 pav. C5-pakeistų citozino darinių sintezė naudojant gyvsidabrio druskas

Chemoterapiniam vėžio gydymui naudojama cis-platina – Pt(NH2)2Cl2. Šis junginys reaguoja su

gretimose DNR grandinėse esančių guaninų N7 atomais. Susidaro stabilus kovalentinis ryšys (11.13
pav.). Taip susiuvamos abi grandinės ir sustabdoma DNR replikacija bei vėžinių ląstelių
dauginimasis.

11.13 pav. Dviejų DNR grandinių susiuvimas cis-platinai reaguojant su dviejų guaninų N7 atomais

Fotocheminės reakcijos

240–280 nm bangos ilgio šviesa sužadina C, T ir U. Sužadinti uridinas ir citozinas gali prijungti
vandens molekulę prie C5–C6 dvigubos jungties. Susidaro atitinkami fotohidratai. Pirimidinų
fotohidratacija – grįžtamasis procesas. Tačiau ~10 % citozino fotohidrato hidrolitiškai deamininama.
Susidaro uracilo hidratas, kuris virsta į uracilą. Todėl citozino hidratacija (veikiant UV spinduliuotei)
gali sukelti mutacijas.

Apšvietus DNR 260–300 nm ilgio UV šviesa, piridinai sudaro ciklobutano fotodimerus (11.14 pav.).
Natyvioje DNR daugiausia susidaro T<>T fotodimero. Daugiausia fotodimerų susidaro tarp toje
pačioje grandinėje vienas po kito einančių timinų. Apšviesti trumpesnio bangos ilgio šviesa
fotodimerai suyra. Tačiau citozinai, įeinantys į fotodimerų sudėtį, lengvai deamininami ir tai yra dar
vienas C→T mutacijų atsiradimo mechanizmas.

11.14 pav. Įvairūs fotodimerai

Jonizuojančiosios spinduliuotės poveikis

Aerobinėmis sąlygomis vandeninėje terpėje didžiausią žalą nukleorūgštims daro hidroksilo radikalai
(HO·), susidarantys veikiant γ- ar rentgeno spinduliuotei.

H2O → ·OH + ·H

Priklausomai nuo radiolizės sąlygų gali susidaryti įvairūs radiolizės produktai. Deguonies įsotintuose
tirpaluose dažniausiai reaguoja pirimidinų C5-C6 dviguba jungtis. Be to, hidroksilo radikalas gali
atakuoti bet kurį deoksiribozės anglies atomą. Tačiau visais atvejais yra suardomas deoksiribozės
žiedas ir susidaro polinukleotidinės grandinės trūkis.
Nukleorūgščių optinės savybės. Heterociklinės bazės, įeinančios į nukleozidų ir nukleotidų sudėtį,
yra konjuguotos aromatinės sistemos, kurios turi π-elektronų. Todėl jos sugeria šviesą ultravioletinėje
srityje tarp 254–280 nm.

Sugerties maksimumas ir intensyvumas kinta keičiant tirpalo pH arba temperatūrą. Nors atskiri
nukleotidai turi šiek tiek skirtingas spektrines savybes, vidutinė polinukleotidų sugerties λmax vertė
fiziologinėmis sąlygomis yra apie 260 nm. Šis bangos ilgis paprastai yra naudojamas kiekybiniam
nukleorūgščių (ir jų komponentų) nustatymui, detekcijai. Pastebėta, kad polinukleotidinės grandinės
DNR sugerties intensyvumas yra apie 15–25 % mažesnis nei ją sudarančių nukleotidų sugerties
intensyvumų suma (11.15 pav.). Panašus efektas pastebėtas ir susidarant dupleksui iš dviejų DNR
grandinių. Šviesos sugerties intensyvumo sumažėjimą (susidaro labiau organizuota struktūra) sukelia
padidėjusi sąveika tarp π-elektronų sistemų heterociklinėse bazėse – heterociklinių bazių sankloda
(stekingas).

11.15 pav. Dvigrandinės DNR, viengrandinės DNR ir jas sudarančių

mononukleotidų sugertis UV spektro dalyje

11.2. Baltymų sandara ir cheminės šoninių grandinių savybės. Jų įtaka baltymų struktūrai ir
funkcijai

Baltymai – tai makromolekulės, randamos visose gyvybės formose. Tai gausiausia biomolekulių
klasė – jie sudaro daugiau nei 50 % sausos ląstelių masės, daug daugiau nei kiti biopolimerai (tokie
kaip nukleorūgštys, polisacharidai ar lipidai). Kiekvienas organizmas turi didžiulę baltymų įvairovę,
kurią lemia jo genai. Kai kurios bakterijos gali turėti kelis šimtus, o žinduoliai – iki dešimčių
tūkstančių baltymų. Baltymai dalyvauja beveik visuose biologiniuose procesuose: fermentai
katalizuoja reakcijas, įvairūs baltymai gali transportuoti ir saugoti įvairius jonus, mažas molekules ir
elektronus. Yra tokių baltymų, kurie veikia kaip hormonai. Imuninės sistemos baltymai saugo
organizmą nuo infekcijų. Baltymai veikia kaip receptoriai ir perduoda signalus tiek ląstelių viduje,
tiek išorėje. Jie reguliuoja genų raišką, o kartu ir organizmų augimą bei vystymąsi. Jie taip pat sudaro
būtinas mechanines atramas ląstelių viduje ir tarp ląstelių. Baltymai lemia ir koordinuoja judesius.
Kad ir kokia būtų baltymų funkcija, jie visi yra polipeptidai – polimerai, sudaryti iš aminorūgščių.
Skiriasi tik aminorūgščių skaičius, rinkinys ir seka. Kad galėtume suprasti baltymų savybes,
pirmiausia reikia suprasti skirtingų aminorūgščių fizikochemines savybes. Baltymų savybės dar
sudėtingesnės nei paprasta juos sudarančių aminorūgščių savybių suma. Biologiškai svarbios baltymo
savybės įgaunamos tik susidarius tretinei šio polimero struktūrai.

Visų organizmų (virusų, bakterijų, augalų, gyvūnų ir kt.) baltymai yra sudaryti iš tų pačių 20 skirtingų
aminorūgščių (11.16 pav.). Dar reikia pridėti ir aminorūgštį selenocisteiną, kurio randama visų
organizmų specifiniuose baltymuose. Selenocisteinas yra retas ir neturi jam priskirto kodono
genetiniame kode. Jis yra įjungiamas į baltymą specialiu keliu. Taip pat metanogeninėse archėjose
atrasta aminorūgštis pirolizinas. Kiekviena aminorūgštis sudaryta iš aminogrupės, karboksigrupės ir
specifinės R grupės, prijungtos prie α-C atomo. R grupė vadinama šonine grandine. Skirtingų
aminorūgščių šoninės grandinės skiriasi dydžiu, krūviu, forma ir chemine sudėtimi.

11.16 pav. A) Bendra baltymus sudarančių aminorūgščių sandara;

B) baltymus sudarančios aminorūgštys

Iš 20 aminorūgščių, sudarančių baltymus, 19 turi bendrąją struktūrą, parodytą 11.12 pav. O viena –
prolinas – turi šoninę grandinę, susijungusią su aminogrupe. Tai yra iminorūgštis. Dar yra retai
pasitaikančių aminorūgščių: selenocisteinas (toks, kaip cisteinas, tik sieros atomas pakeistas selenu)
ir pirolizinas (toks, kaip lizinas, tik šoninės grandinės gale prijungtas pirolino žiedas). Visose
aminorūgštyse, išskyrus gliciną (kur R yra tiesiog vandenilio atomas), α-C atomas yra asimetrinis.
Tačiau iš dviejų galimų optinių aminorūgščių izomerų (D ir L) baltymuose randami tik L izomerai.
Nebent mokslininkai sugalvoja specialiai susintetinti baltymą iš D aminorūgščių. Dvi aminorūgštys
(treoninas ir leucinas) turi papildomą asimetrinį centrą šoninėse grandinėse. Tačiau iš keturių galimų
optinių izomerų tiktai vienas aptinkamas baltymuose.
Aminorūgščių karboksi- ir aminogrupės tirpale fiziologiniame pH yra jonizuotos: karboksigrupė yra
neigiama (-COO-), o aminogrupė – teigiama (-NH3+). Jonizacijos būsena keičiasi priklausomai nuo
pH: terpei rūgštėjant karboksigrupė tampa nebejonizuota (-COOH), o aminogrupė išlieka jonizuota.
Šarmėjant karboksigrupė išlieka jonizuota, o aminogrupė tampa nebejonizuota (-NH2).

Aminorūgščių sudedamųjų dalių jonizacija (įskaitant ir šonines grandines) daro didelę įtaką baltymų
tirpumui, stabilumui ir struktūrinei organizacijai. Šoninių grandinių hidrofobiškumas/hidrofiliškumas
lemia polipeptidinės grandinės fizikochemines savybes ir jos susisukimą į erdvinę struktūrą.
Pagrindines 20 aminorūgščių galima suklasifikuoti įvairiai, pagal vieną iš populiariausių klasifikacijų
jos skirstomos į šešias grupes:

1. Alifatinės: glicinas (paprasčiausia aminorūgštis, šoninėje grandinėje turinti tik vandenilio atomą),
alaninas, valinas, leucinas ir izoleucinas (turintys neciklines hidrofobines nepolines grandines,
sunkiai tirpūs vandenyje).

2. Hidroksilinės: serinas ir treoninas. Jie turi atitinkamai pirminę ir antrinę hidroksigrupes, yra
poliniai ir labai gerai tirpūs vandenyje.

3. Rūgštinės (arba dikarboksilinės) aminorūgštys, taip pat jų atitinkami amidai. Asparto rūgštis ir
glutamo rūgštis šoninėse grandinėse turi po antrą karboksigrupę. Todėl šoninė grandinė yra
neigiamai įkrauta ir labai polinė fiziologinėmis sąlygomis. Grupei priklauso ir šių aminorūgščių
atitinkami dariniai – asparaginas ir glutaminas. Jie turi polinę amidogrupę vietoj šoninės
grandinės karboksigrupės.

4. Bazinės: lizinas ir argininas. Jie teigiamai įkrauti ir labai poliniai fiziologinėmis sąlygomis.
Histidinas, turintis imidazolo grupę, kuri fiziologinėmis sąlygomis būna silpnai protonizuota.

5. Ciklinės: fenilalaninas, tirozinas ir triptofanas, turintys aromatinį žiedą. Prolinas – iminorūgštis,

turinti alifatinį heterociklą.

6. Turinčios sieros: metioninas, turintis hidrofobinę nepolinę grandinę ir cisteinas (polinis dėl
sulfhidrilo grupės).

Baltymai gamtoje būna vandeniniame tirpale arba išsidėstę fosfolipidinėse membranose. Jei baltymą
sudarančių aminorūgščių polinės grupės išsidėsto baltymo paviršiuje, o hidrofobinės – viduje,
baltymas būna tirpus vandenyje. Baltymo tirpumą lemia druskų kiekis: esant mažai joninei jėgai
daugumos baltymų tirpumas yra geras. Jis mažėja didėjant tirpalo joninei jėgai. Tirpalo joninė jėga –
tai elektrolitų tirpalo charakteristika, priklausanti nuo bendros tirpale esančių jonų koncentracijos ir
tų jonų elektrostatinių sąveikų stiprumo. Baltymų tirpumui taip pat įtaką daro tirpalo pH: baltymų
tirpumas minimalus esant pH reikšmėms, artimoms izoelektriniam taškui, kai bendras baltymo krūvis
yra lygus nuliui. Tirpumas taip pat priklauso ir nuo temperatūros. Kai bet koks baltymas yra bent iš
dalies išsuktas – denatūruotas, jis pasidaro mažiau tirpus, nes tada nepolinės grupės atsiduria
molekulės išorėje.

Dalis membraninių baltymų paviršiaus yra sudaryta iš polines grupes turinčių aminorūgščių, kurios
kontaktuoja su vandeniu ir fosfolipidų poline dalimi. Kita dalis sudaryta iš nepolines grupes turinčių
aminorūgščių, sąveikaujančių su membranos lipidais. Todėl membraniniai baltymai yra blogai tirpūs
vandeniniuose tirpaluose. Baltymų įsitvirtinimo membranoje stiprumas yra susijęs su tuo, kokio
dydžio baltymo dalis gali sąveikauti su membrana. Yra tokių membraninių baltymų, kurių beveik
visas paviršius paniręs į lipidinį sluoksnį ir tik patys galiukai kyšo ir sąveikauja su vandeniniu tirpalu.
 Kaip atpažinti baltymus?

Tam pasitelkiami fizikiniai, cheminiai ir biologiniai metodai. Polimerizuotas aminorūgštis galima aptikti pagal tai,
kad peptidinė jungtis sugeria trumpesnio nei 230 nm bangos ilgio šviesą. Kai aminorūgštys, turinčios indolo žiedą
(Trp) arba aromatinį žiedą (Phe, Tyr), yra laisvos arba baltymuose, jas galima aptikti ir pagal 280 nm bangos ilgio
šviesos sugertį. Kadangi dauguma baltymų turi bent po kelias tokias aminorūgštis, paprastai baltymai ir jų
koncentracija laboratorijoje nustatoma būtent pagal 280 nm sugertį.

Tačiau dažniausiai baltymų detekcijai ir kiekiui nustatyti naudojamas dažas Kumasi briliantinis mėlis. Juo galima
nudažyti baltymus tirpale arba po elektroforezės gelyje. Baltymų kiekiui tirpale nustatyti yra naudojamas
Bredfordo metodas. Tai – spektroskopinis metodas, pagrįstas Kumasi dažo sugerties intensyvumo pokyčiu. Esant
rūgštinei terpei, dažas yra rudai rausvas, tačiau prisijungęs prie baltymų jis tampa ryškiai mėlynas. Susidarant
dažo–baltymo kompleksui, dažas sąveikauja su jonizuojamomis baltymo grupėms. Dėl to suyra natyvi baltymo
struktūra, jis išsisuka ir hidrofobinės grupės atsukamos į išorę. Jos sąveikauja su dažo nepoline dalimi, o teigiamai
įkrautos aminogrupės išsidėsto šalia neigiamai įkrautų dažo dalių. Susidaro joninė jungtis, dar labiau sutvirtinanti
dažo ir baltymo sąveiką. Dažui prisijungus prie baltymo stabilizuojama Kumasi dažo mėlynoji forma. Baltymo
kiekis tirpale nustatomas pagal tai, kiek dažo yra komplekse su baltymu: matuojamas šviesos sugerties santykis
tarp laisvo (maksimumas ties 465 nm) ir komplekse esančio (maksimumas ties 595 nm) dažo (11.17 pav.).

11.17 pav. Kairėje:Bredfordo reagentas; Dešinėje: reagentas, pridėjus į jį baltymo tirpalo.

Bredfordo ir panašiais metodais aptinkami visi tirpale esantys baltymai. Jei norime tirti tik konkretų
baltymą, reikalingi tam baltymui specifiniai antikūnai. Antikūnus galima sulieti su kitais baltymais,
kurie leidžia analizės metu panaudoti spalvines reakcijas ir spektroskopiją.

Kadangi baltymus sudarančios aminorūgštys turi įvairių funkcinių grupių, jas galima įvairiai
modifikuoti. Ląstelėse modifikacijas katalizuoja specialūs fermentai. Šiuo metu žinoma apie 200
tokių modifikacijų, jos gali būti ir grįžtamos. Dažniausios baltymų modifikacijos yra glikozilinimas,
lipidų prijungimas, fosforilinimas, baltymo ubikvitino prijungimas ir kt. Šios modifikacijos dar
padidina baltyme esančių funkcinių grupių įvairovę.

Baltymą sudarančių aminorūgščių tarpusavio sąveikos leidžia baltymui susisukti į reikiamą erdvinę
struktūrą. Tą struktūrą palaiko vandenilinės, joninės, kovalentinės (cisteino S–S tilteliai) jungtys,
hidrofobinės sąveikos. Šoninės grandinės ir jų išsidėstymas baltymo paviršiuje taip pat lemia
specifines baltymo sąveikas su aplinka: kitais baltymais, kitomis makro- ir mažomis molekulėmis,
vandeniu ir kt.

Visi šie kontaktai ir ištisi kontaktų paviršiai tiesiogiai susiję su baltymo atliekama funkcija. Jei
baltymas turi sąveikauti su kitais baltymais, tai jis turės tinkamų sąveikai paviršių, skirtų konkretiems
baltymams. Jei tai fermentas, tai aminorūgščių šoninės grandinės (kartais prisidės ir karkaso grupės,
kofaktoriai) ne tik sudarys kontaktus su substratu, bet ir tiesiogiai vykdys katalizę. Bus sudaromos
tokios jungtys su substratu, kad jis suskils. Arba du substratai taip suartės, kad susijungs.

Jei reikia, šoninės aminorūgščių grupės su substratu sudarys laikinas kovalentines jungtis, kad būtų
aktyvintos kitos substrato pozicijos norimam papildomam „statybiniam elementui“ prijungti.
Aminorūgščių funkcinės grupės turi skirtingas savybes. Jų saviti rinkiniai aktyviame fermento centre
gali sudaryti dar įvairesnes cheminio „mikroklimato“ sąlygas. Fermentai gamtoje katalizuoja dešimtis
tūkstančių skirtingų reakcijų, kurių dauguma be katalizės apskritai būtų neįmanomos. Baltyminius
katalizatorius galima reguliuoti, ląstelės tam pasitelkia minėtąsias potransliacines aminorūgščių
modifikacijas. Fosforilinant kai kuriais atvejais galima tam tikrą baltymą „išjungti“ – dėl
modifikacijos truputį pasikeičia jo struktūra ir jis nebegali atlikti savo funkcijos, o pašalinus
modifikaciją aktyvumas sugrįžta.

11.3.Fermentinės reakcijos, jų greitis ir junginių savitoji energija

Fermentai – tai biologiniai katalizatoriai. Dėl jų gana greitai įvyksta įvairiausios gyvybiškai svarbios
reakcijos (maisto medžiagų skaidymas, reikalingų medžiagų sintezė), kurios be katalizės vyktų labai
lėtai arba visai nevyktų. Fermentinės katalizės esmė panaši kaip ir cheminės katalizės: substratui
pateikiami alternatyvūs reakcijos keliai ir/arba stabilizuojami reakcijos tarpiniai junginiai. Taip
sumažinama reakcijai reikalinga energija ir daugiau molekulių „perlipa“ energijos barjerą (11.18
pav.).

Energijos barjeras – tai energija, reikalinga cheminiams ryšiams tarp atomų nutraukti. Net ir sintezės
reakcijose pirmiausia reikia nutraukti kai kuriuos vidumolekulinius reaguojančių molekulių ryšius,
kad jie taptų atviri naujiems atomams partneriams. Susidarant ryšiui energija visada išsiskiria. Ryšio
energija tampa mažesnė nei buvo abiejų atomų atskirai. Iš to išplaukia, kad molekulės energija turi
būti mažesnė nei ją sudarančių atomų energijų suma. Vadinasi, norint ryšius suardyti, reikia vėl
panaudoti papildomos energijos.

Kaip fermentai tai padaro? Kaip jau minėta, dalis baltymo aminorūgščių sudaro aktyvųjį centrą. Čia
jos suriša substratą ir katalizuoja reakciją.

11.18 pav. Katalizė sumažina reakcijos aktyvacijos barjerą

Energijos barjeras gali būti sumažinamas įvairiais būdais:

  Išlenkiant substrato jungtis, kurias reikia nutraukti;
 Vienas šalia kito reikiama orientacija išdėstant substratus, kuriuos reikia sujungti;
 Katalizėje dalyvaujant protonų donorams arba akceptoriams (tokios yra kai kurios šoninės
grandinės). Taip stabilizuojami tarpiniai junginiai;
 Tarpiniai junginiai, turintys krūvį, taip pat gali būti stabilizuoti jonine sąveika su krūvį
turinčiomis šoninėmis grandinėmis;
 Susidarant laikinam kovalentiniui ryšiui tarp baltymo ir substrato.

Visa tai leidžia reakcijas pagreitinti nuo 100 iki neįsivaizduojamo skaičiaus kartų. Nekatalizuojamo
orotidino 5’-monofosfato dekarboksilinimo pusperiodis yra 78 milijonai metų. Kai šią reakciją
skatina fermentas orotidino 5’-monofosfato dekarboksilazė, tai užtrunka tik18–25 milisekundes.

Per sekundę fermentai gali atlikti iki milijonų katalizės reakcijų, priklausomai nuo fermento (katalizės
mechanizmo, fermento struktūros, pačios reakcijos galimybių). Tačiau reakcijos greitį lemia ir
aplinkos sąlygos: tirpalo sudėtis, substrato koncentracija. Sąlygos, kuriomis baltymas denatūruoja
arba tampa netirpus, sumažina arba visai panaikina fermento aktyvumą. Tai – aukšta temperatūra,
ekstremalios pH reikšmės, didelė druskų koncentracija, slopikliai (medžiagos, kurios jungiasi su
baltymu ir taip slopina jo aktyvumą).

Didinant substrato koncentraciją katalizės aktyvumas didėja iki fermento įsotinimo – maksimalaus
įmanomo greičio (Vmax). Jis kiekvienam fermentui yra savitas, priklauso nuo fermento struktūros bei
pačios katalizuojamos reakcijos savybių.

Fermentai pagal katalizuojamos reakcijos tipą skirstomi į 6 klases:

Klasė Katalizuojama reakcija Reakcijos pavyzdys Poklasiai

Katalizuoja oksidacijos ir
redukcijos procesus. Iš Dehidrogenazės,
1. Oksidoreduk-
oksiduojamo substrato paimtus AH + B → A + BH peroksidazės,
tazės
elektronus perduoda reduktazės ir kt.
redukuojamam.
Katalizuoja funkcinių grupių
(metil-,acil-, amino- ar
fosfatinės grupių) pernašą nuo Aciltransferazės,
2. Transferazės vienos molekulės prie kitos AB + C → A + BC metiltransferazė
arba nuo vienos molekulės s, kinazės ir kt.
dalies į kitą tos pačios
molekulės dalį.
Katalizuoja cheminių ryšių
3. Hidrolazės (C–O, C–N, C–S) nutraukimą AB + H2O → AOH + BH Esterazės ir kt.
dalyvaujant vandeniui.
Nedalyvaujant vandeniui Dekarboksilazė,
4. Liazės skaido ryšius tarp substrato RCOCOOH → RCOH + CO2 dehidratazės ir
atomų (C–C, C–N, C–O ar C– kt.
 S). Gali sudaryti naujus
dvigubus ryšius suskaidyto
ryšio vietoje.
Katalizuoja tos pačios
Mutazės,
5. Izomerazės molekulės vidumolekulinį AB → BA
racemazės ir kt.
persigrupavimą.
Naudodamos ATP hidrolizės
metu išsiskiriančią energiją
6. Ligazės katalizuoja C–O, C–S, C–N ar X + Y+ ATP → XY + ADP + Pi Sintetazės
C–C kovalentinių ryšių
susidarymą.

11.4.Fermentų panaudojimas cheminėms medžiagoms gauti, fermentinių procesų valdymas

Fermentai yra puikūs katalizatoriai. Jie gali pagreitinti įvairias reakcijas, veikia esant švelnioms
fiziologinėms sąlygoms bei nepalieka toksiškų atliekų – tai puikus pasirinkimas pramoninei sintezei.
Taip pat svarbu, kad fermentai yra enantioselektyvūs, todėl gali būti naudojami enantiomerų
atskyrimui iš racemato arba chiralinių junginių sintezei. Daug natūralių ir rekombinantinių fermentų
galima gauti iš mikroorganizmų. Šie fermentai naudojami moksliniuose tyrimuose, farmacijoje ir
medicininėje diagnostikoje, tokiose šakose kaip maisto, detergentų, tekstilės pramonė, atliekų
tvarkymas ir kt. Katalizuojamų reakcijų pavyzdžiai – krakmolo skaidymas, gliukozės izomerizacija į
fruktozę. Priklausomai nuo proceso, fermentai gali būti naudojami tirpaluose arba imobilizuoti ant
paviršių.

Fermentų imobilizacija – tai jų kovalentinis arba nekovalentinis prijungimas prie inertiško, netirpaus
pagrindo nesuardant jų struktūros ir išlaikant aktyvumą (11.19 pav.). Imobilizavimas leidžia sutaupyti
fermento, nes jis neišplaunamas kartu su produktu ir gali būti panaudotas daug kartų. Pavyzdžiui,
fermento molekulės gali būti imobilizuojamos (prijungiamos) ant vamzdelio sienelių. Vamzdeliu
nuolat teka substratas, o išteka jau produktas. Fermentas lieka and sienelių ir toliau vykdo reakciją.

Kaip minėta, fermentų aktyvumas labai priklauso nuo terpės sudėties, pH, temperatūros,
denatūruojančių reagentų, slopiklių. Tai galima panaudoti norint reakciją sustabdyti. Baltymą galima
tiesiog denatūruoti reakcijos mišinį pakaitinant, paveikiant rūgštimi. Kita vertus, norint pasiekti
didžiausią reakcijos greitį ir išeigą, reikia palaikyti pačias palankiausias fermentui sąlygas ir
pakankamai didelę substrato koncentraciją. Norint, kad produkto tirpale nebūtų fermento liekanų
(produktas būtų grynas), labai patogu turėti imobilizuotą fermentą.
 11.19 pav. Fermentų imobilizacijos pavyzdys. Šiuo atveju fermentas endogliukanazė turi genų
inžinerijos metodais polipeptidinės grandinės gale pridėtą kelių histidinų „inkarą“. Imobilizacijos
pagrindas turi parodytą cheminę grupę. Ji su minėtais histidinais sudaro chelatinį kompleksą
(pridėjus Ni2+ jonų). Taip fermentas tampa „pririštas“ prie pagrindo, o jo aktyvusis centras lieka
atviras tirpale esančiam substratui ir vykdo katalizę.

11.5.Lipidai, jų struktūros sąsajos su savybėmis ir funkcijomis gyvuosiuose organizmuose

Lipidai – tai chemiškai skirtingi junginiai, kurie netirpsta vandenyje, tačiau gerai tirpsta nepoliniuose
organiniuose tirpikliuose (etanolyje, eteryje, acetone ir pan.). Jie sudaryti iš anglies, vandenilio ir
deguonies, kaip ir angliavandeniai, bet deguonies proporcija čia daug mažesnė.

Lipidai skirstomi į:

1. Paprastuosius: taukai, aliejai ir vaškai

2. Sudėtinguosius
3. Fosfolipidus ir panašius junginius
4. Steroidus
Priklausomai nuo struktūros, lipidai gyvuosiuose organizmuose atlieka kelias skirtingas funkcijas:

 Iš fosfolipidų sudarytas visų biologinių membranų pagrindas;

 Lipidai gali sukaupti daug energijos, todėl naudojami jai saugoti;
 Lipidai naudojami signalams perduoti (hormonai).

Riebalų rūgštys ląstelėse dažniausiai yra prijungtos prie kokių nors kitų molekulių. Jos sudarytos iš
angliavandenilinės grandinės, pasibaigiančios karboksigrupe. Šios rūgštys būna sočiosios (neturi
C=C dvigubų jungčių) ir nesočiosios (turi C=C dvigubų jungčių). Jų angliavandenilinė grandinė
paprastai nebūna šakota. Bendra sočiųjų riebalų rūgščių formulė yra CH3-(CH2)n-COOH. Gamtinėse
riebalų rūgštyse n paprastai yra lyginis skaičius nuo 2 iki 22. Nesočiosios riebalų rūgštys turi 1–3
dvigubus ryšius tarp anglies atomų angliavandenilinėje grandinėje.

Trigliceridai. Trigliceridai susidaro glicerolio molekulei susijungus su trimis riebalų rūgščių

molekulėmis. Tai – pagrindiniai lipidai, naudojami energijai saugoti. Jų sankaupos (lašeliai) būna
citoplazmoje. Trigliceridai yra nepoliniai, netirpūs vandenyje. Jie skirstomi į dvi grupes pagal tai,
kokios būsenos jie yra esant 20 °C temperatūrai: jeigu kieti, jie yra vadinami taukais, jei skysti –
aliejais. Kuo trigliceriduose daugiau nesočiųjų riebalų rūgščių, tuo žemesnė jų lydymosi temperatūra.
Dėl dvigubų jungčių susiformuojantys grandinės linkiai (dar vadinami kinkais) neleidžia susidaryti
tvarkingai struktūrai. Visas sočiąsias jungtis turintys trigliceridai „susideda“ į labai tvarkingą
struktūrą, todėl ir jų lydymosi temperatūra aukštesnė.

11.20 pav.Trigliceridų struktūra ir struktūros ryšys su fizine būsena

Trigliceridai yra mažesnio tankio nei vanduo, todėl vandenyje jie kyla į paviršių. Skaidant lipidus
išsiskiria dvigubai daugiau energijos nei skaidant tokią pačią masę angliavandenių. Taip pat jie labiau
tinka energijai saugoti nei angliavandeniai, nes yra netirpūs vandenyje, nehidratuojami ir dėl to
susirenka į kompaktiškas struktūras – užima mažiau vietos ir mažiau sveria. Trigliceridų savybės
svarbios ne tik energijos saugojimui. Mažas jų tankis padeda jūrų gyvūnams (rykliams, ruoniams,
banginiams) palaikyti plūdrumą. Kadangi riebalai yra mažai laidūs šilumai, gyvūnai kaupia juos
poodiniame sluoksnyje kaip šilumą sulaikančią medžiagą – palaikyti kūno temperatūrai.

Vaškai. Jie yra riebalų rūgščių ir ilgų grandinių alkoholių esteriai. Vaškus organizmai naudoja kaip
vandens nepraleidžiančią apsaugą (ant lapų ar plunksnų).

Fosfolipidai. Dar viena puikiai gyvybei pritaikytų molekulių rūšis. Kai kalbame apie DNR ir
baltymus, visada kelia nuostabą, kaip šios molekulės tobulai pritaikytos gyvybės funkcijoms
įgyvendinti. Fosfolipidai taip pat kelia tokį susižavėjimą.

Pagrindiniai fosfolipidai ląstelėse yra fosfogliceridai. Jie sudaryti iš glicerolio, prisijungusio dvi
riebalų rūgštis ir polinę grupę – fosfatą su alkoholiu (11.21 pav.). Abi riebalų rūgščių grandinės
paprastai turi 14–20 anglies atomų ir jungiasi prie pirmos ir antros glicerolio -OH pozicijos. Pirmojoje
pozicijoje dažniausiai būna sočioji riebalų rūgštis, antrojoje – nesočioji. Trečioji glicerolio pozicija
prisijungia fosfato liekaną. Gamtiniuose fosfolipiduose prie fosfato liekanos dar būna prisijungęs
koks nors alkoholis – inozitolis, cholinas ir pan. Tad fosfolipido molekulė turi dvi nepolines
uodegėles ir polinę galvutę. Polinė galvutė sąveikauja su vandeniniu tirpikliu, o uodegėlė yra
hidrofobinė. Galiausiai fosfolipidai suformuoja dvigubą sluoksnį, kur jų galvutės atsuktos į vandeninį
tirpiklį, o uodegėlės – į sluoksnio vidų. Gali susidaryti dvisluoksnis ant vandens paviršiaus, o jį
supurčius gali susidaryti fosfolipidų rutuliukai su viduje paslėptomis uodegėlėmis – micelės. Iš
dvisluoksnio gali susidaryti ir „maišeliai“, kurių išorėje ir viduje yra vanduo – liposomos (11.22 pav.).
Taip susidaro fosfolipidinė membrana. Ši membrana dengia ląsteles ir viduląstelinius organoidus:
branduolį, endoplazminį tinklą ir kt. Ji ne šiaip atskiria organoidus, o sudaro sąlygas jiems veikti –
atriboja erdvės dalį ląstelei ar organoidui, suskirsto erdvę į atskirus „kambarėlius“. Tuomet tuose
„kambarėliuose“ gali vykti reikalingos reakcijos, gyvybinės funkcijos. Kad ląstelėje galėtų vykti
visavertė medžiagų apykaita ir galėtų būti priimami įvairūs signalai iš išorės, į bilipidinį sluoksnį
panyra ir jį perveria įvairūs specializuoti baltymai. Tai – receptoriai, nešikliai, jonų kanalai ir pan.
Taip sudaroma biologinė membrana, atitinkanti visus gyvybei reikalingos pertvaros reikalavimus.

11.21pav. Fosfolipidai. A – fosfolipidų dvisluoksnis; B – fosfolipido molekulės scheminis

vaizdavimas; C ir D – fosfolipidų struktūra; E – iš fosfolipidų dvisluoksnio sudarytas „maišelis“
liposoma, aplink ir viduje – vanduo.
 11.22 pav. Fosfolipidų dariniai vandenyje: liposoma, micelė ir dvisluoksnis

Glikolipidai – tai lipidai su prijungtomis trumpomis angliavandenių grandinėmis. Jie aptinkami

ląstelių membranose ir dalyvauja imuninės sistemos atsakuose bei ląstelių tarpusavio atpažinime.

Lipoproteinai – tai sujungti baltymai ir lipidai, jie taip pat randami membranose. Lipoproteinai taip
pat perneša lipidus krauju ir limfa.

Steroidų sudėtyje nėra riebalų rūgščių. Tai junginiai, sudaryti iš keturių tarpusavyje sujungtų
cikloalkanų žiedų su įvairiais pakaitais. Steroidai – tai lytiniai hormonai estrogenas ir testosteronas,
vitaminas D2, cholesterolis (11.23 pav.). Pastarasis įeina į biologinių membranų sudėtį.

11.23 pav. Cholesterolis

11.6.Angliavandenių, kaip pagrindinio atsinaujinančio anglies šaltinio, struktūra, savybės ir

ištekliai.

Angliavandeniai – tai organiniai junginiai, kurių sudėtyje yra kelios hidroksigrupės ir viena karbonilo
grupė. Dažniausiai anglies, vandenilio ir deguonies santykis yra toks, kad tinka formulė C n(H2O)n.
Tai – grupė gana skirtingų medžiagų, gausiai ir plačiai paplitusių gamtoje. Organizmuose jie
naudojami energijai saugoti (krakmolas, glikogenas) ir išgauti (gliukozė ir pan.). Taip pat jie yra
sudėtingesnių organinių junginių dalys (deoksiribozė DNR molekulėje), atraminės molekulės
(chitinas, celiuliozė), imuninės sistemos atpažįstami komponentai (ląstelių paviršiuje esantys
oligosacharidai veikia kaip antigenai).
Mažiausios molekulinės masės angliavandeniai – tai monosacharidai. Monosacharidams jungiantis į
poras susidaro disacharidai, į neilgas grandines – oligosacharidai, į ilgas ir sudėtingas grandines –
polisacharidai.

Monosacharidai tarpusavyje skiriasi anglies atomų skaičiumi (5 pentozėse ir 6 heksozėse), karbonilo

ir -OH grupių išsidėstymu (11.24 pav.). Prisiminkime, kad nukleorūgčių pentozės (ribozės) skiriasi
2’ padėties pakaitais: RNR ribozėje ten yra -OH, o DNR -OH nėra. Monosacharidai tirpale linkę būti
žiedinės formos, ciklizuoti per karbonilo grupę. Žinomiausi monosacharidai – gliukozė, fruktozė.
Gliukozė – gausiausias monosacharidas, ląstelės jį naudoja kaip pagrindinį energijos šaltinį. Skaldant
gliukozę glikolizės keliu pagaminamos 2 ATP molekulės, aerobinio kvėpavimo keliu – 32 ATP
molekulės.

Gliukozės gauname iš maisto – skaldant krakmolą. Gliukozė absorbuojama pro žarnų sieneles ir
visam organizmui išnešiojama krauju. Gyvūnai gliukozę saugo sujungtą į polisacharidą glikogeną
(žr. toliau). Prireikus energijos, glikogenas skaidomas iki gliukozės, o gliukozė skaidoma toliau
aerobiniu arba anaerobiniu keliu. Taip gaminamas ATP (kuris jau tiesiogiai dalyvauja energijos
reikalaujančiuose procesuose, pvz. raumenų susitraukime).

11.24 pav. Monosacharidai heksozės (t. y. turintys 6 anglies atomus)

Sudėtiniai (sudaryti iš monosacharidų) angliavandeniai skiriasi tarpusavyje tuo, iš kokių

monosacharidų jie sudaryti, kokio ilgio susidariusios grandinės, kaip monosacharidai susijungę
(11.25 pav.). Monomerai (monosacharidai) sujungiami glikozidinėmis jungtimis – kondensuojantis
hidroksigrupėms ir išsiskiriant vandeniui (11.26 pav.).

11.25 pav.Disacharidas sacharozė ir polisacharido krakmolo fragmentas

 11.26 pav. Glikozidinės jungties suformavimas ir suardymas laktozėje

Oligosacharidai sudaryti iš trumpų monosacharidų grandinių. Laisvai esantys gausiausiai sutinkami

oligosacharidai yra disacharidai (jie sudaryti iš dviejų monosacharidų). Tipiniai jų pavyzdžiai –
sacharozė, sudaryta iš gliukozės ir fruktozės, pieno cukrus laktozė, sudarytas iš galaktozės ir
gliukozės, maltozė, sudaryta iš dviejų gliukozių. Ji susidaro skaidant krakmolą. Trijų ir daugiau
sudėtinių vienetų oligosacharidai ląstelėse dažniausiai būna prijungti prie kitų biomolekulių: lipidų
arba baltymų. Susidaro atitinkamai glikolipidai arba glikoproteinai. Šios sudėtinės molekulės
dažniausiai būna išsidėsčiusios ląstelės membranoje, o jų oligosacharidinė dalis išsikišusi ir formuoja
ląstelės išorėje esantį sluoksnį – glikokaliksą (11.27 pav.). Šie oligosacharidai – tai savotiškas ląstelių
paviršiuje esantis kodas, kurį atpažįsta specifiniai baltymai. Kodas leidžia atskirti savas ir svetimas
ląsteles. Taip pat oligosacharidai padeda iš ląstelių suformuoti audinį. Bakterijos savo
oligosacharidais prisitvirtina prie paviršių (pvz. dantų).

11.27 pav. Membranoje išsidėstę glikoproteinai ir glikolipidai. Oligosacharidų grandinėlės

pavaizduotos raudonais karoliukais
Polisacharidai – tai angliavandenių polimerai, sudaryti iš daugiau nei 20 monomerų. Kai kurie turi
tūkstančius monomerų. Vieni polisacharidai naudojami energijos (gliukozės pavidalu) saugojimui
(krakmolas, glikogenas), kiti – ląstelių, audinių struktūros palaikymui, sutvirtinimui (celiuliozė,
ligninas). Kai kurie polisacharidai, tokie kaip celiuliozė, yra nešakotos, linijinės grandinės. O štai
glikogenas sudarytas iš šakotų grandinių. Tiek celiuliozė, tiek glikogenas sudaryti iš gliukozės, tačiau
skiriasi glikozidinės jungties vieta (tipas) tarp gliukozės molekulių. Dėl to stipriai skiriasi šių
polisacharidų savybės ir biologinis vaidmuo.

Krakmolas sudarytas iš ilgų gliukozės grandinių ir skirtas gliukozės atsargoms kaupti augaluose. Jis
sudarytas iš dviejų tipų grandinių: amilozės ir amilopektino. Amilozę sudaro nešakotos gliukozės
grandinės, sudarytos iš kelių šimtų ar net tūkstančių gliukozės vienetų. Yra duomenų, kad šios
grandinės susisuka į spiralę. Amilopektinas – šakotos grandinės. Bulvių, kukurūzų krakmolo apie 25
% sudaro amilozė, likusią dalį – amilopektinas (11.28 pav.).

Glikogenas – gyvūnų polisacharidas, taip pat skirtas gliukozės saugojimui. Jis dar labiau šakotas nei
amilopektinas (11.28 pav.).

11.28 Krakmolo (amilozė ir amilopektinas) ir glokogeno struktūra

Mono- ir disacharidai puikiai tirpsta vandenyje. Polisacharidai vandenyje netirpūs, jie tik išbrinksta.
Krakmolui atpažinti naudojama reakcija su jodu: šios dvi medžiagos sudaro sudėtingą mėlynos
spalvos kompleksą.

Angliavandeniai – gausiausiai biosferoje gaminamos biomolekulės. Tai pirminė fotosintezės

produkcija, sukaupianti saulės energiją. Fotosintezės metu saulės šviesos energija verčiama chemine
ir sukaupiama (pirmiausia) gliukozės cheminiuose ryšiuose. Vėliau metaboliniais keliais ta energija
perduodama kitoms molekulėms ir procesams. Angliavandenius (naudojamus energijai kaupti)
galima palyginti su baterija, kurioje saugoma ir iš kurios esant poreikiui imama sukaupta saulės
energija. Fotosintezės metu atmosferos anglis verčiama organiniais junginiais, pirmiausia gliukoze.
Vėliau anglis metaboliniais keliais perduodama įvairių kitų junginių sintezei, o per mitybos grandines
– ir kitiems organizmams. Galiausiai kvėpavimo metu anglis pašalinama kaip CO2 ir jos ciklas
prasideda iš naujo. Angliavandenių oksidavimas – pagrindinis energijos gavimo kelias daugumoje
nefotosintetinančių organizmų.

Augalai ir dumbliai vydo fotosintezę ir aprūpina visą biosferą anglimi ir energija, kuri toliau
naudojama įvairiems organiniams junginiams sintetinti. Bendrai sudėjus, fotosintetinantys
organizmai per metus į biomasę įjungia 100–115·109 kg anglies. Pirminė biomasės produkcija
susidaro daugiausia dėl fotosintezės. Šio proceso mastus galima apskaičiuoti stebint biosferą iš
palydovų: galima matyti, kiek žaliųjų augalų dengia Žemės paviršių, ir išmatuoti chlorofilo kiekį
vandenynuose. Iš šių duomenų apskaičiuota, kad sausumos augmenija į biomasę per metus įjungia
56,4·109 kg anglies (53,8 % visos produkcijos), o vandenynų (kur didžiausią dalį sudaro
fitoplanktonas) – 48,5·109 kg. Skaičiuojant produkciją, tenkančią kvadratiniam metrui, gauname 426
g anglies/m² per 1 metus sausumoje (neįskaičiuojant plotų su nuolatine sniego danga) ir 140 g
anglies/m² per metus vandenynuose. Daugiau nei 75 % sausos augalų masės sudaro angliavandeniai,
daugiausia – celiuliozė ir ligninas.

Literatūros sąrašas:

 Saulius Klimašauskas „Nukleorūgščių chemija“. Vilniaus universitetas. Kaunas:

Technologija, 2008.
 Alain J.Cozzone„Proteins: FundamentalChemicalProperties“ ENCYCLOPEDIA OF LIFE
SCIENCES / & 2002 MacmillanPublishersLtd, NaturePublishingGroup.
 Field, C.B.; Behrenfeld, M.J., Randerson, J.T. andFalkowski, P. (1998).
"PrimaryproductionoftheBiosphere: IntegratingTerrestrialandOceanicComponents".
Science281 (5374): 237–240. doi:10.1126/science.281.5374.237. PMID 9657713.
 LehningerPrinciplesofBiochemistry. Fourthedition. D. L. Nelson, M. M. Cox. W.H.
Freemanandcompany, NewYork, 2005.
13. Alternatyvi energetika
Įvadas

XXI amžiaus pradžioje žmonės išgyvena gana įdomius laikus. Mes gilinamės į atomų ir molekulių
pasaulį, turime klestinčią interneto kultūrą, o „Simpsonų“ epizodus galime žiūrėti netgi savo
mobiliuosiuose telefonuose. Tačiau nors ir esame pažengę technologijų srityje, kaip tik šiuo metu
esame lyg įkalinti tarp dviejų skirtingų amžių: laiko, kuriame viskas priklausė nuo iškastinio kuro
(naftos, anglies) ir ateities, kurioje dominuos atsinaujinantys energijos šaltiniai, vadinami alternatyvia
energetika (13.1 pav.).

13.1 pav. Alternatyvūs atsinaujinantys energijos šaltiniai

Sparčiausiai alternatyvi energetika šiuo metu plėtojama JAV, Japonijoje ir ES. Europoje alternatyvią
energetiką ypač propaguoja skandinavai, vokiečiai, olandai. Šis sektorius taip pat pamažu plečiasi ir
Lietuvoje. Šiuo metu iš atsinaujinančių energijos šaltinių mūsų šalyje gaminama apie 3,3 % elektros
energijos.

13.1. Biokuro gamyba iš įvairių šaltinių, jo panaudojimas transporto sektoriuje

Neatsinaujinančių energijos išteklių trūkumas ir ilgalaikiai kenksmingi šalutiniai produktai

(pavyzdžiui, šiltnamio efektą sukeliančios dujos) verčia atsigręžti į ekologišką biokurą. Daugelio
aplinkosaugininkų biokuras vadinamas ateities kuru. Jis dar žinomas ir kaip agrokuras, taip pažymint
jo kilmę iš gyvos biomasės. Biomase vadinamos biologinės kilmės medžiagos: mediena, pramoninės
atliekos, dumbliai, nuotekos, javai. Kai kurie javai (pavyzdžiui, Jatropha) auginami specialiai
biokurui.

Iškastinio kuro ištekliai yra riboti ir negali būti papildyti. Biokuras yra perspektyvi alternatyva didelės
taršos kurui – naftai, benzinui ar dyzelinui. Transporto tarša yra pagrindinis atmosferos CO2 šaltinis,
todėl daro didelę įtaką globaliniam atšilimui. Automobilių skaičiui keliuose augant eksponentiškai,
biokuras transporto sektoriuje atrodo kaip gelbėtojas.
Istorija. Nauja – tai gerai pamiršta sena

Biokuras nėra naujas išradimas. Mediena – kietasis biokuras – naudota jau senovėje. Rudolfo Dieselio
sukurtas dyzelinis variklis kaip kurą naudojo žemės riešutų aliejų. Vokietis Nikolaus Augustas Ottas
buvo vienas pirmųjų išradėjų, atskleidusių etanolio potencialą. Etanolis – skystasis biokuras – buvo
naudojamas Henry Fordo modelyje Ts nuo 1903 iki 1926 metų. Vis dėlto, kai buvo atrastas iškastinis
kuras, jis nukonkuravo tuo metu ne tokį efektyvų ir brangesnį biokurą. Atrasti dideli naftos ištekliai
lėmė, kad ekologiškesnis biokuras buvo greitai pamirštas. Antrojo pasaulinio karo metu biokuras
buvo vėl trumpam prisimintas ir tapo importuojamo kuro alternatyva. Kai Vokietijai ir Didžiajai
Britanijai trūko kuro, šalys pradėjo naudoti benziną, maišytą su etanoliu.

Biokuro rūšys

Biokuras gali būti kietosios, skystosios ar dujinės būsenos. Mediena, anglis, džiovintas mėšlas yra
kietasis biokuras. Skystasis kuras patogiausias transporto sektoriuje, todėl skystojo būvio biokuras
šiandien yra vienas paklausiausių produktų. Plačiausiai šioje kategorijoje naudojami bioetanolis ir
biodyzelinas.

Bioetanolis yra labiausiai paplitusi bioalkoholio rūšis. Etanolį iš angliavandenių fermentacijos metu
gamina mielės ir bakterijos. Bioetanolio gamyba prasideda nuo biomasės surinkimo (derliaus
nuėmimo). Tuomet biomasė smulkinama, veikiama karščiu ir cheminiais agentais tam, kad taptų
prieinama fermentams. Jie hidrolizuoja angliavandenius iki monomerų, daugiausia iki gliukozės
(13.2 pav. A). Gautus daug gliukozės turinčius sirupus kitame etape mielės ir bakterijos fermentuoja
iki etanolio (13.2 pav. B). Paskutinėje gamybos pakopoje bioetanolis gryninamas distiliacijos būdu.
 A)

B)

13.2 pav. A) bioetanolio gamyba iš celiuliozės;

B) mielių ir bakterijų vykdoma gliukozės fermentacija.

Bioetanolis yra plačiausiai pasaulyje naudojamas biokuras (13.3 pav.). Didžiausi bioetanolio kiekiai
šiuo metu pagaminami JAV, o sunaudojami Brazilijoje.
 A)

B)

C)

13.3 pav. A) bioetanolio gamyba ir suvartojimas pasaulyje; B) pasiūlos ir paklausos metinis

augimas; C) pagrindinė rinka Europoje 2009–2012 metais.

Lietuvoje bioetanolis gaminamas nuo 2004 metų, kai Šilutėje pradėjo veikti bioetanolio gamykla
„Biofuture“. Gamybai dažniausiai naudojami kviečiai, kvietrugiai ir cukriniai runkeliai. 2011 metais
mūsų šalyje buvo pagaminta 20,9 tūkst. tonų bioetanolio, o suvartota 14,7 tūkst. tonų (13.4 pav.).
 Gamyba
Suvartojimas

Bioetanolis, tūkst. t

Metai

13.4 pav. Bioetanolio gamyba ir suvartojimas Lietuvoje 2004–2011 metais

Bioetanolis naudojamas sumaišytas su benzinu įvairiomis proporcijomis. Taip padidinamas kuro

oktaninis skaičius ir sumažinami toksiško smogo kiekiai. Tam, kad būtų užtikrintas dabartinių
automobilių su benzininiais varikliais veikimas, būtina naudoti benzino ir etanolio mišinius. Jų
sudėtyje gali būti iki 15 % etanolio. Tuo tarpu biobutanolis tokiuose automobiliuose gali būti
naudojamas grynas, be jokių papildomų techninių variklio pakeitimų. Degalai E85, kurie prieinami
ir Lietuvos degalinėse, susideda iš 85 % bioetanolio ir 15 % benzino. Tačiau juos galima vartoti tik
automobiliuose, kurie turi „lanksčiuosius variklius“.

Kitas biokuras yra biodyzelinas. Šis netoksiškas kuras gaunamas vykdant transesterifikacijos
reakciją tarp alkoholio ir riebalų rūgščių alkilo esterių (augalinio aliejaus, gyvūninių riebalų arba
augalinių ekstraktų) (13.5 pav.). Transesterifikacijos reakcija gali būti katalizuojama cheminiais arba
fermentiniais katalizatoriais. Biodyzelino gamyboje lipidų hidrolizei siekiama pritaikyti fermentus
lipazes. Jos yra pranašesnės už cheminius katalizatorius, nes gali efektyviai hidrolizuoti skirtingų tipų
aliejus ir riebalus bei nekenkia aplinkai. Lietuvoje biodyzelino žaliava yra rapsai.

13.5 pav. Transesterifikacijos reakcija tarp riebalų rūgščių alkilo esterių ir metanolio

Biodyzelinas turi atitikti griežtus pramoninius kokybės reikalavimus, todėl yra gryninamas atskiriant
šalutinius sintezės produktus, pavyzdžiui, glicerolį. Biodyzelinas gali būti tiesiogiai naudojamas
kuras dyzelinėse transporto priemonėse. Be to, biodyzelinas bet kokiu santykiu gali būti maišomas
su mineraliniu dyzelinu. Kai naudojamas už mineralinį dyzeliną švaresnis ir ekologiškesnis
biodyzelinas, susidaro mažesni toksinių medžiagų kiekiai. Biokuras transporto sektoriuje yra
patrauklus ne tik dėl to, kad jis gaminamas iš atsinaujinančių anglies šaltinių. Jis sumažina išmetamų
kenksmingų medžiagų kiekius, padidina kuro oktaninį skaičių. Todėl pailginamas variklio veikimo
laikas.

Biodujos yra potenciali kuro alternatyva žemės ūkyje. Jas daugiausia sudaro metanas, kuris
gaminamas iš organinių medžiagų. Metanas susidaro anaerobiniu būdu biodegraduojant žemės ūkio
ar gyvūnų atliekas, žolę ir kitus biologiškai irius anglies šaltinius, kurie yra prieinami be jokių išlaidų.
Lietuvoje biodujų žaliava yra kukurūzai, kukurūzų ir kitų žolinių augalų silosas. Metanas gaunamas
grynas, o likęs kietojo būvio šalutinis produktas panaudojamas laukams tręšti. Biodujų naudojimas
sparčiai auga, ypač besivystančiose šalyse. Gaminant biodujas iš vieno hektaro žemės galima gauti
daugiausia energijos biokuro pavidalu (13.6 pav.).

13.6 pav. Atstumas, kurį gali nuvažiuoti transporto priemonė, naudodama kurą,
pagamintą iš 1 hektare užaugintos biomasės

Biokuro kategorijos

Visi anksčiau aprašyti biokuro tipai dažniausiai priklauso pirmosios kartos biokuro kategorijai.
Pirmosios kartos biokuras gaminamas iš augalinių aliejų, sacharozės ir krakmolo. Taigi reikalingi
didžiuliai žemės ūkio naudmenų plotai, reikia auginti pasėlius. Dėl šių priežasčių kyla gamybos
apribojimai.

Jei biokuro gamybai panaudojama ne tik sacharozė ar krakmolas, bet ir augalų stiebai, yra atveriamos
durys antrosios kartos biokurui. Tai ne maistinių pasėlių, o celiuliozinis biokuras, efektyvumu
lenkiantis pirmosios kartos biokurą. Nauji biotechnologiniai gamybos metodai leidžia kaip žaliavą
panaudoti sumedėjusių pluoštų celiuliozę. Tai reiškia, kad etanolis gali būti gaminamas iš žolės,
medžių, žemdirbystės atliekų. Biokuro gamybai kasmet nebereikia auginti naujų augalų. Žoliniai
augalai gali būti surenkami eikvojant daug mažiau energijos ir laiko. Antrosios kartos degalai, gauti
iš ekonomiškai efektyvių ir gausių žaliavų, įgyja vis didesnį populiarumą. Jie dar efektyviau nei
pirmosios kartos kuras sumažina išmetamų kenksmingų teršalų kiekį.

Trečiosios kartos biokuras gaunamas iš dumblių. Dumbliai užauginami vos per 5–6 dienas. Jų
biomasė gali būti žaliava butanolio gamybai (plačiau apie butanolio fermentaciją skaitykite skyrelyje
12.4 Biotechnologiniai cheminių medžiagų gavimo pavyzdžiai). Šiuo metu biokuro gamybai bandoma
pritaikyti bakterijų biomasę.
13.2. Suminės augalinio biokuro gamybos anglies dioksido sąnaudos įvertinimas

Nepaisant to, kad dyzelinas ir benzinas kilę iš biomasės (per milijonus metų suskaidytų augalų ir
gyvūnų liekanų), jų negalima laikyti atsinaujinančiais ištekliais. Per pastaruosius penkiasdešimt metų
dėl žmonių veiklos (daugiausia dėl iškastinio kuro deginimo) atmosferos CO2 kiekis išaugo 20 %.
Tokie atmosferos pokyčiai lemia temperatūros kilimą ir yra pagrindinė globalinio atšilimo priežastis.

Nuolatinis naftos kainų kilimas, nerimas dėl didelės CO2 emisijos, senkantys neatsinaujinančio kuro
ištekliai verčia vėl prisiminti biokurą, kuris gaunamas iš šiuo metu auginamų augalų. Celiuliozė,
hemiceliuliozė, ligninas – labiausiai biosferoje paplitę atsinaujinantys anglies šaltiniai. Kai bet kurio
tipo biomasė yra efektyviai sudeginama, cheminiuose ryšiuose saugota Saulės energija išlaisvinama
drauge su šalutiniu produktu – anglies dioksidu. Dėl to kartais kyla abejonių, ar biokuras tikrai
ekologiškas.

Biokuras yra laikomas neutraliu produktu, nes išmetamo anglies dioksido kiekis, kai jis deginamas,
lygus anglies dioksido fiksavimo lygiui augaluose. Todėl atmosferos CO2 kiekiui šis biomasės
panaudojimas įtakos neturi. Nepaisant šio fakto, emisija, susijusi su biokuro gamyba, negali būti
ignoruojama. Ateityje šią problemą ketinama spręsti taikant naujas technologijas, žadančias
švaresnius ir našesnius sprendimus. Biokuras negali sukurti stebuklo per naktį. Be to, jis šiuo metu
dar negali visiškai pakeisti naftos.

13.3. Metano dujų biologinis gavimas ir biodujų gavyba, taikymas energetikoje

Yra žinoma, kad X a. pr. Kr. Asirijos imperijoje metano dujos, gautos iš gyvulinės kilmės atliekų,
buvo naudojamos vonios vandeniui šildyti. Metams bėgant buvo sukurtos kitos technologijos, o
metano dujų populiarumas gerokai išaugo. Ateityje mikrobinės kilmės atsinaujinantys energetiniai
ištekliai turi nemažą panaudojimo potencialą – mikrobai asimiliuoja ir savo biomasėje
sukoncentruoja didelius kiekius energijos. Augalinis Žemės paviršiaus dangalas sudaro daugiau nei
1800 mlrd. tonų sausos masės. Toks milžiniškas energetinės žaliavos kiekis prilygsta visų žinomų
naudingųjų iškasenų energetiniam kiekiui. Apie 68 % sausumos biomasės tenka miškams, maždaug
16 % – žoliniams augalams, kurie nunykę vis dar lieka energetiškai vertinga žaliava (13.7 pav.).

13.7 pav. Energetiškai vertinga biodujų žaliava – augalai

Paprasčiausias būdas energijai iš sausos biomasės išgauti – ją sudeginti. Degant išsiskiria šiluma,
kurią savo ruožtu galima paversti mechanine ar elektros energija (13.8 pav.). Iš žalios biomasės
daugiausia energijos gaunama, kai ji ne deginama tiesiogiai, o pirmiausia paverčiama biodujomis
(dažniausiai metanu).

13.8 pav. Metano dujų biologinis gavimas ir taikymas energetikos srityje

Metaninis rūgimas, arba biometanogenezė, yra gana seniai žinomas biomasės pavertimo energija
procesas (13.8 pav.). Jis buvo atrastas 1776 metais, kai Aleksandras Volta nustatė, kad iš pelkių
išsiskiriančiose dujose gausu metano. Organinių junginių anglį metanu paverčia archėjos (13.9 pav.),
kurios priklauso Methanobacteriaceae šeimai. Šio proceso greitis priklauso nuo temperatūros ir
substrato sudėties. Mikrobams anaerobinėmis sąlygomis skaidant organines medžiagas išsiskiria
biodujos, kurios susideda iš ~65 % metano, 30 % anglies dioksido, 1 % vandenilio sulfido ir trupučio
kitų dujų. Pelkių dujos dega be dūmų, nepalieka nemalonaus kvapo ir gerokai mažiau nei kietasis
kuras teršia aplinką. Nustatyta, kad sudeginus 28 m3 biodujų gaunamas energijos kiekis, atitinkantis
16,8 m3 gamtinių dujų, 20,8 l naftos arba 18,4 l dyzelino.

13.9 pav. Biologinis metano gavimo ciklas

Metano bakterijų, paplitusių gamtoje, yra daug ir metanogenezei tinkamuose substratuose, pvz.,
acetato, metilamino, metionino ir kt. Jau 1967 m. buvo nustatyta, kad acto rūgšties ir metano
bakterijos sudaro simbiozę. Tokie santykiai yra naudingi, nes metanogeninės bakterijos naudoja
dujinį vandenilį, išskiriamą vandenilio bakterijų, ir apsaugo acto rūgšties bakterijas nuo jo pertekliaus,
slopinančio bakterijų augimą.

Gaminant biodujas substratai yra susmulkinami ir atskiedžiami vandeniu, o paskui supilami į

fermentatorius. Juose ir vyksta metaninis rūgimas, iš pradžių veikiant mezofilinėms (30–40 °C),
vėliau – termofilinėms (52–55 °C) bakterijoms. Įprastinei fermentacijai reikia užtikrinti stabilią
temperatūrą, tačiau daugiau ir greičiau biologinių dujų galima gauti termofilinio metaninio rūgimo
metu. Dėl to fermentatoriuose palaikoma apie 55 °C temperatūra. Šiomis sąlygomis iš 1 tonos
organinių atliekų galima gauti nuo 200 iki 600 m3 dujų, turinčių 50–85 % metano ir 15–50 % anglies
dioksido. Biodujų metano koncentracija priklauso nuo žaliavos cheminės sudėties. Apskaičiuota, kad
iš 150 000 gyventojų miesto atliekų per metus galima gauti 2 mln. m3 dujų.

Mikrobiologiškai perdirbant organines atliekas į biodujas galima iš dalies išspręsti tris labai svarbias
problemas:

1) Ekologinę (gamtinės aplinkos apsauga nuo taršos);

2) Maisto (pagaminamos geros organinės trąšos);
3) Energetinę (pagaminamas metanas).
Šiuo metu biodujos yra ekologiškiausias automobilių kuras. Norint jas panaudoti automobilių kurui,
biodujas reikia išvalyti iki 97 % metano lygio (1 m3 išvalytų biodujų = 1 l benzino). Biodujų energinė
vertė yra tiesiogiai susijusi su metano koncentracija. Esant metano koncentracijai daugiau nei 55 %,
biodujos laikomos vertingu kuru.

Biodujos (metanas), gaminamos fermentatoriuose, jau nuo 1895 metų vartojamos Didžiosios
Britanijos miestų gatvėms apšviesti. JAV į dujas perdirbama 372 mlrd. tonų atliekų, jos sudaro 18 %
sunaudojamų gamtinių dujų. Tai sudaro 1,9 % JAV sunaudojamos energijos.

Daug dėmesio metanui gauti pasitelkus metanogenines bakterijas skiriama ir kai kuriose
besivystančiose šalyse. Jau nuo 1978 metų Indijoje veikė apie 30 000, Kinijoje – apie 7 mln.
fermentatorių, gaminančių metaną. Kinijoje biologinis metanas sudaro apie 30 % visos sunaudojamos
energijos. Todėl biodujų gamyba naudojant metanogenines bakterijas atliekoms perdirbti yra vienas
iš galimų būdų spręsti energetines ir ekologines problemas besivystančiose ir žemės ūkio veikla
besiverčiančiose šalyse.

13.4. Dumblių panaudojimas biokuro gamyboje

Dumbliai (13.10 pav.) yra eukariotiniai mikroorganizmai, kurie panaudodami Saulės energiją
oksiduoja H2O, išskiria deguonį ir sintetina angliavandenius. Dumblių vykdomos fotosintezės metu
išskiriamas deguonis sudaro apie 73–87 % viso pasaulyje išskiriamo deguonies.
 13.10 pav. Dumbliai – organizmai, vykdantys fotosintezę. Kairėje: dumblių tirpalai, naudojami
tyrimams laboratorijose; Dešinėje: padidintas dumblių vaizdas pro mikroskopą.

Iki šiol daugiausia biokuro yra gaminama iš aukštesniųjų augalų. Jie fotosintezės metu paverčia
Saulės energiją į įvairių junginių cheminių ryšių cheminę energiją. Fotosintezės metu gaunama
žaliava, reikalinga įvairaus kuro sintezei: protonai ir elektronai (vandenilinių dujų gamybai), cukrus
ir krakmolas (bioetanolio gamybai), lipidai (biodyzelino gamybai) ir biomasė (biometano gamybai).

Deguoninę fotosintezę vykdo sudėtingas baltymų ir pigmentų kompleksas. Šie baltymai ir pigmentai
sujungti į du kompleksus – fotosistemą II (PSII) ir fotosistemą I (PSI). Šias dvi fotosistemas jungia
citochromo b6f (cyt b6f ) kompleksas bei nedideli, judrūs elektronų ir protonų nešikliai – chinonai ir
plastocianinas (13.11 pav.).

13.11 pav. Fotosintezės procesas, kurio metu Saulės energija yra paverčiama chemine energija ir
sudaro pagrindą biokuro gamybai iš augalų ir dumblių

PSII ir PSI yra sudarytos iš reakcijos centrų, kuriuose vyksta fotocheminė reakcija ir antenų
kompleksų. Antenos sugeria Saulės šviesos energiją plačiame spektro intervale ir tuneliuoja energiją
pirminiam elektronų donorui LHCl, esančiame reakcijos centre (tada jame sužadinamas chlorofilas).
Antenų sudėtyje yra chlorofilų, karotinoidų ir kitų papildomų pigmentų. PSII sudėtyje taip pat yra
baltymų ir kofaktorių, fotolizuojančių vandenį. Vanduo yra labai stabilus junginys, jo oksidacijai
reikalingas redukcinis potencialas sudaro apie 1200 mV. Deguonies oksidaciją katalizuoja sistema,
išsidėsčiusi nukreiptoje į lumeną fotosistemos II pusėje. Ją sudaro keturi Mn jonai, vienas Ca2+ jonas,
PsbO ir PsbU subvienetai, bikarbonato anijonas.

Sugėrus 4 šviesos kvantus skaidomos dvi vandens molekulės. Susidaro 4 elektronai (kurie patenka į
reakcijos centrą), atpalaiduojami 4 protonai, išsiskiria deguonies molekulė, susidaro NADPH. Tai –
šviesos fazės reakcijų produktai.

4h
2H2O O2 + 4e + 4H+

Elektronų pernešimas per elektronus pernešančią fotosintezės grandinę yra susijęs su protonų
pernešimu į tilakoidų vidų. Protonų gradientas susidaro pernešant elektronus fotosintezės elektronų
pernašos grandine. Pernešant elektronus, siurbliai perneša vandenilio jonus į lumeną. Be to, protonai
atsipalaiduoja vandens fotolizės reakcijoje. Todėl tilakoidų vidus parūgštėja. Tarp stromos ir
tilakoido vidaus (lumeno) gali susidaryti 3–4 vienetų pH gradientas. Tilakoidų membranoje
išsidėsčiusi ATP sintazė, jos struktūra ir veikimo mechanizmas panašus į mitochondrijų ATP sintazę.
Susidaręs elektrocheminis vandenilio jonų gradientas yra ATP sintezės varomoji jėga.

Antroji fotosintezės stadija yra CO2 redukcija iki angliavandenių panaudojant šviesos fazėje
susidariusius ATP ir reduktorių NADPH. Šiai reakcijų grupei šviesa nereikalinga, todėl ji dar
vadinama fotosintezės tamsos faze. Angliavandenių sintezė vyksta chloroplastų stromoje,
katalizuojant įvairiems fermentams. Susidaro didelis tarpinių produktų skaičius (13.11 pav.). Visų
biocheminių reakcijų seką nustatė Melvinas Kalvinas (M. Calvin). Todėl šis ciklas vadinamas
Kalvino ciklu.

Kalvino ciklas turi tris stadijas:

a) Karboksilinimo stadija, per kurią CO2 kondensuojasi su turinčiu 5 anglies atomus ribuliozės 1,5-
bisfosfatu, susidaręs šešių anglies atomų tarpininkas skyla į dvi 3-fosfoglicerato molekules. Reakciją
katalizuoja RuBisCo fermentas:

b) Redukcijos stadija, per kurią 3-fosfogliceratas redukuojamas į glicerolio aldehido 3-fosfatą;

 Triozės fosfato
CHO izomerazė CH2OH
H C OH C O
2- 2-
CH2OPO3 CH2OPO3
Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono
3-fosfatas fosfatas

c) Regeneracijos stadija, per kurią glicerolio aldehido 3-fosfatas panaudojamas ribuliozės 1,5-
bisfosfato resintezei.
2-
CH2OPO3 CH2OH
C O C O
Fruktozės
CHO CH2OH Aldolazė HO C H 1,6-bisfosfatazė HO C H
H C OH + C O H C OH H C OH
2- 2-
CH2OPO3 CH2OPO3 H C OH HO P H C OH
2 n
2-
CH2OPO3 CH2OPO3
2-

Glicerolio aldehido Dihidroksiacetono Fruktozės Fruktozės

3-fosfatas fosfatas 1,6-bisfosfatas 6-fosfatas

Kalvino ciklo metu gaunami angliavandeniai toliau gali būti sėkmingai panaudoti biokuro gamybos
procese (13.12 pav.).

13.12 pav. Dumblių taikymas biokuro gamyboje

Dumbliai sugeba išgyventi pačiomis sudėtingiausiomis sąlygomis: esant dideliems karščiams ir

šalčiams, padidėjus radiacijai ir kt. Dublius gamta juos apdovanojo ypatingomis gyvybinėmis
galiomis: ypač greitai dauginasi, ilgą laiką gali išgyventi be maisto, o atsiradus geresnėms gyvenimo
sąlygoms maisto atsargas kaupia ateičiai. Vieni dumbliai maisto atsargas kaupia krakmolo arba lipidų
pavidalu, pastarieji gali sudaryti iki ¾ sauso dumblio masės. Šie degalai yra alternatyva iškastinėms
degalų žaliavoms. Iš dumblių pašalinus krakmolą ar lipidus lieka dumblių biomasės atliekos. Jos gali
būti panaudotos įvairių maistinių ir pašarinių papildų, vitaminų, mineralinių medžiagų arba biodujų
gamybai (13.13 pav.).

13.13 pav. Dumblių taikymas biodujų gamybos srityje

Dumbliai yra gera žaliava ir kitų rūšių biokuro gamybai, pavyzdžiui, vandenilio dujų. Tai –
perspektyvi ir aplinkos neteršianti biokuro rūšis, kurios gamybos metu iš dumbliuose esančio vandens
išgaunamas vandenilis. Šis būdas žinomas daugiau nei 65 metus. Pirmą kartą jis buvo atrastas
Scenedesmus obliquus dumbliuose, o vėliau nustatytas ir melsvadumbliuose, melsvabakterėse.
Daugiausia vandenilio gamybos ir fotosintezės tyrimams naudojami žalieji dumbliai Chlamydomonas
reinhardtii, kuriuos 2000 metais sukūrė Melis ir jo bendradarbiai. Bio-H2 procesas yra patrauklus tuo,
kad naudojant Saulės šviesą vanduo paverčiamas vandeniliu ir deguonimi dviem etapais:
H2O  2H+ + 2e- + ½ O2
2H+ + 2e-  H2

Pirmoji reakcija vyksta visuose deguoninę fotosintezę vykdančiuose organizmuose. Tuo tarpu antroji
reakcija yra būdinga tik kai kurioms mikrodumblių rūšims. Ji yra katalizuojama tilakoido
membranoje esančio hidrogenazės fermento, turinčio savo sudėtyje geležies. Ši reakcija gali vykti tik
anaerobinėmis sąlygomis, nes deguonis visiškai nuslopina hidrogenazę (fermentas deguoninėje
aplinkoje visiškai nuslopinamas per 10 sekundžių). Pagrindinis vandenilio dujų gamybos pranašumas
yra tai, kad vandenilis yra dujos. Jos greitai pašalinamos iš ląstelės ir nėra jai toksiškos.

Šiandien bioinžinieriai ir biotechnologai visame pasaulyje intensyviai ieško būdų, kaip būtų galima
pagerinti fotonų konversijos efektyvumo rodiklius nuo šiuo metu esančio ~ 1 % iki ekonomiškai
pelningos normos ~ 7 % (žr. 13.14 pav.). Bandoma prie ferodoksino tiesiogiai prijungti hidrogenazę,
slopinti FNR (ferodoksino–NADP+ reduktazę) ir kt.
 13.14 pav. Dumblių tirpalai, paruošti biokuro gamybos tyrimams atlikti

Plimuto jūrų laboratorija pritaikė apie dumblius turimas žinias biotechnologijos srityje. „Visa, ką mes
darome, yra bandymas atsukti laikrodį atgal, - tvirtina Plimuto jūrų laboratorijos darbuotojas
biochemikas Stevas Skillas. Gamta prieš daugelį metų sukūrė žaliavą, kurią dabar naudojame ir jai
tai nėra nieko naujo“

Anglies dioksidą naudojantys dumbliai taip pat sulaukė ir pramoninių gamyklų susidomėjimo,
kadangi juos galima panaudoti gamyklų išmetamiems anglies dioksido prisotintiems dūmams valyti.

13.5. Kiti energetiškai vertingų cheminių junginių gavybos, panaudojant gyvuosius

organizmus, būdai

Mes gyvename ribotų išteklių planetoje. Vieni šių išteklių labai svarbūs mūsų išlikimui. O kiti,
atvirkščiai – kenkia aplinkai kiekvieną kartą, kai tik juos naudojame. Aptarėmė biotechnologines
energetikos rūšis, kurios yra potenciali iškastinio kuro alternatyva. Bet ar tai viskas, iš ko galima
gaminti energiją? Išvardysime kelias idėjas, kurios gal nustebins, o gal tiesiog pralinksmins. Bet
mokslininko fantazijai nėra ribų.

Bakterijos, kurios gamina elektrą

Mokslininkai jau seniau žinojo, kad sūriame vandenyje gyvenančios bakterijos gali generuoti
energiją. Tačiau nebuvo aišku, kaip jos tai daro. Dabar Aarhuso universiteto (Danija) mokslininkai
jau pradeda suprasti šį mechanizmą. Jie mano greitai patys sukursiantys gamtinę biobateriją iš
bakterijų (13.15 pav.). Tuomet tokios ekologiškos baterijos galės tiekti „švarią“ energiją jūroje
esantiems plūdurams, atliekantiems klimato stebėsenos ar navigacines funkcijas.
 13.15 pav. Bakterijų pritaikymas elektros gamybai

Larsas Nielsenas iš Aarhuso universiteto žurnale „Nature“ išspausdino straipsnį, kuriame aiškina,
kaip sūriame vandenyje sąveikauja bakterijų kolonijos. Šiose kolonijose generuojami elektronai, kai
nuosėdose susikaupusios organinės medžiagos ir vandenilio sulfidas kyla į paviršių ir reaguoja su
deguonimi. Vandens paviršiuje esančios bakterijos naudoja deguonį, o dugne gyvenantys
mikroorganizmai ėda nuosėdas. Bakterijų sluoksnius viršuje ir apačioje jungia natūraliai
susiformavęs nanolaidų (arba nanogijų) tinklas. Norint pasinaudoti šia energija, į dugną reikėtų
prismaigstyti daug grafitinių elektrodų. Jais tekėtų bakterijų gaminama elektros srovė.

Norint išgauti elektrą, yra pritaikomi specialūs įrenginiai, vadinami mikrobiniais kuro elementais –
sutrumpintai MKE (angl. Microbial Fuel Cells, MFC). MKE įgalina iš organinių junginių atimti
daugiau kaip 90 % elektronų. Be to, MKE yra savaime atsinaujinantys, kaip ir juose gyvenantys
mikroorganizmai, kurie kaupia energiją, perduodami elektronus elektrodams.

Tokių kuro elementų panaudojimas turi daugiau pranašumų nei tradiciniai elektros energijos gavimo
būdai. Šie kuro elementai buvo pradėti tyrinėti dar XX amžiaus septintajame dešimtmetyje NASA
mokslininkų, siekiant išspręsti energijos gavimo šaltinius kosmose. Mikrobiniame kuro elemente
yra dvi kameros, atskirtos tarpusavyje pusiau pralaidžia membrana (13.16 pav.). Katodo kameroje
dėl mikrobų metabolizmo susidaro vandenilis. Į anodo kamerą tiekiamas oro deguonis, joje susidaro
CO2. Anodas yra padengtas fermentu hidrogenaze, o katodas – lakaze. Ant anodo susidaręs
vandenilis skyla į protonus ir elektronus, kuriuos oksidacijos–redukcijos reakcijas katalizuojantys
feremntai perneša per membraną. Taip sukeliamas elektronų judėjimas – elektros srovės tekėjimas
išorine grandine. Patekę į katodo kamerą protonai ir elektronai jungiasi su deguonimi ir virsta
vandens molekulėmis.
 13.16 pav. Mikrobinio kuro elemento veikimo schema (pagal www.tnews.lt)

Yra du pagrindiniai mikrobinių kuro elementų tipai:

1) Su elektronų pernašos tarpininkais;

2) Be elektronų pernašos tarpininkų.

Dauguma mikroorganizmų ląstelių yra elektrochemiškai neveiklios, kadangi negali perduoti

oksidacijos–redukcijos reakcijų metu susidariusių elektronų ląstelių išorėje esantiems elektrodams.
Elektronų pernašą iš ląstelių į elektrodą palengvina įvairūs tarpininkai (mediatoriai). Jais gali būti
tioninas, metileno violetinis, metileno mėlis, humo rūgštis, neutralus raudonasis, rezorfuinas. Deja,
dauguma elektronų pernašos tarpininkų yra brangūs arba nuodingi.

Tikimasi, kad mikrobiniai kuro elementai galės būti pritaikyti visapusiškam žmogaus poreikių
tenkinimui. Jie galėtų būti namų elektros generatoriais, įtaisais, varančiais mažus elektroninius
įtaisus, valtis, automobilius, besimaitinančius robotus ar netgi erdvėlaivių elektroniką. Yra vilties,
kad stambūs mikrobiniai kuro elementai bus naudojami nuotekoms ir kitoms organinėms atliekoms
paversti elektra, užterštos aplinkos biologinei regeneracijai.

Deja, kol kas visos šios potencialios galimybės sunkiai įgyvendinamos praktiškai. Vienintelis
ligšiolinis mikrobinių kuro elementų pritaikymas – tai atokiose vietovėse esančių stebėsenos
prietaisų maitinimas. Dabar gaminami mikrobiniai kuro elementai gali pagaminti pakankamai
srovės, kad maitintų mažus elektroninius prietaisus ar įkrautų kondensatorius, kurie galėtų būti
panaudoti esant aukštesnės galios poreikiams. Šiuolaikinių mikrobinių kuro elementų dydis kol kas
trukdo juos įterpti į elektroninius prietaisus, kuriuos jie galėtų maitinti. Todėl būtinas tolesnis šių
elementų tobulinimas ir optimizavimas.

Pagrindinė priežastis, dėl ko MKE dar nėra laikomi ateities energetikos dalimi, yra ta, kad
mikrobiologinė kuro technologija dar nėra itin gerai išplėtota. Todėl dar neįmanoma pagaminti
didelių energijos kiekių už mažą kainą. Didžioji dalis tyrimų, skirtų mikrobiniams kuro elementams
optimizuoti, ieško būdų, kaip prailginti MKE veiklą, kaip padidinti paviršinę elektrodų sritį ir anodo
reaktyvumą. Be tolesnio elektrotechninės dalies tobulinimo būtinas geresnis mikrobiologinės
elektros gamybos fiziologijos ir ekologijos supratimas. Be to, būtina geriau ištirti ir suprasti
mikroorganizmų sąveiką su elektriškai laidžiais paviršiais. Kas žino – gal po dvidešimties metų
mūsų požiūris į buitines nuotekas ir kitas organines atliekas iš pagrindų pasikeis?

Elektrai laidūs polimerai ir jų praktinis pritaikymas alternatyviai energetikai

2000 metais Nobelio chemijos premija buvo suteikta Kalifornijos (JAV) universiteto profesoriui
A. J. Heegeriui už mokslinius darbus elektrai laidžių polimerų sintezės ir tyrimo srityje. Kodėl šios
srities darbai nusipelnė tokio aukšto įvertinimo? Laidūs (konjuguoti) polimerai – tai nauja klasė
medžiagų, kurių elektroninės savybės artimos metalams ir puslaidininkiams. Kitaip nei metalai (varis,
aliuminis, sidabras) ar puslaidininkiai (silicis, germanis, selenas), kurie natūraliai egzistuoja gamtoje,
laidūs polimerai yra tik sintetinami. Kartu su šiomis medžiagomis gimė ir nauja mokslo bei
technologijų sritis. Kadangi laidžių polimerų savybės (taip pat ir elektroninės) priklauso nuo jų
cheminės formulės ir sandaros (13.17 pav.), cheminė sintezė leidžia kurti unikalių savybių
elektronines medžiagas. Jų įvairovė apribota tik mokslininko fantazija.

13.17 pav. Elektrai laidžių polimerų formulės

Buvo parodyta, kad elektrai laidūs polimerai gali būti panaudojami įvairiuose prietaisuose: Saulės,
kuro elementuose, šviesos dioduose, tranzistoriuose, taip pat mikrolitografijos, korozijos kontrolės
srityje, elektrai laidiems klijams gaminti, mikrobangų sugėrikliuose, įvairiuose jutikliuose, vaistų
išnešiojimų sistemose.

Dėl savo cheminių savybių elektrai laidūs polimerai labai naudingi gaminant jutiklius. Puikus jų
pavyzdys – biologiniai jutikliai. Jie naudojami nustatant gliukozės (ir kitų medžiagų) koncentracijas.
Gliukozė yra oksiduojama deguonimi veikiant fermentui gliukozės oksidazei. Taip gaunamas
vandenilio peroksidas, kuris oksiduoja jodido jonus. Todėl atsiranda trijodido jonai. Elektros
laidumas yra tiesiogiai proporcingas peroksido koncentracijai, o ši proporcinga gliukozės
koncentracijai (13.18).
 13.18 pav. Gliukozės koncentracijos nustatymas naudojant elektrai laidų polimerą

Iš visų aukščiau išvardintų elektrai laidžių polimerų sintezės taikymo galimybių tikriausiai
perspektyviausios ir labiausiai reklamuojamos yra lengvai įkraunamos baterijos. Kai kurios
prototipinės baterijos yra panašios į (ar netgi geresnės už) nikelio ir kadmio elementus dabar
parduodamus parduotuvėse. Polimerinės baterijos, tokios kaip polipirolas – ličio elementai, veikia
oksiduodamos ir redukuodamos polimero pagrindą. Per įkrovimą polimeras oksiduoja anijonus,
esančius elektrolite. Tuo pačiu metu vyksta ličio jonų elektrocheminis nusodinimas ličio paviršiuje.
Nueinantys elektronai yra pašalinami nuo ličio. Taip ličio jonai priverčiami pakartotinai pereiti
elektrolitą ir pereiti pro krūvį į jonizuotą polimerą. Teigiamos polimero vietos yra redukuojamos
išleidžiant krūvį balansuojančius anijonus atgal į elektrolitą. Šis procesas gali būti kartojamas tiek pat
kartų, kiek ir paprastoje baterijoje.

13.6. Biosistemų taikymas saulės elementų gamybai

Mikroorganizmų Saulės elementai

Mikroorganizmų Saulės elementai (MSE) yra tokios biotechnologinės sistemos, kurios sujungia
fotosintetinančių ir elektrochemiškai aktyvių mikroorganizmų veiklą į darnią sistemą ir geba šviesos
energiją versti elektros energija. Taip MSE sujungia anksčiau aptartas mikrobinių kuro elementų
technologijas su fotosintezės procesais.

Principinė MSE veikimo schema pateikta 13.20 pav. Pirmiausia vyksta fotosintezė, per kurią Saulės
energija mikroorganizmuose ar augaluose verčiama chemine molekulinių ryšių energija. Iš pirminių
komponentų CO2 ir H2O vyksta biomolekulių sintezė, susidaro angliavandeniai ir lipidai. Vėliau
užaugusi biomasė pernešama prie anodo, kur vyksta biomolekulių skaidymas ir oksidacija
dalyvaujant elektrochemiškai aktyvioms bakterijoms. Šių reakcijų metu susidaro laisvieji elektronai.
Jie perduodami anodui, kaupiamas neigiamas potencialas. Susidarę vandenilio jonai per pusiau
pralaidžią membraną patenka prie katodo, kur vyksta deguonies redukcija ir susidaro vanduo. Šiose
reakcijose naudojamas nuo katodo „atplėštas“ elektronas, todėl jame didėja teigiamas potencialas.
Taip katodo ir anodo susidaro potencialų skirtumas, pradeda tekėti elektros srovė, generuojama
energija.
 13.20 pav. Mikroorganizmų Saulės elementų veikimo principinė schema ir
aukštesniųjų augalų panaudojimas gaunant elektros energiją. Mikroorganizmai skaidydami
organinį substratą atpalaiduoja laisvuosius elektronus, kurie patekę ant anodo
jame didina neigiamą potencialą.

MSE gali būti skirstomi pagal naudojamą fotosintezės sistemą ir medžiagos pernašą prie anodo.
Pagrindiniai jų tipai: aukštesniųjų augalų MSE, fototropinė bioplėvelė, fotobioreaktorius ar jūros
pakrantės ekosistema.

Iš aukštesniųjų augalų biomasė elektros elementams gaunama vadinamuoju rizodepozicijos būdu. Šis
procesas vyksta dėl to, kad augalo šaknys nuolat augdamos išleidžia organines medžiagas į aplinką.
Per šaknis augalas atiduoda aplinkai 20–40 % visos fototosintezės produkcijos. Šios išskiriamos į
aplinką medžiagos natūraliomis sąlygomis sudaro organinių medžiagų šaltinį dirvožemio
mikroorganizmams, o augalas atsikrato dalies nereikalingų junginių. Jei po augančiais augalais
patalpinsime anodą, bakterijos, vykdydamos metabolines reakcijas, dalį elektronų atiduos anodui ir
bus generuojama elektros srovė.
Iš pradžių manyta, kad iš 1 ha augalų MSE galima išgauti 21 GJ per metus (arba 67 mW/m2).
Rezultatai apskaičiuoti teoriškai įvertinus, kad Vakarų Europoje Saulė spinduliuoja apie 150 W/m 2,
vidutinis fotosintezės efektyvumas yra ~2,5 %, rizodepozicijos efektyvumas ~40 %, MSE
efektyvumas ~29 %, o augalų vegetacija trunka ~6 mėn. 2010 metais buvo praktiškai parodyta, kad
naudojant spartiną (Spartina anglica) pasiekiamas ilgalaikis 50 mW/m2 energijos tiekimas. Vis dėlto,
masinė tokių MSE gamyba kol kas nėra plėtojama – ji yra per brangi ir ekonomiškai neapsimoka.
Šios sistemos plėtojamos ieškant būdų, kaip atpiginti technologiją. Taip pat jos aktualios toms
vietovėms, kurios neturi elektros tiekimo. Sistemos naudojamos analitiniams dirvos parametrų
įvertinimo prietaisams – pelkėse matuojant taršos lygį ar panašiais atvejais.

Kitas MSE biosubstrato sintezės būdas yra organizmų auginimas fotobioreaktoriuose. Jie dažniausiai
sudaryti iš skaidrių vamzdžių su viduje augančiais mikrodumbliais (13.21 pav.). Tokiose sistemose
paprasta kontroliuoti dumblių mitybinę terpę, ją filtruoti, reguliuoti biomasės koncentraciją.

13.21 pav. Vamzdinių fotobioreaktorių sistema dumblių gamybai (Vokietija) ir

fotobioreaktorių pritaikymo Saulės elementuose schema

Iš fotobioreaktoriaus dumbliai nukreipiami į papildomą anaerobinį fermentatorių, kuriame jie iš

dalies suvirškinami kitų mikroorganizmų. Taip siekiama kuo efektyviau iš dumblių išskirti
elektrocheminėms reakcijoms reikalingas organines medžiagas (13.21 pav.). Per šias reakcijas kaip
šalutinis produktas susidaro metano (ir kitos) dujos, kurios gali būti naudojamos kūrenti šiluminius
elektros generatorius. Teoriškai fotobioreaktorių sistemos galėtų generuoti iki 2806 mW/m2. Tačiau
aukščiausias praktinis rezultatas tesiekia 14 mW/m2 – tik pusę procento teorinių galimybių.

Dar vienas būdas iš kur būtų galima gauti biosubstrato, yra jūrų pakrantės mikroorganizmai. Šio
metodo pranašumas yra didelis jūros vandens tūris ir paviršius. Jame plūduriuoja ir aktyviai auga
dumbliai, fitoplanktonas su zooplanktonu, kurie galėtų būti panaudojami kaip substratai
elektrochemiškai aktyviems mikroorganizmams. Didžiausias šio būdo taikymo iššūkis yra efektyvus
biomasės surinkimas iš vandens.

Biomolekulės Saulės energijos elementams kurti

Gamtoje vykstantis Saulės energijos sugertis ir elektros krūvio atskyrimas yra gerokai efektyvesnis
už dirbtines žmogaus kuriamas technologijas, skirtas Saulės šviesai paversti į elektros energiją. Todėl
mokslininkai nuolat ieško naujų medžiagų ir būdų, kaip pagerinti šio proceso efektyvumą ir jį
atpiginti tiek, kad jis taptų ekonomiškai konkurencingas iškastinio kuro energijai. Plėtojantis
technologijoms, labai dažnai atsigręžiama į motulę Gamtą ir mokomasi iš jos darniai veikiančių
sistemų.
Įdomu, kad šiuo metu ekonomiškai labiausiai apsimoka diegti ne aukštos kokybės efektyviausias
technologijas, o žemo efektyvumo Saulės elementus. Jie pagaminti iš organinių molekulių ar laidžių
polimerų. Organinės medžiagos yra itin perspektyvios. Jos gerokai pigesnės nei reti metalai,
naudojami neorganiniuose Saulės elementuose. Jos taip pat gali būti paprasčiau modifikuojamos
siekiant pakeisti ir optimizuoti jų optines savybes.

Šiuo metu ypač populiarėja ftalocianinų ir porfirinų taikymas tokiuose tyrimuose. Šių molekulių
struktūra panaši į keturlapį dobilą, kurio centre yra metalo jonas, apsuptas anglies ir azoto atomų
žiedų. Porfirino tipo molekulės atlieka svarbias funkcijas gyvūnuose ir augaluose. Jos sudaro
hemoglobino, chlorofilo ir citochromų (dalyvauja elektronų pernašos grandinėse) aktyviuosius
centrus. Keičiant porfirinų centrinį metalo joną ir žiedų šonines grupes keičiama molekulės elektronų
konfigūracija ir gebėjimas sugerti spinduliuotę bei efektyviai perduoti ją elektrodams.

Trumpai aptarsime, kaip vyksta Saulės energijos vertimas elektra (13. pav.). Kiekvienas elektronas
gali užimti tik tam tikrą (diskrečią) energijos būseną. Tai reiškia, kad jo energija negali būti bet kokia,
o kinta tam tikromis porcijomis (kvantais). Esant ramybės būsenai fotoaktyvios medžiagos elektronas
užima nesužadintą energetinę būseną, vadinamą HOMO (angl. highest occupied molecular orbital).

13.22 pav. Šviesos kvanto sugertis ir elektronų pernaša

Apšvietus tokią medžiagą, elektronas gali sugerti šviesos kvantą (kurio energija E = hν, kur ν –
elektromagnetinės bangos dažnis, h – Planko konstanta). Įgijęs papildomos energijos, elektronas
peršoka į aukštesnės energijos sužadintą būseną LUMO (angl. lowest unoccupied molecular orbital).
Esant tokiai perteklinės energijos būsenai, sužadintas elektronas yra nestabilus. Jis šią energiją
praranda vienu iš kelių būdų ir grįžta į savo pradinę būseną:

1. Išsiskiria šiluma,
2. Vyksta liuminescencija,
3. Eenrgija perduodama aplinkinėms molekulėms,
4. Elektronas perduodamas aplinkinėms molekulėms.

Jei prie tokios medžiagos prijungsime elektrodą – kitą medžiagą, kurios elektronų energetinis lygmuo
yra šiek tiek žemiau už mūsų nagrinėjamo elektrono LUMO lygmenį, tuomet sužadintas fotoaktyvios
medžiagos elektronas turės papildomą būdą prarasti energiją. Jis galės peršokti į elektrodą (anodą),
užuot grįžęs į savo pradinę HOMO būseną. Elektrode dėl padidėjusio elektronų kiekio pradės kauptis
neigiamas krūvis, susidarys tam tikras neigiamas potencialas (tai bus anodas). Kai iš fotoaktyvios
molekulės išlėks elektronas, joje susidarys skylė (vakansija) – neužpildyta elektrono orbitalė.
Jei prie šios medžiagos prijungsime antrą elektrodą, kuriame esančių elektronų energetinis lygmuo
yra šiek tiek aukštesnis už fotoaktyvios medžiagos HOMO būseną, tuomet elektronai iš elektrodo
galės peršokti į fotoaktyvią molekulę ir užimti susidariusią skylę. Tokiu atveju, antrajame elektrode
susidarys elektronų trūkumas, jame palaipsniui didės teigiamas krūvis (tai bus katodas). Sujungus
teigiamą ir neigiamą elektrodus į bendrą grandinę, elektronai pradės judėti iš didesnio elektrinio
potencialo link mažesnio. Tarp elektrodų pradės tekėti elektros srovė, kuri pagal Omo dėsnį
proporcinga potencialų skirtumui (I = U/R).

Viskas prasideda nuo šviesos kvanto sugerties. Todėl kuriant naujus Saulės elementus ieškoma pigių
medžiagų, kurios efektyviai sugertų šviesą ir perduotų didelės energijos elektroną į grandinę. Gamtoje
tai efektyviai atlieka porfirino tipo molekulė – hemas. Jo centre yra geležies jonas (13.23 pav.). Šioje
molekulėje porfirino žiedai veikia kaip antena, sugerianti šviesos kvantą, o geležis atlieka elektrono
perdavimą. Hemas įeina į baltymų – hemoglobino, chlorofilo ir citochromų sudėtį. Tai rodo aukštą
šios molekulės svarbą biocheminiuose elektronų pernašos procesuose. Mokslininkai aktyviai domisi,
kaip šias molekules galima būtų „įkinkyti“ dirbtinėse sistemose, kurios būtų efektyvios ir pigesnės
už dabartines medžiagas.

13.23 pav. Viršuje: hemo grupės struktūra, baltymo (citochromo c), į kurio sudėtį įeina hemas,
struktūra. Apačioje: hemo grupės geležies atomo rentgeno spindulių sugerties spektras. Rentgeno
spindulių spektroskopijos metu galima išskirti tik geležies sugerties juostas iš šimtų
angliavandenilių sugerties fono.

Be porfirinų ir ftalocianinų pastaruoju metu plačiai domimasi melanino ir bakteriorodopsino

panaudojimu Saulės elementų gamyboje. Melaninas yra natūralus pigmentas, randamas daugumos
žinduolių odoje, plaukuose, akyse, vidinėje ausyje, smegenyse ir kituose audiniuose. Jis suteikia
mūsų odai rusvus atspalvius ir lemia jos patamsėjimą įdegant Saulėje. Pasirodo, ši medžiaga itin
fotostabili ir sugeria šviesą plačioje spektro srityje – nuo ultravioletinių iki matomų spindulių (13.24
pav.). Medžiagos fotostabilumas yra viena pagrindinių savybių, reikalingų Saulės elementams. Tai
lemia Saulės elemento ilgaamžiškumą. Platus medžiagos sugerties spektras svarbus norint kuo
efektyviau sugerti ir išnaudoti visą Saulės spinduliuojamą šviesą. Iš tiesų melaninas sudarytas iš kelių
medžiagų komplekso, kurio svarbiausi komponentai yra eumelaninas ir feomelaninas.
 13.24 pav. A) Melanino sugerties spektras, struktūrinė formulė ir lokalizacija odoje. Medžiaga
pasižymi stipria sugertimi beveik visoje matomoje ir UV spektro srityje (ypač UV). Tai sąlygoja
efektyvią gilesnių kūno sluoksnių apsaugą nuo spinduliuotės prasiskverbimo;
B) Bakteriorodopsino struktūra, fotoizomerizacijos ciklas ir saulės elemento modelis. Baltymas
sugėręs šviesos kvantą pakeičia savo konformaciją, perneša elektros krūvį ir vėliau grįžta į savo
pradinę būseną. Tai stabilus grįžtamasis procesas. Siekiant baltymą „įdarbinti“ saulės elementuose,
reikia jį erdviškai taip orientuoti, kad jo galai būtų kuo arčiau elektrodų, o elektronas galėtų
efektyviai pereiti į elektros grandinę.

Bakteriorodopsinas yra fotoaktyvus baltymas, randamas archėjose (13.24 pav. B). Šis baltymas yra
labai panašus į rodopsiną, randamą žmogaus ir kitų gyvūnų akies tinklainėse. Sugėrus šviesos kvantą,
bakteriorodopsino centre esanti retinalio grupė izomerizuojasi, keičiasi viso baltymo sugerties
spektras. Tranformacijų metu baltymas per kelias tarpines būsenas deprotonizuojasi ir
reprotonizuojasi – iš pradžių netenka protono, o vėliau jį atgauna. Fotociklo pabaigoje
bakteriorodopsinas grįžta į pradinę būseną. Ciklo metu protonas pernešamas iš vieno baltymo galo į
kitą. Gyvose ląstelėse bakteriorodopsinas pumpuoja protonus iš ląstelės vidaus į išorę. Todėl galima
panaudoti šį baltymą krūvio pernašai dirbtinėse sistemose atlikti – potencialų skirtumui sukurti.

Bakteriorodopsinas yra itin atsparus cheminiam, šiluminiam ir fotocheminiam poveikiui, todėl jis
labai tinka Saulės elementų gamybai. Svarbi tokių elementų panaudojimo sąlyga yra tinkama baltymo
orientacija, nes krūvis (protonai) pernešamas išilgai molekulės ašies. Kryptingai orientuoti molekules
galima lokalizavus baltymus jiems natūraliai priimtinoje aplinkoje – fosfolipidinėje membranoje. Iš
abiejų jos pusių prijungiami elektrodų kontaktai (13.6.5 pav. B).
Atsinaujinantys Saulės elementai

Tiek žmogaus kuriamų Saulės elementų elektros srovė, tiek augaluose vykstanti fotosintezė prasideda
nuo šviesos kvanto sugėrimo. Jo energija virsta elektrono sužadinimo ir išlaisvinimo energija.
Gamtiniame chlorofile (ir kituose pigmentuose) tai yra pakopinis procesas, kuris vyksta molekulės
aktyviajame centre. Jei šis centras yra pažeidžiamas, molekulė tampa optiškai nebeaktyvi ir todėl
nebegali palaikyti potencialų skirtumo, užtikrinti srovės tekėjimo. Su ta pačia problema susiduria ir
saulės elementų gamintojai: dėl pastovios spinduliuotės fotoelementai „išdega“, suyra juos
sudarančios molekulės ir kristalai. Augalinėse ląstelėse pažeistos ir nebeaktyvios molekulės
pakeičiamos naujomis vidutiniškai kas valandą. Purdue universiteto (JAV) mokslininkai pasiūlė, kaip
galima šį principą panaudoti ir anglies nanovamzdelių pagrindu sukurtuose Saulės elementuose.

13.25 pav. Atsinaujinančio Saulės elemento schema. Biomolekulės (žalios), kurios atlieka šviesos
sugėrimo funkciją, susidėvi, todėl turi būti pakeičiamos. Prie anglies nanovamzdelio, kuriuo
perduodami daug energijos turintys elektronai, biomolekulės prijungtos nekovalentinėmis
jungtimis. Jos leidžia pažeistoms molekulėms disocijuoti ir prisijungti naujoms molekulėms.

Įprastiniuose Saulės elementuose spinduliuotę sugeriančios molekulės yra tvirtai kovalentiškai

prijungtos prie elektroną perduodančio pagrindo. Dažniausiai tai yra porfirinai, rutenio kompleksai
ar puslaidininkiniai nanokristalai. Mokslininkai sukūrė nekovalentiškai prijungtas funkcionalizuotas
biomolekules, kurios yra vandeniniame tirpale aplink anglies nanovamzdelius (13.25 pav.).

Priešingai nei neorganinių medžiagų, biomolekulių savybės priklauso nuo terpės, kurioje jos yra
(rūgštingumo, temperatūros, druskų koncentracijų ir kt.). Todėl tokios sistemos savybes galima
reguliuoti keičiant mikroaplinką. Keičiant biomolekulių dydį galima keisti atstumą tarp fotoaktyvios
molekulės ir elektroną pernešančio nanovamzdelio. Taip optimizuojama elektrono pernaša, kuri yra
labai jautri atstumui tarp molekulių. Kita mokslininkų grupė (Strano ir kt.) sugalvojo naudoti ne
vandeninį, o lipidinį tirpalą, į kurį įeina fosfolipidai ir fotojautrūs baltymai.

Paprastai tokioje suspensijoje molekulės išsidėsto chaotiškai. Todėl medžiaga yra nelaidi elektrai,
sužadintas elektronas neperduodamas anglies paviršiui. Tačiau naudojant tam tikrus surfaktantus šios
biomolekulės ant paviršiaus išsidėsto tvarkingai ir gali efektyviai perduoti elektronus. Kai
biomolekulės susidėvi, jos atsijungia nuo paviršiaus. Jų vietą užima kitos aplinkinėje suspensijoje
esančios fotoaktyvios biomolekulės.

Literatūros sąrašas:

 Kadziauskas J. Biochemijos pagrindai. Vilniaus universiteto leidiniai, 2012; p.648.

  Strik DP, Timmers RA, Helder M, Steinbusch KJ, Hamelers HV, Buisman CJ.
Microbial solar cells: applying photosynthetic and electrochemically active organisms.
Trends Biotechnol. 2011 Jan; 29(1):41-9.
 Jin Y, Honig T, Ron I, Friedman N, Sheves M, Cahen D. Bacteriorhodopsin as an electronic
conduction medium for biomolecular electronics. Chem Soc Rev. 2008 Nov;37(11):2422-
32.
 Meredith P, Powell BJ, Riesz J, Vogel R, Blake D, Kartini I, Will G, Subianto S. Broad
Band Photon Harvesting Biomolecules for Photovoltaics. Chapter in Artificial
Photosynthesis: From Basic Biology to Industrial Application. 2006, Wiley-VCH Verlag
GmbH.
 Barton SC, Gallaway J, Atanassov P. Enzymatic biofuel cells for implantable and
microscale devices. Chem. Rev. 2004; 104: 4867-4886.
 Schreiber, William. "Solving the Energy Problem." MIT Faculty Newsletter. May/June
2007. (Jan. 17, 2012) http://web.mit.edu/fnl/volume/196/schreiber.html

Taip pat daugiau informacijos rasite šiuose internetiniuose tinklalapiuose:

 Treehugger [interaktyvus]. „Ask the EcoGeek: Muscle Power.“ Žiūrėta 2012-09-02. Interneto
tinklalapis <http://www.treehugger.com/files/2007/07/ask_the_ecogeek_1.php>
 http://gamta.vdu.lt/bakalaurai/pop_straipsniai/
 http://www.asu.lt/nm/l-projektas/mikroorganizmubio/50.htm
 http://www.elektor.com/news/nature-inspired-solar-panels-are-self-healing.1665912.lynkx
 http://www.msnbc.msn.com/id/39058522/ns/technology_and_science-
green_innovation/t/scientists-develop-self-healing-solar-cells/#.UGmH9k3tRMk
 http://science.howstuffworks.com/environmental/green-science/
 http://www.skyrenewableenergy.com/renewable-energy/bio/
 http://nobelprize.org
 http://www.conductivepolymers.com
 http://regions202020.eu/cms/assets/Uploads/Resources/Metodine-medziaga-Zemes-ukis-
energetikai.pdf