Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • Biologie Celulară Și Moleculară LP2

    Uploaded by

    Ioa Ola
    10 views10 pages

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    10 views10 pages

    Biologie Celulară Și Moleculară LP2

    Uploaded by

    Ioa Ola

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    of 10
    2. Metode de studiu in Biologia Celular si Moleculard Microscopia electronic de transmisie— TEM (transmission electron microscopy) Microscopia fotonic& prezint limitiri impuse de lungimea de undi a luminii vizibile. Microscoapele care utilizeazA alti sursi de radiafie, cum ar fi microscoapele electronice , pot furniza informatii la o rezolutie de ordinul a 1 nm (10 A). De fapt, insisi noyiunea de biologie ‘moleculatt a apdrut odata cu utilizarea microscopului electronic in biologie, dupa anii 1950. ‘Intr-o perspectiva foarte generalé, microscopul electronic de transmisie este similar ‘microscopului optic, avand insa tot designul inversat. (Fig 1) a7 ne Fig. 1. Schema de functionare a microscopului fotonic (stinga) si a microscopului electronic de transmisie (dreapta). Sursa de iluminare este inlocuité cu un filament sau catod, care are rolul de a emite fasciculul de electroni( generatorul de e). Imaginea se formeazA prin trecerea unui fascicol de electroni accelerat (electroni primari) intr-un spafiu vidat prin preparatul de analizat, imaginea putind fi analizati pe un ecran fluorescent. Catodul este localizat in partea superioard a unei coloane cilindrice de aprox 2 m. Pentru a se evita dispersia electronilor din fascicul prin coliziunea cu moleculele din aer, spatiul din coloand este vidat. In microscopia electronica fasciculul de lumina este inlocuit cu un fascicol de electroni accelerati. Blectronii mu au o Iungime de unda constanta, lungimea de undi crescand cu viteza lor. De exemplu, la 0 tensiune de accelerare de 100 000 V Iungimea de unda a electronilor este 0,004 nm, adic aproximativ dimensiunile unui atom. Teoretic, din calcule matematice rezolufia ar trebui sa fie 0,002 nm. In realitate, rezolutia unui microscop electronic de transmisie este mai mica (0,2 nm), fiind limitata de mai multe cauze, cum ar fi de exemplu: a) aberatiile de sfericitate ale lentilelor electromagnetice, (care sunt mult mai greu de corectat decit in cazul lentilelor din sticla), b) tehnicile de preparare (fixare, includere contrastare), etc. ‘Componentele microscopului electronic de transmisie si principiul de functionare. Fig.2. Microscopul electronic de transmisie din dotarea Disciplinei de Biologie Celulara si ‘Moleculara—Universitatea de Medicina Grigore T. Popa Iasi 1. tunul electronic - ansamblul catod - anod si cilindrul Wehnelt. Catodul inodlzit la incandescent emite electroni. Prin aplicarea unei diferenfe mari de potential de 100-300 kV intre catod (filament de tungsten) si anod, electronii sunt dirijati c&tre anod prin intermediul cilindrului Wenhelt. 2. pompa de vid, care asiguri un vid inalt la nivelul coloanei microscopului pentru a se asigura un fascicul de electroni coerent si rectiliniu 3. lentile clectromagnetice condesor previizute cu un orificiu fix (apertura). 4. camera preparatului S. panou de control al fluxului de clectroni prin lemtile si aperturi. 6. panow de control al focalizirii si maririi imaginii. 7. monitor care red& imaginile objinute cu o camer’ fotografic& aflaté in interiorul microscopului 8. camera de obscrvare prevazuti cu eotan fluorescent. Imaginea este produst prin trecerea unui fascicol de electronii primari prin preparatul de analizat. Aplicatit: Domeniul de investigatie al microscopiei optice a fost extins prin aparitia microscopiei electronice de la nivel de tisular la nivel molecular. A fost astfel creat contextul pentru a analiza: - structura si configurarea acizilor nucleici, virusuri, mecanismele infectiei virale, - etapele proceselor de translatie si transcriptie in biosinteza proteica, - transportul ionilor prin membrane reactiilor imunologice si a activitatii enzimat - struotura si configuratia macromoleculelor proteice, etc. Ne aflém astfel Ia un domeniu informational de ultrastructurd, esential diferit de histologia sau fiziologia clasica. ‘Microscopul electronic de baleaj SEM (scam lectron microscopy) tn 1965 a aparut primul microscop electronic de baleaj SEM (scanning electron microscopy). SEM oferd informatii asupra structurii tridimensionale a suprafejelor. In cazul SEM, imaginea este produsi de clectronii secundari, reflectafi de preparat, si captafi de un detector pentru electroni secundari. Puterca de rezolutie a acestui tip de microscop electronic este aproximativ de 10 ori mai redusé comperativ cu TEM. (fig.3) = iss / (a= Re Fig.3. Schema de functionare a microscopului electronic de baleaj.. ‘Microscopia crio-electronica La inceputul anilor ‘80 au aparut primele publicafii legate de microscopia crio- electronic’, din necesitatea protejarii probelor biologice de radiatille necesare pentru a obfine 0 imagine. Acest tip nou de explorare, permite studierea direct a probelor rapid conservate la temperaturi criogenice ( temperaturi corespunzitoare azotului lichid, mai mici de -150°C), faré a fi fixate sau colorate anterior. Avantaje: - permite obtinerea unei rezolufii de nivel atomic, putindu-se analiza virusuri, ribozomi, mitocondrii, canale ionice, complexe enzimatice, etc. In anul 2017 a fost acordat premiul Nobel pentru chimie lui Jacques Dubochet, Joachim Frank $i Richard Henderson, pentra “dezvoltarea criomicroscopiei electronice, cu scopul determinaii cu {nalti rezolufic a structurii biomoleculelor din solutii” Criofracturarea Criofracturarea este © metod folositi in tandem cu procedura de examinare in microscopie electronica. Metoda consti in fracturarea unei probe biologice congelate. Detaliile expuse prin ffracturare (planul de fractura) sunt accentuate prin depunerea unui strat subfire de platind/carbon peste planul de fracturd;depunerea stratului are loc sub vid. Se realizeazi o replicé (copie perfecta negativl), care poate fi examinatd in microscopie electronica de transmisie. Metodi Celulele sunt congelate in Ns lichid (-196°C), indirect, intr-un sistem bain-marie cu izopentan; piesa este imersata in izopentanul récit indirect de azotul lichid Congelarea are loc in prezenja unui agent de crioprotectie pentru a preveni distorsiunile (artefactele) determinate de formarea cristalelor de gheajé. Ulterior blocul de gheaffi format este spart cu ajutorul unui cutit. in cazul examinérii membranelor celulare, planul de fracturd traverseaza adesea planul hidrofob al stratului bilipidic al plasmalemei. bon (vaporizare #00 vid = 90°C) Fefele de fracturd rezultate sunt acoperite prin pulverizare sub vid cu un strat subjire de platini-carbon. Stratul de carbon se face prin depunere verticalé. Depunerea platinei se face sub ‘un anumit unghi (45°)astfel incat unele zone capteazi mai mult metal si determina un aspect ,de ‘umbra” sub incidenfa unui fascicul de electroni . Se obsine o replica de platind-carbon care este ccurdfatd gi examinata cu ajutorul microscopului electronic de transmisie. Curdjarea se realizeazi la presiune atmosferica gi temperatura camerei, cu ajutorul unei solutii de hipoclorit de sodiu. Fig.5 Imagimi de microscopic electronic de transmisie (A,B), imagine de microscopic de baleaj si ctiofiacturare (C). MICROSCOPUL CONFOCAL Produce imagini digitale de calitate superioard a diferitelor probe, pomind de la principiul fluorescenfei, utilizind probe simplu, dublu sau triplu marcate fluorescent in culorile rosu, verde si albastru. in comparatie cu microscopul optic conventional, cel confocal permite controlul adéncimii de cémp si climinarea perturbatiilor imaginii care apar datoriti. lipsei de focalizare, imbunatafeste contrastul gi rezolutia, Componentele microscopului confocal 1, sursa de radiafii —laserul 2, oglinda dicroic& 3. detector — tub fotomultiplicator 4, ecran de focalizare- fltru (pinhole) D —rroponutprer sat Batctoe #0" “Laser Seanning passe contol teroscoce Kari ‘Spt Fugue sggegys conttguation Pie - Exctaton Lace wie | \ TS a Upithahe } Fat eactazon # ae gh our Aperture Focal HS sigu2 Principiul de functionare ‘Microscopul confocal permite focalizarea punct cu punct a imaginii, succesiv, in diferite seefiuni si profunzimi ale preparatului, astfel ca in final se vor crea imagini tridimensional Blocarea razelor nefocalizate se face cu ajutorul ecranului de focalizare care nu este altceva decat ‘un ecran opac cu un orificiu foarte mic in centrul lui (pinhole aperture). Desi acest orificiu va reduce considerabil atét cantitatea de lumina cat si largimea cémpului microscopic, in final jimaginea obfinuti nu mai este bluraté. Se vor putea uni mai multe imagini din acelasi plan rezulténd 0 imagine mai mare. Se pot uni si mai multe planuri intre ele care vor genera (dupa prelucrarea software corespunz&toare) o imagine tridimensionala. Avantaje ~ Pemnite trecerea doar a razelor care sunt rezultatul focalizirii unui singur punct al mostrei, realizand astfel blocarea razelor din grosimea preparatului, care sunt rispunzitoare de aparifia imaginilor blurate. Asfel se explic& rezolutia si contrastul superior al imaginilor obfinute cu microscopul confocal. Aplicatii - permite examinarea in dinamic& a celulelor vii - detectarea celulelor nemarcate intt-o populatie de celule marcate fluorescent - analiza proteinelor membranare - analiza interactiunilor dintre celulele din cultura etc. MICROSCOPUL CU FORTA ATOMICA (AFM) Pentru investigarea suprafejelor, cele mai folosite metode sunt Scanning Electron ‘Microscopy (SEM) si Scanning Probe Microscopy (SPM) SPM cuprinde un grup de tehnici care permite accesul rapid la caracteristicile fizice ale suprafefelor prin scanarea unci suprafefe cu un varf foarte ascujit si crearea unei imagini de inalta rezolufie a materialului studiat. AFM esto cea mai folositi technica a SPM, servind pentru analiza topografica a suprafetelor. Se pot obfine imagini tridimensionale cu rezoluie de ordinul nm, Utilizari: in cercetarea fimdamental&, in stiinfa materialelor, fizic&, biologie, chimie, deschizénd astfel era nanotehnologici Principiul de functionare Sonda microscopului cu forfa atomic& este alcatuita dintr-o lamel sub forma de cruce, alungiti gi elastic, numita cantilever, cu dimensiuni de ordinul zecilor de microni, in capatul cAreia este plasat un ac ascuft, perpendicular pe cantilever. Cantileverul este miscat in plan xy gi vertical de un sistem de pozitionare piezoelectric, cu precizia in jur de 5 nm orizontal si pana la 10 pm vertical. in timp ce acul baleiaz suprafafa, migedndu-se in sus si in jos odati cu conturul acesteia, 0 razi{ laser cade oblic pe partea superioara (putemic reflectatoare) a cantileverului si se reflecta cltre un senzor alcatuit din dou’ fotodiode aléturate (sau 0 fotodioda splitata) Acul cu un varf foarte ascutit (in varf se afld cativa atomi), montat pe cantilever se deplaseazi pe suprafata probei . Varful acului face ca latura cantilverului care il confine si se deformeze in functie de forjele care actioneaza asupra sa. Aceste forte sunt intt-o strict relatie cu harta topografici a probei studiate. Varful este apropiat de proba pand cand intre acesta gi molecule din proba se stabileste o fort din categoria forfelor van der Waals, bazate in primul rand pe forfele electrostatice dintre particulele incarcate ale acului si probei. Aceasti fort, in functie de “denivelarile” de la suprafaja probei , respinge sau atrage varful. In timp’ ce cantileverul se deformeazi , lumina proveniti de la un laser este reflectati pe o fotodiod’ splitati. Interactia dintre varf si proba Componentele unui microscop cu forte atomice: (1) un cantilver prevazut cu un varf ascutit (2) un scanner care controleaz pozitionarea pe axele x-y-z (3) un laser cu semiconductor (4) un fotodetector (5) circuit de control al reactiei . oor laser cantilever ye vart Lntataprocesare (Sieg so: suprafata de studiu =

    You might also like