LObtinerea unui preparat permanent: generalititi, utilitate medical practic& si in cercetare, recoltarea si prelucrarea probelor, includerea in parafina si sectionarea, ILPrelucrarea probelor pentru examinarea in microscopia electronic’ de transmisie ULSectionarea la gheati: utilitate medical’ avantaje, Studiul structurii colulelor,de 0 deosebiti complexitate morfo-funcfionala este, posibil de realizat doar intr-o mic mésurd cu microscopul fotonic deoarece are o putere de rezolutie redus’, Acest studiu necesiti utilizarea unor tehnici speciale de citomorfologie, citochimie, citoenzimologie etc., al céror atribut este conservarea integritatii structurale in conditii cét mai apropiate de cele existente in organismal viu. Pentru identificarea cu ajutorul microscopiei fotonice a unor caracteristici morfofuncfionale a celulelor este necesard realizarea unor preparate mieroscopice formate fic din sectiuni subfiri,plane gi transparente obfinute prin recoltare de probe tisulare urmaté de o prelucrare conform tehnicii avute in vedere,etalate pe o lami de sticli sau portobiect cu dimensiuni standard de 76/26mm (LA), 1,5-2mm grosime, protejate de o lamela de sticla de forma patrata sau dreptunghiulari,de dimensiuni variabile, fie prin etalarea materialului biologic {in monostrat pe o lama de sticla-frotiu,amprente de organe inainte de a fi folosite, atat lamele cat si lamele vor fi bine curitate si degresate. Preparatele microscopice se clasifica in: 1. Preparate permanente care permit un studiu amanuntit al celulelor pe secfiuni fixate si colorate; ele rezistd in timp gi se pot realiza prin: : a. metoda sectiunilor fine; . b, metoda etalarii materialului biologic in monostrat (frotiu, amprente de organe); 2. Preparate extemporanee, proaspete sau temporare Realizarea unui preparat microscopic permanent prin metoda secfiunilor fine necesit’ 0 anumita tehnicl care se desfigoaré in ummitoarele etape: recoltare, fixare, spilare, includere, sectionare, etalarea materialului biologic pe lama, colorare, montare METODA OBTINERII UNUI PREPARAT MICROSCOPIC PERMANENT. LLLRECOLTAREA PROBELOR TISULARE Recoltarea include 0 serie de metode prin care se objin mostre de jesut de diferite consitenge (Solide ~ os, mugchi, piele etc. sau fluide din cavitifi reale/virtuale — pleura, pericard, peritoneu) in vederea investigirii lor morfologice. Existi numeroase metode de recoltare a produsului biologic, clasificate in:a. Metode invazive ~ pentru tesuturi care nu pot fi accesibile in mod direct, sau la care nu se poate ajunge prin intermediul unor orificii naturale; b, Metode minim invazive ~ pentru fesuturi superficiale, fesuturi care pot fi accesate prin intermediul unor orificii naturale sau tehnici care nu necesit& o alti forma de anestezie decéit cea locala, pentra tesuturi accesibile prin punctionare percutanaté; Exemple de metode de recoltare a fesuturilor: - Biopsia excizionald ~ se adreseaz& unor leziuni accesibile direct sau indirect, indepartate complet, in cadrul unei interventii chirurgicale. - Biopsia incizionalé ~ se adreseazA unor leziuni care nu sunt indepartate complet ci numai explorate chirurgical dupa reguli precise. Chirurgul preleva probe bioptice din diferite regiuni de interes ale regiunii investigate. - Biopsia de raclare — in special pentru leziuni cutanate. Aceste tipuri de biopsii chirurgicale sunt considerate a fi invazive, oferd siguranga unui diagnostic in aproape 100% din cazuri, fiind considerate ,,standardul de aur”. De asemeni, pentru tumorile mici, biopsiile excizionale pot fi chiar curative dac& fragmental de fesut prezind margini de rezectie negative histopatologic. Dezavantajul il reprezinta faptul c& necesita incizii mai mult sau mai putin extinse ce pot lasa cicatrici tegumentare, recuperarea dureazi mai mult decat in cazul puncfiilor percutanate $i au un risc mai mare de complicafi = punetia/biopsia aspirativi: cu ac fin — utilizath in prineipiu pentru formatiuni chistice, cu indicafii reduse pentru tumori solide, datoriti celularitatii reduse a materialului recoltat, ce uneori face dificila diferentierea intre o leziune maligna in situ si una invaziva. in schimb este rapida, facild, cu un cost redus gi este cea mai pufin invazivé, + puncia/biopsia cu ac gros — este utilizat un ac de punctie mai gros, special, prevazut cu un sistem de taiere obfinandu-se un cilindru de fesut suficient pentra a diferentia un fesut invaziv de unul neinvaziv; este folosita pentra formatiuni solide. Avand in vedere ci se recolteazi doar fragmente de fesut, nu toat& formatiunea exist’ posibilitatea ca fragmentul de tesut recoltat astfel si nu contin celule tumoral, deci, nu avern 0 garantie absolutd in caz de negativitate a probei 7 * Dupa recoltare, fesutul este splat cu PBS (tampon fosfat salin) pentru indepartarea sngelui sau a altor secrefii si ulterior, cu ajutorul unei lame se taie fragmente de fesut de dimeniuni de aproximativ 10/10/3mm (3mm grosimea maxima). 1.2.FIXAREA PROBELOR Fixarea este un timp obligatoriu in realizarea preparatelor permanente gi are drept scop Principali conservarea (imobilizarea) constituienfilor celulari intr-o stare ct mai apropiat& de starea vie si de pregarirea lor in vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare), Aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituienfi ai materiei vii, ceea ce inseamni ci un bun fixator histologic trebuie sd fie in primul rand un fixator al proteinelor. ‘Mecanismul molecular al fixérii proteinelor nu este ined perfect elucidat dar este cunoscut faptul cd fixatorii determina 0 coagulare sau o insolubilizare a proteinelor si in majoritatea cazurilor, un anumit grad de polimerizare al acestora De exemplu, formaldehida, elementprincipal al fixetorilor uzuali se combini cu numeroase grupiri functionale ale moleculelor proteice, formeazi legituri inte moleculele invecinate si constituie astfel complexe macromoleculare insolubile. © alta consecin{a important a acestei coaguléri a proteinelor este blocajul reactiilor enzimatice pe care le antreneazi, impiedicnd astfel distrugerea autoliticd a tesuturilor. Fixarea trebuie privitd in functie de: © gradul conservarii morfologice pe care dorim si-1 obtinem: fixarea se realizeazi in mod diferit pentru microscopia electronica (unde trebuie pastrate relafiile dintre constituienfii chimici ai celulei la scar& moleculara, cea ce nu este indispensabil in acelasi grad pentru ME) fat de cea fotonica; © de natura constituientilor chimici ce trebuie conservafi:existé constituienti macromoleculari cum ar fi proteinele care sunt usor de fixat comparativ cu alti constituienti (de ex.oligozaharidele), care sunt mai instabili si dificil de fixat; © do volumul fragmentelor tisulare ce trebuie conservate: fixarea unui frotiu de singe este diferité comparativ cu cea a fixirii unui organ de soarece sau a unui organ uman, aceasta depinznd de viteza de patrundere a fixatorului; © de tipul reactiilor de culoare sau histochimice pe care le efectu&m: nu vom fixa in acelasi fel cAnd vom folosi o colorafie simpla ,topografics” sau vom incerca decelarea lipidelor sau enzimelor, in bun fixator ¢ ~ si pitrunda rapid in tesut; ~ si produc o retractie ct mai mica a pieselor evitind modificarea dimensiunilor, formei si a raporturilor dintre celule; ~s& permit o buna includere; - si permit o bund colorare a structurilor a ciror evidentiere se doreste. Reguli generale ale fixii - evitarea alterarilor autolitice — fixarea trebuie facut’ cat mai repede posibil dupa recoltarea materialului biologic; - spilarea fragmentelor — cu 0 solutie fiziologic’, nu in ap care poate provoca umflarea {esuturilor, - evitarea uscdirii fesuturilor ~ ficdnd toate manevrele ce preced fixarea intr-un mediu umed - acoperirea fragmentelor cu o solufie fiziologica, umectarea lamelor cu care se sectioneaz sau alt instrumentar folosit cu acelasi tip de soluie; - t8ierea unor fragmente suficient de mici; - facilitarea la maximum a penetririi fixatorului ~ se vor utiliza flacoane mari cu fundul plat si dop rodat; nu se va lésa singe sau mucus la suprafetei piesei; se evit8 ca acestea si se lipeasci de perefii recipientului in care se face fixarea, agitind din timp in timp flaconul; - utilizarea unui volum suficient de fixator; in afara unor cazuri particulare, volumul fixatorului trebuie si fie de aproximativ 40-50 ori mai mare dec&t a fragmentului fixat;- piesele se introduc in amestecul fixator ambalate in tifon gi purténd un numér de ordine pentru identificare; - durata fixérii variaz’ in functie de compozifia amestecului fixator, structura gi dimensiunea pieselor, temperatura — existnd o duratd optima pentru fixare pentru fiecare tip de fixator/tesut - un fixator utilizat odat& nu poate fi refolosit pentru fixarea altei piese. Factori care pot afecta fixarea © pEul trebuie mentinut in limite fiziologice, cu valori intre 4-9. Pentru conservarea structurii probelor, solutile fixatoare utilizate trebuie tamponate la un pH de 7,2-7,4. + osmolaritatea: solufiile de fixare hipertone determina ratatinarea celulard. Solutiile hipotone pot determina edem celular gi o slab& fixare. « dimensiunea probei — trebuie si sib o grosime de cca, 1-4 mm, ‘© volumul fixatorului — si fie de cel putin 15-20 ori mai mare decdt cel al tesutului ‘© temperatura — cresterea temperaturii creste viteza de fixare. Sunt necesare precaufii pentru a evita coagularea proteinelor prin fierbere. De obicei, fixarea se face la temperatura laboratorului. © durata fixiri: ca si regula generala, fixarea se realizeaz cu viteza de Imm pe ori. Timpul necesar fixirii variaz dar nu poate fi nelimitat, Pentru formaling 10%, in functie de volumul tisular, avem urmitoarele limite: = 12-24h (piese mici cu dimensiuni de 10X10X3mm) cu o conservare bun a constituientilor citoplasmatici si a detaliilor nucleare, Fixarea este completa la 24h dar reactiile de cuplare incrucigati a proteinelor continu’ pentru cel putin 2 siptméni. - 2-6 siptiméni pentru piesele mari, de consistenfi moale (ex. creier uman integral) cénd capt 0 consistenfa suficient& pentru a fi sectionate in vederea prelevarii unor fragmente cu utilitate histologica. Fixarea este un proces chimic care necesiti un timp anume pentru a putea fi completa. Atét suprafixarea c&t si subfixarea pot fi responsabile de esecul realizarii probelor histologice. Tipuri de fixator Fixarea se realizeaza prin: A Agent fizici B.Agenfi chimici Prin definitie, agentii fixatori au capacitatea de a modifica organizarea fizico-chimic& a componentelor celulare din fesuturi, Fixatorii acfioneazi nu numai asupra unor componente celulare (proteine gi acizi nucleici) ci gi asupra macromoleculelor de la suprafafa celulelor sau din spafiile extracelulare. in mediul extracelular, fixatorii actioneazi asupra glicoproteinelor gi proteoglicanilor. Celulele vii prezinta plasmaleme impermeabile pentru macromolecule hidrofile Fixarea in agenti organici care dizolva sau distrug lipidele membranare permite moleculelor mari s& patrunda in celul& sau si iasi din aceasta. Citoplasma devine si ea permeabild pentru anumite macrocromolecule, forménd o refea proteic& suficient de poroas& pentru pitrunderea moleculelorde mari dimensiuni. Astfel de structuri includ amestecul de parafing cu cears, anticorpi utilizafi in imunomarcare sau coloranfi cu molecula mare, Gradul de porozitate obfinut depinde de fixatorul utilizat, Agentii fixatori coagulani, precum clorura de mereur, acidul picric, suflatul de zine determina aparitia de pori de dimensiuni mai mari decét agentii necoagulanti (formaldehida, plioxal sau glutaraldehida). Unii fixatori au proprietati mixte, coagulante si non-coagulante. De exemplu acidul acetic coaguleaz cromatina nucleara dar nu si proteinele. A.Fixarea prin ager Aici se incadreazi metodele ce folosesc cildura, desicarea la temperaturi sctizute (congelare-desicare sau criodesicare), desicarea la temperatura laboratorului, metodele ce presupun racirea preparatului urmati de actiunea unui fixator lichid (congelare-substitutie), nicirea nereprezentind un procedeu de fixare, ea avnd ca efect oprirea proceselor de autoliz’; aceasti oprire 2 modificirilor postmortem inceteaz ins odat% cu revenirea la temperatura laboratorului, cea ce face imperios necesari completarea cu o fixare in adevératul sens al cuvantului. ‘Fixarea prin desicare la tempers Desicarea rapida la temperatura laboratorului este folositA pentru pregitirea frotiului de singe destinat colorérii cu metodele hematologiei morfologice. Ea poate fi aplicat si pentru frotiuri de mAduva osoasi si amprente de organe. fn afara acestor situafii particulare, indicatiile sale sunt destul de limitate, nefiind vorba de o veritabild fixare. Denaturarea proteinelor obfinut astfel nu merge pani la pierderea solubilit&qii lor in ap’, astfel c& desicarea trebuie totdeauna completati in momentul colorarii fotiurilor prin actiunea unui alt fixator (ex. alcool metilic ce se foloseste ca solvent pentru eozinatul de albastru de metilen din compozifia colorantului May- Grumwald) Fixarea prin desicare la temperatura scizuti ‘Congelarea-desicarea sau criodesicarea nu este 0 fixare in sensul propriu al termenului pentru ci ea nu determind denaturarea proteinelor tisulare. Principiul ei este foarte simplu, bazfindu-se pe eliminarea prin sublimare a apei confinute tn piese, ricire la o temperaturé inferioara de 0° si plasarea intr-o incinta unde presiunea este inferioara valorii de 4,6mmHg. Din punct de vedere tehnic aceast metoda are 3 etape: - congelarea piesei care are drept scop principal oprirea rapida a tuturor reacfiilor vitale, ceea ce se poate obfine prin folosirea unei temperaturi de -50°-70°; la aceasta temperatura se obfine oprirea real’ a tuturor reactiilor enzimatice ce s-er putea derula in interiorul fesuturilor. Este etapa crucial a acestei metode; eventuale defectiuni pot duce la artefacte grosiere ce ar face piesa recoltat& inutilizabila. ~ desicarea sub vid — sublimarea apei ce are drept scop eliminarea apei, prezent& in mare parte sub forma de cristale de gheati continue in interstifille tesuturilor.tratamentul ulterior al piesei - 0 datd deshidratat, fesutul nu prezinté la examenul microscopic nicio retractie comparativ cu starea proaspata, proteinele tisulare nefiind denaturate. ‘Urmeazii apoi impregnarea si includerea la parafina, Indicatii si contraindicayii: In cazul utilizarii acestei tehnici, este nevoie de utilizarea nor fragmente foarte mici de fesut. Exista riscul compromiterii structurilor datorita formarii in momentul congelarii a unor cristale de gheafi de talie superioard puterii de separare a microscopului fotonic. De asemeni, anumite fesuturi (ficat, pancreas, tegument) sunt bine conservate prin aceasti metoda, in timp ce altele (rinichi, intestin) se conserva satisficdtor, in timp ce in cazul testicolului, fesutului nervos, m&duvei osoase si ganglionilor limfatici conservarea este necorespunzitoare. Desi din punct de vedere morfologic rezultatele criodesicarii pot rivaliza uneori cu cele obfinute folosind fixarea prin agenti chimici,costurile sunt ins& mult mai mari, Aceasti metoda trebuie rezervati numai unor cazuri bine definite, in afara clrora ea nu prezinta nici o superioritate raportat la alte procedee mai rapide, mai putin minutioase si avand costuri mai mici Fixarea prin con| itutie Principiul acestei metode este apropiat de cel al criodesicirii si avantajele sunt aseminatoare, Primul timp al aceste metode este similar criodesic&rii: piesele foarte mici sunt congelate cu aceleagi precautii dar deshidratarea se face transferdnd fragmentele in etanol, eter sau glicol racit la o temperatura cuprinsd intre -20° si -50°. Din punct de vedere practic, aceasté metoda este mult mai simpla in raport cu criodesicarea, Fara a oferi garanfiile teoretice ale criodesicarii, metoda congelarii-substitutie permite obfinerea unor preparate bune din punct de vedere morfologic. Fixarea prin agenti chimici Clasificarea fecatorilor chimici in functie de mecanismul de acfiune: 1. Fixatori coagulanfi (alcooli, acid clothidric, acid cromic) utilizati mai ales pentru preparatele care vor fi examinate in microscopia foronica, deoarece precipita (coaguleazA) si denatureazi proteinele care nu sunt in mod natural vizibile in microscopia fotonicé. Nu sunt utilizabili pentru microscopia electronic&. Exemple: alcooli, inclusiv aloo! metilic si etilic, care vor denatura proteinele si nu sunt utilizati de rutin pentru fixarea tisulard deoarece determina friabilizarea acestora. Sunt ins buni fixator pentru frotiuri, deoarece au o actiune rapida si determin& o evidenfiere bund a detaliilor nucleare, 2. Fixatori non-coagulanti - formeazi punti intra gi intermoleculare determindind o tranzitie de faz a citoplesmei de la starea lichida la starea de gel transparent si pentru electroni. Aceste tipuri de fixatori includ formaldehida, formalina si glutaraldehida. Cel mai utilizat fixator este eprezentat de o solutie apoasi 4% de formaldehidé, numiti adesea gi formalina 10%, De obicei aceastd solutie este neutralizata cu séruri anorganice. Glutaraldehida induce deformarea structurii -helicale a proteinelor si este foarte utila pentru preparatele de microscopic electronica. Penetrarea fesutului este destul de slaba, de aceeapiesele trebuie si fie de mici dimensiuni, dar determin o bund fixare citoplasmatici permijand evidengierea unor detalii nucleare de calitate, Solufia standard n acest caz este cea de slutaraldehida tamponaté 2%. ‘Agenfii oxindanji includ permanganafii (parmanganat de potasiu), dicromatii si tetraoxidul de osmiu, Realizeaz legarea incrucigati a proteinelor dar gi o denaturare extensiva a acestora. Unii dintre acesti fixatori sunt supraspecifici pe anumite aplicafii (ex. tetraoxidul de osmiu — in microscopia electronica; este cel mai bun fixator chimic simplu, find insa foarte toxic). 13.SPALAREA -De obicei se realizeaz in ap’ curent& -Nu se aplic& pentru fesuturi fixate care rimén deshidratate gi nici pentru frotiuri 1.4.INCLUDEREA iN PARAFINA ‘Scopul acestei etape este de a indeparta apa din fesutul fixat si splat gi de a o inlocui cu un mediu care se solidifica la temperatura camerei si care permite realizarea unor seotiuni fine, cu ‘grosimea de 3-ISum. Cel mai folosit mediu pentru procesarea tisulara este parafina, un amestec de hidrocarburi alifatice, nemiscibil cu apa dar solubil in solventi organici. Tesuturile biologice trebuie incluse intro matrice dura care permite realizarea unor sectiuni destul de fine: ~3-5yum grosime pentru microscopia fotonica ~80-100nm grosime pentru microscopia electronica Pentru microscopia fotonic&, mediul uzual este parafina imbun’tatita cu ceari de albine. Deoarece parafina este nemiscibila cu apa, aceasta din urma trebuie extrasé in cadrul unui proces de deshidratare, Probele sunt transferate ulterior prin bai succesive de solvent organic (de exemplu xilol) in scopul indep&rtérii alcoolului si apoi prin bai succesive de parafind topiti (agentul uzual de includere), care va inlocui xilenul in structura intima a fesutului Includerea in parafin’ cuprinde 4 etape: deshidratarea, indepdrtarea alcoolului, clarificarea, impregnarea $i includerea, Deshidratarea: se face utilizand b%i succesive de alcool, in concentratii crescitoare- 50%,70%,90% si 3 bai in alcool absolut, toate a céte 15 minute. Indepértarea alcoolului — se face prin 3 bai de acetond, a cate 5 minute fiecare, Clarificarea — 3 bai de xilol, a céte 15 minute fiecare, Impregnarea si includerea ~ se utilizeaz& 3 b&i de parafind topit’, a céte 15 minute fiecare. Ulterior pentru includere, fragmentele de fesut sunt amplasate in forme in care se toama gi parafina topiti, care apoi se solidific& la temperatura camerei. La parafina topita se adauga ccaré de albine care creste densitatea amestecului de includere. Dacd se lucreaz pe un sistem de distributie a parafinei, aceasta poseda o placa de ricire pe care parafina din forma se poate intéri mult mai repede, Odati incluse, fragmentele de fesut pot fi conservate in blocuri de parafina pe termen nedefinit.Parafina este mediul de includere cel mai frecvent utilizat dar, exist& si alte medii si tehnici de includere: paraplast, celoidin’, dubl& includere in celoidina si parafina,dietilen sau polietilenglicol sau gelatin 15. SECTIONAREA LA MICROTOM Microtomul este un instrument de sectionare care este utilizat pentru realizarea sectiunilor fine din blocurile de fesut incluse in parafina. inainte section&rii propriu-zise, blocul de parafin’ ce confine preparatul, se va modela in forma de trunchi de piramid& patru unghiularé astfel incat {in junul piesei s& rman o banda de parafind de 1-2mm grosime. Astfel finisat el se fixeazi, indiferent de mediul de includere folosit, cu baza mare pe un port-obiect care se monteazi la microtom, 1.6. ETALAREA SI LIPIREA SECTIUNILOR PE LAMA {in vederea prelucrisii lor ulterioare (colorare), sectiunile trebuie aplicate pe un port-obiect (lama de sticl8) bine degresat. Pentru sectiunile la parafina, panglicile de parafind obtinute prin sectionarea la microtom sunt plisate si trebuie etalate pe un mediu lichid, slab incalzit, pentru ca pliurile s& dispara. Pentru aceasta se pot utiliza 2 procedee: efalarea la bain-marie si etalarea pe lamé (cel mai utilizat). Astfel,lama de sticla este acoperita cu o picaturi de solutie apoasé de gelatin’ sau albumina Mayer, din panglica de parafina se taie fragmente ce contin 3-4 sectiuni si se aplic& (cu fata lucioasa in jos) pe suprafata uns cu albumina Mayer a lamei; se picurd ap distilat la una din extremitatile panglicii de parafina pentru ca sectiumile si pluteasca si se ageaz’ orizontal pe 0 plac incilzité 1a o temperatura inferioard celei punctului de topire al parafinei folosite la includere. Dupa intinderea complet a sectiunilor, apa in exces se indep&rteazi iar lamele puse {nclinat intr-un stativ, se introduc fn termostat la 37° timp de 24h. ILPRELUCRAREA PROBELOR PENTRU EXAMINAREA iN MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISIE IL1.PRELEVAREA PROBELOR Pentru a preveni schimbirile de orice naturé care pot apare la nivel tisular sau celular chiar din momentul prelevarii, recoltarea trebuie s& se faca rapid. Deoarece piesele trebuie si fie de mici dimensiuni 0,5x0,5x0,5 mm, tBierea acestora din proba recoltatl se realizeaz& sub lup binoculara. Fragmentele sunt preluate cu o pensi si introduse in fixator racitla 4°C. Altemativ, fragmentele de material biologic obfinute prin punctii sau biopsii, sau fragmentele mici din jesuturile si organele recoltate imediat dupa sacrificarea animalului de experienf’ sunt puse pe fata fir&i emulsie de azotat de argint a unei hartii fotografice. Peste aceste fragmente se pun 2-3 picdturi din lichidul fixator (4°C) pentru a opri pe cat posibil actiunea distructiva a enzimelor celulare.Cu ajutorul a dou& lame de res noi, bine degresate, prin migcéri de translatie se confectioneaza din proba prelevatd cubuleje cu latura demaxim 1mm care se introduc intr-un flacon cu fixator ricit la-+4°C.‘siamese IL.2.FIXAREA Metode fizice - au la baz folosirea temperaturilor foarte scdzute, deshidratarea inert& gi metoda de substitutie prin congelare. Metode chimice: 0 solutie fixatoare in cazul prelucrarii probelor pentru examinarea in microscopia electronica de transmisie este formatl din: a) solutia tampon si b) agentul fixator a), Solutia tampon se alege in functie de compatibilitatea cu agentii fixatori gi poate fi: -1ampon cacodilat (compatibil cu toyi agent fixatori) tampon fosfat (compatibil cu tofi agentii fixatori, incompatibil cu ionii de caleiu si uranil) tampon veronal (este incompatibil cu aldehidele fixatoare) b). Agentiifixatori pot fi: -anorganici :oxizi - OsO4, séruri-permanganat de potasiu sibicromatul de potasiu ~organici :aldehidele-formaldehidele, glutaraldehida, acroleina, acizi-acidul tanic si unele catechine tn practica curenta se foloseste o dubli fixare: - prefixare cuglutaraldehida tamponat’; -postfixare cu tetraoxid de osmiu tamponat- fixatorul Milloning Tehnica delucru Fragmentele prelevate gi fasonate sunt introduse intr-un flacon cu glutaraldehida tamponata Ia+4°C timp de 1 ora la frigider. doUlterior se efectueaza o triplé spilare a probelor-fiecare a cate 1 ord-cu tampon fosfat Ja temperatura de 4°C urmata de post-fixarea cu fixatorul Milloning timp de 1 ord la +4°C. IL3.SPALAREA PIESELOR Dupa fixare, urmeazé obligatoriu spilarea pieselor. Piesele se spala timp de 5-20 min sau chiar peste noapte cu aceeasi solutie tampon care a intratin compozitia fixatorului. 1L4.DESHIDRATAREA PREPARATELOR Prin deshidratarea preparatelor se urmareste eliminarea apei din fesuturile fixate farii a produce modificari in structura moleculara nativa a celulelor din fesuturi. Alegerea solventului pentru deshidratare este in functie de materialul de includere, fiind nevesar caacesta si fie miscibil cu agentul de deshidratare. in cazul folosirii vestopalului ca material de includere se foloseste acetona iar in cazul eponului, alcoolul etilic gi propilenoxidul. ILS.INCLUDEREA Cele mai utilizate medii de includere fac parte din grupa risinilor poliesterice (vestopal) a risinilor epoxidice (epon 812, epon 562, araldita) si mediile de includere hidrofile (durcopanul, hidroxipropilmetacrilatul) care prezint& avantajul c& evita deshidratarea !/si conserva lichidele si enzimele din celula. Includerea se face in capsule de gelatind sau polietilen’. yn 812: ‘In compozitia mediului de includere intra urmitoarele substante: ‘Amestecul A+ Amestecul B+ Accelerator DMP - 2 Epon 812 + DDSA _Epon812+MNA 5 ml 5 ml 0,15 ml unde DSA = anhidrida dodecil-succinica; MNA = anhidrida metilanadicé Piesele din materialul biologic se introduc in capsule de gelatina, in eponul de lucru, ‘in nig, la temperatura laboratorului. Adaugarea eponului de lucru, pentru includere, in capsulele de gelatina on11.6.SECTIONAREA Preparatele biologice fixate $i incluse in diferite medii de includere sunt supuse unor operatii de sectionare cu ajutorul unor aparate numite uliramicrotoame, pentru a realiza sectiuni ultrafine, a c&ror grosime nu depaseste 1000 A si care vor fi usor traversate de fasciculul de electroni. Fasonarea blocurilor Tnainte de a le supune procesului de sectionare, blocurile cu preparate biologice trebuie fasonate. Prin acesta operafie o anumitd zoni din preparat capita aspect de piramida. Daci la includere s-au folosit capsule de polietilend, atunci blocul apare gata fasonat in aceasta forma. Operatia de fasonare a blocurilor se face manual dupa indepartarea capsulei de gelatin, sub o lupa binoculara, cu ajutorul unei lame de ras noi, dup& fixarea blocului intr-un portbloc. tySe confectioneaz un trunchi de piramida, al cdrui varf trunchiat ce confine piesa, trebuie sa aiba forma unui patrat cu latura de 0,1-0,2 mm. Poel pein) irionarea, iu-zisd si« rea sectiunil Seotionarea se face cu ajutorul unui ultramicrotom Vizual, grosimea sectiunilor se poate aprecia prin reflexia in baifé pe suprafata apei, culoarea sectiunilor in lumina reflectaté fiind in funcyie de grosimea acestora. Mai intai se pot realiza cu ajutorul ultramicrotomului sectiuni semifine prin folosirea avansului manual (cu o grosime de 1500-3200 A) cu scopul de a verifica dac& blocul respectiv confine elementele pe care ni le-am propus si le examin&m.Acestea sunt etalate pe lame de sticla gi apoi colorate in vederea examintirii la microscopul fotonic. Pentru colorarea sectiunilor semifine existi mai multe metode printre care se num&ri colorarea cu albastru de toluidina. Aceasta se face aplicénd pe lam& 2-3 picaturi din solutia de albastru de toluidin’,introducerea lamelor in termostat la 60 grade C timp de 1610-30 min. urmati de spalare cu api si ulterior cu acetond 100%, trecerea rapida prin xilol, sugativare, montarea lamelei si examinare Dupa verificarea efectuati prin examinarea sectiunilor semifine colorate se continua secionarea in vederea obfinerii sectiunilor ultrafine ce vor fi depuse pe un portobiect care in microscopia electronic de tansmisic este o grild metalicd. IL.7.APLICAREA SECTIUNILOR ULTRAFINE PE GRILE in prezent exist o gamf variati de suporturi pentru preparate (grile si discuri), confectionate pe cale electrolitic’ din cupru, nichel, ofel inox, argint, aur, plating, molibden sau tungsten. Grilele clectrolitice sunt de mai multe feluri: a) standard; b) de identificare; c) duble. Pentru ca grilele s& devina un bun suport pentru preparat, se acoper’ cu pelicule organice sau anorganice fine, transparente la fasciculul de electroni a céror grosime nu trebuie sé depaseasc’ 200 A. Grilele cu preparatul in sus se plaseaza intr-o cutie Petri pe fundul creia se afl hrtie de filtru gi pe care se noteazi numarul preparatului din registrul de evident Contrastarea_preparatelor biologice Pentru mérirea contrastului biomoleculelor, al virusurilor, al diferitelor microorganisme $i al seojiunilor de tesuturi, se recurge in practica la o serie de metode de contrastare, cele mai utilizate fiind: colorarea pozitivd, colorarea negativat si umbrirea Sau metalizarea. Microscopia crioelectronicii (Cryo-EM) in anii 1960, oamenii de stiint& s-au confruntat cu problema metodelor de determinare a structurii folosind microscopia electronic& care déuneazi probei din cauza fasciculelor de electroni cu energie mare, astfél incat microscopia electronic criogenicd a fost considerata si depageasci aceastd problema, deoarece era de asteptat ca temperaturile sc&zute s& reduc deteriorarea fesciculului Sectiunile subfiri montate pe film de carbon s-au dovedit a fi de la 30 la 300 de ori mai rezistente la fasciculul de electroni la 4K decat la temperatura camerei Egantionul trebuie congelat extrem de rapid, obfinandu-se fixarea intr-o stare vitroasi (starea vitoas& a apei inghetate nu prezinti structura cristalina), Daca inghefarea se produce prea incet sau la temperaturi de peste -137 ° C, temperatura la care apa se devitrifiazd, se formeazi gheaff cristalina. De asemeni, inc&lzirea egantionului mai mult de ~ - 160°C. va produce o gheati de o calitate scizuta cu risc mare de a se forma cristale de gheaté care ar compromite integritatea structurala si degradeaz’, de asemenea, calitatea imaginii . in acest az electronii suferind fenomenul de difractie. Sectionarea poate fi efectuati in conditii criogenice, ceea ce ofera cea mai bund conservare a probei. Aceasti tehnici, cunoscuté sub denumirea de microscopie crio- electronica a sectiunilor vitroase , foloseste un crio-ultramicrotom cu un cufit de diamant pentru a produce sectiuni de 40-100 nm grosime. Cryo- EM pemnite studierea directi a probelor rapid conservate la temperaturi criogenice ( temperaturi corespunzitoare azotului lichid, mai mici de -160°C), fairs a fi fixate sau colorate anterior. IteTILSECTIONAREA LA GHEATA Tehnica sectionarii pieselor biologice congelate permite analiza microscopic& rapid& a unui preparat. Recoltarea, fixarea, seofionarea, etalarea, colorarea, montarea gi etichetarea se desfasoara intr-un timp foarte scurt (cca. 10 minute) fapi de tehnica sectiunilor fine la parafing (Cea. 16h). La aceasti metoda, etapele de fixare si includere se realizeaz& in acelasi timp, practic se suprapun, Utilitate medical practicd si in cercetare: - efectuarea unui examen anatomopatologic rapid * pentru examinarea in timpul operator a unei tumori cu presupuse metastaze; proba suspecta de a fi o metastazi este prelucrata prin congelare si sectionare la criotom, iar rezaltatul decide continuarea procedurii operatorii in sens radical sau conservator; ©. totin timp operator, pentru a verifica marginile negative ale rezectiei unei tumori; - evidentierea unor componente tisulare care se pierd la prelucrarea prin tehnici histologice uzuale (in care, de exemplu, folosirea formolului ca fixator dizolva lipidele); se pot detecta lipidele, enzimele, mucopolizaharidele; ~ efectuarea unor preparate care s& permit detectia unor antigene, prin tehnici complementare de imunofluorescen{i sau imunohistochimie; aceste antigene pot fi mascate de fixarea cu formaldehida, motiv pentru care se poate opta pentru secfionarea la criotom ‘Materiale si echipamente necesare - fesut proaspit recoltat; metodele de recoltare sunt similare celor utilizate pentru fesuturile incluse in parafin’, - criotom — un microtom pentra sectiuni congelate, amplasat intr-o incint& fiigorificd; grosimea seofiunilor este de 5-60um; ~ gel crioprotector OCT — un amestec de glicerol si ragini care impiedic& formarea cristalelor de gheatii in interiorul fesutului (fapt care ar putea afecta structura tisulars), 1, Recoltarea — se poate realiza prin metodele cunoscute; 2, Fixarea gi includerea — fixarea se realizeazA prin congelarea probei (implicit - metod& fizicd). Congelarea probei se realizeazé intr-un container special. Piesa este acoperit’ cu solufie crioprotectoare si sigilati cu 0 membran& PET. Congelarea se poate realiza si in sistemul de ricire al criotomului, pe o placé riciti la -58°C. Pentru congelearea probelor, piesa de tesut se amplaseaza pe suportul racit in incinta criotomului, pe placa de ricire, la ~ 58° C. Initial se adauga o picttur’ de crioprotector. Peste piesa se cobara aplicatorul récit si el la -58° C. Piesa este congelata simultan din partea superioara gi inferioard. Se las la récit (congelare = fixare + includere) céteva minute, Reducerea artefactelor rezultate din congelare se realizeaz’ prin urmatoarele artificii tehnice. ‘Racirea agentului crioprotector Congelarea si formarea cristalelor de gheafi incepe imediat dup& ce fesutul atinge placa de racire. Tesuturile care conjin mult apa sau care sunt edematiate pot forma cristale de gheatd care si le afecteze structura. Acest fenomen poate fi redus prin racirea gelului OCT la frigider. Gelul crioprotector este folosit de obicei pentru biopsiile cerebrale, tiroidiene, pulmonare sau renale. Viteza de congelare este crescuti prin aceasti metoda RPre-raécirea fesutului Tesuturile racite rapid prezint& mai putine artefacte. Tesuturile primite din clinica au ‘temperatura cuprins& intre temperatura corpului si temperatura camerei. Prericirea fesutului inainte de congelare (1a 0°C) este util& in accelarea etapei de fixare+includere 3. Sectionarea Containeral special de congelare este amplasat pe sistemul portobiect al criotomului. Biocul congelat cu fesutul trebuie si fie paralel cu lama cutitului; acum se poate incepe sectionarea, Acelasi fenomen poate fi evitat cu ajutoral unui panou de sticla an atagat si amplasat deasupra cutitului 4. Etalarea — sectiunile sunt preluate cu un penson gi amplasate pe lama. \curbare, Colorarea unui preparat microscopic in vederea examinarii in microscopia fotonic’:_1 colorantii2.colorarea_cu_hematoxilin3-cozin&_a_probelor incluse in_parafing (tehnict, rezultate, utilitate medicali practica) 3. colorarea probelor obtinute prin sectionarea Ja. gheatd — tehnicd, avantaje, rezultate Capitolul cuprinde pentru inceput si cAteva notiuni fundamentale privind coloranfii si mecanismele generale ale colorrii, precum si importanfa acestora pentru evidentierea unor structuri celulare. 1.Colorantii 1.1.Generalitéti Colorarea structurilor celulare si tisulare este un fenomen complex, in care intervin factori fizici si mecanisme chimice, Tofi colorantii, in sensul strict al termenului utilizat in tehnicd, sunt compusi organici, marea lor majoritate corespunzind seriei aromatice. Un colorant este un produs ce poate colora durabil o substan sau un ansamblu de substante Pentru aceasta au nevoie de: 1. _grupiri atomice specifice numite eromofore ce confer culoarea; 2. grupari ce permit o fixare permanenti pe substanfa de colorat numite grupari auxocrome; Se stie & fenomenul .,culoare” este legat de absorbtia selectiva de c&tre 0 substanti data a unor anumite lungimi de und& din spectrul vizibil astfel incét lumina reflectati de aceasta substan{a apare colorata; responsabile de aceasta absorbfie selectivé sunt grupatile cromofore. Compusii organici ce contin grupri cromofore sunt numiti gi ,cromogeni”, Gruparile auxocrome din punct de vedere chimic sunt, cel mai ades, funcfii simpe, fra duble legéturi, polare sau semi-polare. Grupirile hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil sunt principalii auxocromi. Clasificarea colorantilor Colorantii utilizati in citologie pot fi clasificafi dup mai multe criterii 1. Dupa origine: - naturali, de origine vegetali (hematoxilina, safranina) sau de origine animala (carminul) - sintetici (albastrul de metil) 2. Dupi natura auxocromilor ce determin’ $i comportamentul lor in solutie: - coloranti acizi sau anionici 19- colorant bazici sau carionici - coloranti neutri * Termenul de acid sau bazic nu se refer la caracterul acid sau bazic al solutiilor colorante; clasificarea se refera la auxocromi: colarantii confinénd auxocrom anionic sunt coloranti acizi ce coloreaz& componentele subcelulare incarcate pozitiv; cel mai utilizat coloreant acid este eozina ce coloreaz in roz citoplasma colorangii bazici conjin auxocromi cationici si coloreazi componentele sucelulare incdrcate negativ, cei mai utilizafi fiind tionina, violet de metil, hemalaunul. colorantii neutri sunt purtitorii de grupiri cationice si anionice; se obtin din solutii apoase de coloranti bazici si coloranti acizi amestecate in anumite proportii (ex. eozinatul de albastra de metilen si eozinatul de azur de metilen) 1.2.Principalele metode de colorare E. Acestea sunt clasificate in functie de urmatoarele crite Numérul colorangilor utiliza - simple, cand se foloseste un singur colorant, fie nuclear (hematoxilina) fie citoplasmatic (eozina) - combinate, cand sectiunile se coloreaz succesiv cu 2 sau mai multi coloranti (dubla ~ hematoxilin’-cozina, triplé - hematoxiliné-eozina-albastru de metilen), folosite pentru colorarea diferentiala a diverse elemente ale unui jesut si de a facilita astfel analizarea structuri lui Utilizare unor adjuvanyi: ~ direct: colorantul se fixeazi prin simplul contact cu secfiunea (colorarea cu hematoxilini-eozina) ~ indirect sau prin mordansare — necesita prezenfa unui mediator sau mordant Glaunurile, iodul, strurile de fier, etc.) care fixeazi colorantul de componentele celulare; combinatia dintre colorant $i mordant se numeste lac. Intensitatea coloréiri ~ progresivii — se fac incercari succesive sub control microscopic pana se ajunge la tenta de culoare optima a structurii celulare dupa care se opreste colorarea prin spilare (ex. hemalaunul coloreazi nuclei tuturor tipurilor de celule in albastnu in 4-6 minute; dac& lstim sectiunile mai mult timp in contact cu colorantul, se coloreazi si alte structuri celulare); ~ regresivi ~ se face 0 supracolorare care prinde gi alte structuri celulare decat cele dorite, dupa care excesul de colorant, este indep&rtat prin substanfe decolorante sau diferentiatorii (de ex. dup& ce am colorat sectiunea in negru intens cu hematoxilind fericd Heindenhain, introducem lama intr-o solufie de alaun de fier amoniacal pand in momentul in care a rimas colorati numai cromatina nuclear, celelalte elemente celulare-mitocontriile, centrul celular etc. se decoloreaza), Starea materiahutui ~ coloratia vitalii se face pe celule in stare vie prin utilizarea unor colorangi vitali si care persist’ numai atéta timp ct supravietuieste celula; se utilizeazA pentru evidentierea unor organite cclulare (mitocondrii — verde Janus B sau complex Golgi — osu neutru) si a unor activitati fiziologice celulare. 40- coloratia permanentii — se face prin colorarea unor preparate permanente. 2. Colorarea preparatelor obtinute prin secfionarea probelor incluse in parafink Pre-colorarea © Deparafinarea: se indeparteaz& parafina din sectiuni prin 3 bai de succesive de xilol, a cAte 10 minute fiecare. © | Hidratarea: se folosese 3 bai de alcool absolut a cate 5 minute fiecare, urmate de 3 bai de alcool in concentrajii descrescatoare, de la 95%,70% si 50%, a cate 5 minute fiecare © Spalarea: se spala rapid (scufundari succesive a cate 10 secunde) in apa distilata Colorarea propriu-zisi Colorarea se face cu solufie de hematoxilind timp de 10 minute, se spalé in ap& curentt timp de 5 minute, se diferenfiazi in solutie acid-alcool 1% timp de 30 de secunde, se spal {in apa curenta timp de 1 minut si se contracolorareaz cu solufie de eozin& timp de 2-5 minute. Post-colorarea © Deshidratarea in b&i succesive de solutie de alcool in concetratii cresc&toare © Clarificareain 3 b&i de xilol, 5 minute fiecare * Montarea ~ se monteazi lamela cu o picétur’ de mediu specific (Balsam de Canada) solubil in xilol * Etichetarea se poate face ou etichete preformate, imprimate sau coduri de bare. Rezultatele colorarii cu H&E ~ colagenul ~ roz palid - muschi ~roz.intens - citoplasma acidofil& ~ rogu - citoplasma bazofilica ~ violet nuclei — albastru - eritrocite — rogu deschis, 3.Colorarea preparatelor obfinute prin secfionarea la gheati Colorarea sectiunilor din blocuri de fesut congelat se poate face fie pe sectiuni libere fie pe sectiuni lipite pe lame portobiect. Pentru sectiuni libere, batria de colorare este format din cutii Petri cu diametru mic prin care sectiunile se trec cu ajutorul unor baghete de sticla in forma de ,L”. Dupi colorare, aceste sectiuni se pescuiesc pe lame portobiect si se monteaz& in medii apoase (glicerin’, gelatin’), Pentru sectiunile ctalate pe lama, colorarea se realizeaz& cu diferiti coloranti si prin metode variate; coloratiile utilizate sunt cele folosite de obicei pentra sectiuni fine (albastru de toluidina sau hematoxiliné-eozind — colorafii de rutin’) sau sunt adaptate rezultatelor scontante (ex. imunofluorescentil)Tehnica de colorare si montare a secfiunilor lipite pe lama (cu solutie 1% de albastru de toluidinds) Sectiunile lipite pe lama, dupa sectionarea la criotom, sunt hidratate dar confin inc& impuritifi si grésimi. in consecinta este necesara o clarificare cu xilol (solvent organic). Xilolul nu este miscibil cu apa, agadar, inainte de clarificare este necesara deshidratarea iar dupa clarificare, este necesara hidratarea acestora, avand in vedere faptul cf solufia de colorare este apoast. Pre-colorarea: © Deshidratare: se toam’ alcool 90% ulterior alcool absolut in picéturi peste sectiuni, pe lama agezati pe marginile unei cutii Petri. Se las’ cdteva secunde fiecare, apoi se scurge in vasul Petri. © Clarificare: se toam& Xilol in picéturi peste sectiuni, pe lama asezati pe marginile unei cutii Petri. Se lasa cateva secunde, apoi se scurge in vasul Petri © Hidratare: se toarna alcool absolut ulterior alcool 90% in picaturi peste sectiuni, pe lama asezati pe marginile unei cutii Petri. Se asi céteva secunde fiecare, apoi se scurge in vasul Petri, Colorarea propriv-zisi ~ se toama solutie de albastru de toluidiné 1% in picdturi peste seciuni, pe lama agezat pe marginile unei cutii Petri. Se las 30-60 secunde, apoi se scurge in vasul Petr Post-colorarea Aceasti etapa se face in funcfie de mediul de montare: pent: un mediu de montare apos, se adauga direct 1-2 picdturi din mediul de montare si se acopera cu o lamelise ¢liminé bulele de aer prin presarea usoar a lamelei. Ulterior se poate examina la microscop. Pentru un mediu de montare anhidru (Balsam de Canada) etapele sunt: © Deshidratare cu alcool 90% urmat de alcool absolut, in picturi peste sectiuni, pe lama agezati pe marginile unei cutii Petri. Se lasé cAteva secunde fiecare, apoi se indepirteazé © Clarificare cu xilol in picituri peste seotiuni, pe lama agezata pe marginile unei cutii Petri. Se lasi cdteva secunde, apoi se indepirteazi © Montarea cu Balsam de Canada: se adaugi direct o pickturi din mediul de montare gi se acopera cu o lamela; se eliminé bulele de aer prin presarea usoara a lamelei Rezultatele coloririi cu albastru de toluidin3: nuclei apar albastru inchis iar citoplasma albastra deschis.