UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS: INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS ~ICEx DEPARTAMENTO DE QUIMICA ‘Avaliagbo da eficéncla de colunas de imunoafinidade reutlizadas para determinasio de aflatoxinas B,,B,,G, @G, baseada na avallagdo da homogeneldade de amostras de ‘amendoim utiizadas na produgao de material de reeréncla Monografia. apresentada como ord Tequsito para a obtencto do tuo de: Bacharel em uimica pelo Departamento de Quimica "da Gerais Orientador: Prof. Ox. Wetington Farera de Magalies: ‘Aluno: Gabriel Earros de Oliveira Belo Horiznte, Novembro de 2041Agradecimentos Prmetramente,& Dew, par todo 0 poste impossvl que eu venho conguistado em toda mina vida os mess pat pelo apoio ncosiconal,paciinci afte em todo minha va vows Terezinha, pela cara epoiéetaem todos ese aos ‘4s mins rms ead, igs «Camila, por crear sempre em fro promlsr na ina vide 4 amiga e companhera de raatho Kata, pela imensa boa vont ¢ pela enorme conribug de &mitha Jorma;20 A amiga ecompanteira de ratatho Giovana, pela sabedoria, bom humor ereceptldade deseo prieira do amigo ecompanhsiro Mon, or axailar com muta pronto eefcinca tod o meu trabalho no laboratdrio Ao .amigo de toda at horas Marco Tilo pela genialidade,sabedorlaeamiade a lrgo dees anos ‘Ao amigo ingustonével Mateus Fernandes, pela pacincla, pelo conhecimento pela decompo ‘proprcionada até nds tempos mats difies 40 aig sm Igual Fernand Jardim. pela opornaidade de aprendzagem ¢presenga om tod moment 40 grande e melhor amigo Srano Saldana, por toda ua vida de companhsriomo, saber lerermina20 © pacléncia como wm verdadero do desde sempre ‘40 LACQSA, pela mensa cportunidade de aprendzagem e formes profisiona que leva porta mide vide ‘Ao Prof, Wellington, pla promi imedlaae pela imensa hagagem de conhecinentotranmitida os amigos da Universidade por toda uma histria dela, ros, congsstareriada‘SUMARIO 8.4 OnsenWo GERAL 8 3.2 Onve1W09 esrecinco8.. : - 8 4 MATERIAL, 4.1 MATERIAL DE REFERENDA 8 4.2 Aranaros. 8 43 Eourawentos i 10 44 REAGENTES E SOLUGOES. = 1 44.1 Proparo de solugdos reagentes, 12 5 MéroDos. '§ PROCEDIMENTOS PARA PREPARO DE AMOSTRAS E DETERMINAGAO DE AFBG ...14 6.1 PREPARO OE AMOSTRAS. 6 82 BxrRagao, 2 15 (6.3 PURIFICAGAO ELUIGKO UTLIZANDO COLUNA DEINUNOAFINIADE COM O PURIFICADOR vTowArICO DE AMOSTRAS (ASPEC) 18 {8A DeTECGAO E QUANTIFICAGKO POR CROMATOGRAFIALIQUIDA DE ALTA EFICIENCI 16 6.4.1 Céeulos 18 7 TRATAMENTO DE DADOS sere : set 7.4 TESTE DE CocHRAN PARA RESULTADOS DUPLICADOS 20 7.2 TESTEPARAA MOHOMOGENEDADE SIGNFICATWA a ‘8 RESULTADOS E DISCUSSAO... 2 9 concLusAo. 410. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 'ANEXO | TABELAS DE CALCULOS ESTATISTICOS PARA A AVALIAGAO DA. HOMOGENEIDADE DAS AMOSTRAS ANALISADAS VIA COLUNAS DE IMUNOAFINIDADE [NOVAS E REUTILIZADAG......LISTA DE FIGURAS FloUA 1 ~ ESTRUTURA DUMICA DAS AFLATOXNAS B, Bs, Gy E Gy ees. FFiouRA 2- PRINCIPIO DAS COLUNAS DE MUNOAFINDADE. oe FFGURA 3 CROMATOGRAMA DA SOLUGAO PADRAO DE AFLATOXINAS Gr, Gy, 8s € By COM O8 TEMPOS DE RETENGHO DE 10,60, 12,8MIN, 14,1 MINE 17,2 MIN, RESPECTVAMENTE naesnsnnint FIGURA 4~CURVADE CALIBRAGRO PARA AFLATORINAB ons as FIGURAS ~ CURVADE CALIBRAGAO PARAAFLATORINAB 2% FIOURA 6 CURVADE GALIBRAGKO PARA APLATOXINA Gn vB FFIGURA 7 ~ CURVA DE GALIBRAGKO PARA AFLATOXINA Go 2 FicUea 8 RESULTADOS O8710S UMLZAKDO COLLNAS DE IMUNOAPNOADE NOVAS E REUTIIZADAS PARA AFLATOXINA By EM AMENDOME ress : 30 Flauta 9 RESULTADOS 0871005 UTILZANOO COLUNAS DE IMUNOMFINDOADE NOVAS E REUTILZADAS. PARA AFLATORINAB, EM AVENOOIM CORRICIDOS PELA RECUPERAGAD 7 30 Flours 10—RESULTADCS 0871008 UTLLZANDO COLLNAS DE IMUNOAPINOADE NOVAS E REUTILIZADAS PARA AFLATOXINA BEM AMENDOM : at Flouea 11 = RESULTADOS O8T100S UTILZANDO COLUNAS DE IMLNOAFINADE NOVAS E REUTILZADKS PARA AFLATOXINAB, Et AMENOOIM CORRIGIDOS PELARECUPERAGAO sona Bt Flouta 12 ~ RESULTADOS 0871008 UTILZANDO COLUNAS DE MUNOAFINDADE NOVAS E REUTIZADAS PARA AELATOXINA Gy EM AMENDOIM | Flouea 13 = RESULTADOS 0871005 UTLLZANDO COLLNAS DE IMUNOAFINOADE NOVAS E REUTILZADAS PARA AFLATOXINA GEM AMENDOM CORRIGIDOS PELA RECUPERAGKO. 32 Fiouea 14 RESULTADOS 0811008 UTLIZANDO COLUNAS DE IMUNOAFINDADE NOVAS E REUTIIZADAS PARA AFLATOXINA GEM AMENOOM : : 88) Flour 15 RESULTADOS OB7100S UTIUZANOO COLLNAS DE MUNOAFINGADE NOVAS E REUTILIZADAS ‘PARA ATLATORINA GEM ANENDOMA CORRIGIOOS PELA HECUPEIAGD sn 8LISTA DE TABELAS. “TABELA 1 - ESTIMATIVAS DE GUSTO PARA O PROCESSO DE EXTRAGAO ELIMPEZA DE AFLATORNAS. Umiizanoo CouuNa DE MUNOAFIIDADE, (RAMOS, 2008), sense ‘TaBELA 2- CRITERIOS DE DESEMPENHO DOS METODOS ANALINCOS PARA DETERMNAGAD DE AFLATORNAS B, Bz, GEG on ce ‘TeBELA 3 -FAIKAS OE CONCENTRAGOES APROXMADAS PARA O PREPARO DA CURVA DE CALIBRAGAO DE ‘APABG~CLAE, oo : vol ‘TABELA4 - VALORES CRIICOS OE COCHRAN oo: a TABELA S- TABELA OE FATORES FARA TESTE PARA A NKO-HOMOGENEIOADE SIGNIFICATVA 2 ‘TABELA 6 ~ DADOS DE CONCENTRUGAO & AREA DOS PICOS CROMATOGRAFICOS PARA CONSTRUGAD DAS CURVAS DE CALIBRAGAO PARA AS AFLATORNAS ANALISADAS, soon ‘TABELA 7 ~ RESULTADOS OA AMAUSE DA AMOSTRA CONTROLE COM COLUNAS REUTIZADAS.nnn-28 “TABELA 8 - RESULTADOS OA ANAUISE 0A AMOSTRA CONTROLE COM COLUNAS NOVAS. 28 ‘TABELA 9 - RESULTADOS DA ANALISE DAS AMOSTRAS PARA PRODUGAO DE MATERIAL DE REFERENCIA LUTLIZANDO COLLNAS REUTILEADAS. ve 28 ‘TaBELA 10 RESULTADOS DA ANAUSE OAS AMOSTRAS PARA PRODUGAO DE MATERIAL DE REFERENCIA LURLUZANDO COLUNAS NOVAS nn ss 20 ‘TABELA 1A.-TESTE DE COCHRAN FARA RESULTADOS DUPLICADOS OAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOM FEMRELAGKOA AFLATOXINA By, sen? “TABELA2A.-TESTE PARA NAO-HONOGENEIDADE SIGNFICATIVA OAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOM EM RELAGAO AAFLATOXNA B, vn ‘TABELA 3A--TESTE DE COCHRAN PARA RESULTADOS OUPLICADOS DAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOM EMRELAGAO A AFLATOXINA, a) ‘TaBELA 4A - TESTE PARA NAO-HONOGENEIDADE S'GNIFICATIV DAS SUBAMOSTRAS DE AVENDOIM EM RELAGAO A AFLATOXINA Bp ann os 40 TABELA GA- TESTE DE COCHRAN PAA RESULTADOS DUPLICADOS DAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOW ERELAGAO AAFLATOXNAG, sen at ‘TABELA GA - TESTE PARA NAO-HOMDGENEIOADE SIGNFICATIVA DAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOM EM RELAGAO AAFLATOXINA G, ni : a ‘TaBELA TA- TESTE DE COCHRAN PARA RESULTADOS DUPLICADOS DAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOM EMRELAGAOA AFLATOXINA Gren cy ‘TABELA BA - TESTE PAPA NKO:HOMOGENEIDADE SIGNFICATIVA OAS SUBAMOSTRAS DE AVENOOM EM eLAGKOAAATORINA Gs : “ ‘TaseLA 1B- TESTE DE CocHRAW PARA RESULTADOS DUPLICADOS DAS SUBAMOSTRAS DE AMENDOIM EURELAGAO A AFLATOXINAB,‘TADELA 28 - TESTE PARA NAO-HOMOGENEIOADE SIGNFICATIVAOAS SUBAMOSTRAS DE AUENOOM EM RELAGAD AAFLATOXINAB, setae ‘TaBELA 38- TESTE DE COCHRAN PARA RESULTADOS DUPLIGADOS DAS SUBAMCSTRAS DE ANENDOM FEMRELAGRO A RFLATOXINA By os ae secs TABELA 48 ~ TESTE PAPA NKO-HOMOGENEIDADE SIGNFICATWA DAS SURAMOSTRAS DE AVENDOM EM RELAGAD A AFLATOXINA B; sn von ‘TABELA SB TESTE DE COCHRAN PARA RESULTADOS OUPLICADOS DAS SUBAMOSTAAS DE ANENDOM EMRELAGAOA AFLATOXINA Gh o : 49 "TABELA GB- TESTE PARA NAO-HOMOGENEIOADE SIGNFICATIVADAS SUBAMOSTFAS DE AVENOOM EM RELAGAD A AFLATOXINA Gy, i sn 50 ‘TaBELA 78- TESTE DE COCHRAN PARA RESULTADOS DUPLICADOS DAS SUBAMOSTRAS DE ANENDOME EMRELAGAOARFLATOXINA Gyo a ot "TABELA BB - TESTE PARA NAO-HOMOGENEIDADE SGNFICATIVAOAS SUBAMOSTRAS DE AVENOOM EM RELAGKO AAFLATOXINA Gs ns eel1 INTRODUGAO AA sgrcuitura do Brasil 6 uma das bases mals potentes da economia do pals, que garante 0 fomecimento continuo de Insuos baseados em cereals, oleagiosas, horaigas, frutas © ‘erivadiosorundos de processamonto. (HAYASHI 2007) ‘A contaminagdofingica © @ produrdo de metabelitos txicos consttuem fatores inevtavels © de Medi 28 mi. (27,7 mL) do acid e adcionar @ 72 de Sque deionized ‘Soup padrio de atatoxinas A solugto trabalho “peo” (TP) de AFLABs, AFLAB:, AFLAGs € AFLAG:(1:02:1:02; WW) deve ser preparada conforme procedimentes descritos no POP O13, revisio 06 - “Prepare @ padronizagdo de soluges padtao de micotoxinas’+ Solupto padroda cura de calbracdo 5 wéropos Seré utiizado © mitodo previamente validado pelo LACQSA segundo POP 055, revisio 9 — "Determinagéo de aatoxinas BB, Gy © Gs por cromatografialiquida de ata efleéncia © em camada delgada" para edragao, purflcagto, separagto, detecedo e quantifcacto de afatoxinas conde a purflcacto serérealizada no processador automatico de amostras - Aspec. O preparo das amosttas fol realatdo de acordo com o procedimento descte ne POP 009, rev 13 ~ "Prepare, larmazenamento descarte de amostas" e 0 tralamento dot dados para a votiieagio da homogeneldade e presenca de outers fol realizado segundo © Protocolo Infemacional Harmonizede para Enssios de Profencia em Laboratérioe de Quimica Analitea (ELLISON, 2006), © teste confematirio para a eféncia dos resuitados baseado na andlse de amostas de controle ndo-cego € descito no POP 008, rev. 05 - "Conte Inralaboratria’. Cada uma dessas tapas & desea detatnadamente nos ites 6 e 7.6 PROCEDIMENTOS PARA PREPARO DE AMOSTRAS E DETERMINAGAO DE AFBG |A seguir serd descito detamadamente os processos de preparo de amestas, extagao, puricagao, separagto, deteceo © quanicaeto de aflatoxinas.O fuxograma 1 resume as etapas do andlce, oxcoto a etapa de preparo de amostra que & bem descrta no tem 6.1. ‘Fuxograma 1 -Metioicga para alice do Aa 8G para amendcim soo (POP O55, ev. 3) "ie neditarent po 3h stor nda ra a roa Peaarars ASP aaa cen ome6.1 Prepare de amostras [As amostras de nimero 11A0T28A e 1 1A0163B provenients do programa PNCRV preparadas a 00, previamente moidas em moinho Turax foram rounidas em uma masseira para homogeneizagao préva, O tenpo de homogeneizagso fi de 240 min com inlervalo de descanso de 20 min a cada 40 min de homogensizago. A massa resultante da unio das amostas fo! do 18 kg © @ nova amosta fol eno denominada de T1ATO29. A mesma fol vansteréa para 0 rmoine Geiger para homogensizago por 30 min, Apés homegensizaggo foram reradas 20 ‘subamostras de $0 g para a realzagdo da anise. 6.2 Extragio + Pear 50 da amosta (1009 para amostras preparadas em pasta), temperatura ambiente: + atdcionar 5g de clreto de scio: + adcionar 100 mi. de hexane; 1+ aticionar 300 ml da solugto de metanot:Agua (8:2, vN) ou 200 mL. de metanol para amostras em pasts; + homogeneizar por3 minutes, a velocidad alta (aproximadarente B00 rp) + fivar 0 exrato através de papel de fitro qualtatve pregueade e em seguida fia & vicuo ‘rave de membrana de bra de vidro Whatman GFIG 1 pm ou equlvalente uikzando aperato de fitragao. + pipetar§ mi do itrado adiionar 30 ml. da solugio tame PBS 0,1% e homogensizar. 6.2 Purticagso.@ sluigSo utlizanda eolumna da imunoafinidada com a purficador autométicn de amostras (Aspec) Programaro Aspec para processamento das etapas: ‘+ condicloramento da eoluna com 9.0 ml da solugdo tampo PBS 0,1% a uma taxa de 6 mUmin, + passagem de aproximedamente 21,0 mL. do extrato diuido pola coluna em tres tapas ‘com passagem de aprocmadamente 7,0 mL. cada una com uma taxa de 6 min + Iavagem da coluna com aproximadamente 2,0 ml. de agua a 6 mLimin, ‘+ secagem da coluna pela passagem de aproximademente 2 mL de ara mLimin © + lugdo das aflatoxinas AFLAB, AFLAB;, AFLAG, © AFLAG, em duas eta‘© passagem de 0,5 ml de metancl grou HPLC ou semelhante pela colura a uma taxa e apeoximadamente 1,8 mln (© passagem de mais 3,0 mL de metanol grau HPLC ou semelhante ela coluna a uma taxa de aproximadamento 1,5 mUmin S 12 por fim a lavagem da aguha com apreximadamante 30 mL. de Sgua deionizada © fivada 6.4 Deteccte e quantificagdo por eromatografla liquda de alta eficléncla Utiizando a solo trabalho "pool (TP) de AFLABs, AFLABs, AFLAG: © AFLAG: prparar uma: curva padrdo de calbragdo om metanctigua (2:3, vv), com 10 concentragbes diferentes, senda: estas uals équelas apresentadas na Tabela 3 + Pipetar ullzando micropipeta um volume conhecido da solugie trabalho “poor & transfer ara um frasco apopriado para o prepara da primera solugso da cura de caloragso ++ Evaporar padio sob fuxo de Nzou ar comprimido seco; + Observar a proporgo do soWvente de relomada e adiconar metanol HPLC ob pa. com ‘agitagto por 5 minutes em agitador de tubos, segudo de um minuto no utra-som. Em sequida: adiionar agua para obtongdo da proporgdo do solvente, Por exemple: considerando que 0 padtdo. sera reissovio em 10 mi de metanoksgua (2:9, vW) deve-se sdiionar 4 mL. de metanol & depois de devidamente homogeneizado adiclonar 6 mi. de Agua, podende a adigse de metanol ser real2ado pola ati de 4 aliquots de 1 mL, sendo realaado agitarSo por 2 mirutos seguida: ‘de transferéncia para outa frasco. Os demais padrbes da curva de calbraglo serdo preparados pela duigdo do prmeir, conforme Tabela 3.0 preparo da slug padréo P1 pode ser realizado, 1 lia antes. Os procedimentos utlzados no proparo das solugées para a curva de calbragdo. -devem ser reistrados“Taboa 3 Faas de concetajtes eproxinades para o prepare da cura de calbraxéo do Mla BG CLAE ‘Concentracdo de AFLA BG na solugio preparada rare amt Preparda em) 8 8 o o Pio ‘0000088 .000017 —c.coooea : Po oot —.000083 | c.cootes | oan00a3 Ps ‘000038 0.000073 .conss3 on00073 Pr 0.000554 000112 conse omn0s12 Ps ‘00108 © a.gonrse — ann109onnnate Ps oozica 0.000427 cgczrze§—ono0427 Pa oom 00068 a.caase2 noose Ps 005402 001083 costs2 © ogor005 P2 010904 © .002%86 © ocr0504 aout Pt 021608 000437321608 004379 | rtomar og erating dag amanier ables na alana de puiicagio com a solic de rmetanotdgua (23, vv) @ homegensizar utikzando agitador de tubos ou Utra-som por 1 min, coneiderandh os volumes: +800 pL. pra residues obtidos do processamento automslico ~ ASPEC XL ‘+ Injtar no CLAE solugées padre © amostras nas condgses cromatogiiticas especticad para determinago de sfatoxinas Br, 8, Ge Gx: ~ coluna Ge, 25 em de compriment com particulas de 5 um e 48 um de cémet interno; + doctor de furesctncia com exciago em 360 nm @ emissto em 420 ar fase mével égua:acetonieimetana (6:22, viv), uz da ‘ase mével de 1,0 mLiin, + volume de ijendo de 50 + temperatura do foro da ealuna de 40°C ou ambiente de apoximadamente de 25°C; + rivatiagto: ilzando cla eetroquimica - Kobra Col = iionar 340 mg de KBr€ 700. decid nico 4M 82000 mi da fase mie! ‘iquaacetonirla:metanol (622, vv) desgaseicar em utrasom por 10215 minutos. "Nota 6: exemplo de cromatogramas de solugdo pasrdo © amostras esto mdrados no anex."= ermazenar os exratosbruos ¢ 0s purficados, em freezer ‘+ caleular a8 concenttagées de aflatoxinas presentes nas amosiras (0 tempo de rotengdo & leproximadamente de 11; 19; 14 © 17,6 minutoc para AFLAG2, AFLAGI, AFLABZ © AFLAB1, espectivamente) uizanco a cuva padio de calbragio ds padrées (Fgura 3) EET T Figura 3 -Cromatogama ts soli pss de sfsloxnas Gy, GB: © 8; com os empos de rien de $08 min, 128 min, tat mine 172 mn, respecvarete 6.44 Céleulos (0s caleulos podem ser relzados no programa Excel desde que @ érmula tora so valitada ou blzando a sequinte fue: Cae *He 4, Can = AGT Ft Cae = cncertragso de atatoxna determinada pela CLAE (igi), Vie volume da slug é extract (mt) j= volume de retomadadoreisuo (i), z= vlume do firado passado na coun de lmunoatniéede (mt), ‘m= massa ca amosta eaid (9). ‘Aconcenragdo determinada pela CLAE (Cae) ¢determinada pela seguint formule:AC-a Cue » AS send AC = trea cromatogritiea do p20 da amostra Inteccopte da curva de catragdo cinaglo da curva de calragio (mU/b) 7) TRATAMENTO DE DADOS _Apbs a anise das amostras brancas, de controle ndo-cego e naturaimente contaminadas, avala- © arecuparagdo obida da andize da amostrabranca friicada com solugso padréo de Ala BS (amostas de contole niocego) na falea de concentrarso das amostas naturalmente contaminadas. A expresséo para 0 céleulo da recuperagio & a seguinte (POP 004, rev. 5) oo ¥lor determina ‘aloradiionada ede recuperasio (Onde © valor deteminado cortsponde a0 reultado da andse ¢ 6 valor adicionado corraspondo «8 concentrago obida pela quentidade de padre adiconade a uma massa esperifica de amostra branca, [Alem da recuperagdo, o DPR dos controls ndo-cegos (duplicata) foram caleulados para que tanto (© DPR quanto a recuperagse sejam avaladas de acordo com os enrios de desempenho deserts na Tabela 2. Para a avalagdo da homogersidade da concentragso de alatoxinas no material naturalmerte confaminado, & necessério, ximelramente, observer se 0 proparo desto material foi feto ‘adequadamente garantindo que haja homogensidade de granuiometria & composigso visual de ‘card com @ POP 008, rev 13. DDepois de vereado 0 aspect visual, 0 material 6 divdo em lates. Dessesltes, um nimero m de lotes sto excolidos aleatoriamente onde #80 coletados uma amostra de cada um desses lots. cada amosta ¢ pesada em duyleat (50g por dupicata) © anasada com 0 procedimento deserto rnoitem 6, FForam analisados 10 lotes (m = 10) € os resultados foram avalados de acordo com dois procedimentosestatisicos: 0 teste de Cochran para resulados duplicados eo teste para a ndo- homogenstdade significtiva (UPAC, 2006).