METODOS QUIMICOS GENERALES 19 NITROGENO y PROTEINAS CRUDAS FS ce oso contenido total de protenas en los alimentos se determinaba a actualidad, existe mee: nittégeno organico determinado por el método Kjeldahl. En la ‘idles hag Pa : = métodos alternativos fisicos y quimicos, algunos de los Meloan (1978) ce ntzados o semiautomatizados. Lillevik (1970), Pomeranz y 78), elaboraron una lista general de los métodos para la determinacién de nitrogeno en materiales alimenticios. Por su parte, Lakin (1978) ha revisado los tiltimos desarrollos. El método Kjeldahl Aunque con el tiempo ha estado sujeto a modificaciones (Hatfull, 1983; Morries, 1983), el método Kjeldahl atin sigue siendo la técnica més confiable para la determi- nacién de nitrégeno orgénico. En consecuencia, se incluye en métodos oficiales y reglamentarios y est4 aprobado por organizaciones internacionales; més atin, los resultados obtenidos por el método Kjeldahl se usan para calibrar métodos fisicos y automaticos. Este método se basa en la combustién en htimedo de la muestra por calentamiento con acido sulfiirico concentrado en presencia de catalizadores metdlicos y de otro tipo para reducir el nitrégeno orgdnico de la muestra hasta amoniaco, cl cual queda en solucién en forma de sulfato de amonio. El digerido, una vez alcalinizado, se destila directamente 0 por arrastre con vapor para desprender el amoniaco, el cual es atrapado y luego se titula. Se emplean diversos catalizadores. El mercurio, como 6xido merctirico es el mas eficaz, junto con el selenio, que casi tiene la misma eficacia; pero ambos tienen propiedades t6xicas y plantean problemas para desecharlos. Mas atin, el mercurio forma complejos con el amoniaco en el digestor, que requieren la adicién de tiosulfato de sodio para romperlos y desprender el amoniaco. Williams (1976) y Croll et al. (1985) recomiendan una mezcla de sulfato de cobre (ID) y diéxido de titanio y en un estudio exhaustivo en el que participaron 22 laboratorios, Kane (1984) reporté ‘esultados comparables en alimentos para animales al usar 6xido merctrico 0 sulfato de cobre. ‘También se ha de sodio 0 de potasio, lo metélicos se encuentran Jogrado reducirel tiempo de digestién mediante la adicién de sulfato ® cuales elevan la temperatura de digestién. Los catalizadores ‘disponibles en a forma conveniente de tabletas en unamezcla io, Concon y Soltness (1973) y Koops et al. (1975) reportan aber Se Snide de hidedgeno acelera en forma importante la digestiGn y que Ia adievon Scion de espuma, Singh ef al. (1984) y Florence y Milner (1979) han reduce Ia formaciot te lograr una digestiGn satisfactoria en presencia de peréxido demostrado que s© PUY alizadores. Tradicionalmente, el amoniaco liberado del de hidrégeno sin US. estila.y reeolecta en una cantidad estindar de écidodiluido digerido alcalin: Setitula con Slcali esténdar para dar el contenido de nitrégeno que, como siltima claps 5°" actualidad, es mas comtin destilar y recolectar el ra. En 4 ; ve lucia de dcico bérico al 4% y titularlo en forma directa con una Acido sulfiirico. : ara macro-Kjeldahl corresponde bésicamente al de la orgdnico de amoniaco en und $0 ie solucién esténdar de acid El siguiente procedimiento Pt AOAC, Escaneado con CamScanner2 comPostciOn’ {y ANALIsIS DE LOS ALIMENTO® ah oe tes ae gest EE 1 ne i 0,15 9 de eulfaty be un a da ye eid suf rico concentra, Se calienta en forua surre oman en nici, 130 ode hacer espumna (weave not 2); despues se mantiere una ehaliciin engi incinad an, Se deja enfin (vase nots 3). Se agreiaet aproximadasnente 2 tol de spa y 25 tl de ran waft de sodio (0 gf) se me2e Seaiade un poo de graalla de tino penta de ebulisci soln de fog se dja cact por a pared el ata tuna cantidad suficiemte (alrededor de 1) nly de Suctinde hidroxido de sodio (450 g/) para hacer ‘el contenido fuertemente alcalina, Antes de mezclarlas sola rida y dicali, se conecta ef mata. a un aparaie de destilaciOn (véaxe nota 4) incorporandy un ae adr un protector conta safpicaduras ue se eficiente. Se conecta al extrema del condensate conte de salida 1 cual debe estar sumergido por deboit de la superficie de un volummen pi sal a gz cloca nun matraz cepa nico, Se mela] comin do mee eae, ) se calenta aeballici hasta que por lo menos se hayan destilado 150 ml en el matraz receptor. Se sai alvin incaora de ojo de metio(.5 100 ra cand) Guan ieiien, 5 pots de oe fein ambien una titulaciontestigo 1 ml de ido correo 01 ode ido salin 0.05 M equivalen a 0.0014 g de nitrégeno. Sse pesa una porcion NOTAS +.” Los materiales semisélidos, como los productos eémicos, por conveniencia pueden pesarse sobre un pdazo de papel filo en el que se envuelve la muestra y todo se coloca en el fondo del matraz de digestion. 2. Se pueden agregar preparaciones antiespumantes. 3. Lascantidades muestra, de dcido sulfirico y de sulfato de potasio deben ser tales que el digerido no se soliifique al enftiar. 14, Se-cuenta con aparatos de destlacién disefiados especificamente. En Ia figura 2.1 se muestra uno de ellos. Figura 2.1 Aparato de r Taglar) ‘estilacién para Macro-Kjeldahl. (Cortesfa de Coming Medical and Scientific Otros procedimie me ntos oficial cA les © recomendados han sido publi : edo Chena (SAC) ana, 173) por Renae sen of BS 4401: Pane, Teer aISO Site: 1978 para almidones aes ivadoa a Para came y productos cdmmicos, en la norma Sela 72 199 50S, la = Escaneado con CamScannerAdaptaciones al método Kjeldahl Markham (1942) describié unos aparatos para destilacién de amoniaco en escala semi-micro. En las figuras 2.2. y 2.3 se muestra cl aparato que atin lleva su nombre, asf como un equipo de destilacién alternativo a la misma escala semi-micro, los cuales estén comercialmente disponibles. El método Kjeldahl semi-micro se describe en cl libro de métodos de la AOAC, y Lin y Randolph (1978) describen la microdifusin de digeridos de leche con cdmaras de microdifusién de Conway modificadas y en la norma 71/393/EEC (OJ No. 279, 20.12.1971, pag. 7) aparece como un método para la determinacién de bases nitrogenadas volatiles en productos alimenticios. El método Kjeldahl se ha mecanizado y automatizado. Wall et al. (1975) y McGill (1981) reportan la exactitud y precisiGn de la versién Kjel-Foss automatizada del método original. Los sistemas instrumentales de Tecator, Biichi y Gerhardt llevan a cabo Ia digestién en tubos en un digestor de aluminio en bloque calentado eléctricamente, seguida por una répida destilacién por arrastre de vapor del amoniaco de los tubos, y luego una titulacién manual con Acido bérico. Algunos modelos incorporan una titulacién automatica del amoniaco destilado, detectandolo colorimétrica (Tecator) 0 potenciométricamente (Biichi y Gerhardt). En el laboratorio quimico del gobierno del Reino Unido se aplica el siguiente método cuando se utiliza dicho equipo. Se precalienta durante 30 minutos el bloque de digestién a 435 °C antes de usarlo. Se transfiere a un tubo de digestién la muestra homogenizada y pesada con anterioridad envuelta en papel filtro, tomando una ccantidad de muestra estimada para que latitulaci6n se efectie con aproximadamente 25 ml de dcido sulfdrico 0.05 M, o un peso maximo de 2. Se afiadendos tabletas Kjeltab TCT (Thompson y Capper Ltd. Liverpool), cada tableta contiene 3.5 g de K2SOs, 0.105 g de CuSOs y 0.105 g de TiOz. Se agregan 10 ml de fcido sulfirico concentrado, gravedad especifica 1.84, 10 ml de peréxido de hidrégeno (100 voltimenes) y se rmezcla, Se deja reposar la solucin por unos minutos. Se coloca el tubo en el digestor caliente y se conecta el tubo de ventilacién que deja salir los vapores de ido, Se permite que la digestisn prosiga por 45 minutos. Se retita el tubo del bloque digestory se enfria por 5 minutos en el bastidor metélico. Se agregan 75 ml de agua ddesmineralizada y se mezcla. Para instrumentos que utilizantitulacién manual, se colocan 25 ml de soluciGn Figura 2.2 Aparato tipo Markham para destlacién Kjeldahl semi-micro. (Cortesia de Coming Medical and Scientific (Inglaterral) = Figura 2.3 Aparato Quickfit para Kjeldahl semi-micro, (Cortesfa de Coming Medical and Scientific (Europal) Escaneado con CamScanner1 chlo bsicn (04%) en un cidn y se eoloca en la Sfeotuar la adicién medida de la solucién de hidréxido de sodio cass ca fa plataforina del receptor y se detiene la destilacién, Solucién indcadora de rojo de metilo (0.125 g de rojo de metilo y 0.082 g de azal de metleno os Oo ‘ectanol ys ttula con solucién de dcidosulfrico 0.05 M hasta un punto final de color grisacco, Seefeenty ‘ina determinacign testigo Para t completarnente autométicas, se coloca el tubo en la unided se destlacién y se siguen las instrucciones del fabricante. de tid de deste, Se Dresona el btn de arson ciara destin por anasto doves tei el matty aan Soe Suhre ef al. (1982) han descrito en colaboracién un estudio comparativo de los mnétodos Kjel-Foss, de bloque de digesti6n con sistema de destilacién por arrastre de vapor y el de referencia de la AOAC. El método Kjeldahl también se ha adaptado para el andlisis automitico y el microa- ndlisis del amoniaco por colorimetrfa. La reaccién entre el amoniaco y el reactivo de Nessler se utiliza en la ISO 5378:1978 (BS 5697: Parte 2: 1979) para la determinacién de nitrégeno en almidones y sus derivados, La reaccién de Berthelot del amoniaco con una mezela alcalina de fenol e hipoclorito, y el color verde brillante formado por Ia reaccién del amoniaco con una solucién alcalina que contenga salicilato de sodio, nitroprusiato y dicloroisocianurato, también usado. (Scheiner, 1976; Havilah et al. 1977; Nkonge y Ballance, 1982). Las tiltimas dos reacciones se usan en los sistemas ‘Technicon Auto Analyser (Crooke y Simpson, 1971; Isaac y Johnson, 1976). La importancia de los procedimientos de calibraci6n para la exactitud y precisi6n de los andlisis automatizados de nitrogeno de Kjeldahl ha sido descrita por Vincent y Shipe (1976). Pailler (1982) reporta la determinaci6n satisfactoria de amoniaco en digestiones 4cidas de Kjeldahl usando un electrodo especffico para'el ion amonio, Otros métodos para determinacién de nitrégeno Sc estima el contenido de protefnas en los alimentos a partir de 1a determinacién de nitrégeno elemental usando instrumentos modernos basados en el principio de Dumas, como el analizador automatico de nitrégeno de Carlo Erba. En este instrumento, los constituyentes de la muestra que contienen nitrégeno se queman a altas temperaturas en presencia de oxigeno y de helio, con lo cual se obticnen éxidos de nitrégeno que luego se reducen con cobre a nitrégeno gaseoso, el cual se mide por cromatografia de 80s sélido. En el instrumento Antek, el dxido nftrico reacciona con ozono y la Quimioluminiscencia asf formada, se mide con un tubo fotomultiplicador. Estos instrumentos parecen ser de una utilidad limitada para el andlisis de alimentos, debido Fa S6lo manejan cantidades de muestra a nivel de miligramos. La mayorfa de los fy ae a neotopéncn, Y por tanto, es dificil preparar muestras representativas tereaeige ee epone tun método automético para nitrégeno proteinico basalo en Teena sen el Acido trinitrobencensulfénico y los aminodcidos E polarosttia para de Eas isis de hidroxiprotina. Fosdick y Pike (1982) eal Tormaldehido et amonicen es ameilentetraamina producia por la reaction le neutrones © sencillas y seguras de andlisis por etal., 1976), Williams oly etal. 1970) y andlisi is por activaci6n de protones (Dohan ¢*al. (1978) reportan estudios comparativos usando Kjeldahl, Escaneado con CamScannerMETODOS QUIMICOS GENERALES 23 Kjel-Foss, Kjeltec, refractancia de infrarrojo, activacién de neutrones, activacién de Protones y andlisis por descomposicién térmica. Los autores sefialan que para la determinacién del nitrgeno en trigo, todos los métodos son satisfactorios y pueden emplearse en vez del Kjeldahl como métodos estindares. El anélisis por activacién de neutrones se sefiala como el mas exacto y cconémico. Factores de conversién de nitrégeno a proteina cruda La determinacién de nitrégeno total por el método normal de Kjeldahl no incluye el nitrégeno inorgnico de, por cjemplo, nitratos y nitritos. Sin embargo, los métodos radioquimicos y de andlisis elemental detectan y miden el nitrégeno en todas sus formas de combinacién. El contenido de nitrégeno no protefnico es alto en ciertos alimentos (pescado, frutas y verduras), pero los factores cominmente usados para Convertir nitrégeno en protefna cruda se basan en el contenido promedio de nitrégeno de las protefnas encontradas en alimentos particulares (Jones, 1931). Los factores recomendados por la FAO/OMS (1973) son: ‘Trigo: harina integral 33 Soya 571 ‘otras harinas| 570 Nueces: cacahuates, nuez de Brasil 5,41 macarrones 570 almendras S18 salvado 631 otras nueces 530 Arroz S95 Leche y derivades 638 Cebada, avena, centeno 583 Gelatina y coligeno 535 Matz 625 Todos los otros alimentos 625 Estos factores, basados en andlisis anteriores de protefnas, han sido cuestionados por Heidelbaugh et al, (1975), quien publicé factores para una amplia variedad de alimentos basados cn un anilisis detallado de aminodcidos, De Rham (1982) sugiere que el limite de factores protefna nitrogenada para alimentos depende en gran parte de la proporcién de arginina y de las amidas de los dicidos glutdmico y aspéitico. Ha propuesto factores para una variedad de alimentos bas‘indose en los perfiles de aminodcidos de la FAO/WHO y sus consideraciones para las proporciones de amidas presentes. Es recomendable en el andlisis de alimentos mencionar el factor que se emplea para reportar el contenido de protefna. DETERMINACION DIRECTA DE PROTE{NAS Las protesnas de los alimentos contienen aminodcidos, los cuales poseen diversos gtupos funcionales y, por lo tanto, efectian una amplia variedad de reacciones quimicas. Debido a que los alimentos contienen mezclas de protefnas, los métodos para la determinacién directa de protejnas deben calibrarse contra un método estandar de referencia para nitrégeno, como el método Kjeldalh. Titulacién con formol ‘Cuando se afiade formol a una soluciGn acuosa neutralizada que contiene proteina, el grupo —NH, reacciona para formar el grupo metilen-amino— N=CH; con la libera- ci6n de un proton titulable. El procedimiento fue descrito por Taylor (1957) y ha sido Escaneado con CamScannerusado para la determinaci6n de s6lidos de leche en helados (Crowhurst, 1g Hill y Stone (1964) con una modificacién potenciométrica. Roeper ana 956) y por titulacién con formol para la estimacidn de nitrégeno proteinico en exe e* descremada. Véase el indice de aplicaciones, asefna y leche Métodos colorimétricos ‘Se ha empleado la reacci6n de biuret que da una coloracién ptirpura cuando | peptidicos reaccionan con iones cipricos a pH alcalino; Mitsuda y Mitsunaga (19 han reportado que concentraciones bajas de azsicares reductores no Diectiea = dicha reaccin. Este método ha mejorado considerablemente mediante el a na 2-propanol y la aplicacién de calor (Noll et al., 1974); y un método sencllo par protefnas en alimentos que se compara de manera favorable con el m ro-Kjeldah fue descrito por Ramachudran ef al. (1984). El reactivo de Folin (écido fosfomoltbdico- fosfottingstico) se reduce con las protefnas y forma un complejo de molibdeno color azul, Lowry, ef al. (1951) modific6 la reaccién y amplié su sensibilidad y es muy empleada en especial en andlisis bioquimicos. El método se ha automatizado para andlisis de leche (Huang et al., 1976) y también resulta apropiado para protefnas en harina de pescado (Martone et al., 1980). Los colorantes a base de dcidos sulfonados reaccionan con las proteinas a pH bajo para formar un cofgulo de colorante y protefna insoluble; si este codgulo se separa por filtraci6n o centrifugacién, la cantidad de color debida al colorante que permanece en el Iiquido sobrenadante es indirectamente proporcional a la cantidad de protefna en la muestra, La reaccién del colorante con la protefna es compleja y no uniforme, por lo que el método es muy empfrico y requiere estandarizaci6n y calibracién. Este método ha encontrado aplicaci6n en muestras con un alto contenido de protefnas. Udy (1971) hace una revisién completa y describe los métodos para leche y productos licteos (libro de métodos de la AOAC), productos cérnicos (Pearson y Parveneh, 1971), cereales (Hartley, 1975) y postres lacteos congelados (Bruhn et al., 1980). La técnica se hace sumamente sensible mediante 1a extraccién del colorante enlazado (McKnight, 1977). los enlaces Destilacién directa Debido a la presencia de Jos aminodcidos asparagina y glutamina, los cuales también reaccionan como amidas, las protefnas de los alimentos desprenden amoniaco cuando se destilan en exceso de una solucién concentrada de hidréxido de sodio. Ronalds (1974) us6 esta técnica empleando el aparato de destilacién de Kjeldahl para la determinacién de protefnas en trigo y cebada, y Lehmann y Beckmann (1982) para protefnas en productos cérnicos. El sistema Kjeltec DD es una. adaptacién de la unidad automética de destilacién Tecator Kjeltec para este propésito. Métodos espectroscépicos La absorcién en la regién principal del infrarrojo (2.5-16 zm) ha sido por varios afios la base de los instrumentos para la determinacién de protefnas (incluyendo lactosa Y grasa) en leche, por ejemplo, la serie IRMA de Grubb Parsons, La Shield Instruments Multispec y la Foss Electric Milko-Scan (Kerkhof Mogot et al., 1982). La Foss aa eee Escaneado con CamScanner