SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG THPT TRẦN VĂN GIÀU

--------
CUỘC THI KHOA HỌC KĨ THUẬT DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG
HỌC NĂM HỌC 2019 – 2020

ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

TRÊN MỘT SỐ BÀI THUỐC DÂN GIAN

LĨNH VỰC HOÁ HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS. LÊ HƯƠNG THẢO

TÁC GIẢ

HUỲNH ĐỖ NGỌC MỸ
HỒ THANH PHƯƠNG VÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 9 NĂM 2019

 MỤC LỤC

TÓM TẮT ............................................................................................................ 1

1. Lí do chọn đề tài .....................................................................................................2
2. Cơ sở lí thuyết liên quan ......................................................................................... 2
2.1. Bệnh đái tháo đường và enzyme 𝜶-glucosidase .............................................. 2
2.2. Tổng quan về thành phần bài thuốc sử dụng.................................................... 5
3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 6
THỰC NGHIỆM ................................................................................................. 7
1. Trích nóng các bài thuốc dân gian qua các hệ dung môi khác nhau. .....................7
2. Đánh giá tác dụng sinh học bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme 𝜶-
glucosidase...................................................................................................................7
3. Định tính thành phần hóa học của cao chiết ........................................................... 8
KẾT QUẢ........................................................................................................... 11
1. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme 𝜶-glucosidase ............................................11
2. Định tính thành phần hóa học của cao chiết .......................................................... 13
 TÓM TẮT
Bệnh đái tháo đường là một trong những bệnh không lây nhiễm phổ biến
trên toàn cầu. Trên thế giới có 415 triệu người lớn (độ tuổi 20 – 79) tương đương
1 trong 11 người lớn đang sống với bệnh đái tháo đường trong năm 2015. Dự đoán
vào năm 2040, con số này tăng tới khoảng 642 triệu người, hay nói cách khác, 1
người trong 10 người lớn sẽ có bệnh đái tháo đường.
Tại Việt Nam, vào năm 2015 đã có 3,5 triệu người mắc bệnh, đây là báo
cáo của Hiệp hội đái tháo đường thế giới IDF Diabetes Atlas, và con số này được
dự báo sẽ tăng lên 6,1 triệu vào năm 2040. Theo kết quả điều tra năm 2015 của
Bộ Y tế, 68,9% người tăng đường huyết chưa được phát hiện. Chỉ có 28,9% người
bệnh đái tháo đường được quản lí tại cơ sở Y tế. Đây thực sự là khoảng trống lớn
về sự chêch lệch giữa nhu cầu và cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe. Cũng như
sự lạm dụng thuốc tây ngày càng nhiều, họ nghĩ đây là phương pháp duy nhất để
trị dứt bệnh đái tháo đường mà họ đã lãng quên đi phương pháp dân gian từ một
số bài thuốc. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng trị bệnh đái
tháo đường trên một số bài thuốc dân gian”. Dựa vào một số bài thuốc dân gian
được thực hiện bằng phương pháp hóa học để phân tích thành phần và khảo sát
khả năng ức chế enzyme 𝛼-glucosidase trong việc điều trị bệnh đái tháo đường.
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi đã tiến hành:
 Điều chế cao 10 thang thuốc trị bệnh đái tháo đường phổ biến trong dân
gian với các hệ dung môi nước, ethanol, ethanol: nước (8:2).
 Khảo sát hoạt tính kháng enzyme 𝛼-glucosidase trên tất cả các mẫu cao thu
được để tìm ra mẫu cao có khả năng nhất trị bệnh đái tháo đường.
 Định tính thành phần hóa học của thang thuốc cho hiệu quả trị bệnh cao
nhất.
 Điều chế bột hòa tan từ cao chiết cho kết quả trị bệnh cao nhất.

1
 TỔNG QUAN
1. Lí do chọn đề tài
Trong số các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa thì bệnh tiểu đường đang trở
thành căn bệnh phổ biến và gia tăng nhanh chóng tại các nước phát triển và đang
phát triển trên toàn thế giới. Nếu như 30 năm trước, Việt Nam phải đối mặt với
tình trạng suy dinh dưỡng thì hiện nay chúng ta đang bị đe dọa bởi béo phì và
bệnh tiểu đường. Bệnh tiểu đường là một trong ba nguyên nhân gây tử vong cao
nhất thế giới, chỉ đứng sau bệnh tim mạch và ung thư. Thực trạng bệnh tiểu đường
hiện nay đáng để người dân quan tâm và có sự cảnh giác nhất định.
Hiện nay, có nhiều bài thuốc trị tiểu đường trong dân gian đang được người
dân sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, chúng ta vẫn chưa có một nghiên cứu nào đánh
giá hiệu quả của các bài thuốc trên và việc sử dụng các bài thuốc dân gian còn có
nhiều tranh cãi. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng trị bệnh tiểu
đường trên một số bài thuốc dân gian” với mong muốn làm rõ hiệu quả của một
số bài thuốc phổ biến. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành định tính 1 số thành
phần cơ bản của bài thuốc cho hiệu quả cao, đồng thời tìm cách điều chế thuốc
nang con nhộng từ thang thuốc đã được khảo sát nhằm giúp việc sử dụng thuốc
dễ dàng hơn.
2. Cơ sở lí thuyết liên quan
2.1. Bệnh đái tháo đường và enzyme 𝜶-glucosidase
2.2.1. Bệnh đái tháo đường
- Khái niệm: Bệnh đái tháo đường (tiểu đường) là bệnh do rối loạn chuyển
hoá carbohydrate khi hormone insulin sinh ra bởi tế bào beta của tuyến tuỵ bị
thiếu hay giảm tác dụng cơ thể. Bệnh được đặc trưng bởi tính trạng tăng đường
huyết cùng với các rối loạn quan trọng về chuyển hoá đường, đạm, mỡ, chất
khoáng. Những người mắc bệnh tiểu đường không những có hàm lượng đường
trong máu cao mà còn cả trong nước tiểu.
- Nguyên nhân: Insulin là một hormone được tiết ra từ tuỵ tạng (pancreas).
Tuỵ tạng vừa là tuyến ngoại tiếp để tiêu hoá mỡ trong ruột non, vừa là tuyến nội
tiếp để điều tiết ra Insulin vào máu. Hormone insulin có nhiệm vụ chính trong sự
vận chuyển đường vào trong tế bào của cơ thể, nhưng vì lí do nào đó, Insullin
không được sản xuất, hay sản xuất không đủ, hoặc sản xuất ra nhưng bị cơ thể đề
kháng không dùng được. Do đó, đường sẽ không được vận chuyển vào tế bào mà
ứ đọng lại trong máu và thoát ra bằng được nước tiểu, từ đó gây ra bệnh đái tháo
đường.
 Phân loại bệnh đái tháo đường
 Bệnh đái tháo đường loại 1
Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xảy ra ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên và chiếm
10% trong các trường hợp bị tiểu đường. Nguyên nhân là do cơ thể không sản
xuất được Insulin vì hệ thống miễn dịch của cơ thể nhầm lẫn đã tấn công vào các
2
tế bào của tuyến tuỵ làm cho tuyến tuỵ không sản xuất được Insulin. Khi không
có Insulin, tế bào sẽ không chuyển hoá được glucose làm cho hàm lượng glucose
trong máu tăng rất cao. Do đó, bệnh nhân đái tháo đường loại 1, cần tiêm Insulin
để sống.
 Bệnh đái tháo đường loại 2
Bệnh đái tháo đường xảy ra trên người 50 tuổi, chiếm gần khoảng 90% trong
tổng số trường hợp bị đái tháo đường. Đối với bệnh đái tháo đường loại 2, cơ thể
vẫn sản xuất được Insulin nhưng tế bào vẫn không thể sử dụng và lượng đường
trong máu do không được chuyển hoá thành năng lượng nên giữ ở mức cao. Khi
đó, cơ thể phản ứng bằng cách tăng sản xuất Insulin và gây nên quá tải cho tuyến
tuỵ. Theo thời gian, lượng Insulin được tiết ra dần dần giảm.
Đái tháo đường loại 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen. Điều
này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn. Nếu những người mang gen tiềm ẩn bệnh
đái tháo đường được phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa một cách hợp lí
thì bệnh có thể sẽ không xuất hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn đang
tiềm ẩn. Trong trường hợp ngược lại thì bệnh phát triển rất nhanh.
Ngoài ra, còn một vài trường hợp bệnh đái tháo đường khác như: đái tháo
đường đôi và đái tháo đường thai kỳ.
 Tác hại của bệnh đái tháo đường
 Các biến chứng cấp tính
Một số biến chứng cấp tính có thể xảy ra khi đường huyết quá cao hay quá
thấp. Nếu không được điều trị sớm sẽ đe doạ đến tính mạng của nạn nhân. Các
biến chứng này bao gồm các loại sau: hạ đường huyết, tăng lượng ceton trong
máu, tăng áp lực thẩm thấu, tăng acid lactic trong máu.
 Các biến chứng mãn tính
Tăng huyết áp lâu dài sẽ dẫn đến những biến chứng sau đây: Bệnh võng mạc,
bệnh thận, bệnh thần kinh, bệnh tim mạch.
 Phương pháp điều trị
Đối với những người mắc bệnh đái tháo đường loại 1: sẽ phải tiêm Insulin
thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hormone
này. Hiện nay, việc uống Insulin dạng viên là không thể vì trong môi trường dạ
dày Insulin sẽ bị phân huỷ.
Phương pháp chữa bệnh đái tháo đường loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của
bệnh nhân. Phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường
hoạt động.

3
 2.2.2. Enzyme 𝜶-glucosidase
Trong thực phẩm chúng ta dùng hằng ngày chứa rất nhiều carbohydrate, đây
là nguồn cung cấp năng lượng lớn cho cơ thể, đặc biệt là chất đường. Trước khi
các phân tử đường đến các tế bào trong cơ thể, các carbohydrate sẽ được thủy
phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non. Đầu
tiên, tụy tạng (pancreas) sẽ tiết ra enzyme 𝛼-amylase dùng để thủy phân các phân
tử đường đa thành các phân tử đường nhỏ hơn. Sau đó, màng tế bào ruột non lại
tiết ra enzyme 𝛼-glucosidase để tiến hành thủy phân các phân tử đường này thành
các phân tử đường đơn rồi mới thẩm thấu vào máu.
Enzyme 𝛼-glucosidase là một enzyme glucosidase có nối 𝛼-1-4 liên kết 2 phân
tử glucose hay 1 phân tử glucose và những phân tử thay thế khác (ví dụ các
disaccarid), thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy
phân). Enzyme 𝛼-glucosidase nằm ở tế bào ruột non của người và động vật, hỗ
trợ bước cuối cùng của việc tiêu hóa carbohydrate từ thức ăn. Chức năng chính
của enzyme này là xúc tác cho việc cắt dứt liên kết 1,4-𝛼-D-glucose từ đầu không
khử (nonreducing) của chất nền để giải phóng ra 𝛼-D-glucose.
2.2.3. Đánh giá tác dụng sinh học bằng phương pháp thử hoạt tính ức
chế enzyme 𝜶-glucosidase
Hoạt tính ức chế enzyme 𝛼-glucosidase được xác định dựa trên phương pháp
phân tích trắc quang. Enzyme 𝛼-glucosidase xúc tác quá trình thủy phân cơ chất
heterogeneous như saccarose và 𝜌-nitrophenyl-𝛼-D-glucopyranoside… Vì vậy,
để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme 𝛼-glucosidase, người ta sử dụng 𝜌-
nitrophenyl-𝛼-D-glucopyranoside (𝜌NP-G) làm chất nền. Chất nền sẽ bị enzyme
𝛼-glucosidase chuyển hóa thành 𝛼-D-glucose và 𝜌-nitrophenol (𝜌NP).
Trong môi trường đệm phosphate pH = 7,0, enzyme 𝛼-glucosidase sẽ xúc tác
cho quá trình thủy phân 𝜌-nitrophenyl-𝛼-D-glucopyranoside (𝜌NP-G) tạo thành
sản phẩm là 𝜌-nitrophenol trong môi trường kiềm có độ hấp thu cực đại tại bước
sóng 401 nm. Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với lượng 𝜌-nitrophenol
cũng như lượng glucose tạo thành sẽ giảm theo. Vì vậy, dựa trên độ hấp thu của
𝜌-nitrophenol sinh ra khi có và không có mẫu thử sẽ tính được khả năng ức chế
enzyme 𝛼-glucosidase của mẫu khảo sát.

Hình 1: Phản ứng thủy phân enzyme 𝛼-glucosidase với cơ chất 𝜌-nitrophenyl-𝛼-D-glucopyranoside

4
 Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát đối với phương pháp
thử hoạt tính ức chế enzyme 𝛼-glucosidase, trong quy trình này sử dụng chất đối
chứng dương là acarbose. Công thức cấu tạo của acarbose được trình bày trong
hình 2.

Hình 2: Công thức cấu tạo của acarbose

2.2. Tổng quan về thành phần bài thuốc sử dụng

Hiện nay có khoảng hơn 20 bài thuốc trị tiểu đường khác nhau được sử dụng
trong dân gian. Tuy nhiên, việc thu thập và định danh các bài thuốc gặp nhiều khó
khăn. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên 10 bài thuốc phổ biến
nhất. Thành phần của các bài thuốc được thể hiện trong bảng 1.
BÀI THUỐC 2
BÀI THUỐC 1
KHỐI LƯỢNG (g) (Lục vị Địa hoàng KHỐI LƯỢNG (g)
(Không tên)
hoàn gia giảm)
Câu kỷ 12 Sinh đại 15
Thục địa 20 Hoài sơn 30
Hoài sơn 20 Phục linh 12
Thạch hộc 12 Trạch tả 12
Mẫu đơn bì 12 Nữ trinh tử 12
Sơn thù 8 Bạch thược 12
Rễ qua lâu 8 Thục địa 15
Sa sâm 8 Sơn thù du 15
Đan bì 9
Cẩu kỷ tử 12
Đồng tật lê 12
BÀI THUỐC 4
BÀI THUỐC 3 (Lục vị địa hoàng
KHỐI LƯỢNG (g) KHỐI LƯỢNG (g)
(Không tên) gia thạch hộc thiên
hoa phấn)
Thục địa 20 Hoài sơn 16
Tri mẫu 10 Trạch tả 12
Huyền sâm 15 Đan bì 12
Mạch đông 20 Sơn thù 16
Hoài sơn 20 Bạch linh 12
Vỏ kén 20 con Thục địa 32
Hoàng kỳ 20 Thiên hoa phấn 12
Trạch tả 10 Thạch hộc 12
Thương truật 10
Phục linh 10
BÀI THUỐC 5 KHỐI LƯỢNG (g) BÀI THUỐC 6 KHỐI LƯỢNG (g)
5
(Không tên) (Không tên)
Thiên môn 12 Củ mài 40
Thạch cao 20 Bí ngô 120
Sa sâm 12 Lá sen 50
Mạch môn 12
Hoài sơn 12
Bạch biển đậu 12
Ý dĩ 12
Tâm sen 8
BÀI THUỐC 7 BÀI THUỐC 8
KHỐI LƯỢNG (g) KHỐI LƯỢNG (g)
(Không tên) (Tăng dịch thăng)
Hà thủ ô đỏ 12 Huyền sâm 32
Long nhãn 12 Sinh địa 32
Quyết minh tử sao 12 Mạch môn 32
Lá dâu Thiên hoa phấn 32
20 Hoàng liên 10
BÀI THUỐC 9 BÀI THUỐC 10
(Kim quỹ thận khí KHỐI LƯỢNG (g) (Lục vị địa hoàng KHỐI LƯỢNG (g)
hoàn) hoàn)
Thục địa 30 Hoài sơn 16
Sơn thù du 15 Trạch tả 12
Đan bì 9 Đan bì 12
Nhục quế 3 Sơn thù 16
Sơn dược 30 Bạch linh 12
Phục linh 15 Thục địa 32
Trạch tả 9
Phụ tử 6
Bảng 1: Bảng thành phần của từng bài thuốc

3. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp trích nóng.
- Phương pháp định tính các hợp chất trong cao: sử dụng thuốc hiện hình
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme: Phương pháp trắc quang
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1.Đối tượng nghiên cứu: Một số bài thuốc dân gian
4.2.Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian: tháng 6/2019 đến tháng 10/2019
- Không gian:
 Phòng bộ môn Hóa học – Trường THPT Trần Văn Giàu
 Phòng thí nghiệm Hóa Dược – ĐHKHTN TPHCM

6
 THỰC NGHIỆM
1. Trích nóng các bài thuốc dân gian qua các hệ dung môi khác nhau.
Mẫu được thu thập từ các hiệu thuốc nam trên đường Hải Thượng Lãn Ông,
quận 5, TP HCM.
Mẫu sau khi được thu thập được xay nhuyễn để đồng hóa mẫu.
Mỗi mẫu được cân 20 gam hòa vào 500 ml dung môi với độ phân cực khác
nhau.
 Dung môi 1: 100% nước.
 Dung môi 2: 80% etanol – 20% nước (về thể tích).
 Dung môi 3: etanol nguyên chất.
Đun mẫu trên bếp hồng ngoại trong 30 phút, vừa đun vừa khuấy đều. Mẫu sau
khi đun được làm nguội và lọc qua giấy lọc. Đun dung dịch sau lọc để làm bay
hơi bớt dung môi và làm khô mẫu hoàn toàn bằng cách phơi nắng.
2. Đánh giá tác dụng sinh học bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế
enzyme 𝜶-glucosidase
Hóa chất được pha chế theo phụ lục 2. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme
𝛼-glucosidase được thực hiện như sau: mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm
phosphate pH = 7,0. Thêm 50 𝜇L enzyme 0.1 U mL-1, lắc đều, ủ trong 5 phút tại
370C. Cho tiếp 50 𝜇L dung dịch nền 1.5 mM và ủ trong 30 phút tại 370C để phản
ứng xảy ra. Sau khi ủ, thêm 375 𝜇L Na2CO3 0.1M để dừng phản ứng. Dung dịch
sau đó được đem đo quang tại bước sóng 401 nm.

7
 V1 μL đệm V2 μL dung dịch
phosphate mẫu

Dung dịch
1
1. Thêm 50 μL enzyme
2. Lắc đều, ủ ở 37 0C trong 5 phút

Dung dịch
2
1. Thêm 50 µL dung dịch pNP-G
2. Lắc đều, ủ ở 37 0C trong 30 phút

Dung dịch
3
1. Thêm 375 µL Na2CO3
2. Lắc đều

Đo quang ở
bước sóng 401
nm

Hình 3: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme 𝜶-glucosidase

3. Định tính thành phần hóa học của cao chiết

3.1.Nhận biết hợp chất polyphenol
 Thuốc thử Folin – Ciocalteu
Cho khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, thêm 1ml Na 2CO3 1M và
1ml thuốc thử Folin – Ciocalteu 10% để yên, màu của dung dịch sẽ đổi sang màu
xanh dương chứng tỏ có sự hiện diện của polyphenol.
 Thuốc thử FeCl3
Lấy khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, nhỏ từ từ từng giọt dung
dịch FeCl3 0.1%. Dung dịch sẽ xuất hiện màu xanh dương hoặc xanh tím cho thấy
sự hiện diện của polyphenol.

8
  Thuốc thử Pb(CH3COO)2
Lấy khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, nhỏ từ từ từng giọt dung
dịch Pb(CH3COO)2 10%. Dung dịch xuất hiện màu vàng chứng tỏ có sự hiện diện
của flavonoid; dung dịch xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ có sự hiện diện của
polyphenol.
 Thuốc thử Sahinoda
Lấy khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, thêm khoảng 0.5g (cỡ hạt
đậu) bột Mg và 0.5ml dung dịch HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Sau phản ứng kết
thúc, dung dịch sẽ xuất hiện màu hồng, cam hoặc đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của
flavonoid.
Đối với mẫu cao khô:
a) Hòa tan 0.5g cao khô với 5ml ethanol, đun nóng vào lọc thu được dung dịch
A.
b) Lấy khoảng 2ml dung dịch A, thêm vào khoảng 0.5g (cỡ hạt đậu) bột Mg
và 2ml dung dịch HCl đậm đặc.
c) Sau khi phản ứng kết thúc, dung dịch sẽ xuất hiện màu vàng → đỏ là
Flavone, đỏ → đỏ thẫm là Flavonol, đỏ thẫm → đỏ tía là Flavonone.
 Thuốc thử NaOH
Lấy khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, nhỏ từ từ từng giọt dung
dịch NaOH 1M. Dung dịch sẽ xuất hiện màu vàng và bị mất màu khi cho từ từ
từng giọt CH3COOH chứng tỏ có sự hiện diện của các Flavonoid.
3.2. Phản ứng nhận biết alkaloid
Lấy khoảng 1ml dung dịch chuẩn vào ba ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch
HCl 1%.
- Ống 1: Cho từ từ từng giọt thuốc thử Dragendorff, kết quả xuất hiện kết tủa
màu đỏ cam.
- Ống 2: Cho từ từ từng giọt thuốc thử Mayer, kết quả xuất hiện kết tủa màu
da trắng.
- Ống 3: Cho từ từ từng giọt thuốc thử Bouchardat, kết quả xuất hiện kết tủa
màu đỏ cam.
→ Kết quả từ ba thí nghiệm này cho thấy sự hiện diện của alkaloid.
Đối với mẫu cao thô:
a) Lấy 0.5g mẫu vào becher 50ml, hòa tan với 10ml acid acetic 10% trong
ethanol, đun nóng và lọc thường thu lấy dung dịch A.

9
 b) Lấy ra 5ml dung dịch A vào bình lóng 50ml, thêm vào 2ml dung dịch NH3
10% và 5ml CHCl3, lắc mạnh cho dung dịch tách thành 2 lớp, chiết lấy lớp dung
dịch baz, lớp CHCl3 được chiết tiếp với HCl 5%.
c) Nhỏ từ từ vài giọt dung dịch thuốc thử Mayer vào dung dịch sau chiết sẽ
thấy kết tủa trắng chứng tỏ có sự hiện diện của alkaloid.
3.3. Thuốc thử nhận biết Terpenoid và Steroid
 Thí nghiệm Liebermann – Burchard
Lấy khoảng 1 ml dung dịch chuẩn vào ống nghiệm, thêm 1ml CH 3COOH,
thêm từng giọt H2SO4 một cách cẩn thận. Dung dịch sẽ xuất hiện màu từ tím sang
màu xanh dương hoặc xanh lá cây cho thấy có sự hiện diện của Steroid.
Đối với mẫu cao thô:
a) Lấy khoảng 0.5g cao thô hòa tan hoàn toàn với 2ml CHCl3.
b) Thêm từ từ một cách cẩn thận 2ml dung dịch H2SO4.
c) Dung dịch sẽ xuất hiên màu từ tím sang màu xanh dương hoặc xanh lá cây
cho thấy có sự xuất hiện steroid.
 Thí nghiệm Salkowski
Đối với mẫu cao thô:
a) Lấy 5ml dung dịch cao thô hòa tan hoàn toàn với 2ml CHCl3.
b) Thêm từ từ một cách cẩn thận 3ml H2SO4 đậm đặc theo từng lớp sao cho
có sự tách lớp rõ ràng.
c) Kết quả nhìn thấy vệt đỏ nâu đậm xuất hiện ở giữ 2 lớp dung dịch chứng tỏ
có sự hiện diện của các hợp chất triterpenoid.
3.4. Thí nghiệm nhận biết Saponin
Đối với mẫu cao thô:
a) Hòa tan 1g cao thô với 10ml nước nóng trong becher 50ml, sau đó lọc thu
lấy dung dịch A.
b) Cho 3ml dung dịch A vào ống nghiệm có nắp, lắc mạnh trong 2 phút để
dung dịch tạo bọt chứng tỏ có sự hiện diện của saponin.
c) Sau đó để ống nghiệm đứng ổn định trong 15 phút và đọc kết quả nhận
được.

10
 KẾT QUẢ
1. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme 𝜶-glucosidase
1.1. Xác định giá trị phần trăm ức chế
Khả năng ức chế của mẫu khảo sát được tính dựa trên phần trăm ức chế (I%)
theo công thức
Acontrol - Asample
I (% ) = * 100%
Acontrol
Trong đó:
Acontrol: giá trị mật độ quang của dung dịch không chứa mẫu khảo sát
Asample: giá trị mật độ quang của dung dịch chứa mẫu khảo sát
Dựa trên trên phần trăm ức chế ta có thể đánh giá khả năng ức chế enzyme 𝛼-
glucosidase của mẫu thử tại nồng độ khảo sát.
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme 𝛼-glucosidase của các mẫu cao thuốc và
chất đối chứng dương acarbose được trình bày trong bảng.
1.2. Cách xác định giá trị IC50
Tiến thành khảo sát hoạt tính ức chế enzyme 𝛼-glucosidase của các mẫu ở
nhiều nồng độ khác nhau từ 10 – 100 𝜇g mL-1 (đối với mẫu là cao chiết) hay 10 –
100 𝜇M (đối với mẫu là chất tinh khiết).
Với những mẫu có hoạt tính ức chế biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng
ta vẽ một đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là phần trăm ức chế
và x là nồng độ chất ức chế).
Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, tính một
cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng tiến
thành vẽ đường thẳng y = ax + b tương tự.
Từ phương trình đường thẳng y = ax + b với 2 hế số a, b đã biết, thế giá trị y
= 50% vào phương trình sẽ tính được giá trị x là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại
đó có khả năng ức chế được 50% enzyme 𝛼-glucosidase, được ký hiệu là IC50.
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó có thể ức chế được 50%
enzyme 𝛼-glucosidase. Đây là chỉ số dùng để xem xét, đánh giá khả năng ức chế
enzyme 𝛼-glucosidase của mẫu khảo sát. Dựa trên định nghĩa có thể hiểu giá trị
IC50 giúp đánh giá khả năng ức chế của mẫu khảo sát là mạnh hay yếu so với mẫu
đối chứng, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.

11
 Bảng 2: Kết quả phân tích mẫu với dung môi nước

Phần trăm ức chế I (%) IC50

Tên
STT 250 100 50 25 10 (𝝁g
mẫu -1 -1 -1 -1 -1 mL-1)
(𝜇g mL ) (𝜇g mL ) (𝜇g mL ) (𝜇g mL ) (𝜇g mL )
1 1N
2 2N * * 98,30±0,44 73,10±0,7 25,43±0,85 17,7
3 3N 7,2±1,3 - - - - >250
4 4N * 95,12±0,92 77,1±1,0 52,7±1,2 31,23±0,62 23,1
5 5N 4,69±1,1 - - - - >250
6 6N * 99,57±0,62 89,17±0,80 62,1±1,1 36,99±0,83 18,3
7 7N * 59,4±1,4 44,8±1,1 36,13±0,52 22,5±0,97 68,7
8 8N 34,2±1,0 8,4±1,1 - - - >250
9 9N 66,7±3,5 10,1±1,1 - - - 205,5
10 10N 78,33±0,93 30,11±0,88 7,7±1,5 - - 165,9
Chất đối
chứng
138.4
dương
acarbose

Bảng 3: Kết quả phân tích mẫu với dung môi ethanol

Tên Phần trăm ức chế I (%) IC50

STT 250 100 50 25 10 (𝜇g
mẫu mL-1)
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
1 3E * 99,32±0,48 82,7±1,0 31,81±0,98 6,79±0,13 33,9
2 5E * 81,2±1,2 67,51±0,80 24,4±1,8 10,0±1,1 37,2
3 7E * 95,5±1,0 77,46±0,95 51,0±1,1 19,5±1,0 24,5
4 8E 82,13±0,74 7,61±0,85 - - - 185,3
10 5 2,5 1,0
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
5 1E 98,85±0,21 74,52±0,91 43,8±1,1 18,7±0,93 3,1
6 4E 67,1±1,5 42,4±1,2 12,1±1,2 - 6,5
7 6E 51,34±0,62 19,22±0,47 3,2±1,21 - 9,7
8 9E 81,39±0,89 39,78±0,99 4,73±0,74 - 6,4
9 10E 98,6±0,45 57,7±2,1 22,5±1,1 5,90±0,37 4,9
1,0 0,5 0,25 0,1
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
10 2E 65,87±3,55 12,13±0,82 - - 0,82
Chất đối
chứng
138.4
dương
acarbose

12
 Bảng 4: Kết quả phân tích mẫu với dung môi ethanol: nước (8:2)

ST Tên Phần trăm ức chế I (%) IC50

250 100 50 25 10 (𝜇g mL-
T mẫu 1
)
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
1 3EN
2 4EN
3 5EN 85,97±0,67 40,7±1,3 15,4±1,3 5,4±1,2 - 130,7
4 7EN * 92,87±0,63 70,3±1,4 45,4±1,0 20,83±0,15 29,6
5 8EN 14,83±0,50 - - - - >250
6
10 5 2,5 1,0
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
7 1EN 86,52±0,95 51,6±1,1 21,28±0,57 7,23±0,82 4,9
8 6EN 98,44±0,3 80,88±0,72 52,55±0,97 19,4±1,75 2,3
9 9EN 77,79±0,95 42,93±1,16 13,83±0,5 1,2±0,21 5,6
1,0 0,5 0,25 0,1
(𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1) (𝜇g mL-1)
10 2EN 79,87±0,83 40,11±0,67 12,01±1,59 - 0,62
Chất đối
chứng
138.4
dương
acarbose
*: I>100% tại nồng độ thử nghiệm
I<1% tại nồng độ thử nghiệm
N: nước 100% EN: etanol: nước (80%:20%) E: etanol 100%
Nhận xét:
- Đa số các mẫu thử nghiệm đều cho kết quả ức chế enzyme 𝛼-glucosidase
cao hơn chất đối chứng dương acarbose. Mẫu số 8 cho khả năng ức chế thấp nhất
(ở cả 3 loại dung môi).
- Các bài thuốc số 1, 2, 6, 9 cho hiệu quả ức chế enzyme 𝛼-glucosidase rất cao
đối với dung môi etanol: nước.
- Các bài thuốc dân gian trên được sử dụng trong dung môi nước. Tuy nhiên,
theo kết quả khảo sát thu được, hoạt tính có xu hướng cao hơn khi dùng dung môi
etanol hoặc hệ etanol: nước (8:2). Vì vậy, cần cân nhắc trong việc sử dụng dung
môi chưng cất nếu quy trình sản xuất được thực hiện trong công nghiệp.
2. Định tính thành phần hóa học của cao chiết
Từ ba bảng 2, 3, 4, chúng tôi đã lấy 2 mẫu cao với giá trị IC50 thấp nhất (2E,
2EN) để định tính thành phần hóa học trong cao.
Hình 1: Hình ảnh kết quả định tính thành phần hóa học của cao 2E

13
 Hình 2: Hình ảnh kết quả định tính thành phần hóa học của cao 2EN

Bảng 5: Kết quả định tính thành phần hóa học của mẫu cao

Mẫu Alkaloid Flavonoid Saponin Steroid Triterpene Polyphenol

2E - + + - - +
2EN + + +++ + - +++

Với các hợp chất là “ + ” : Mức độ màu yếu

flavonoid, triterpene “ ++ ”: Mức độ màu trung bình
và steroid “ +++ ”: Mức độ màu cao
Với hợp chất “ + ” : Xuất hiện tủa ít
alkaloid “ ++ ”: Xuất hiện tủa trung bình
“ +++ ”: Xuất hiện tủa nhiều
Với hợp chất “ + ” : Lượng bọt cao 1 – 2 cm
saponin “ ++ ”: Lượng bọt cao từ 2 – 3 cm
“ +++ ”: Lượng bọt cao >3cm
“ - ” : không có sự xuất hiện của hợp chất này
Nhận xét:
- Cao 2E chứa chủ yếu flavonoid, saponin và polyphenol
- Cao 2EN chứa chủ yếu là alkaloid, flavonoid, saponin, steroid và
polyphenol.

14
 Các hợp chất polyphenol là chất chống oxy hóa có tác dụng kháng viêm, sát
trùng, chống lão hóa và chống oxy hóa. Những nghiên cứu đã công bố cho thấy
polyphenol giúp cải thiện chức năng của tế bào màng trong, đây là lớp tế bào nằm
bên trong các xoang (khoang) của cơ thể, ví dụ như lớp tế bào bên trong thành
mạch máu, giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch. Polyphenol không những giúp ức
chế tiểu cầu bất thường (các tế bào này ngưng kết lại gây đột quỵ) mà còn chống
viêm và giảm mỡ máu.
Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học: ngăn chặn quá trình
oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác
thường, khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất
xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng
bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái hóa
gan, tổn thương do bức xạ, flavonoid làm bền thành mạch, được dung trong các
trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn
tuần hoàn võng mạc, flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn
gan, bảo vệ chức năng gan.

15
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong phạm vi đề tài này chúng tôi đã:
 Chọn 10 bài thuốc dân gian đang được sử dụng phổ biến hiện nay, điều chế
cao trên 3 hệ dung môi khác nhau: etanol, nước, etanol: nước (8:2).
 Khảo sát khả năng ức chế enzyme 𝛼-glucosidase trên các mẫu cao đã điều
chế được. Kết quả cho thấy trong thực tế có 1 số bài thuốc cho hiệu quả ức chế
enzyme 𝛼-glucosidase khá thấp trên tất cả các hệ dung môi đã khảo sát (bài thuốc
số 8) và cần phải xem xét lại tiềm năng điều trị bệnh.
Bài thuốc số 2 (với các thành phần Sinh đại, Hoài sơn, Phục linh, Trạch tả,
Nữ trinh tử, Bạch thược, Thục địa, Sơn thù du, Đan bì, Cẩu kỷ tử, Đồng tật lê)
cho hiệu quả tốt nhất trong tất cả các bài thuốc đã được khảo sát, và hệ dung môi
tốt nhất là etanol: nước. Khả năng ức chế enzyme 𝛼-glucosidase cao gấp 86 lần
chất đối chứng dương acarbose.
 Tiến hành định tính thành phần hóa học của bài thuốc số 3 thấy rằng hợp
chất chiết được trong cao 2E chứa chủ yếu flavonoid, saponin và polyphenol. Hợp
chất chiết được trong cao 2EN chứa chủ yếu là alkaloid, flavonoid, saponin,
steroid và polyphenol.
Kiến nghị:
- Với kết quả khảo sát như trên, chúng tôi đề nghị nên phổ biến rộng rãi hơn
bài thuốc dân gian số 2 vì hiệu quả hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường cao. Không
nên sử dụng bài thuốc số 8 vì gần như không giúp hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo
đường.
- Thực tế dân gian sử dụng nước để trích nóng các chất có trong các vị thuốc.
Tuy nhiên, kết quả cho thấy, nước chưa phải là dung môi tối ưu. Trong quy mô
công nghiệp, nên sử dụng hệ dung môi etanol: nước (8:2) để trích kiệt các hợp
chất có hoạt tính trong cao.
- Với lượng cao thuốc sắc ra trên 1 thang là rất lớn, việc đóng thành viên
nang hoặc viên nén sẽ gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi kiến nghị sản xuất
bột hòa tan để làm sản phẩm công nghiệp. Việc điều chế cao thành bột hòa tan sẽ
giúp người bệnh dễ sử dụng và đỡ mất thời gian đun nấu hơn.
- Do thời gian thực hiện đề tài còn nhiều hạn chế, chúng tôi chưa thực hiện
việc tối ưu hóa các thành phần của thang. Vì vậy kiến nghị rằng thực hiện khảo
sát thêm để tối ưu hóa thành phần của thang thuốc số 3 sao cho mang lại hiệu quả
điều trị tốt nhất.

16
 PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Danh mục các hóa chất/dụng cụ sử dụng để định tính dược liệu
Hóa chất
- DD Folin – Ciocalteu
- DD Dragendoff
- DD Mayer
- DD Bouchardat
- DD FeCl3 100%
- DD Pb(CH3COO)2 100%
- DD HCl 1%
- DD Na2CO3 1M
- DD NH3 10%
- DD NaOH 1M
- HCHO
- H2SO4
- HCl
- CHCl3
- Mg (bột)
- CH3COOH
- C2H5OH
Dụng cụ
- Ống nghiệm
- Kẹp ống nghiệm
- Giá ống nghiệm
- Đèn cồn
- Becher
- Paster pipet
- Phễu lọc, giấy lọc
- Dụng cụ khác: hủ bi, ống vi quản…
Phụ lục 2: Chuẩn bị hóa chất thử hoạt tính enzyme 𝛼-glucosidase
 Dung dịch đệm phosphate pH = 7,0 (0.01M): lấy 20 mL dung dịch
Na2HPO4 0.2M và 12 mL dung dịch NaH2PO4 0.5M vào becher 1000 mL. Thêm
nước cất 2 lần và chỉnh đệm đến pH = 7,0, sau đó tiến hành định mức bằng fiol
đến 1000 mL.
 Dung dịch nền 𝜌NP-G 1.5mM: cân chính xác khoảng 9.13 mg chất nền
𝜌NP-G, hòa tan trong dung dịch đệm phosphate, định mức bằng fiol 20 ml. Bình
đựng dung dịch sau đó được che kín bằng giấy bạc để tránh ánh sáng mặt trời.
 Dung dịch 0.1 U mL-1: cân khoảng 0.5 mg enzyme 𝛼-glucosidase, hòa tan
trong dung dịch đệm phosphate bằng fiol 5 mL, thu được dung dịch gốc. Dung
17
dịch enzyme làm việc được pha loãng từ dung dịch enzyme gốc với dung dịch
đệm phosphate và giữ mát để đảm bảo sự ổn định của enzyme trong ngày làm
việc.
 Dung dịch Na2CO3 0.1M: cân khoảng 10.62 g muối Na2CO3 khan, hòa tan
trong nước cất 1 lần và định mức bằng fiol đến 1000 mL.
 Mẫu thử: được pha trong dung dịch đệm phosphate ở nồng độ 500 𝜇g mL-
1
(đối với mẫu thử là cao chiết) và 500 𝜇M (đối với mẫu thử là chất tinh khiết).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. https://amp.thaythuoccuaban.com/thuoc_chua_benh_viem_dau/Baitham
khao/dong-y-tri-dai-thao-
duong.html?fbclid=IwAR2nEFFF3f5Kgy5OxXBt_OaApIX119UWTkQiqY-
XUkpmgxVLXQ7Vp2lVmjg
2. https://m.suckhoedoisong.vn/bai-thuoc-chua-benh-dai-thao-duong-
n72368.html
3. http://m.tapchidongy.vn/tieu-duong/nhung-bai-thuoc-nam-chua-benh-
dai-thao-duong-hieu-qua-9571990.html/
4. http://m.suckhoegiadinh.com.vn/thuoc-va-suc-khoe/bai-thuoc-hay-tu-
thien-hoa-phan-tri-tieu-duong-17120/
5. https://nslide.com/bai-viet/bai-thuoc-chua-benh-dai-thao-
duong.hhor0q.htmlhttps://www.google.com/amp/s/amp.vnexpress.net/suc-
khoe/thao-duoc-phong-chua-tieu-duong-2259958.html

18