Accession number (GenBank):

GenBank): Bir dizi

GenBank’a kaydedildiği zaman bu kayıt için
verilen yada kayda özel kimlik numarasıdır.
Bir büyük harf ve ardından gelen 5 rakam
veya 2 büyük harf ve 6 rakamdan oluşur.
 Accession number (RefSeq):
efSeq): Bütün bir
RefSeq dizisine atanmış kimlik numarasıdır.
Sırasıyla iki büyük harf, bir alt çizgi (_) ve 6
rakamdan oluşur (NT_123456).
* NT_123456 birleştirilmiş kontigler
*NM_123456 mRNA’lar (mRNA’dan
oluşturulmuş cDNA’lar)
cDNA’lar)
* NP_123456 proteinler
* NC_123456 kromozomlar
 Bit score:
score: Kullanılan skorlama sisteminin
istatistiksel özelliklerinin hesaba katılmasıyla
ham karşılaştırma skoru S’ten türetilmiş S
değeridir. Farklı karşılaştırmalar arasında
ilişki kurmak için kullanılabilirler.
 BLAST: (B
(Basic Local Alignment Search Toolool):
):
Aynı yada farklı organizmalar arasında
nukleotid yada protein dizisi karşılaştırılması
ve benzer bölgelerin araştırılması için
kullanılan yüksek hızda bir bilgisayar
programı.
 Blosum (Block Substitution Matrix
Matrix):
):
Proteinlerin karşılaştırılması ile elde edilen
blokların değişim frekansının
gözlemlenmesinden türetilmiş değerlerden
oluşan bir değişim matrisidir. Her matris özel
bir evrimsel uzaklığa dayanır.
CDS: Bir nukleotid dizisinin kodonları
oluşturan bölgesi yada kodlayan dizi.
Conserved Sequence
Sequence:: Bir DNA molekülünde
(bir proteindeki Aa dizisinde) evrim
süresince değişmeden kalmış olan baz dizisi.
Contig: Bir kromozomun üst üste çakışma
Contig:
gösteren, klonlanmış farklı DNA parçaları
grubu.
 Domain: Bir proteinin bağımsız olarak
katlanabildiği ve çalışılabildiği kabul edilen
parçası.
E value (Expectation value
value):
): Beklenti değeri,
Veritabanı taramasında şans eseri çıkması
beklenen, S değerine denk yada daha büyük
skorlara sahip benzer dizilerin sayısı. Düşük E
değeri büyük skora işaret eder.
EST (Expressed
(Expressed Sequence TagTag):
): Bir cDNA
molekülünün, bir genin kimliği olarak
kullanılabilecek kısa bir parçası. Genlerin
konumlanmasından ve haritalanmasında
kullanılır.
Homologue: Dizisi büyük oranda başka bir
Homologue:
gene benzeyen gen. Bu genlerin ortak bir
ataya sahip olduğu ve benzer fonksiyonlar
taşıdığı düşünülür.
Motif: Protein dizisi içinde kısa, korunmuş
bir bölge. Motifler genellikle domainlerin
yüksek derecede korunmuş bölgeleridir.
 Orthologous: Ortak bir atadan geldikleri
Orthologous:
düşünülen, benzer bir fonksiyonu olabilen,
farklı türlere ait homolog diziler.
 Paralogous: Aynı tür içinde, gen
Paralogous:
dupliklasyonu sonucu oluşmuş homolog
diziler.
Query: Veritabanındaki tüm dizilerin
Query:
karşılaştırılacağı giriş dizisi.
 Farklı Dizi Formatları
A. Gen Bank DNA Dizi Formatı: Girilen her
dizinin tanımlayıcı bilgileri verilir.
Bu bilgiler her satırda ilk bilgi olarak, her biri
bir belirleyici ile birlikte gruplara ayrılmış
şekilde yazılır.
 Örneğin; referans için RF gibi,
LOCUS lokusun ismi
DEFINITION girişin tanımı
ACCESSION orijinal kaynağın accession
nımarası
KEYWORDS bu girişin karşı
referanslarının yapılabilmesi için anahtar
kelimeler
SOURCE DNA’nın elde edildiği organizma
Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı Veri
Kütüphanesi Formatı (EMBL)
ID veritabanındaki dizi için kimlik
numarası
AC dizinin başlangıcını gösteren accession
nımber
DT girişin ve modifikasyonların tarihi
KW anahtar kelimeler
OS, OC kaynak organizma
 İşlevsel Genomik Nedir?
• İşlevsel Genomik, yapısal genomik tarafından sağlanan bileşenlerin
ve bilginin kullanımı ile gen işlevinin değerlendirilmesinde, deneysel
yaklaşımların (genom veya sistem boyunca) geliştirilmesini ve
uygulanmasını içermektedir.

• Geniş ölçekte uygulanan deneysel teknolojilerin, elde edilen

sonuçlarla istatistiksel veya bilgisayar analizleriyle birleştirilmesiyle
tanımlanabilir.

• Klasik bir gen anlatımı araştırmasında, in vivo’da bir organizmanın

gelişimiyle birlikte bir genin anlatımının nasıl değişeceği
araştırılırken, modern işlevsel genomik yaklaşımı, organizmanın
gelişimiyle birlikte sayıca 1,000’den 10,000’e kadar değişen genin
anlatımının nasıl değiştiğini incelemektedir.
 İşlevsel Genomik
• Amaç: Genomik bilgiye biyolojik bir anlam
kazandırma

• Çeşitli sistematik yaklaşımlar, bir genomdaki genlerin

bir çoğu için sorulan basit sorulara cevaplar
oluşturabilirler
– Gen anlatımı ne zaman gerçekleştirilir?
– Gen ürününün yerleşimi nerede olur?
– Bir gen hangi genlerle etkileşime girer?
– Bir gende mutasyon yapılırsa hangi fenotip ile
sonuçlanır?
 Klasik dizi analizi

İşlevsel Genomik’in Üç Merkezi

Uygulaması:

- Genome-wide knock-out
- Gen Anlatımı
- Genetik Haritalama Çalışmaları
 Dizileme İçin Gerekli Olan
Teknikler
• Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara
ayırmada
• Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık bazlık diziler
halinde çoğaltma
• Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması.
– fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi
kullanılarak.
• Dizilerin Birleştirilmesi – parçaların bir araya
getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama.
 Genom Dizilemesi
- Büyük genomlar robotik ve otomasyon
gerektirir.
• Ortak dizilerin birleştirilmesi
- ideal olan, kromozom başına bir ortak dizi
- standart, her bir nükleotidin 10 kez
okunması
- bilgisayar kullanımı ile birleştirme
• İki temel dizileme stratejisi
- Düzenli klon dizilemesi
* fiziksel bir haritayı oluşturan klonlardan
yapılan birleştirme
* pozisyonların bilinmesinden dolayı
tekrarlı diziler için uygun yerleştirilme
• Tüm genom shot-gun dizilemesi

- rastgele dizilenen klonların birleştirilmesi

- küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun

- boşluklar primer yürüme ile doldurulur

• WGS: Whole Genome Shotgun sequencing
• 1. Klon Kitaplığının Oluşturulması
• 2. Her bir Klonun iki ucunun dizilenmesi
• 3. Çakışan okumaların kontigler içine birleştirilmesi
• 4. Kontiglerin super-kontigler içine birleştirilmesi
• 5. Super kontiglerin genom içine dahil edilmesi
• 6. Genomun Tamamlanması
DNA Dizilenmesinde Otomasyon
Dzi analiz cihazı: Dizi analiz cihazı:
MegaBACE ABI 3700
Otomatik jel
okuyucu
Kapiler elektroforez cihazı
Klon Temelli Fiziksel Haritalama
 DNA Dizilemesi
• Çoğunlukla dideoksi metodu (zincir
sonlandırma metodu) ile yapılır.
• Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin
birçok kopyası aşağıdaki bileşikler ile
karıştırılır.
– Primer
• DNA tek zincirine bağlanan kısa dizi (~20bp)
– Normal (deoksi) nükleotidler
• dNTP – dATP, dGTP, dCTP, dGTP
– dideoksi nükleotidler
• ddNTP – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddGTP
– DNA polimeraz I
• Enzim
 DNA
Dizilemesinde
Zincir
Sonlandırma
Metodu

Voet Fig. 3-23

Sequencing 2
Sequencing 3
Bir Klonun Okunması
• 2,4,6,10, 12 ve 40 kb’lik
büyüklüklerdeki
parçalardan oluşan
kitaplıkların elde edilmesi

• Her bir ayrı klon, her bir

kitaplıktan seçilir.
 Bir Klonun Okunması
>clone47_f
AAGCAATTTCATAAGAATAACTTTGAGCACAAGCCCGTAAACCACCAATAAAAGAATACT
TACCACCACTAAAAATTCCAGATAGCATAATAAAATACGCAGAAACCCCCATTAAGCAAA
ATAAAAAAACACCAGAATAATCAAAAGACATAAAAACAAAAAAATAAGGCAAAGTAAACC
AAAAAAAAATCATCAAAATAAAACTACAAACAGGCATCAATAAAAAAGATAGTCATGAAGA
AAAATAAAAAAAAAGCTGTTCTTTCTTTAATAATTTAAGACCATCAAACAACGCCTGAAAA
ATACCAGAGTAACCAACTTTATTGGGACCAATACGACACTGAGTGCCACCCAAAAAATGA
CGTTCTATTAAAGTTAAAAAAGCAATGGCTTGTAAAATAAAAATAATTATAAGAAAAATAC
CAATATAATAAAAAATAAACAAAGTAAAATCCAAAGAATTTACnnTTCTTTATTCTAATATAA
ACTAATACTTTAAAAAATAGAGACAAGTTTCCTTACCTCTACCATACTACAACTTACGCCC
CTATAGGCCATTGACGGATGGTTTGTACCACTTTGTTTATTAAATTCATTAATATATAAAAA
AAAAATTACTTTCTTTTCCAATTTCAAAAAAAAATAAAAAAATA
>clone47_r
TGATTGGTGTTTGTTTTCTTATTGTTAATTTTTTTCGTGCTAAATTACATAATTTTAATTGGT
ATCATACTCAAGCTTATGATATGTCTATTGACTATTGACGGTTCTTAGAATGAATGTGAGG
TATTATATTTTGTTTATTATATGTTTGAGGTTCTTAATTTTTAATTGTAAGATATCTGTTTTA
CTTCATTATTTTTTATAGCTTATTTTTAATGATGATTTTTTTAATTATTTCTTCTTTTTTTTTTT
TGGTTTTTTTATTTTTTGTACGTTCAATATAATTATGAATAATTATTAGTAATTATTTAAAAA
TAATTACTAAATTAAATACAATTCTCAGAGTATTATAACATTAAAGTTATAATACTCTGTTA
GAATTGTATTTATTTAATAGACCAACTACTTAAATTACTAACTAAAGATTATTTTTTTACTAT
AGTGTATATATTATAnAGTTATTATATTTGATTTGCAATCTTAAGATTTTTATACACTATGGC
TTTTTAGTATAATAAGTATATTCGTTTTAAGCGCGGCTGGTTTTAAGCTATTAGAATTTTA
 Dizilerin Birleştirilmesi
• Direkt dizi okuma tekniği, 10kb.’a kadar
olan bir diziyi okuyabilir.

• Uzun dizi bilgisi elde edebilmek için, kısa

okumaların birbirleriyle birleştirilmelerinde
bilgisayara gereksinim duyulur.
Kontiklerin Birleştirilmesi

• Okumaların ucunda
dizilerin üst üste
çakışması
belirlendiğinde, iki
okuma tek bir dizi
şeklinde birleştirilebilir
Superkontiklerin Oluşturulması

“ scaffolds” olarak da tanımlanmaktadır.

BCM-
HGSC
 Büyük Genomlar
• İnsan Genomu, daha büyüktür ve
süperkontiklerin bir şekilde birleştirilmesi
gerekir.

• Bu da genetik haritalama ile yapılmaktadır.

 Birleştirmeler Sonucunda
Genom Üzerinde Yerleştirme
• Bir dizi etiketi tüm genom
boyunca tek olan kısa bir
dizidir .
• Genetik Harita,bir çok dizi
etiketini ve onların
yerleşimini içermektedir.
• Böylelikle, etiketlere göre
süper kontiklerin genom
içinde sıraya dizilmeleri
sağlanır.
 Primer Yürüme: Genom
Dizilemesinin
Sonlandırılmasında Bir Yol
• Eğer bir baz üç okuma ile belirlendiyse
kesin olarak tanımlanabilmektedir. Kesin
olmayan pozisyonlar da mevcuttur.
• There are gaps in the Süperkontiklerde ve
süperkontikler arasında boşluklar vardır.
• Primer Yürüme bu bölgelerin daha ileri
dizilemesinin yapılmasında kullanılabilir.
 Primer Walking

Seq 1

primer1 Seq 2

primer2 …………

Time consuming
 Yeni Dizileme Metotları

1. MALDI-TOF Mass Spektrometri ile Dizileme

2. Hibridizasyon ile Dizileme

3. Pirodizileme
4. Atomic-Force Mikroskopisi

5. Tek Molekül Fluoresans Mikroskopisi

6. Nanopor Dizileme
MALDI-TOF Mass Spektrometrisi Kullanılarak Dizileme

MW spectrum of 33-mer 5’-ACT AAT GGC AGT TCA

TTG CAT GAA TTT TAA AAG-3’
 Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi
Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını
(ör: 8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini
İçerir.
 Pirodizilemenin Temeli

Basamak 1

Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA kalıbına, hibridize edilir
ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz, lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin 5´
fosfosülfat (APS) ve lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır.

Basamak 2
İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dNTP) reaksiyona ilave edilir. DNA
polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA zincire katılmalarını kataliz eder.
Yapıya katılan dNTP ile orantılı olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır.
Basamak 3
ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında kantitatif olarak PPi’yi ATP’ye
dönüştürür. Bu ATP molekülü, lusiferaz temelli reaksiyon lusiferinin oksilusiferine
dönüşümünü sağlarken, ATP miktarı ile orantılı olarak görünür ışık oluşumu
gerçekleşir. Lusiferaz katalizli reaksiyon sonucunda üretilen ışık CCD kamera
(charge coupled device) ile belirlenir bir pirogramda pikler halinde görüntülenebilir.
Her bir ışık sinyali yapıya katılan nükleotid sayısı ile orantılıdır.
Basamak 4
Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya girmeyen dNTPleri ve
fazla ATP’yi parçalar. Parçalama bittiğinde, diğer dNTP eklenir.

Basamak 5
Her bir işlem için dNTPlerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal deoksiadenozin
trifosfat (dATP) DNA polimeraz tarafından etkin bir şekilde kullanılmasına rağmen,
lusiferaz tarafından tanınmadığından deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (dATPaS)
kullanılmaktadır. Süreç devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi
pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir.
 Pirodizilemenin Özeti
Pirodizileme, DNA’nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir, DNA dizisi sentezi sırasında
açığa çıkan fotonların oluşturduğu sinyallerin şiddetine göre belirlenir .
Zipper-sequencing of DNA
 Polinükleotidlerin Nanopor Dizilemesi
Bu yöntemde, tek zincirli polinükleotidlerin ince bir filmdeki nanopor
boyunca ilerlemelerini sağlayan elektrik alan sonucu oluşan iyonik
akım değişimi görüntülenmektedir.
DNA’nın bir yön değiştiren alanda dizilemesi

DNA

E
2nm


E  E cos( wt )iˆ  E sin( wt ) ˆ
j
DNA’nın Zaman ile Translokasyonu
Bir Dizileme Düzeneği
 Sonuçlar
- Geleneksel Sanger metodu yavaş, pahalı, ve kesin değildir. İnsan
Genom Projesindeki dizileme 15 yıl almış ve 3 trilyon US dolarına
mal olmuştur.

- Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir.

100 milyon bazın dizilemesi yaklaşık bir gün almaktadır, yüksek
oranda kesinlik, örnek serilerinin çok zamanlı incelenmeleri sonucunda
sağlanmaktadır.