$ REPUBLICA FEDERATIVADOBRASIL \Mirétério da inci, do Comérco edo Turismo Tnstixto Nacional da Propriedade Industral Loe an PL 9700778-1 A (22) Data de Depésito: 27/01/1997 (43) Data de Pubticagao: 06/10/98 (RPI 1450) (61) int. CF ABIK 31/40 ABIK 311445, (64) Titulo: METODOS DE INIBIGAO DE TUMORES DO. COLON (80) Prioridade Unionista: 1stato9e ce seosts0.s 290171008, Us o10772 (71) Depositante(s); EX Lily And Company (US) (72) Inventor(es): Meria Luisa Brandi,Francesco Toneli (74) Procurador: Dannemann, Stemsem,Biglr& Ipanema Moria Reaumet Esa de vena: WETEDOS (7) im de DE INBIGAO DE oR?10 15 20 Relatério Descritivo da Patente de Invenc&éo para "METODOS DE INIBIGAO DE TUMORES DO COLON". Fundamentos da Invenc3o Cancer do célon, que inclui adenocarcinomas re- tal e colo-retal, adenocarcinoma primério ou metastatico e similares, constitui hoje uma importante preocupacéo na drea de satide em termos de incidéncia da doenga. Estima- se que um em vinte e cinco americanos desenvolveré alguma forma de cancer do célon durante o curso de seu tempo de vida. Sugarbaker, P. H. e outros, in Cancer, DeVita, V. T., e@ outros (gds.), Lippincott Publ. Philadelphia, pp. 755-884 (1985). Em termos de tratamento, tem-se usado amplamente cirurgia com resultados bons, ambiguos ou abaixo de favo- raveis. Particularmente entre pacientes de c&ncer do cé- lon com doenga localmente avancada ou metastatica, o prognéstico é extremamente desfavorével com alta taxa de morbidez e mortalidade. Terapias com drogas tém sido tentadas com resul- tados abaixo de favoréveis. 0 composto antineopléstico 5- fluoruracil (5-FU) tem sido a droga importante na escolha pare tratamento de cancer do célon e seu uso provou ser apenas marginalmente eficaz. 5-FU poderé reduzir tempora-10 as 20 25 riamente o tamanho de tumores do Gloi. pouca evidéncia em mostrar que og tempos de sobrevida de pacientes tenham se prolongado substancialmente ou que "curas" sejam obtidas (com base em perfodos de cinco anos de remiss&0). Quimioterapia com 5-FU tem sido utilizada em pacientes com metéstases no figado, mas aperfetcoamen- to temporério ¢ observado em apenas 25 por cento ou menos desses casos, e a sobrevida total nado é significativa~ mente afetada. LaMont, J. T. e Isselbacher, K., in “principios de Medicina Interna de Harrison” (Harrison's Principles of Internal Medicine) (10a. ed.) McGraw-Hill, Nova Torque, p. 1764 (1983). Apesar da eficdécia marginal de 5-FU, nenhuma outra terapia com drogas ou combina¢do de terapias tem mostrado de modo convincente ser mais eficaz. Sugarbaker P. H. e outros, supra. Woolley, P. V. e@ outros, New Eng. J. Med., 312:1465 (1985). Terapias com drogas tém também sido avaliadas com relac&o a tratamento de cancer humano, por exemplo linhagens xenoenxertadas de cancer do célon humano, em que tumores humancs s8o heterotransplentados em série em camundongos imunodeficientes, chamados "nus", e esses ca- mundongos s80 ent&o testados em relagéo a sua sensibili- dade a uma droga especifica. Giovanella, B. C. e outros, Cancer 5(7):1146 (1983). Os dados obtidos nesses estudos sustentam fortemente a validade de tumores humanos hete- rotransplantados, incluindo tumores do célon, em mamife- xos imunodeficientes, tais como camundongos “nus", como modelo de prognéstico para testar 2 eficdcia de agentes10 15 20 25 anticancer. © sal de sédio de um alcaldéide de ocorréncia na- tural, camptotecina, foi utilizado numa breve experiéncia clinica para avaliar efeitos téxicos em pacientes com canceres incurdéveis. Gottlieb, G. A. e outros, Cancer Chemotherapy.Rep. 54:461 (1970). Poucas conclusdes pode- riam ser tiradas desse estudo, embora a sobrevida média desses pacientes que respondiam ao tratamento aumentou de cerca de dois meses a cerca de 3,5+ meses. Derivados ou andlogos da camptotecine tém sido sintetizados e empregados como agentes antileucémicos em camundongos (ver por exemplo Wani, M. C. e outros, J. Med. Chem. 23:544, 1980; Wani M. C. e outros,., J. Med. Chem. 30:1744, (1987); e.Wani M. C. e outros,., J. Med. Chem. 30:2317 (1987). In Pats. U.S. Nos. 4.473.692 e 4.545.880, Miya~ seka e outros, s&o apresentados derivados da camptotecine 10-substituida e processo para sua preparacio. Os deriva- dos da camptotecina 10-substituida s#o referidos como possuindo aitividade antitumor com reduzida ou ligeira toxicidade em comparag&o com o composto de origem cempto- tecina. Miyasaka e outros nd&o apresentam tumores-alvo es- pecificos nem indicam que nivel de toxicidade reduzida ou ligeira é atingido usando seus compostos de camptotecina 10-substituida. Recentemente, a enzima topoisomerase I humana foi examinada em vérios cAnceres humanos, por exemplo leucemia, linfoma. Potmesil M. e outros, Cancer Res.20 15 20 25 4 *Cothdel be! cond) 537 (1988). A topoisomerase I hurtina! sendo uma: proteina mcnomérica com peso molecular aparen- te de 100,000 daltons. A fungdo semelhante a articula- g&o da enzima tem implicado em varias transagSes de ADN (xeplicagao, transcrig&o e recombinag&o). Topoisomerase I de mamifero purificada relaxa ADN positivamente superen- rolado, bem como ADN negativamente superenrolado em um mecanismo que envolve o rompimento transiente de um dos dois filamentos de ADN e a formac&o de um complexo cova- lente topoisomerase I-ADN. Nesse complexo, a enzima liga- se covalentemente & extremidade 3'-fosforila da cadeia principal de ADN rompida. Recentemente, descreveu-se que os niveis da en- zima topoisomerase I eram em média maiores em tecido can- ceroso, por exemplo em espécimes cirirgicos de carcinoma colo-retal, em comparagéo com o nivel de enzima em mucosa normal (Hsiang, Y. -H. e outros, Proc Ann Meet of the Amer. Assoc. Cancer Res. 29:172 (1988) Abstract. Embora tenha sido estabelecido que a topoisomerase I poderia ser considerada um alvo alternativo na quimioterapia dessa doenga (carcinoma colo-retal), nenhuma descrig&o ou su- gest&o foi de modo algum feita quanto a qualquer droga especifica que interage com topoisomerase I. Em vista de taxas de sobrevida muito pobres de 5 anos (aproximadamente 50 por cento ou menos) para paci- entes que sofrem tratamento convencional de cancer do cé- lon, por exemplo resseg&o cirtrgica ou quimioterapia com 5-FU, seria extremamente itil descobrir uma nova maneira10 as 20 25 utilizando drogas ou compostos, em seguida a cirurgia, por exemplo que ajude a estabilizar a diagnose e remova a mass@ cancerosa. 0 tratamento com drogas poderia também ser valioso para pacientes com doenca avangada que sofrev metaéstase ou se espalhou a varios érgdos, de modo que ci- rurgia ndo 6 exeqiivel para remover todos os tecidos can- cerosos. SUMARIO DA _INVENCKO A inveng&o proporciona métodos para inibir cén- cer do célon em mamiferos mediante administrag#o aos mes- mos com necessidade deste tratamento de uma quantidade eficaz de um composto de férmula I. ea) onde R' e R® sdo independentemente hidrogénio, ° ° fl -CH3, -C-(alquila de C1-Cg) ou -c-Ar, onde Ar é fenila opcionalmente substituida; R? @ selecionado do grupo que consiste de pirro- 1idino, hexametilenoimino e piperidino; e sais e solvatos farmaceuticamente aceitéveis do composto acima. DESCRICAO DETALHADA DA INVENCKO10 15 20 25 ii A presente inveng&o refereive 4 cortacatdedo! que um seleto grupo de 2-fenil-3-aroilbenzotiofenos (ben- zotiofenos), aqueles de férmula I, s&o Uteis para inibir c&ncer do célon. 0s métodos de uso proporcionados por esta inven- go so praticados administrando a um humano com necessi- dade deste tratamento de uma dose de um composto de f6r- mula I ou um sal ou sclvato farmaceuticamente aceitaével gesse composto, o qual é eficaz para inibir cancer do cé- ion. © termo "inibir" inclui seu significado geralmente aceito, que includ proibir, prevenir, restringiz e redu- gir, parar ou reverter progress&o, gravidade ou sintoma ou efeito resultante. Raloxifene, um composto desta inveng&o em que ele é 0 sal de cloridreto de um composto de fézmula 1, Rt e R? s80 hidrogénio e R” 6 1-piperidinila, é uma molécula reguladora nuclear. Mostrou~se que raloxifene se liga ao receptor de estrogénio e pensava-se originalmente ser uma molécula cuja func%o e farmacologia fossem aquelas de um antiestrogénio em que se bloqueava a capacidade do estro- génio ativer canceres do tecido uterino e de mama depen- dentes de estrog&nio. Na verdade, raloxifene bloqueia de fato a agio de estrogénio em algumas células, entretanto noutros tipos de células raloxifene ativa os mesmos genes como ocorre com estrogénio e exibe a mesma farmacologia, por exemplo osteoporose, hiperlipidemia. Como resultado, raloxifene tem sido referido como um antiestrogénio com propriedades mistas agonistas-antagonistas. O perfil tni-10 15 20 25 co que raloxifene exibe e difere deifiede ‘do! eatredéhic acredita-se agora ser devido @ ativas8o e/ou supressto tnicas de vérias fungdes de genes através do complexo ra- loxitene-receptor de estrogénic em oposigéo & ativaco e/ou supressdo de genes através do complexo estrogénio- receptor de estrogénio. Portanto, embora raloxifene e es- trogénio utilizem e compitam pelo mesmo receptor, o re- sultado farmacolégico de regula¢do genética dos dois nfo é facilmente prevista e ¢ tnico em cada um. De modo geral, o composto é formulado com exci- pientes, diluentes ou veiculos comuns e conformados em comprimidos ou formulados como elixires ou solugées para administragéo oral conveniente, ov administrados pelas vias intramuscular ou intravenosa. Os compostos podem ser administrados transdermicamente e poderéo ser formulados como formas de dosagen de liberaco sustentada e simila- res. Os compostos usados nos métodos da presente in- vengao podem ser produzidcs de acordo com procedimentos estabelecidos, tais como aqueles detalhados nas Pats. Nos. 4.133.814, 4.418.068 e 4.380.635, todas aqui incor- poradas como referéncia, Em geral, o processo parte com um benzofb] tiofeno que possui um grupo 6-hidroxila e um grupo 2-(4-hidroxifenila). 0 composto de partida é prote- gido, acilado e desprotegido para formar os compostos de férmula I. Exemplos da preparagio de tais compostos s&o fornecidos nas patentes U.S. acima discutides. Fenila opcionalmente substituida inclui fenila e fenila substi-10 15 20 25 tuida uma ou duas vezes por alquila” da steht tel. ctx: de Cj-Cg, hidréxi, nitro, cloro, flior ou tri(cloro ov fltor)metile. Os compostos usados nos métodos desta inven¢cao formam dcidos e sais de adic&o de base farmaceuticamente aceitéveis com uma ampla variedade de dcidos e bases or- g@nicos e inorgénicos e incluem os sais fisiologicamente aceitaéveis que s&o fregientemente utilizados em quimice farmacéutica. Tais sais sdo também parte desta invencto. Acidos inorg&nicos tipicos usados para formar tais sais incluen dcidos cloridrico, brom{drico, iodridico, nitri- co, sulfurico, fosférico, hipofosférico e similares. Sais derivados de dcidos organicos, tais como 4cidos aliféti- cos mono e dicarboxilicos, acidos alcanéicos substituidos por fenila, écidos hidroxialcandico e hidroxialcandiéi- cos, Acidos arométicos, dcidos sulf6énicos alifaticos e aromaticos, podergo também ser usados. Tais sais farma- ceuticamente aceitaéveis incluem assim acetato, acetato de fenila, trifluoracetato, acrilato, ascorbato, -benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxi- benzoato, benzoate de metila, o-acetoxibenzoato, naftale- no-2-benzoato, brometo, isobutirato, butirato de fenila, B-hidroxibutirato, butino-1, 4-dioato, hexino-1,4-dioato, caprato, caprilato, cloreto, cinamato, citrato, formiato, fumarato, glicclato, heptanoato, hipurato, lactato, mala- to, maleato, hidroximaleatc, malonato, mandelato, mesila- to, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, ftalato, tereftalato, fosfato, monoidrogenofosfato, diidrogenofos-10 15 20 25 Sa Sptetbohato fato, metafosfato, pirofosfato, proflolate: propionato de fenile, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bissulfato, pirossulfato, sulfito, bissulfito, sulfonate, benzenossulfonato, P- bromofenilsulfonato, clorobenzenossulfonato, etanossulfo- nato, 2-hidroxietancssulfonato, metanossulfonato, nafta- leno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, Pp toluenossulfonato, xilenossulfonato, tartarato e simila- res. Um sal preferido é o sal de cloridreto. Os sais de adi¢&o de acido farmaceuticamente aceitével s8o tipicamente formados pela reag8o de um com- posto de férmula I com uma quantidade equimolar ou em ex- cesso de 4cido. Os reagentes sfo geralmente combinados em um solvente mituc tal como éter dietilico ou benzeno. 0 sal normalmente se precipita da solugio dentro de cerca de uma hora a 10 dias e pode ser isolado por filtrac¢&o ou © solvente pode ser separado através de meio convencio- nal. Bases comumente usadas para formagao de sais in- cluem hidréxido de aménic e hidréxidos de metais alcali- nos © alcalino-terrosos, carbonatos, bem como aminas ali- féticas e aminas primarias, secundérias e terciérias, di- aminas aliféticas. Bases especialmente teis na prepara- so de sais de adigao incluem hidréxido de aménio, carbo- nato de potassio, metilamina, dietilamina, etileno diami- na e cicloexilamina. Os sais farmaceuticamente aceitaéveis possuen ge- ralmente caracteristicas de solubilidade acentuadas em10 45 20 25 10 comparago com as do composto de que Sto.Werivaded ¢ ts+ sim so freqientemente mais adequados para formula¢io como liquidos ou emulstes. Formulacées farmacéuticas podem ser preparadas através de procedimentos conhecidos na técnica. Por exem- plo, os compostos podem ser formulados com excipientes, @iluentes ou veiculos comuns e conformados em comprimi- dos, cdépsulas, suspensédes. pos e similares. Exemplos de excipientes, diluentes e veiculos que s&o adequados para tais formulagées incluem o seguinte: cargas e extensores tais como amido, agticares, manitol e derivados silicicos; agentes de ligac¢&o tais como carboximetilcelulose e ou- tros derivados da celulose, alginatos, gelatina e polivi- nil pirrolidona; agentes de umectag&o tal como glicerol; agentes de desintegrag&o tais como carbonato de calcio e bicarbonato de sédio; agentes para dissolugéo retardada tal como parafina; aceleradores de ressorgio tais como compostos de aménio quaterndrio; agentes de superficie ativa tals como élcool cetilico, monoestearato de glice- rol; veiculos adsorviveis tais como caulim e bentonita; e lubrificantes tais como talco, calcio e estearato de mag- nésio e polietil glicéis sdélidos. Os compostos podem também ser formulados como elixires ou solugées para administracao oral conveniente ou como solugSes apropriadas para administracaéo parente- ral, por exemplo através de vias intramuscular, subcuta- nea ou intravenosa. Adicionalmente, os compostos so per- feitamente adequados para formulag&o como formas de dosa-10 15 20 25 12 gem de liberac&o sustentada e simildtes!, AY Yormuriche? podem ser constituidas de modo a liberar o ingrediente ativo apenas ou preferencialmente numa parte. particular do tzato intestinal, possivelmente por um periodo de tem- po. Os revestimentos, invélucros e matrizes protetoras poderdo ser produzidos, por exemplo, de substancias poli- méricas ou ceras. A dosagem particular de um composto de férmula I requerida para inibir céncer do célon, ou qualguer outro uso aqui apresentado e de acordo com esta invencio, de- penderé da gravidade da condico, via de administracao e fatores correlatos que serdo decididos pelo médico assis- tente. De modo geral, doses didrias aceitas e eficazes seréo de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg/dis, e mais ti- picamente de cerca de 50 a cerca de 200 mg/dia. Tais do- sagens sera administradas a um individu com necessidade deste tratamento de uma a cerca de trés vezes ao dia, ou mais freqlentemente conforme a necessidade para inibir eficazmente cancer do célon. i Prefere-se usualmente administrar um composto de formula I em forma de um sal de adig&o de Acido, como é usual na administrac&o de produtos farmacéuticos que su- portam un grupo bésico, tal como o anel piperidino. # também vantajoso administrar tal composto por via oral. Com tal finalidade as formas de dosagem oral seguintes 880 disponiveis.10 15 12 Nas formulagdes que seguem, “Ingrediente ativo" significa um composto de férmula I. Formulacso 1: Cépsulas de gelatina dura s&o preparadas usando Capsulas de Gelatina © seguinte: Ingrediente Quantidade (mg/cépsula) Ingrediente ativo 0,1 - 1000 Amido, NF 0 - 650 P6 de amido escodvel 0 - 650 Fluido de silicone de 0,35 x 1073 m?/s (350 centistokes) o- 15 Os ingredientes sao combinados, passados através de uma peneira U.S. de malha No. 45 e enchidos em cépsu- Jas de gelatina dura. Exemplos de formulagées especificas para cépsu- las de raloxifene que foram produzidas incluem aqueles apresentados abaixo: Formulagéo 2: Caépsula de Raloxifene Ingrediente Quantidade (mg/cépsula) Raloxifene 1 amido, NP 112 P6 de amido escodvel 225,3 Pluido de silicone de 6,35 x 1073 m@/s (350 centistokes) 1713 Formulacio 3: Caépsula de Raloxitene! Ingrediente Quantidade (mg/cépsula) Raloxifene 5 amido, NF 108 P6 de amido escodvel 225,3 Fluido de silicone de 0,35 x 107? m2/s (350 centistokes) 4,7 Formulacdo 4: Cépsula de Raloxifene Ingrediente Quantidade (mg/cépsula) Raloxifene 10 Amido, NF 103 P6 de amido escodvel 25,3 Fluido de silicone de 0,35 x 107? m/s (350 centistokes) 17 5 Formulaco 5: Cépsula de Raloxifene Ingrediente Quantidade (mg/caépsula) Raloxifene 50 Anido, NF 150 P6 de amido escodvel 397 Fluido de silicone de 0,35 x 107? m@/s (350 centistokes) 3.0 As formulagSes especificas acima poder&o ser al- teradas de acordo com as variacées razoaveis proporciona- das. 10 Uma formulac&o para comprimidos ¢ preparada uti-10 14 lizando os ingredientes abaixo: Pormulacséo 6: Comprimidos Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente ativo 0,1 - 1000 Celulose, microcristalina 0 - 650 Didxido de silicio, defumado 0 - 650 Acido estedrico o- 15 Os componentes s&o combinados e prensados para formar comprimidos. Alternativamente, os comprimidos, cada contendo de 0,1 - 1000 mg dos ingredientes ativos, s&o produzidos como segue: Formulacso 7: Comprimidos Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente ativo 0,1 - 1000 amido 45 Celulose, microcristalina 35 Polivinilpirrolidona 4 (como solug&o a 10% em 4gua) Sédio carboximetil celulose 4,5 Estearato de magnésio 0,5 Talco 1 © ingrediente ativo, amido e celulose séo passa- dos através de uma peneira U.S. de malha No. 45 e mistu- rados totalmente. A solug&o de polivinilpirrolidona é misturada com os pés resultantes que so por conseguinte10 15 20 15 passados através de uma peneira vg ad neiha noid. Os" grnulos ent& produzidos so secados a 50-60°C e passa- dos através de uma peneira U.S. de malha No. 18. 0 sédio carboximetil celulose, estearato de magnésio e talco, an- teriormente passados através de uma peneira U.S. de malha No. 60, s&0 por conseguinte adicionados aos grénulos que, apés mistura, s&o prensados numa maquina de comprimidcs para produzir comprimidos. Suspensdes, contendo cada 0,1 - 1000 mg de medi- camento por 5 mL de dose, s&o produzidas como segue: Formulacso 8: Suspensoes Ingrediente Quantidade (mg/5 m1) Ingrediente ativo 0,1 - 1000 mg Sédio carboximetil celulose 50 mg Xarope 1,25 mg Solucao de écido benz6ico 0,10 mL Aromarizante av. Corante av. Agua purificada, até 5 mL © medicamento é passado através de uma peneira U.S. de malha No. 45 e misturado com o sédio carboximetil celulose e xarope para formar uma pasta lisa. A solugéo de Acido benzéico, aromatizante e corante sé diluidos com um pouco de Agua e adicionados, com agitac&o. Agua suficiente é ent&o adicionada para produzir o volume re- querido. Tumores desméideos sio raros sem tumores metas-10 15 20 16 téticos de origem fibrosa. Correlétos.ctidices “Sugertm” que horménios esteroidais poderao desempenhar um papel na histéria natural desses tumores: observa-se predominante~ mente em pacientes fémeas em idade de procriac&o e a re~ gresséo desses tumores tem sido associada 4 menopausa ou a terapia antiestrogénio. © objetivo deste trabalho é identificar recepto- res de estrogénio em células primérias de tumores desméi- deos e avaliar o efeito de um composto de férmula I sobre células desméideas em cultura primaria. Porque as vezes tumores desméideos se desenvol- vem em pacientes com Polipése Adenomatosa Familiar (PAF), que pode degenerar em c&ncer do célon ou retal, testa-se © efeito inibitério do Composto Ta no crescimento celular de uma linhagem de células de adenocarcinoma, (HCT8), e em fibroblastos de espécimes biépticos de cancer do cé- lon. © Composto Ta & um composto de férmula I onde R* & pirrolidino e rR! e R? sao hidrogénio. Estudos de ligacg&o s&o realizados usando células intactas. Células desméideas s8o colocadas em placas de 6 pogos em meio de crescimento (F12 de Ham modificado por meio de Coon suplementado com FCS a 10%). Apés 24 horas, © meio de crescimento é substituido por meio em estado estaciondério sem vermelho de fenol e as células s&o man- tidas em inanicao por 24 horas. Em seguida as células sto dincubadas por uma hora com 1 ml de meio sem vermelho de fenol contendo HEPES 25 mM e EtOH a 0,5% (tampiio de liga-10 15 20 17 iQ G80) e concentragées crescentes (0,05-20 ii) de” (*k)i7pk2 com ou sem excesso de 500 vezes de 17BE2 n&o-marcado e Composto Ia. Apés incubag&o, as células s8o lavades duas vezes com 800 ul de tampio de ligagdo e lisadas com NaOH 1.N a 70°C por 30 minutos. HCl 4 N é ent&o adicionado a cada pogo para neutralizacio. A radioatividade é medida Por espectroscopia de cintilagdo em liquido. Afinidade de ligagio e capacidade de ligacdo com RE s&o avaliades através de andlise de Scatchard. Todas as etapas subseqilentes so realizadas a 0- 4°c. © tecido pulverizado é homogeneizado com duas arre- metidas de 10 segundos em um homogeneizador “polytron" separadas por um perfodo de resfriamento de 30 segundos no seguinte tampio: Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, molibdato de sédio 10 mM, ditiotreitol 10 mM, glicerol 10% (v/v), PH 7,4. © homogenado centrifugado a 7000 g por 20 minu- tos e o pelete é descartado, o sobrenadante foi recentri- fugado a 105.000 g por 60 minutos para se obter citosol para anélise de receptor de estrogénio. 0 citosol é dilu- ido até 1-2 mg de proteina/ml. A proteina de citosol é Geterminada de acordo com o método de Bradford. Para ava- Lago de receptor de estrogénio, citosol é incubado por 16 horas a 4°c numa faixa de concentragdes de 0,05-5 nM de (°H]17BE2 com ou sem excesso de 500 vezes de 17BE2 n&o-marcado e Composto Ia. Afinidade de ligagéo e capaci- dade de ligacio com RE sic avaliadas através de andlise de Scatchard.10 15 20 25 18 Células s&o colocadas em Hlecds de" 6 tote nuina’ densidade de 8 x 10% células por pogo em meio de cresci- mento. Apés 24 horas, as células so estimuladas em meio de crescimento sem vermelho de fenol suplementado com DMF a 0,1%, EtOH a 0,1% e diferentes concentragSes de Compos- to Ia (2x 109M, 109M, 5x 10° mM, 10° mw. As células séo incubadas seis dias, desprendidas com solugao de tripsina/etilenodiamina/écido tetracético e em seguida o crescimento 6 avaliado mediante contagem ao microscépic. 0 mesmo método é utilizado para linhagem de células primérias de fibroblastos de cancer do colon e para linhagem de células HCT8: esta linhagem é cultivada em RPMI e incubada 4 dias apés estimulacéo. Coldgeno tipo I em meios de cultura e camadas de células s&o medidos utilizando um imunoensaio ligado por enzima (ELISA). Resumidamente, as células s&o incubadas por 24 horas em meio Hem F12 modificado por meio de Coon isento de suplemento contendo 50 pg/ml de dcido ascérbico e 100 wg/ml de fumarate de B-aminopropionitrila: 0s meios de cultura so coletados e apropriada- mente dilufdos em tamp&o 0,1 M de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e em seguida usados para revestir as placas de ELISA, da noite para o dia a 4°C. As placas de ELISA sio incubadas 1,5 hora a 37°C em PBS contendo 5% de leite em pé (Blotto de PBS) pare saturar sitios de ligacgio n&o- especificos, 2 horas a 37°C com Blotto de PBS contendo o anticorpo policlonal especifico e 1,5 hora a 37°C em Blo- tto de PBS contendo complexo conjugado de IgG-fosfatase10 15 20 25 19 alcalina de cabra anticoelno (sigma -ntinital” ce. ! gt Louis, MO). Amostras S80 por conseguinte expostas 4 dietano- lamina a 10% (pH 9,8) com 50 pg/ml de Wg** e 1 mg/ml de fosfato de paranitrofenila como substratc de fosfatase alcalina & temperatura ambiente. A densidade Optica é lida a 405 nm e as concentragSes calculadas com base na curva padr&o. Monocamadas de células s&o coletadas em NaOH 0,5N e submetidas a ultra-som para determinar Cola- geno celular tipo I. Extratos de células s&o ent&o dilui- dos em tampao 0,1 M de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) e usados para revestimento das placas de ELISA. Padrées e amostras s&o ensaiados em triplicata. Os resultados s&o expressos como yg de proteina/ug de ADN celular. 0 teor de ADN é medido espectrofluormetricamente. Experimentos de ligacg&o sao realizados: utilizan- do (3H)17B82 como ligante em células primérias de tumores desméideos e em espécimes congelados de tumores desméi- deos. : Em ambos os experimentos, a ligacéo de [7H] 17BE2 foi ligeiramente (aproximadamente 10%) deslocada por ex- cesso de 500 vezes tanto de estrogénio nfo-marcado como de Composto Ia. Andlise de Scatchard de dados de ligagao de (2HJ17BE2 utilizando o programa de computador LIGAND para ligag&o (Munson P. J., Rodbard D., Anal. Biochem. 1980; 107:220-39) revela a presenca de RE em trés dife- rentes culturas e em duas diferentes preparacées de cito-10 15 20 25 20 sol a partir de espécimes bidpticds de ‘tuhorts ‘tebméi~ deos. No ensaio de crescimento, células primérias de tumores desméideos s&o estimuladas quando expostas a va- rias concentragdes de Composto Ia. O resultado é uma ini- big&o de crescimento celular com concentrages crescentes de Composto Ia (Tabela 1). Resultados similares sfo obti- dos com a linhagem de células HCTS (Tabela 2) e com uma linhagem de células fibrobldsticas de cancer do célon (Tabela 3). Células deanéideas so inibidas em um modelo de- pendente da dose através de Composto Ia em concentractes de 105 m, 5 x 107° m, 10°° M, com efeito inibitério mé- ximo sob concentracao de 107° M (Tabela 4). © Composto Ia é capaz de deslocar a ligag&o de 17BE2 em tecido desméideo somente em concentracdes muito altas (excesso de 500 vezes). © Composto Ia 6 capaz de inibir significativa- mente proliferagao de células deaméideas em concentragées micromolares. Adicionalmente, sob concentracdes similares © composte inibe a proliferacao de células epiteliais e fibroblasticas derivadas de cancer do célon humano. A produc&o de colageno do tipo I é também signi- ficativamente reduzida em células desméideas em cultura primaria através do Composto Ia. Hm todas as condicbes (eletroporag&c, precipita- g&o de Ca/P, lipossomas) testadas para transfecc&o de cé- lulas desméideas com os elementos responsivos a estrogé-2a ree nio, as células s&0 danificadas, rebuluando hac adtqhad’s’ fH para andlise in vitro. abe Composto Ia_(Mol/L) céluna x 10-# a controle 12,3 2,10°° 2 1075 2.8 10°& 10,0 10 Tabela 2 Composto Ia (Mol/L) célura x 10-4 Controle 150 2,1075 3 1075 n 4s 5.1076 115 Tabela 3 Composto Ta (Mol /L) Controle 20 2,10°5 O.1 10°75 5.4 5,10 © 6,322 s00'O>d §00'0>4 s00'o>a @ 9p sezoTea Tp'T F 00'8T 19'0 ¥ 0S'0z 9'T F 00° Tw'T ¥ 00'S Nav 9p 51/51 I oats, ouebptoo Vv'T F OT'SE = GZ‘ F 96'T ye'9 F TO'BE = -Z‘0 F SB'T €c'S F BL'ev = S00 F LE'T ST‘ F ZB'LY «= 900 F 9E'T 0304/54 I odtz ousspToD (511) Naw vy ereqer 9v'T F 06‘ 0S'0 + 06'9 €2'0 F 028 ze'o F sey wrt oT er wr er wit er o3s0dwo ojsoduo3 o3soduioa etoxqWOD10 15 20 REIVINDICACOES: 1. Uso de um composto que apresenta e férmula I (ai onde R' e R? sio independentemente hidrogénio, o o -CH3, -C-(alquila de C1-Cg) ou eee onde Ar 6 fenila opcionalmente substituida; R? € selecionado do grupo que consiste em pirro- lidino, hexametilenoimino e piperidino; ou um sal de sol- vato farmaceuticamente aceitével do composto; na prepara- ¢&o de um medicamento Util para inibir cancer do célon em um mamifero. 2. Uso, de acordo com a reivindica¢&o 1, no qual o mamifero é um hunano. 3. Uso, de acordo com a reivindica¢&o 2, no qual © composto é o sal de cloridreto deste.4. Uso, de acordo © composto & HO’ 10 ou seu sal de cloridreto.10 15 20 RESUMO Patente de InvencSo: "M&TODOS DE INIBICAO DE TUMORES DO COLON" Esta inveng&o refere-se a um método de inibicao de c&ncer do célon, processo este que compreende adminis- trar a um mamifero com necessidade deste tratamento uma quantidade eficaz de um composto que apresenta a férmula ea) onde R' e R® s&o independentemente hidrogénio, ° oO tl i i ~CH3, -C-(alguila de Cy-Cg) ou -C-Ar, onde Ar é fenila opcionalmente substituida; R? @ selecionado do grupo que consiste em pirro- 1idino, hexametilenoimino e piperidino; ou um sal de sol- vato farmaceuticamente aceitével do composto.