Guião do Professor

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VERSÃO B

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ÍNDICE Página

Introdução 3

Parte I – Enquadramento teórico da actividade 5

Parte II – Planificação da actividade 14

Parte III – Problematização da actividade 15

Parte IV – Procedimentos protocolares 18

Parte V – Análise e discussão dos resultados 23

Parte VI – Actividade complementar – “Mapeamento de plasmídios” 24

Parte VII – Glossário 28

Apêndices
Apêndice I – Guia prático de microbiologia 30
Apêndice II – Power-point “Kit BioExperimentando - Preparando a 33
actividade laboratorial”
Apêndice III – Power-point “Kit BioExperimentando - Análise e discussão 36
da actividade experimental”

Anexos 41
Anexo I – Plasmídios utilizados: pUC18 e pCR2.1.

Referências Bibliográficas 42

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Introdução

O kit BioExperimentando é resultado de um trabalho de investigação na área da biotecnologia,

nomeadamente dos testes genéticos, e surgiu da necessidade da criação de actividades laboratoriais
didácticas nesta área do conhecimento em profundo desenvolvimento.
A Biotecnologia surge integrada nos programas de ensino de Ciências, quer do 3º ciclo do Ensino
Básico, quer do Ensino Secundário. Relativamente ao 3º ciclo do Ensino Básico, está apenas presente num
ponto do quarto tema geral “Viver melhor na Terra”. Encontra-se inserida no capítulo “Transmissão da
vida” onde se sugere que “Os alunos devem ter oportunidade para reflectir sobre algumas aplicações e
possíveis consequências da manipulação do material genético. A discussão de notícias veiculadas na
comunicação social (relativas, por exemplo, à clonagem, à reprodução medicamente assistida) pode
contribuir para o reconhecimento de algumas restrições de natureza ética que se colocam à investigação
científica .” (1)
A Biotecnologia assume de facto maior relevância no Ensino Secundário, nomeadamente no
programa de Biologia do 12º ano. É finalidade de aprendizagem para a formação científica dos jovens “o
reconhecimento da relevância da Biologia e da Biotecnologia nos dias de hoje, uma vez que influenciam a
qualidade de vida das pessoas e a organização das sociedades, ao apresentarem alternativas e originarem
questões que exigem tomadas de decisão a nível tecno-científico, político, social e ético”(www1). Segundo
o mesmo programa “pretende-se enfatizar a influência que, actualmente, a Biologia e a Biotecnologia
exercem sobre a vida das pessoas, visando-se, por isso, tanto o conhecimento de exemplos de produtos e
serviços, como a reflexão sobre aspectos de natureza social, económica e ética que contextualizaram a
sua génese e/ou influenciaram”.(2)
Assim, tendo em conta as orientações dadas pelo Ministério da Educação acima referidas, pretende-
se com a implementação deste kit que os alunos atinjam os seguintes objectivos:
estudar a transmissão de determinada característica hereditária, através de técnicas de
Engenharia Genética;
analisar e interpretar casos de mutação, sua génese e consequências;
explorar procedimentos laboratoriais de microbiologia;
explorar procedimentos laboratoriais de manipulação do DNA;
compreender a importância e modo de funcionamento das enzimas de restrição;
manipular o material de laboratório de forma autónoma e responsável;
despertar a curiosidade relativa à metodologia desta investigação;
compreender a utilidade de algumas técnicas utilizadas em Engenharia Genética no
quotidiano dos cidadãos;
usar o pensamento crítico para resolver problemas;
discutir algumas questões éticas inerentes à manipulação do DNA.

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Este kit foi concebido para alunos do Ensino Secundário do Curso de Ciências e Tecnologias do
12ºano, no âmbito da disciplina de Biologia. No entanto, e uma vez que é um kit com procedimentos e
actividades mais avançadas (versão B), nomeadamente na área da microbiologia, sugere-se que seja
implementado na disciplina de Área de Projecto, Roteiros/Feiras da Ciência, Clubes de Ciência ou oficinas
da Universidade Júnior, na área da Genética.

Kit BioExperimentando (versão B)

Etapas de implementação Vantagens da utilização Ajuda a ensinar

Cultura de bactérias Preparação e manutenção de culturas Preparar meios de cultura

Extracção do DNA de bactérias. Extrair DNA plasmídico
plasmídico Aquisição de técnicas laboratoriais na Estrutura do DNA
Introdução aos perfis de área da microbiologia e da biologia Hereditariedade clássica
DNA molecular. Mendeliana (autossómica ou
Restrição das amostras Uso de enzimas de restrição reais e ligada ao sexo)
de DNA realização de electroforese com Análise de restrição do DNA
Electroforese em gel de fragmentos de DNA real. Preparar um gel de agarose para
agarose A actividade pode ser realizada em três electroforese
Análise e interpretação sessões de 90 minutos (no entanto o Determinar o tamanho molecular.
de resultados professor poderá reajustar o tempo). Simulação de perfis de DNA
Material suficiente para 23 alunos. Análise de mapas de restrição
Questões éticas inerentes aos
testes genéticos.

Tabela 1 – Potencialidades pedagógicas do kit BioExperimentando

Estratégia de ensino
O kit BioExperimentando é uma actividade prática, de laboratório, que se baseia numa simulação
de uma triagem genética numa família que possui uma doença hereditária fictícia. Nesta actividade
pretende-se que se integre a compreensão de processos genéticos, com as técnicas associadas, e as
respectivas questões éticas.

A escolha de uma doença fictícia para esta análise, deve-se essencialmente ao facto de não se usar DNA
humano na actividade. Assim, embora se possa fazer paralelismo entre a doença fictícia apresentada e
doenças hereditárias reais que apresentem o mesmo padrão de transmissão, evitam-se constrangimentos
de ordem ética, quer referentes à manipulação de DNA humano, quer relativos a testes genéticos e seus
resultados.

Os alunos terão que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente, através da
análise das amostras de DNA, após restrição e separação electroforética.

Medidas de segurança
Não é permitido comer, beber, fumar no laboratório ou área de trabalho.
É recomendado a utilização de luvas e de uma bata de algodão.

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Os alunos devem lavar as mãos com água e sabão antes e depois da actividade.
Se alguma solução entrar em contacto com os olhos dos alunos devem ser imediatamente
lavados com água.

Condições de armazenamento
Este kit deve ser guardado à temperatura ambiente, com excepção das bactérias que são
fornecidas em cultura “Stab”, e devem ser guardadas a uma temperatura de 4ºC. As enzimas de restrição
são fornecidas liofilizadas, e por isso podem ser mantidas à temperatura ambiente.

Parte I – Enquadramento teórico da actividade

A análise de DNA humano tem aplicações em duas grandes áreas:

1. Cuidados de saúde – inclui o diagnóstico de doenças hereditárias, mutações cromossómicas e cancro.
2. Sistema judicial – identificação de suspeitos em casos criminais (homicídio, rapto, roubo…) e análise
de relações familiares em casos de disputa da paternidade e de imigração.

Na presente actividade simula-se o diagnóstico de uma doença fictícia, que afecta vários membros de uma
família. São vários os conceitos e técnicas inerentes à implementação e compreensão da actividade:

Cultura de bactérias

As bactérias são conhecidas desde 1674, sendo a sua estrutura ainda objecto de estudo. São os seres
vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e os de menor tamanho. As bactérias são
microorganismos unicelulares, procariontes.

A cultura de bactérias é o crescimento de colónias de microorganismos induzida pelo Homem para

facilitar o seu estudo. Para a realização de uma cultura bacteriana, precisamos de um inoculo e de um
meio de cultura. Os meios de cultura podem ser de dois tipos: meios líquidos ou meios sólidos. Os meios
líquidos são normalmente utilizados para enriquecimento das bactérias, enquanto que os meios sólidos
são utilizados para o seu isolamento. O meio de cultura permite a nutrição, o crescimento e a
multiplicação dos microorganismos do inoculo. Os meios de cultura são seleccionados consoante o tipo
de bactéria. As bactérias multiplicam-se em meios de cultura apropriados desde que sejam respeitadas
as condições de temperatura, pH, humidade e composição.

Um bom meio de cultura deve possuir as seguintes características:

- Um teor de humidade entre os 75% e os 95%.
- Os nutrientes necessários
- Possuir um pH adequado
- Ser estéril
- Possuir as propriedades físicas desejáveis (límpido, líquido, sólido…)
(Manual Prático de Microbiologia Básico, Rogério Lacaz-Ruiz, 2000, Editora da Universidade de São Paulo)

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Os meios de cultura podem ser usados na selecção e crescimento de um determinado microrganismo ou

na identificação de uma espécie em particular. Desta forma, a função de um dado meio depende da sua
composição. O isolamento de uma determinada estirpe bacteriana pode ser feito através do recurso e/ou
combinação dos seguintes tipos de meios:

 Meios selectivos – suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefício de

outros.
 Meios diferenciais – permitem a distinção entre diferentes grupos de microrganismos com base
na capacidade de metabolizar componentes específicas do meio de cultura ou na morfologia
(aparência) das colónias. Permitem, por vezes, a identificação de microrganismos com base nas
suas características biológicas.

No apêndice I “Guia prático de microbiologia”, ou no site www.bioexperimentando.blogspot.com encontra-

se informação necessária à preparação de diferentes meios de cultura para estirpes de E.coli.

Manutenção de estirpes de E. coli

Há diferentes métodos para manutenção de estirpes de E.coli, dependendo do tempo de armazenamento
que se deseje. Os stocks de glicerol e as culturas “Stab” permitem um longo tempo de conservação das
bactérias, enquanto que placas de agar podem ser usadas para um período de manutenção mais curto.
O kit BioExperimentando fornece as bactérias em cultura “Stab”. Para que possa implementar o trabalho
experimental do kit várias vezes, com menos custos, é necessário manter as culturas de bactérias viáveis.
Para tal, após a recepção das primeiras bactérias em cultura “Stab”, proceda como é sugerido no ponto 1
dos procedimentos protocolares. Após a incubação das bactérias em meio líquido durante a noite, poderá
manter novas culturas em placas de agar, ou em cultura “Stab”. Os procedimentos para a realização dos
meios de cultura para placas de agar ou cultura “Stab” encontram-se no apêndice I “Guia prático de
microbiologia”, ou no site: www.bioexperimentando.blogspot.com

Extracção de DNA plasmídico

A lise alcalina, em combinação com o detergente SDS, tem sido usado nas últimas décadas, para isolar o
DNA plasmídico de E.coli. A exposição de suspensões bacterianas ao detergente fortemente aniónico, a
um pH elevado, rompe a parede da célula, desnatura o DNA cromossómico e as proteínas, e liberta DNA
plasmídico no sobrenadante. Embora a solução alcalina rompa completamente a formação de pares de
bases, as cadeias de DNA plasmídico circular fechado são incapazes de se separar uma da outra, devido à
forma como estão entrelaçadas. Desde que a intensidade e a duração da exposição ao OH- não seja
muito elevada, as duas cadeias de DNA plasmídico regressam novamente à conformação inicial, quando o
pH se tornar neutro.
Durante a lise, as proteínas bacterianas, as paredes celulares rompidas, e o DNA cromossómico
desnaturado juntam-se em grandes complexos que são revestidos com SDS. Estes complexos precipitam-
se eficientemente da solução quando os iões de sódio são substituídos por iões de potássio. Após a
matéria desnaturada ser removida através de centrifugação, o DNA plasmídico original pode ser
recuperado do sobrenadante.

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A lise alcalina na presença de SDS é uma técnica flexível que resulta bem com todas as estirpes de E.coli.
O DNA plasmídico circular fechado recuperado da técnica de lise alcalina, pode ser purificado de diversas
formas e para diversos fins, de acordo com as necessidades da actividade experimental.

Enzimas de restrição
As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta ácidos nucleicos) são enzimas que
reconhecem sequências específicas de bases no DNA e são capazes de hidrolisar as cadeias de DNA.
Para além da sua função protectora na célula bacteriana, as enzimas de restrição têm também
extrema importância em investigação científica, nomeadamente nos processos de clonagem de genes,
execução de mapas de restrição ou na determinação do tamanho de moléculas de DNA.
Uma enzima de restrição liga-se a uma molécula de DNA e desliza ao longo da hélice até reconhecer
sequências especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta
então quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrição. Se um local de restrição específico
ocorrer em mais do que um local numa molécula de DNA, a enzima de restrição irá cortar em cada um
desses locais, resultando múltiplos fragmentos. Do mesmo modo, se uma sequência linear de DNA é
cortada com uma enzima de restrição cujo local específico de reconhecimento é encontrado em dois locais
diferentes na molécula de DNA, o resultado irá ser de 3 fragmentos de diferentes tamanhos. Se o
fragmento de DNA é circular e é cortado com uma enzima de restrição cujo local específico de
reconhecimento é encontrado em dois locais diferentes na molécula de DNA, o resultado vai ser 2
fragmentos de diferentes tamanhos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localização dos locais
de restrição na molécula de DNA.
Quando as enzimas de restrição são usadas para cortar cadeias de plasmídios circulares de DNA, tal
como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos são produzidos. O DNA que se cortou pode
ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose. Os fragmentos
resultantes podem depois ser usados para criar um mapa do plasmídio.
As enzimas têm uma designação que deriva do nome científico da espécie bacteriana de onde é
extraída, como é o caso da enzima EcoRI, a primeira (I) a ser isolada da estirpe R da bactéria Escherichia
coli.

O gel de agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa solução tampão e
deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose é um políssacarídeo derivado do agar, com
estrutura tridimensional, altamente purificado e livre de cargas (não influencia deste modo a migração das
moléculas) e impurezas (não provoca impedimento da migração das moléculas).
A agarose deve ser previamente pesada para a concentração pretendida do gel e deve ser dissolvida na
solução tampão com a ajuda de uma fonte de calor (em banho –maria ou no microondas). Assim que a
solução levantar fervura deve ser retirada da fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha do gel pode
ficar laxa, o que poderá trazer implicações na electroforese e nos resultados que deveremos obter.
A solução deve ser vertida num molde apropriado quando atinge uma temperatura de cerca de 50ºC (ou
seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mão sem nos queimarmos).
Antes de vertermos a solução de agarose no molde, devemos colocar um pente junto da extremidade
orientada para o pólo negativo da tina de electroforese (uma vez que o DNA irá migrar para o pólo
positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poços.

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Após solidificação do gel, vertemos tampão de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente retiramos o
pente, tendo o cuidado de não danificar os poços (nunca retirar o pente sem o gel estar submerso em
tampão de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampão de electroforese sobre os
poços para eliminar eventuais resíduos de agarose que não tenha sido polimerizada.
Dependendo da tina de electroforese que se utilizar, poderá ser necessário colocar fita isoladora no
recipiente onde se vai colocar a solução de agarose, no sentido de limitar a respectiva área de solidificação
da solução de agarose. Noutras tinas, não é necessário o uso de fita isoladora, uma vez que existem uns
adaptadores de borracha que se colocam nas extremidades do recipiente do gel (figura1). Em qualquer
um dos casos, chama-se a atenção para o facto de ser necessário retirar quer a fita isoladora quer os
adaptadores de borracha das extremidades do recipiente molde antes de submeter as amostras de DNA a
electroforese. Caso contrário, a corrente eléctrica não atravessará de forma eficaz o gel de agarose.

Figura 1 – Gel de agarose

Electroforese
A electroforese consiste em fazer migrar biomoléculas por uma matriz, sob a influência de um
campo eléctrico, permitindo separá-las segundo os seus tamanhos. Podem realizar-se electroforeses de
proteínas, de RNA e de DNA. A electroforese em gel de agarose é um procedimento utilizado em várias
áreas da biotecnologia, em laboratórios de investigação, medicina e de biologia forense. Esta técnica
permite analisar fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.
O DNA antes de ser carregado nos poços tem que ser tratado com tampão de amostra que tem várias
funções: dá cor à amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose ou
glicerol) e mantém o pH alcalino. Os fragmentos de DNA são então descarregados em poços, no gel de
agarose, que é colocado numa tina cheia de tampão de electroforese (TAE ou TBE). O tampão de
electroforese fornece condutibilidade eléctrica e mantém o pH que é necessário para a manutenção da
carga e estabilidade das moléculas. O carregamento dos poços é um procedimento que deve ser feito com
muito cuidado para não danificar os poços do gel. Quando procedemos ao carregamento, devemos
adoptar a posição que melhor permita uma total estabilização da mão que segura a pipeta e que vai
carregar as amostras de DNA nos poços (figura 2). Assim pode-se adoptar uma posição em que com os
cotovelos bem pousados na bancada onde está a tina, se segure bem o punho da mão que vai pipetar
com a outra mão, para evitar tremer durante a pipetagem no gel, ou então adoptar uma posição em que
não se apoiem os cotovelos, mas se consiga estabilizar a mão que vai proceder à pipetagem nos poços
com a ajuda da outra mão, pois um simples toque nos limites do poço a carregar pode danificá-lo e
interferir nos resultados a obter pela electroforese (o poço pode furar e a amostra ser perdida). O
conteúdo deve ser expelido da pipeta devagar e continuamente, carregando no êmbolo da pipeta até ao

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primeiro ponto de resistência. Quando é sentida esta primeira resistência, deve-se aguardar uns breves
segundos antes de retirar, lentamente, a ponta da pipeta do poço.
Após o carregamento dos poços, ligam-se os eléctrodos à fonte de alimentação, determinando
previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).
A corrente eléctrica é passada entre os eléctrodos que estão nos terminais da tina de electroforese. Desde
que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vão avançar para o pólo positivo
(cátodo) quando estiverem sujeitos a um campo eléctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto à
extremidade que contém o eléctrodo negativo a libertação de H2. Na extremidade que contém o pólo
positivo observa-se a libertação de O2. Se não estiver a ocorrer a electroforese não há formação deste
gases, pelo que a observação da libertação destes gases sob a forma de “bolhinhas” é um bom indicador
da ocorrência ou não deste processo.
A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular através da qual cada fragmento
pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razão entre o que
cada fragmento de DNA migra através do gel é inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de
bases. Após um determinado período de tempo, os fragmentos menores de DNA vão viajar até mais longe
do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa única banda de DNA.
Estas bandas irão ser vistas posteriormente no gel após o DNA ser corado.

Figura 2 – Carregamento dos poços Figura 3 – A electroforese

Visualização do DNA
O DNA é incolor, por isso os fragmentos no gel não podem ser vistos durante a electroforese. Um
tampão de amostra contendo dois corantes azuis é adicionado às amostras de DNA. O tampão de amostra
não cora o DNA, mas torna o processo de carregamento dos poços com o DNA mais fácil, assim como
permite uma monitorização do progresso do DNA durante a electroforese. As frentes do corante migram
em direcção à extremidade positiva do gel, como os fragmentos de DNA. Corando as bandas de DNA é
possível a sua localização no gel.
O corante mais comum para a visualização das bandas de DNA é o brometo de etídio, cuja visualização só
é possível recorrendo a uma transiluminador de raios UV. Contudo este corante não é usado em trabalhos
com alunos uma vez que apresenta propriedades mutagénicas. Em alternativa a este corante utiliza-se
habitualmente um outro corante – o Azure A - 100% inócuo, e com um grau de eficácia muito elevado, já
que permite uma boa visualização do DNA, num espaço de tempo reduzido (figura 4).
Quando o gel é imerso no corante Azure A, as moléculas
do corante atacam o DNA que se encontram na malha do
gel de agarose. Quando as bandas ficam visíveis, é possível
comparar os padrões de restrição do DNA em diferentes
amostras de DNA.
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Existe no mercado uma nova geração de corantes de
qualidade que permitem obter uma boa visualização das
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Figura 4 – Corante para o visualização do

DNA - Azure A
Tabela 2 - Corantes de DNA
Características
Muito usado para visualização
do DNA.
Corante de fluorescência.
Brometo de Etídio
Inflamável.
Adicionado ao gel após
separação electroforética.
O gel fica todo corado e para
Azure A vermos as bandas de DNA
temos que descolorar o gel.
O DNA aparece formando
bandas azuis.
Vantagens
Grande sensibilidade a
baixas concentrações.
rede de saneamento.
Não tóxico nem
carcinogénico.
Pode ser eliminado
sem prejuízo para o
ambiente.
O gel corado pode ser
guardado
indefinidamente.
Desvantagens
Tóxico e altamente mutagénico.
Não deve ser lançado directamente para a
(http://www.merck-
chemicals.com/brazil/brometo-de-
etidio/MDA_CHEM-
111615/p_xw.b.s1LJBYAAAEW4eAfVhTl)
A descoloração do gel é um pouco lenta
(tem que se lavar o gel várias vezes com
água).
(http://www.ncbe.rdg.ac.uk/NCBE/
PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA14.pdf)

Seguro. Tempo de coloração Pouca sensibilidade.

Carolina BLU DNA Sistema de coloração em duas
Stain etapas.
Seguro e de fácil utilização.
Cora o DNA de azul.
Apresenta-se numa
concentração de 500x.
Fast Blast DNA Stain Pode ser utilizado num
concentração de 100x ou
numa concentração de 1x.
Pode ser utilizado para
coloração do núcleo.
Corante de fluorescência,
sensível.
Solução estável à temperatura
ambiente.
Deve evitar-se a exposição do
corante à luz.
Permite substituir a coloração
GelRed Nucleic Acid
com brometo de etídio.
Gel Stain A coloração das bandas pode
ser feita terminada
electroforese, diluindo a solução
concentrada em água
incubando o gel na solução.
A coloração pode ser feita
também aquando da preparação
do gel.
Corante de fluorescência,
sensível.
Solução estável à temperatura
GelGreen Nucleic Acid
ambiente.
Gel Stain Deve evitar-se a exposição do
corante à luz.
Permite substituir a coloração
com SYBR ou GelStar.
curto (15 minutos)
(http://www.carolina.com/product/
carolinablu+dna+stain.do)
Não tóxico. Quando utilizado 1x concentrado é
Económico. necessário uma noite para visualização das
Pode ser utilizado para bandas.
uma rápida coloração
(concentração de 100x). (http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
Permite obter 50L de Bulletin_4110153A.pdf)
solução 1x concentrada.
Não é mutagénico nem
tóxico para o Homem, O tempo de vida do GelRed 3x solução em
nem para o meio água, é de cerca de 6 meses, quando
ambiente. armazenado devidamente.
Mais sensível que o A utilização do GelRed aquando da
brometo de etídio. preparação do gel pode comprometer a
Não é necessário resolução das bandas de DNA ou retardar a
descolorar o gel. migração das mesmas.
A coloração do DNA demora cerca de 30
a minutos.
É necessário um transiluminador UV.
e O custo por embalagem de 4L é de $168.
(http://www.biotium.com)
Não é mutagénico nem O tempo de vida da solução GelGreen
tóxico para o Homem, 10000x em água, é de cerca de 6 meses,
nem para o meio quando armazenado devidamente.
ambiente. A utilização do GelGreen aquando da
Mais sensível que o preparação do gel pode comprometer a
SYBR ou GelStar. resolução das bandas de DNA ou retardar a
Não é necessário migração das mesmas.
descolorar o gel. A coloração do DNA demora cerca de 30

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A coloração das bandas pode minutos.

ser feita terminada a É necessário um scanner a laser com leitor
electroforese, diluindo a solução de comprimento de onda na ordem dos
concentrada em água e 488nm, ou um “Dark Reader” que utiliza uma
incubando o gel na solução. luz azul visível para excitação.
A coloração pode ser feita O custo por embalagem de 0,5mL é de
também aquando da preparação $100.
do gel. (http://www.biotium.com)

Tabela 2 – Propriedades de diferentes corantes de DNA

Dada a relação qualidade/preço/segurança, o corante seleccionado para esta actividade é o Azure A. No

caso da escola possuir transiluminador UV sugere-se a utilização do corante GelRed. No caso da escola
possuir uma fonte de luz azul, pode optar-se pela utilização do GelGreen.

* O corante GelRed e Gel Green pode ser adquirido através do site www.biotium.com

Perfis de DNA
Cada indivíduo apresenta diferenças e semelhanças nas sequências de DNA. Para mostrar que
um determinado fragmento de DNA contém uma sequência específica de nucleótidos, uma sonda
radioactiva complementar pode ser feita para reconhecer e ligar-se a essa sequência. As sondas
radioactivas permitem aos biólogos moleculares localizar, identificar, e comparar o DNA de diferentes
indivíduos. Devido à especificidade, a sonda radioactiva pode ser utilizada para demonstrar semelhanças
genotípicas entre indivíduos. Num perfil de DNA, a posição relativa das bandas radioactivas num gel é
determinado pelo tamanho dos fragmentos de DNA em cada banda. O tamanho dos fragmentos reflecte
variações no DNA dos indivíduos.
A evidência necessária para um perfil de DNA pode ser obtida a partir de qualquer material biológico que
contenha DNA: tecidos, fluidos (sangue, esperma), folículos capilares, etc. A análise de DNA pode inclusive
ser feita a partir de material desidratado, como manchas de sangue ou tecidos mumificados. Se a amostra
de DNA for demasiado pequena, pode ser amplificada utilizando a técnica de PCR. O DNA é então tratado
com enzimas de restrição que cortam o DNA em fragmentos de diferentes tamanhos.

Digestão do DNA pelas enzimas de restrição

As enzimas de restrição são as “tesouras químicas” dos biólogos moleculares. A restrição
enzimática é uma das formas de se detectar um SNP (single nucleotide polymorphism – polimorfismo
nucleotídico simples). Para se proceder à restrição enzimática são utilizadas enzimas de restrição próprias
para a sequência de nucleotídeos que nos interessa.
As enzimas de restrição têm um melhor desempenho sob determinadas condições tamponantes e de
temperatura. O tampão de enzima, juntamente com as amostras de DNA também foi incluído neste kit, de
forma a que quando se misturarem as enzimas com as amostras de DNA, estejam criadas as condições
ideais para uma óptima funcionalidade. As enzimas e os tampões são normalmente adquiridos em firmas
que os comercializam, e são fornecidos em conjunto. Neste caso em concreto o tampão já se encontra
incluído no tubo que contem a enzima liofilizada, a enzima BamHI.

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Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR

Esta reacção foi descrita por Kary Mullis, em 1985. É uma reacção que permite a amplificação de
porções específicas de DNA que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam
conhecidas as suas extremidades. Em aproximadamente 2 horas podem-se obter milhões de cópias de
DNA, a partir de uma pequena quantidade de DNA. Numa reacção simples, o DNA molde é desnaturado
pelo calor (94ºC) para originar duas cadeias simples. São fornecidos em excesso dois oligonucleótidos
sintéticos, complementares às extremidades 3´das cadeias simples originadas. A temperatura é reduzida
para 50-60ºC, durante 1 minuto, para que os oligonucleótidos em excesso emparelhem por
complementaridade com as extremidades 3´do DNA molde. Os oligonucleótidos funcionam como
iniciadores (primers) de uma nova cadeia de DNA por parte de uma DNA polimerase (Taq DNA
polimerase), que incorpora desoxirribonucleótidos a 3´dos iniciadores por complementaridade com a
cadeia de DNA molde à temperatura de 72ºC. Quando a síntese da segunda cadeia termina, toda a
mistura é aquecida outra vez (94ºC) para desnaturar as novas moléculas de DNA, e deste modo reinicia-
se o ciclo anteriormente descrito. Cada ciclo completo de amplificação consiste pois na desnaturação da
dupla cadeia de DNA a uma temperatura próxima da ebulição de modo a obter cadeias simples de DNA,
ligação dos primers e replicação da cadeia modelo por extensão dos primers mediada pela polimerase
(figura 5). A PCR ocorre num termociclador que permite fazer variar de uma forma rigorosa o tempo e a
temperatura ao longo das três etapas em que se desenvolve um ciclo de amplificação.
A especificidade da PCR é dada pelos primers. Por isso, não é necessário isolar o DNA que se pretende
amplificar.
A visualização dos produtos amplificados é feita normalmente após electroforese, através de um corante
de DNA.

Figura 5 – PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia)

Fonte: Hughes (1995) – National academy of science

Testes genéticos

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Um teste genético é o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar

alterações genéticas, e envolve a análise directa do DNA. Alguns testes genéticos incluem testes
bioquímicos para produtos de genes como enzimas e outras proteínas e exame microscópico de
cromossomas.
As finalidades dos testes genéticos podem ser o diagnóstico, o rastreio ou a monitorização. Os testes
genéticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doença genética, para determinar se um indivíduo é
portador de uma doença associada a uma mutação, para prever o desenvolvimento de uma doença
genética, para determinar a susceptibilidade de um indivíduo para uma determinada doença, ou ainda
para aplicações na ciência forense.
Os testes genéticos devem ter reproducibilidade, elevada especificidade e sensibilidade e valor preditivo.
Um teste genético preditivo é o uso dos testes genéticos para prever se um determinado indivíduo irá
desenvolver uma doença genética. Pode apenas ser utilizado se for conhecida a relação mutação – doença
e esta for altamente penetrante. Um exemplo clássico da utilização deste tipo de teste genético é para
prever a doença de Huntington. O gene associado a esta doença foi descoberto em 1993. A doença é
associada com alterações numa parte específica da sequência, que facilmente são detectadas pela análise
do DNA. Como a doença de Huntington só se manifesta tardiamente, um indivíduo que tenha um dos pais
afectado pela doença, não irá saber se a doença foi ou não transmitida, até atingir a meia-idade. Contudo,
o teste de DNA em qualquer idade, até mesmo pré-natal, irá revelar se a mutação está ou não presente,
alterando o risco do indivíduo de 50% para 100% ou 0%.
Idealmente, a utilização de um teste genético de previsão deve ser utilizado conjuntamente com um
tratamento profiláctico, para os indivíduos cujo resultado tenha sido positivo. A doença de Huntington é
incurável e fatal, pelo que o aconselhamento cuidadoso é essencial para qualquer pessoa proveniente de
uma família afectada e que pense realizar um teste genético.
Actualmente são realizados centenas de testes genéticos e muitos outros estão em desenvolvimento.

13
 Guião do Professor

Parte II - Planificação da actividade

A planificação que se segue foi elaborada para enquadramento no programa de Biologia de

12ºano do Curso de Ciências e Tecnologias, e é apenas uma sugestão, podendo ser reajustados os
tempos de execução das diferentes actividades, com mais ou menos preparação prévia das actividades
laboratoriais feita pelo professor, ou pelo maior ou menor aprofundamento das questões levantadas. Cabe
ao professor, adaptar a planificação ao tempo disponível que possuir e à realidade de cada turma.

Aula Tema Estratégia Duração

Procedimento protocolar 1: 20 minutos mais

1 Cultura de bactérias - Cultura de bactérias para extracção incubação durante
de DNA plasmídico. a noite
Procedimento protocolar 2 e 3:
Extracção do DNA plasmídico e Preparação
2 - Extracção do DNA plasmídico. 90 minutos
das amostras de DNA
- Preparação das amostras de DNA.
Exploração do power-point nº1 sobre:
- Estrutura do DNA;
3 Introdução “Perfis de DNA” 45 minutos
- Restrição das amostras de DNA;
- Electroforese.
Procedimento protocolar 4 e 5:
- Distribuição das amostras de DNA
4 Restrição das amostras de DNA - Restrição das amostras de DNA. 90 minutos
Procedimento protocolar 6:
- Preparação do gel de agarose.
Procedimento protocolar 7, 8 e 9:
- Electroforese em gel de agarose das
Electroforese em gel de agarose das
5 amostras de DNA. 90 minutos
amostras de DNA
- Coloração do DNA.
Registo dos resultados
6 Análise e discussão dos resultados obtidos Exploração do power-point nº2 sobre: 45 minutos

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 Guião do Professor

- Análise dos resultados obtidos;

- Discussão da questão problema;
- Questões éticas inerentes ao
trabalho desenvolvido

Tabela 3 – Planificação da actividade

Nota: Existe disponível no site : www.bioexperimentando.blogspot.com uma planificação mais detalhada,

que inclui estratégias, materiais, competências e tempo de execução.

Parte III – Problematização da actividade

Inicialmente, e antes da apresentação da questão-problema que vai servir de ponto de partida

para o desenvolver de toda a actividade, sugere-se que o professor explore um power-point de revisão de
alguns conteúdos leccionados em anos anteriores e de apresentação de alguns procedimentos que vão ser
executados aquando da actividade laboratorial, fundamentais para uma profunda e sólida compreensão de
todos os processos envolvidos nesta actividade. O power-point (ver apêndice I) pode ser obtido acedendo
ao site http://bioexperimentando.blogspot.com.

O problema apresentado à turma é o seguinte:

Transmissão da doença “Raritose”

A família Antunes é afectada há quatro gerações sucessivas pela doença “Raritose”. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,
casou com o André, e pretendem ter um filho. Tendo o André conhecimento de que a família de Ana tem problemas com essa
doença, este sugere a Ana que façam um teste genético para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentes
ou portadores da doença. A árvore genealógica desta família encontra-se disponível na figura 6.

Questão- problema: Será possível pela análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?

Mulher

Homem
D. Maria Sr Joaquim
Sexo
Indefinido
Parte III – Procedimentos protocolares
Parte IV – Análise e discussão dos resultados
Legenda

José Rosa Paulo Elisabete Agostinho Manuel Helena Joana António

Rita Tiago Rui Josefina Serafim Diana Marta

Ana André 15
Carlos Pedro Vera
 Guião do Professor

Filho A Filho B

Para simplificação de identificação, aFigura

cada 6membro
– Árvoreda família será
genealógica atribuído
da família um número, como mostra a
Antunes
figura 7.

1 2

Parte III – Procedimentos protocolares

Trabalho laboratorial:

- Material/Métodos
3 4 5 6 7 8 9 10 11
- Notas para o professor
- Informação adicional
Pipetagem
Electroforese
12 13 14 15 16 17 18

Legenda

20 21 Mulher
19 22 23

Homem

Sexo
Indefinido

Filho A Filho B

Figura 7 – Árvore genealógica da família Antunes numerada

Membros da família Antunes:

1 – D. Maria 9 – Helena 17 – Diana

2 – Sr. Joaquim 10 – Joana 18 – Marta
3 – José 11 – António 19 – Carlos
4 – Rosa 12 – Rita 20 – Ana
5 – Paulo 13 – Tiago 21 – André
6 – Elisabete 14 – Rui 22 – Pedro
7 – Agostinho 15 – Josefina 23 – Vera
8 – Manuel 16 - Serafim

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 Guião do Professor

No sentido de dar resposta à questão formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de

cada um dos membros da família Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contém parte do
gene responsável pela doença, amplificado previamente por PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia).
Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que está ser investigado. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo dominante (genótipo RR) terá apenas DNA do tipo R. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo responsável pela doença (genótipo rr) terá apenas DNA do tipo r. Por sua vez,
um indivíduo que seja heterozigótico (genótipo Rr), terá DNA dos dois tipos. A amplificação da região de
interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.
O objectivo é detectar que formas de DNA estão presentes em cada
Genótipo Número de bandas
amostra, e para isso sujeitam-se as amostras a restrição com a
RR 1
enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes,
rr 2
no gel de electroforese.
Rr 3
A diferença na sequência de DNA dos alelos R e r é tal que, no alelo
r existe uma sequência de bases que pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrição BamHI. O
alelo R não possui local de restrição para a enzima BamHI e assim não vai ser cortada pela enzima.
Os resultados que podem ser observados no gel de agarose, após o tratamento das amostras com a
enzima de restrição e da electroforese são os seguintes:

Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos, é sujeito a
electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais pequenos
obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).

Nota para o professor 1

As amostras de DNA

Nesta actividade não foi utilizado DNA humano. Usaram-se três plasmídios de diferentes tamanhos para preparar as
amostras (A, B e C) que corresponderão respectivamente a uma, duas ou três bandas no gel.
Os plasmídios são fragmentos circulares de DNA, mas uma preparação de plasmídio pode conter o plasmídio em
diferentes estados: circular (uma cadeia está quebrada), linear (duas cadeias quebradas) e super-enrolado. As
diferentes formas irão correr no gel de agarose a diferentes velocidades, originando diferentes bandas para um único
plasmídio.
Durante esta simulação cada plasmídio é tratado com uma enzima de restrição. Os plasmídios seleccionados tem
apenas um local de restrição para a enzima, por isso a enzima irá apenas cortar o DNA circular para formar um
fragmento linear que originará uma única banda após electroforese (ver anexo I).

17
 Guião do Professor

Parte IV – Procedimentos protocolares

Segue-se o trabalho de laboratório que implica o cumprimento de todas as regras de segurança

já mencionadas na introdução deste guião. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre
em atenção que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular
atenção às pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mãos ou entrar em contacto
com material não esterilizado, para que não haja contaminação do DNA.

1. Cultura de bactérias para extracção de DNA plasmídico

a) Seleccionar um conjunto de culturas em stock (em placa petri, cultura “Stab”, ou meio líquido LB
mais Ampicilina), dependendo de como são mantidas as bactérias no laboratório, e proceder à propagação
das bactérias através de cultura líquida, transferindo perto da chama, para um tubo estéril que continha já
10 mL de meio de cultura (tabela 4):
- uma colónia de cada cultura de bactérias no caso de estarem em meio sólido;
- uma picada de cada cultura de bactérias caso sejam retiradas da cultura “Stab”;
- 10 µL de cada cultura de bactérias, no caso de estarem em meio líquido.
b) Agitar de modo a provocar a dispersão das bactérias no meio.
c) Incubar a 37ºC durante a noite.

Culturas
pCR2.1 pUC 18 pCard
(meio LB+Ampicilina)
Volume final da
10mL 10mL 10mL
cultura

Tabela 4: Cultura de bactérias seleccionadas para extracção de

DNA plasmídico

2. Extracção do DNA plasmídico

a) Perto da chama, transferir 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos de 1,5 mL
estéreis.
b) Centrifugar à velocidade média durante 3 minutos para recolher as bactérias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.

18
 Guião do Professor

c) Perto da chama transferir novamente 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos
de 1,5 mL.
d) Centrifugar à velocidade média durante 3 minutos para recolher as bactérias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.
e) Ressuspender os sedimentos em 300 de STET e adicionar 4 uL de lisozima (50mg/mL) a cada
tubo.
f) Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
g) Ferver durante 45 segundos.
h) Centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima, para que as estruturas celulares sedimentem
no fundo.
i) Remover o sedimento de cada tubo com um palito.
j) Adicionar a cada tubo 300 µL de isopropanol (insolubiliza o DNA) e agitar.
k) Centrifugar os tubos à velocidade máxima, durante 10 minutos, para sedimentar o DNA.
l) Eliminar o sobrenadante e deixar secar até desaparecer o odor de isopropanol, evitando que os
sedimentos sequem em demasia.
m) Adicionar 100 µL de etanol, a 70% e deixar evaporar.
n)Ressuspender os sedimentos em 30-40 µL de água destilada estéril, agitando a base dos tubos com
os dedos.
o) Utilizar o DNA dissolvido directamente, ou conservar a preparação de DNA a -20ºC para posterior
utilização.

3. Preparação das amostras de DNA

Nesta actividade experimental, se o corante de DNA a utilizar for o Azure A, será necessário 0,3 µg de
DNA para cada banda visível – num volume de 20 µL a carregar nos poços.
As soluções de plasmídios são normalmente fornecidas em concentrações de 1 µg/µL, que necessitam de
ser diluídas para uma concentração de 0,06 µg/µL (ver tabela 5). 5 µL dessas soluções contêm 0,3 µg de
DNA.
Para este trabalho, é necessário preparar 3 misturas diferentes de plasmídios, que vão posteriormente ser
utilizadas. A tabela 6 indica as quantidades de cada mistura que são necessárias para a realização da
actividade experimental. As amostras de DNA vão conter 20 µL de uma das misturas, pelo que a
quantidade de DNA em cada amostra vai ser 0,3 µg, 0,9 µg, ou 0,6 µg, dependendo se contem a mistura
A (1 plasmídio), a mistura B (3 plasmídios) ou a mistura C (2 plasmídios).

Plasmídio Volume Final

Água
(1 µg/µL) (0,06 µg/µL)
3 µL 47 µL 50 µL
Tabela 5 - Preparação das soluções de plasmídios
6 µL 94 µL 100 µL para a concentração final de 0,06 µg/µL
9 µL 141 µL 150 µL
15 µL 235 µL 250 µL

Amostra de DNA Volume necessário

Amostra de DNA A Amostra de DNA C
B de plasmídio

19
 Guião do Professor

(o,o6 µg/µL)
pUC 18 ------------------------ 60 µL 20 µL 80 µL
pCR 2.1 ------------------------ 60 µL 20 µL 80 µL
pCArd 45 µL 60 µL ----------------------- 105 µL
Água 135 µL 60 µL 40 µL
Volume total 180 µL 240 µL 80 µL
Nº de amostras
de 20 µL 8 tubos 11tubos 3 tubos
necessárias

Tabela 6 - Preparação das misturas de plasmídios (amostra de DNA A, B e C)

4. Distribuição das amostras de DNA
a) No topo de cada um dos tubos que contêm enzima liofilizada, proceder à identificação dos mesmos
com os números de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).
b) Colocar 20 µL de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que
continha já enzima de restrição liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a
amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).
c) Proceder à mistura da solução de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no
fundo do tubo.

Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22

Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23
Figura 8 – Distribuição das
Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15 diferentes amostras de DNA

5. Restrição enzimática
a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37ºC,
durante cerca de 40 minutos.

6. Preparação do gel de agarose

a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampão TAE (1x) (ver nota para o
professor 2).
b) Tapar o matraz com película aderente, e furar a película antes de o levar ao microondas (não
utilizar parafilme).
c) Proceder à sua dissolução no microondas durante 2 minutos (ter atenção para a solução não
levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicações na
electroforese).
d) Retirar o matraz do microondas com o auxílio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de
que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.
e) Deixar arrefecer até à temperatura aproximada de 60ºC.
f) Colocar o pente junto ao eléctrodo negativo da tina de electroforese.
g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a
criação de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.

20
 Guião do Professor

h) Aguardar a polimerização da agarose durante cerca de 20 minutos.

Nota para o professor 2

Cálculos a realizar para a preparação do Gel:

o Agarose em tampão TAE (1x) (0,8% p/v) : 0,8 g de agarose para cada 100 mL de TAE (1x)

GEL: Vfinal= 50 mL (o volume final depende do tamanho da tina de electroforese)

0,8 g agarose ---------------------------- 100 mL TAE

X ----------------------------- 50 mL Vfinal

X= (0,8 X 50) / 100

X= 0,4 g agarose

Tampão TAE:
o Tampão de electroforese (tris-ácido acético – EDTA) – Tris é um tampão de pH e o EDTA é um agente quelante, isto é, capta catiões
bivalentes (neste caso Mg2+) necessários à actividade das DNAses evitando assim a destruição do nosso DNA alvo.
7. Carregamento do gel
a) Após a solidificação do gel de agarose, cobrir toda a
sua superfície com TAE (0,25x).
b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como
as placas laterais.
c) Adicionar 2 µL de tampão de amostra que contém azul de
bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.
d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampão de
amostra com a solução de DNA.
Figura 9 – Carregamento do gel de
e) Pipetar 5 µL do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar agarose

2µL de tampão de amostra.

f) Carregar 5 µL da solução anterior no primeiro poço do gel.
g) Pipetar 20 µL de cada amostra de DNA, pela ordem numérica dos tubos, e carregar nos poços do
gel (figura 9) (ver nota para o professor 3).

Nota para o professor 3

Carregamento dos poços

o Por convenção, no 1º poço carregamos o nosso marcador. O marcador de DNA serve para podermos comparar o tamanho dos diferentes
fragmentos de restrição, pois o marcador provém de um DNA já cortado, em que o tamanho dos seus fragmentos são conhecidos (em kb).
Nesta actividade utilizamos o marcador Lambda cortado com a enzima HindIII, comercializado pela Fermentas Life Science.
o Os poços carregam-se da esquerda para a direita.
o No carregamento dos poços do gel com as amostras de DNA, devemos ter o cuidado de estabilizar a pipeta antes de expelir o conteúdo.
Para isso podemos apoiar os cotovelos na bancada e segurar a pipeta com as duas mãos, ou segurar a pipeta com uma das mãos enquanto
a outra estabiliza a mão que segura a pipeta.
o Não se pode introduzir toda a ponta da pipeta no poço, uma vez que se poderá furar o poço e assim perder a amostra de DNA.
o Durante o carregamento das amostras de DNA nos poços, o êmbolo da pipeta deve ser pressionado continuamente, sem interrupções, até
ao primeiro ponto de resistência.
o Retirar a pipeta do poço com o êmbolo ainda pressionado (se se largar o êmbolo antes de retirar a pipeta, a amostra de DNA vai ser
aspirada do poço.

8. A electroforese
a) Verificar se os eléctrodos estão bem colocados
(ver nota para o professor 4).
b) Regular a voltagem para os 120 volts.

21
 Guião do Professor

c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).

d) Interromper a electroforese quando o azul do tampão alcançar o
fim do gel.

Figura 10 - Electroforese

Nota para o professor 4

A electroforese

o Na tina de electroforese, os poços de gel de agarose devem ocupar a posição junto ao pólo negativo (eléctrodo preto), pois o DNA migra
do pólo negativo para o pólo positivo (eléctrodo vermelho).

o Quando a tina de electroforese é ligada à corrente, podemos certificarmo-nos da passagem da corrente eléctrica se houver libertação de
bolhas no interior da tina, resultantes da hidrólise da água (há libertação de bolhas de oxigénio e de hidrogénio).

9. Coloração do DNA
a) Remover a solução tampão TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizações (tem que se ter
o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).
b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfície do gel (ver nota para o professor
5).
c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.
d) Retirar o corante da superfície do gel e guarda-lo para posterior reutilização, anotando no frasco o
nº de vezes que este já tinha sido utilizado.
e) Retirar o corante da superfície do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.
f) Eliminar o álcool e lavar o gel com água corrente, durante 3 ou 4 minutos, não deixando água no
gel, para que não seja removido do gel a totalidade do corante.
g) Aguardar até que as bandas se tornem visíveis.
h) Observar os resultados.
i) Registar o número de bandas na respectiva árvore genealógica.

Nota para o professor 5

Se a coloração for feita com GelRed, ou com GelGreen, a quantidade de DNA a pipetar é de 5 µL (passo1 do

procedimento experimental). Deve adicionar-se 5 µL de GelRed/GelGreen ao gel de 50mL antes de este polimerizar. Quando
tiver terminado a electroforese, deverá observar-se as bandas obtidas utilizando um transiluminador UV, ou um leitor com luz
azul, respectivamente.

22
 Guião do Professor

Parte V – Análise e discussão dos resultados

Após a realização dos procedimentos laboratoriais os alunos são convidados a debaterem um

conjunto de questões. Posteriormente será explorado um power-point “Kit BioExperimentando – Análise e
discussão da actividade experimental” (apêndice II), de consolidação e reflexão de toda a actividade
desenvolvida. O power-point pode ser obtido acedendo ao site http://bioexperimentando.blogspot.com.

Questões e explorar:

1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poços devidamente

assinalados.

2. Na árvore genealógica fornecida, registe o número de bandas obtido em cada indivíduo (para
cada amostra de DNA poderá visualizar uma, duas ou três bandas).

3. Indique, justificando, qual o modo de transmissão da doença.

4. Identifique os indivíduos que são portadores da doença.

5. Refira os indivíduos que podem ter falecido devido à doença “Raritose”.

6. Indique o genótipo e o fenótipo dos indivíduos 1, 15 e 22.

7. Comente a seguinte afirmação: A probabilidade de o André e a Ana terem um filho doente é igual
à probabilidade de terem um filho portador. (Sugestão: Faça um xadrez mendeliano).

8. A Ana e o André optaram na realidade pela realização de um teste genético, antes de terem filhos,
para saberem se há a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da família apoiam a
decisão tomada pelo casal, mas há outros membros que se opõem. Enumera dois argumentos que
possam ter sido referidos a favor da realização do teste genético e dois argumentos que possam ter
sido referidos contra.

9. Complete o V de Gowin relativo à actividade experimental desenvolvida.

23
10. Elabore uma resposta para a questão-problema formulada inicialmente “Será possível pela
análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?”
 Guião do Professor

Parte VI – Actividade complementar

Actividade complementar 1 – Mapeamento de plasmídios

Plasmídios e enzimas de restrição

O mapeamento de plasmídios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a indústria da
biotecnologia. Esta técnica permite aos biólogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso de
experiências de clonagem assim como identificar facilmente plasmídios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
genómico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmídico para simular como os verdadeiros perfis de
DNA são analisados.
Após o corte dos plasmídios pelas enzimas de restrição, estes podem ser ligados a um fragmento de DNA
proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrição. O
plasmídio resultante que possui DNA híbrido pode ser incorporado em células bacterianas (transformação).
O plasmídio híbrido replica-se na bactéria da mesma forma que o plasmídio original, incluindo o fragmento
de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmídio híbrido contém uma cópia do DNA estranho
incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi “clonado” e o plasmídio de DNA que o transporta é
designado “vector”.
Os plasmídios podem ser descritos em termos de localização dos locais de restrição usando simples
procedimentos e lógica. O procedimento geral é digerir um plasmídio com duas enzimas de restrição
separadamente e com as duas em simultâneo (digestão dupla). Os tamanhos dos fragmentos de DNA
resultantes são determinados usando a lógica para determinar a localização relativa dos locais de
restrição.
Uma vez que os plasmídios são circulares, o número de fragmentos representam o número de cortes ou
locais de restrição.

Ler um mapa de um plasmídio

Um mapa de um plasmídio contém informações relativas ao tamanho do plasmídio, aos genes presentes,
à origem do local de replicação, e aos locais de restrição para as enzimas de restrição. Os plasmídios
utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmídio pUC 18, o plasmídio pCR2.1.TOPO, e o plasmídio

24
 Guião do Professor

pCard (resulta da adição de um insert de 1500bp no plasmídio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a enzima de
restrição BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes plasmídios
(exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrição são marcados no mapa com um número que indica o
local de restrição. Uma vez que o plasmídio é circular, existe um local zero arbitrário. Todos os locais de
restrição são indicados com um número entre zero e o número total de pares de base do plasmídio. O
tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtracção (e nalguns casos adição) entre
pontos do plasmídio.

Plasmídios utilizados neste kit

O mapa de um plasmídio mostra as posições (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos locais onde o
plasmídio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrição. O nome do plasmídio e o seu tamanho
em pares de base de DNA é mostrado dentro do círculo, assim como a Origem de Replicação (Ori). Dois
dos plasmídios utilizados neste kit são plasmídios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 11 e 12).

Figura 11 – Plasmídio pUC 18

Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

25
 Guião do Professor

Figura 12: Plasmídio pCR2.1

Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

Questões:
1. A partir do mapa do plasmídio pCR2.1 enumere as enzimas de restrição que podem cortar o plasmídio.

2. Qual dos plasmídios, pUC 18 ou pCR2.1, é o maior e qual é o seu tamanho?

3. Utilizando o plasmídio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrição para a enzima AvaII.
Quantos locais de restrição existem? Se a enzima AvaII for usada para restrição deste plasmídio, quantos
fragmentos iremos obter?

4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrição do plasmídio pUC18 com a enzima AvaII.
Confirme que a soma dos fragmentos obtidos é igual ao tamanho total do plasmídio.

Proposta de solução

1. As enzimas que podem cortar o plasmídio são: Hind III; Kpn I; Sac I; BamH I; Spe I; EcoR V; Not I;
Xho I; Nsi I; Xba I; Apa I; Dra III; AspEI; Rsr II; Neo I; MscI; Bgl II; BssH II.

2. O plasmídio maior é o pCRr2.1 que apresenta 3929bp.

3. Existem dois locais de restrição para a enzima AvaII. Iremos obter dois fragmentos.

4.

Tamanho do 1ºfragmento: 2059-1837=222bp

Tamanho do 2ºfragmento: 3900-222=3678bp

3678+222=3900bp

26
 Guião do Professor

Actividade complementar 2 – Actividade pDRAW

1. Instale o programa pDRAW no seu computador. O programa é gratuito e terão que ser
feitas as actualizações.

27
 Guião do Professor

Parte VII - Glossário

Glossário

Ácido desoxirribonucleico – vulgarmente conhecido por DNA, é um polímero orgânico complexo formado por duas
cadeias de nucleótidos emparelhadas entre si, com uma disposição antiparalela. Cada nucleótido que constitui o DNA é
composto por um açúcar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,
guanina e citosina).

Ácido ribonucleico – vulgarmente conhecido por RNA, é um polímero orgânico formado por uma cadeia simples de
nucleótidos. Cada nucleótido que constitui o RNA é composto por um açúcar, a ribose, um grupo fosfato e uma das
quatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).

Adenina – base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Agarose – polímero constituído por unidades de galactose. Após dissolução em água a ferver, seguido de
arrefecimento, toma uma consistência gelatinosa.

Alelos – formas diferentes de um determinado gene.

Base Azotada – moléculas que entram na constituição dos ácidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro bases
azotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina são bases complementares, emparelhando entre
si. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.
No RNA encontram-se também quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As bases
emparelham do mesmo modo que no DNA à excepção da adenina que vai emparelhar com o uracilo.

Cariótipo – conjunto dos cromossomas presentes nas células de cada ser vivo.

Centrómero – parte central dos cromossomas. O centrómero é importante no processo de mitose e de meiose para a
separação dos cromossomas.

Citosina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Co-dominância – situação em que há expressão individual dos dois alelos de um locus, num heterozigótico.

Cromatídio – componente de um cromossoma contendo uma molécula de DNA.

Cromatina – denso material do núcleo constituído principalmente por DNA e proteínas.

Cromossoma – estrutura filamentosa constituída por DNA associado a proteínas estruturais (histónicas e não
histónicas). Os cromossomas encontram-se no núcleo das células eucarióticas.

Cromossoma homólogo – cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idênticos, que apresenta os
mesmos loci genéticos. Cada cromossoma de um desses pares é homólogo do outro e emparelha com ele durante a
meiose.

DNA – ver ácido desoxirribonucleico.

DNA fingerprinting – técnica de separação de segmentos de DNA que permite a identificação genética dos
indivíduos.

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DNA polimerase – enzima presente nas células procarióticas e eucarióticas, responsável pela polimerização das novas
cadeias de DNA.

Dominante – refere-se a um carácter que se exprime quando há heterozigotia para o gene que o determina. A
expressão ocorre na presença de uma cópia normal do alelo.

Enzimas de restrição - enzimas responsáveis por cortar o DNA. Estas enzimas são produzidas por bactérias e
recebem o nome da espécie da bactéria de onde foram extraídas. Enzimas de restrição diferentes reconhecem e cortam
DNA em diferentes sequências de bases.

Electroforese – é uma técnica que permite a separação de moléculas (DNA, proteínas…) de acordo com o tamanho,
carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente eléctrica. As moléculas vão movimentar-se no meio de
suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as características que
apresentam (tamanho, carga e forma).

Engenharia genética – manipulação do material genético.

Feniltiocarbamida – a feniltiocarbamida (PTC) é uma proteína, descoberta na década 30,

Fenótipo – características observáveis num organismo. O fenótipo resulta da combinação de factores genéticos e
ambientais.

Gene – é a unidade básica da hereditariedade. Corresponde a uma sequência nucleotídica de DNA que codifica uma
determinada sequência polipeptídica, responsável por determinada característica ou função no organismo. Cada gene
encontra-se num local específico de um cromossoma (locus) e pode apresentar várias variantes (alelos) que
determinam uma forma particular dessa característica (exemplo: a característica “cor dos olhos” pode ter vários alelos:
alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).

Genética – ciência que estuda os genes e a hereditariedade.

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Genótipo – constituição génica de um indivíduo no que diz respeito aos alelos de um locus.

Guanina - base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA

Hereditariedade – mecanismo através do qual as características genéticas passam dos progenitores para os
descendentes.

Heterozigótico – um indivíduo diz-se heterozigótico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.

Histona – proteínas básicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Têm baixo peso molecular, e são ricas nos
aminoácidos lisina ou arginina.

Homozigótico – um indivíduo diz-se homozigótico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.

Locus – localização de um gene num cromossoma.

Primer – pequena sequência específica de oligonucleótidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o início da síntese da
cadeia complementar pela DNA polimerase.

Reacção de polimerização em cadeia (PCR) - reacção que permite a amplificação de porções específicas de DNA
que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.

Recessivo – gene ou carácter que só se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presença de um único alelo no
genoma).

RNA – ver ácido ribonucleico.

SNP (Single nucleotide polymorphism) – variação numa sequência de DNA que envolve uma alteração num único
nucleótido.

Southern blot – método descrito por E.Southern em que fragmentos de restrição são separados num gel de
electroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana é posteriormente
tratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequência de bases conhecida, e complementar ao DNA
contido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA é
marcada radioactivamente para permitir a sua detecção.

Taq polimerase – é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da
técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus. A Taq
polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).

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 Guião do Professor

Teste genético – teste que permite detectar a presença, ausência ou alteração, num gene particular, cromossoma ou
num produto genético.

Timina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA (ausente no RNA).

Uracilo – base azotada pirimídica encontrada nos nucleótidos do RNA.

Apêndices:
Apêndice I

Guia prático de microbiologia

Meio Liquido

Culturas líquidas de E.coli, podem geralmente fazer-se crescer no meio LB (Luria-Bertani). Há diferentes
meios LB, com diferentes composições. Fórmulas diferentes contêm diferentes concentrações de NaCl e
dão origem a quantidades variadas de DNA plasmídico. Para obter grande quantidade de DNA plasmídico
a composição LB recomendada é a seguinte:

Composição do meio LB por litro

Triptona 10 g
Extracto de
5g
levedura
NaCl 10 g

Tabela 1: Composição do meio LB por litro

Preparação do meio LB

Para preparar um litro de meio LB, adicione 10g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura a
950 mL de água destilada e desionizada, e agite até se dissolver. Ajuste o volume da solução para um litro
com água destilada e desionizada. Decante para pequenos reservatórios e esterilize na autoclave.

Nota 1: é aconselhável autoclavar o meio líquido em vários frascos pequenos, do que apenas num frasco
grande, para evitar uma possível contaminação de todo o meio. Depois de autoclavar, não utilizar o meio
durante 24 h para garantir que está devidamente esterilizado e livre de contaminação por microorganismos.

Esterilização do meio

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 Guião do Professor

Esterilize o meio líquido ou sólido na autoclave, utilizando uma pressão e um período de tempo adequado
ao tipo de meio, tamanho do frasco, e tipo de autoclave.

Nota 2: Encha apenas ¾ da capacidade dos frascos com meio, e solte as rolhas antes de autoclavar para
evitar que o meio a ferver verta para fora. Aperte as rolhas quando o meio estiver frio (por volta dos 40ºC)
para o manter completamente estéril.

Nota 3: Os antibióticos e os nutrientes como os aminoácidos são inactivados pelas altas temperaturas de
uma autoclave. Eles devem ser adicionados ao meio frio e autoclavado a partir de soluções stock
adequadas.

Meio sólido

Estirpes de E. coli podem geralmente ser riscadas e armazenadas em placas de petri com meio LB que
contenham 1,5% de agar e o antibiótico apropriado.

Preparação: prepare o meio LB de acordo com a composição dada na tabela acima. Mesmo antes de
autoclavar, adicione 15 gramas de agar por litro e misture. Depois de autoclavar, agite o meio suavemente
para distribuir o agar dissolvido por toda a solução. Tenha o cuidado para que o líquido quente não verta
para fora enquanto o agita.

Nota 4: Deixe arrefecer o meio de agar autoclavado até aos 50ºC, antes de adicionar antibióticos e nutrientes
sensíveis ao calor. Misture muito bem.

Nota 5: Faça o plaqueamento das placas com o meio numa câmara de fluxo laminar, ou numa superfície
limpa, próximo de uma chama. Use 30-35 mL de meio para placas de petri de 90mm de diâmetro (1 litro de
meio dá para cerca de 30 placas).

Nota 6: Após o plaqueamento, quaisquer bolhas de ar podem ser removidas passando rapidamente uma
chama perto da superfície da placa. Não se deve demorar com a chama pois esta pode destruir os
antibióticos.

Seque as placas directamente quer após a solidificação ou logo antes de usar removendo as tampas e
colocando as placas na câmara de fluxo laminar durante 1 hora. Em alternativa, se não houver câmara de
fluxo laminar, as placas podem ser secas com as tampas ligeiramente abertas numa estufa a 37ºC durante
30 minutos, ou deixe-as invertidas com as tampas à temperatura ambiente durante 2-3 dias.

Nota 7: Guarde as placas invertidas a 4ºC, protegidas da luz, para preservar os antibióticos sensíveis à luz.
Não guarde as placas por períodos superiores a 3 meses, já que os antibióticos podem degradar-se.

Antibióticos

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Estirpes bacterianas que contêm plasmídios ou genes com marcadores selectivos de antibióticos devem
sempre ser postas num meio de cultura liquido ou sólido que contenha o agente selectivo. Os antibióticos
devem ser adicionados ao meio apenas quando este estiver a uma temperatura abaixo dos 50ºC.

Antibiótico Soluções stock Concentrações a utilizar (diluidas)

Concentração Armazenamento
Ampicilina
50 mg/mL em água -20ºC 100 ug/mL (1/500)
Clorofenical
34 mg/mL em etanol -20ºC 170 ug/mL (1/200)
Kanamycin
10 mg/mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Streptomycin
10 mg /mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Tetraciclina
5 mg/mL em etanol -20ºC 50 ug/mL (1/100)

Tabela 2: concentrações de antibióticos frequentemente utilizados

Culturas “Stab”

As estirpes de E.coli podem ser mantidas durante um ano em cultura “Stab”. As culturas “Stab” são
utilizadas para transportar bactérias de uns laboratórios para outros.

Preparação das culturas “Stab”:

1. Preparar e autoclavar o meio LB como descrito anteriormente,
tendo em conta que se pretende um meio LB que contenha 0,7% de agar.
2. Arrefecer o meio LB até cerca dos 50ºC, e adicionar o
antibiótico apropriado. Enquanto o agar ainda estiver líquido,
adicionar 1 mL de agar para um tubo de 2 mL, em condições estéreis,
e deixar solidificar.
3. Com uma ansa esterilizada, retirar uma única colónia
de bactérias de uma placa de petri e introduzir a ansa no fundo do frasco
com agar diversas vezes (figura 1).
4. Incubar o tubo a 37ºC durante 8 a 12 h deixando a tampa
do tubo ligeiramente aberta.
5. Após incubação, retirar o tubo, apertar muito bem a tampa,
Figura 1- Inoculação de uma cultura “Stab”
e guardar no escuro a uma temperatura de 4ºC. Fonte da imagem: www.qiagen.com

Placas de agar

Placas com riscado de bactérias podem ser seladas com Parafilme, e guardadas invertidas a 4ºC durante
várias semanas.
O riscado de bactérias deve ser sempre feito em placas que contenham o antibiótico apropriado.

Para se obter colónias de bactérias bem isoladas, riscar uma placa de agar como se descreve de seguida:

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1. Passar uma ansa de inoculação pela chama, e arrefece-la

numa placa esterilizada que contem agar, mas que não vá ser utilizada.
2. Utilizando a ansa, proceder ao riscado de bactéria
(a partir de uma cultura stock em glicerol, cultura “Stab” ou de uma
colónia isolada de outra placa) a partir de uma canto da placa de
agar fresco.
3. Passar a ansa pela chama mais uma vez e arrefece-la.
Passar a ansa sobre o primeiro riscado e riscar de novo a partir
de um canto fresco da placa.
4. Repetir o processo até formar o padrão visível na figura 2. Figura 2: Riscado de bactérias em
placas de agar
5. Incubar a placa invertida a 37ºC durante 12 a 24 h, até as colónias
Fonte da imagem: www.qiagen.com
se desenvolverem.

Apêndice II

Power-Point nº 1 – “Kit BioExperimentando - Preparando a actividade experimental”

Este documento é uma sugestão de exploração do power-point ”Preparando a actividade experimental”, a

utilizar antes da realização da actividade laboratorial.
O objectivo deste power-point é servir como introdução teórica à actividade, recordando termos e
conceitos já abordados nas aulas de Ciências Naturais do 9ºano, de Biologia-Geologia do 10º e 11º ano e
nas aulas de Biologia do 12ºano. Para além disso, o power-point permitirá fazer uma breve abordagem ao
trabalho laboratorial, fazendo referência às técnicas a utilizar. Por último será levantada a questão-
problema, para a qual os alunos deverão encontrar resposta com a execução da actividade laboratorial.

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Apêndice III

Power-Point nº 2 – “kit BioExperimentando – Análise e discussão da actividade experimental”

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Neste momento, o professor poderá levantar outras questões éticas relacionadas com a realização de testes
genéticos:
Dilemas relacionados com o sigilo médico.
Permanecer na ignorância vs atitude responsável.
Dilemas relacionados com as seguradoras.
Confidencialidade por medo de discriminação.

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Anexo I
Plamídios utilizados

1) pUC 18

Plasmídio pUC 18
Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

2) pCR 2.1

Plasmídio pCR2.1
Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

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 Guião do Professor

Referências Bibliográficas

(1) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento

da Educação Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

(2) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular

http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Para mais informações consultar:

Bailey J (1995) A Genética – A Nova Enciclopédia das Ciências, Círculo de Leitores.

Regateiro F (2003) Manual de Genética Médica - Imprensa da Universidade de Coimbra.

Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory.

Videira A (2001) Engenharia Genética – Princípios e Aplicações, Lidel.

Corantes
Biotium Microbiologia
www.biotium.com
QIAGEN News
Carolina www.qiagen.com
http://www.carolina.com

BioRad Plasmídios
http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
Invitrogen
www.invitrogen.com
Biotecnologia – conceitos e técnicas
The European Initiative for Biotechnology Education Source BioScience ImaGenes
http://www.eibe.info/ http://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

Learn.Genetics - Science Learning Center

http://learn.genetics.utah.edu/

Roy J. Carver Biotechnology Center

http://www.biotech.uiuc.edu/

Orientações curriculares do Ministério da Educação

Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular
http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da Educação

Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

Kits comerciais
Nature`s dice – Teacher`s guide
http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf

Bio-Rad Laboratories
http://www3.bio-rad.com

Testes genéticos
Understanding Gene Testing
http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php

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