TEHNIKE MOLEKULARNE GENETIKE U MEDICINI

TEHNIKA REKOMBINANTNE DNA

Tehnika u kojoj je fragment DNA molekule iz donorske stanice ili organizma izoliran i onda umetnut u
DNA druge stanice. Tehnika se koristi za poboljšanje karakteristika nove stanice ili jednostavno za
proizvodnju proteina koji su potrebi čovjeku. Npr. modificira se organizam da proizvodi inzulin.
Tehnika se temelji na 4 temeljna principa.

Prvo: Fragment DNA se mora dobiti iz donorske stanice.

Drugo: Odgovarajući plazmid se mora dobiti od bakterije jer ih koristimo kao vektore za prijenos
gena kojeg smo dobili iz donorske DNA u stanicu koja je DOMAĆIN.

Treće: Fragment DNA (donorski) se mora presjeći koristeći enzime nazvane RESTRIKCIJSKI ENZIMI /
DNA ŠKARE. Isti taj enzim reže i plazmid.

Četvrto: Fragment DNA se pomoću DNA LIGAZE povezuje s plazmidom.

Restrikcijski enzimi/ restrikcijske endonukleaze mogu djelovati tako da režu DNA „ravno“ pa
dobijemo neljepljive odnosno TUPE krajeve, a neki mogu rezati „cik cak“ pa dobijemo LJEPLJIVE
krajve.

Kako bi sačuvala svoju DNA a rezao DNA faga, bakterija posjeduje i RESTRIKCIJSKO-MODIFIKACIJSKE
ENZIME koji metiliraju staničnu DNA i tako je zaštićuju.

HIBRIDIZACIJA DNA

SOUTHERN BLOT

- Molekularna genetička metoda koju koristimo za detekciju specifičnih gena u staničnoj DNA.

- Prvo DNA molekulu koju želimo analizirati moramo pomoću restrikcijskih endonukleaza
rastaviti na fragmente koje zatim moramo odvojiti pomoću gel elektroforeze. Nakon gel
elektroforeze, na gel stavimo najlon i celulozni filtar, na koji se prenose fragmenti DNA. Taj
filtar onda inkubiramo s obilježenom sondom/probom koja će hibridizirati s onim djelovima
DNA gdje će se pronaći komplementarni slijed nukleotida.

NOTHERN BLOT

- Kad umjesto DNA želimo detektirati RNA molekule. Ukupna stanična RNA se izolira i razdvoji
pomoću gel elektroforeze. RNA se prenosi na filtar i detektira hibridizacijom s kloniranom
sondom. Koristi se za analizu ekspresije gena npr. kad želimo utvrditi je li specifična mRNA
prisutna u različitim tipovima stanica.

WESTERN BLOT

- Metoda koja se ne koristi za analizu nukleinskih kiselina već PROTEINA

- Imamo prvo nakupinu proteina i zapravo pomoću ove metode iz te nakupine detektiramo
samo jedan protein.
 - Ovoj metodi prethodI SDS PAGE metoda.

HIBRIDIZACIJA S DNA MIKROČIPOVIMA

- Metoda koja omogućava analizu mnoštvo gena istovremeno

- DNA mikročip se sastoji od PREDMETNOG STAKLACA (MEMBRANA) na koju su utisnuti

fragmenti cDNA.

- Primjenjujemo metodu pri analizi ekspresije gena

PCR METODA

REAL-TIME PCR

- Modificirani oblik PCR metode zvan i kvantitivan PCR (qPCR)

- Oblik promatranja amplifikacije DNA tijekom PCR metode u stvarnom vremenu dok kod
koncencionalnog PCR njegovi produkti idu dalje u elektroforezu i tek su onda promatrani.

RT- PCR – reverzna transkripcija

- Stvara se cDNA iz RNA