TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

DỰ THẢO
TCVN 8685-XX : 2019

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN –

PHẦN XX: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC PHÒNG BỆNH MAREK Ở GÀ
Vaccine testing procedure –
Part XX: Marek Disease Vaccine, live

HÀ NỘI – 2019
TCVN 8685-XX : 2019

2
 TCVN 8685-XX : 2019

Lời nói đầu

TCVN 8685-XX : 2019 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 -
Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng
cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ
công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3 : 2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở
gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34
F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm
A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long
móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà
(coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13 : 2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn
hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể
kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do
pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

3
 TCVN 8685-XX : 2019

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi
truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng
phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20 : 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh
Newcastle;

- TCVN 8685-21 : 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22 : 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng
ở gia cầm;

- TCVN 8685-23 : 2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella
enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24 : 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella
typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25 : 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26 : 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm
thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27 : 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế
quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28 : 2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29 : 2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền
nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30 : 2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy
truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31 : 2019, Phần 31 Vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32 : 2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma
gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33 : 2018, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Riermerella
anatipestifer.

4
TCVN 8685-XX : 2019

5
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-XX : 2019

Quy trình kiểm nghiệm vắc xin –

Phần XX: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà
Vaccine testing procedure – Part XX: Marek Disease Vaccine, live

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định quy trình kiểm nghiệm vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công
bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản
mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011 “Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y – Phép thử độ thuần khiết”

3 Ký hiệu và chữ viết tắt

PBS Phosphate Buffered Saline

PFU Plaque-forming Unit

VNT Viral Neutralization Test

TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50

FBS Fetal Bovine Serum

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media

CPE Cytopathic Effect

4 Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng các phương pháp phân tích trong
phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu tính an toàn và tính hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí
nghiệm.

5 Vật liệu và thuốc thử

5.1 Gà 1 ngày tuổi, gà khỏe, không có kháng thể kháng vi rút Marek

5.2 Tế bào xơ phôi gà 1 lớp

5
 TCVN 8685-XX : 2019
5.3 Môi trường nuôi cấy tế bào

5.4 Dung dịch PBS pH 7,2

6 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 

6.1 Micropipet đơn kênh, dung tích từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl

6.2 Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl

6.3 Máy ly tâm, có thể quay với tốc độ từ 1000 rpm đến 3000 rpm

6.4 Ống ly tâm vô trùng

6.5 Bơm tiêm 1 lần, dung tích 1 ml, 3 ml, 5 ml, 10 ml

6.6 Cốc có mỏ vô trùng

6.7 Buồng cấy sinh học

6.8 Tủ ấm duy trì nhiệt độ 37 ºC

7 Cách tiến hành

7.1 Kiểm tra cảm quan

7.1.1 Vắc xin dạng đông lạnh

Quan sát bằng mắt thường, khi vắc xin được giải đông: hỗn dịch đồng nhất, không đông vón, không
lắng cặn.

7.1.2 Vắc xin dạng đông khô

Kiểm tra bằng mắt thường: vắc xin dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ.

7.2 Kiểm tra vô trùng

Theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011, vắc xin đạt chỉ tiêu kiểm tra vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn
hay nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3 Kiểm tra tính an toàn

7.3.1 Tiêm cho 10 gà (5.1), mỗi con 10 liều vắc xin ghi trên nhãn theo đường dưới da.

7.3.2 Theo dõi toàn bộ lợn thí nghiệm trong 21 ngày.

7.3.3 Đánh giá kết quả: vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn khi tất cả gà (7.3.1) sống khỏe, phát triển bình
thường, không có biểu hiện khác thường cũng như không có biểu hiện triệu chứng của bệnh Marek
gây ra.

7.4 Kiểm tra hiệu lực

7.4.1 Cách tiến hành

6
 TCVN 8685-XX : 2019
- Sử dụng 30 gà (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 20 gà, mỗi con được tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo đường dưới da;

+ Nhóm 2: gồm 10 gà làm đối chứng, tiêm dung dịch PBS (5.4) theo đường dưới da với liều lượng như
gà nhóm 1.

- Hiệu lực của vắc xin được đánh giá bằng 1 trong 2 phương pháp sau:

+ Phương pháp trung hoà:

Sau khi tiêm vắc xin từ 28 ngày đến 35 ngày, tất cả gà nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu, thu huyết
thanh, kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp trung hoà với chủng vi rút vắc xin.

+ Phương pháp chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin:

Mỗi liều vắc xin có ít nhất 1000 PFU

7.4.2 Đánh giá kết quả

Vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực khi ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 1 không xuất hiện
Plaque; trong khi đó ít nhất 80 % mẫu huyết thanh của gà nhóm 2 âm tính (xuất hiện Plaque)(tham
khảo phụ lục A, B).

8 Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, an toàn
và hiệu lực như đã nêu ở mục 7.1, 7.2, 7.3 và 7.4.

7
 TCVN 8685-XX : 2019

Phụ lục A
(Quy định)
Phản ứng trung hòa vi rút (Viral Neutralization Test - VNT)

A.1 Chuẩn bị tế bào mật độ 10x106 cells/ml

Bước 1. Bộc lộ phôi: Dùng panh đập vỏ trứng phía buồng hơi và bộc lộ màng cứng. Lấy panh cong gắp phôi
ra ngoài, tập trung phôi vào cốc đong.
Rửa phôi bằng dung dịch PBS 1X, thực hiện 2-3 lần.
Gắp phôi ra đĩa lồng. Dùng kéo nhọn loại bỏ chân, tay, đầu, cơ quan nội tạng.
Rửa phôi bằng dung dịch PBS1X, với lượng 10 ml/ phôi/ lần rửa.
Dùng kéo cắt nhỏ phôi.
Chuyển phôi sau khi cắt nhỏ vào bình tam giác chuyên dùng để trypsin. Thêm PBS1X với lượng 10ml/ phôi.
Rửa phôi bằng máy khuấy từ trong vòng 10 min. Sau đó để lắng, loại bỏ dịch nổi giữ lại cặn.
Bước 2. Trypsin hóa tách tế bào: Dùng Trypsin 1X để tách tế bào sau khi đã rửa với PBS1X. Lượng trypsin 1X
là 7 ml/ phôi. Giữ bình trypsin ở nhiệt độ 37 0C trong khoảng 15-20 min. Quan sát tế bào đã được trypsin hoàn
tất. Dùng một lượng 2 % FBS so với lượng trypsin đã dùng để trung hòa dung dịch.
Bước 3. Loại bỏ trypsin: Ly tâm tế bào sau trypsin 1500 vòng/ min, trong 15 min ở nhiệt độ 4 0C. Loại bỏ
huyễn dịch, thu cặn tế bào.
Bước 4. Cân bằng môi trường và đếm số tế bào: Rất nhẹ nhàng, hòa tan tế bào trong 6 ml môi trường đầy
đủ (dùng pipet 5 ml). Đếm tế bào: Pha loãng tế bào 100 lần (10 l trong 990 l môi trường không đầy đủ), dùng
buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào có trong 1 ml.
Bước 5. Cấy chuyển tế bào: Pha loãng tế bào đến 10x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ (5-10 % huyết
thanh bào thai bò), vừa đủ thể tích cần nuôi cấy. Bảo quản tế bào ở nhiệt độ 2-8 0C để thực hiện các bước pha
loãng huyết thanh.

A.2 Pha loãng huyết thanh

1. Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100 TCID 50 trong môi trường DMEM.

Lượng dung dịch vi rút với 100 TCID 50 cần cho một đĩa phản ứng 96 giếng là 5 ml.

2. Thực hiện trên đĩa phản ứng: huyết thanh pha loãng bắt đầu từ 1/4 đến 1/512.

8
 TCVN 8685-XX : 2019

Hình A.1 – Sơ đồ đĩa phản ứng

CHÚ THÍCH:

Cột: từ cột 1 đến cột 12                        Hàng: từ hàng A đến hàng H

Bảng A.1 - Sơ đồ đĩa phản ứng bố trí mẫu thực hiện

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 ĐC ĐC

MT TB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/2 A
1/4 B
1/8 C
1/32 D
1/64 E
1/128 F
1/256 G
1/512 H
Bảng A.2 - Sơ đồ đĩa phản ứng bố trí mẫu đối chứng

Mẫu ĐC + Mẫu ĐC - ĐC TB/ ĐC -1 -2 -3 -4

MT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1/2 A
1/4 B
1/8 C
1/32 D
1/64 E
1/128 F
1/256 G

9
 TCVN 8685-XX : 2019
1/512 H
- Cho 150 μl môi trường DMEM vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9 và A11.

- Cho 100 μl môi trường DMEM vào các giếng từ B1 đến H1, từ B3 đến H3, từ B5 đến H5, từ B7 đến H7, từ B9
đến H9 và từ B11 đến H11.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 01 vào giếng A1.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 02 vào giếng A3.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 03 vào giếng A5.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 04 vào giếng A7.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 05 vào giếng A9.

- Cho 50 μl mẫu huyết thanh 06 vào giếng A11.

- Sử dụng pipet 12 kênh pha loãng bậc 2 mẫu huyết thanh từ A1 đến H1, từ A3 đến H3, từ A5 đến H5, từ A7 đến
H7, từ A9 đến H9 và từ A11 đến H11 và loại bỏ 100 μl. Sau khi pha loãng xong, sử dụng pipet 8 kênh chuyển 50
μl mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2, từ cột 3 sang cột 4, từ cột  5 sang cột 6, từ cột 7 sang cột 8,
từ cột 9 sang cột 10 và từ cột 11 sang cột 12.

a) Cho 50 μl dung dịch vi rút với 100 TCID50 vào các giếng.

b) Ủ đĩa ở 37°C/3 – 5 % CO2/45 - 60 min.

c) Sau khi ủ xong, cho 50 μl DMEM chứa tế bào CEF vào tất cả các giếng.

d) Ủ đĩa ở 37°C/3 – 5 % CO2/48-72 h

e) Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào
chết nhiều).

A.3 Thực hiện trên đĩa đối chứng

a) Đối chứng huyết thanh

- Cho 150 μl môi trường DMEM vào giếng A1.

- Cho 100 μl môi trường DMEM vào các giếng từ B1 đến H1.

- Cho 50 μl huyết thanh đối chứng vào giếng A1. Tiến hành pha loãng bậc hai từ A1 đến H1 và loại bỏ 100
μl ở giếng H1.

- Sau khi pha loãng xong, sử dụng pipet 8 kênh chuyển 50 μl mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút với 100 TCID50 vào các giếng từ A1 đến H2.

- Ủ đĩa ở 37 0C /3 – 5 % CO2/45 - 60 min

10
 TCVN 8685-XX : 2019
b) Đối chứng tế bào

- Cho 100 μl môi trường DMEM vào giếng A4 đến H5.

- Ủ đĩa ở 37 0C /3 – 5 % CO2/45 - 60 min.

c) Đối chứng môi trường

- Cho 150 μl môi trường DMEM vào giếng A6 đến H7.

- Ủ đĩa ở 370C /3 – 5 % CO2/45 - 60 min.

d) Chuẩn độ lại vi rút sử dụng

- Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10 -1 đến 10-8

- Cho 50 μl môi trường DMEM vào các giếng từ A9 đến H12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-1 và các giếng từ A9 đến A12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-2 và các giếng từ B9 đến B12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-3 và các giếng từ C9 đến C12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-4 và các giếng từ D9 đến D12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-5 và các giếng từ E9 đến E12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-6 và các giếng từ F9 đến F12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-7 và các giếng từ G9 đến G12.

- Cho 50 μl dung dịch vi rút pha loãng 10-8 và các giếng từ H9 đến H12.

- Cho 50 μl môi trường DMEM vào các giếng từ G9 đến H12.

- Ủ đĩa ở 37 0C /3 – 5 % CO2/45 - 60 min.

e) Sau khi ủ xong, cho 50 μl DMEM chứa tế bào CEF vào tất cả các giếng từ A1 đến H2, từ A4 đến H5 và từ A9
đến H12.

- Ủ đĩa ở 37 0C /3 – 5 % CO2/24 - 48 h.

- Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để xem tế bào có ảnh hưởng bởi độc tố không (tế bào
chết nhiều).

A.4. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng.

Điều kiện chấp nhận kết quả:

+ Đối chứng tế bào: bình thường

11
 TCVN 8685-XX : 2019
+ Đối chứng môi trường: bình thường

+ Đối chứng tế bào và môi trường: bình thường

+ HG của mẫu đối chứng huyết thanh dương chuẩn chỉ chênh lệch ±1 độ pha loãng bậc 2 so với hiệu giá đã
biết;

+ HG chuẩn độ lại của vi rút nằm trong khoảng log10 HGVR đã biết ±5.

Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược không có bệnh tích tế bào (không có
CPE).

Kết quả âm tính là những giếng khi xem dưới kính hiển vi soi ngược có bệnh tích tế bào (có CPE).

Bệnh tích tế bào được ghi nhận vào phiếu kết quả. Kết quả được tính bằng công thức Karber (1931).

TCID50 = a + 0,5 - 1/n x ∑rl

Trong đó:

a là độ pha loãng cao nhất có bệnh tích tế bào;

rl là số giếng không có bệnh tích tế bào ở từng độ pha loãng;

n là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng.

12
 TCVN 8685-XX : 2019

Phụ lục B
(Quy định)
Chuẩn độ hàm lượng vi rút vắc xin

B.1 Nguyên vật liệu

Tế bào: Tế bào xơ phôi gà một lớp

Vi rút: Vi rút Marek chủng ...

Hóa chất: DMEM 2X, DMEM 1X, Hepes, FBS, kháng sinh, kháng nấm, neutral red (Phenol Red),
crystalviolet, Trypsin, Agar Technical.

Dung dịch pha loãng vi rút DMEM 1X (dung dịch A)

Dung dịch DMEM 2X 10% FBS, kháng sinh kháng nấm (dung dịch B)

DMEM 2X 90ml

FBS 10ml

Agar Technical (Noble agar) 2 % (dung dịch C)

Agar 2g

Nước cất 2 lần 98ml

Hấp 121 0C trong 25-30 min. Để nhiệt độ 50-60 0C trong water bath đến khi sử dụng.

Agar 1 % trong dung dịch B (Dung dịch D)

Dung dịch B 50ml

Dung dịch C 50ml

Trộn đều giữ 40-45 0C cho đến khi cho vào đĩa

Chú ý: Nồng độ thạch sử dụng có thể dao động từ 0.6-1 %.

Agar 1 % trong DMEM 2X (dung dịch E)

DMEM 2X 50ml

Dung dịch D 50ml

Trộn đều giữ 40-45 0C cho đến khi bổ xung Neutral Red

Neutral Red 1 % hoặc Phenol Red (dung dịch F)

Neutral Red 0.1g

13
 TCVN 8685-XX : 2019
PBS 10ml

Lọc qua lọc 0.45 μm. Bảo quản 4 0C.

Neutral 1 % trong DMEM-Agar 1/200 (dung dịch G)

Dung dịch E 100ml

Dung dịch F 0.5ml

Dung dịch crystal violet (dung dịch H)

Crystal violet 1g

Formaline 270ml

Nước cất 730ml

Dụng cụ dùng một lần: Đĩa 6 giếng, Eppendorf, ống li tâm 15, ống li tâm 50, tip 200μl lọc, tip 100μl có
lọc, cốc xả thải, túi xả bẩn.

Máy móc thiết bị: Máy Vortex, Water Bath, Pipette các loại, tủ ấm CO2, tủ lạnh.

B.2 Phương pháp thực hiện

B.2.1 Chuẩn bị tế bào trên đĩa 6 giếng mật độ 10x106 cells/ml

Bước 1. Bộc lộ phôi: Dùng panh đập vỏ trứng phía buồng hơi và bộc lộ màng cứng. Lấy panh
cong gắp phôi ra ngoài, tập trung phôi vào cốc đong.

Rửa phôi bằng dung dịch PBS 1X, thực hiện 2-3 lần.

Gắp phôi ra đĩa lồng. Dùng kéo nhọn loại bỏ chân, tay, đầu, cơ quan nội tạng.

Rửa phôi bằng dung dịch PBS1X, với lượng 10ml/ phôi/ lần rửa.

Dùng kéo cắt nhỏ phôi.

Chuyển phôi sau khi cắt nhỏ vào bình tam giác chuyên dùng để trypsin. Thêm PBS 1X với lượng
10ml/ phôi. Rửa phôi bằng máy khuấy từ trong vòng 10 min. Sau đó để lắng, loại bỏ dịch nổi giữ lại
cặn.

Bước 2. Trypsin hóa tách tế bào: Dùng Trypsin 1X để tách tế bào sau khi đã rửa với PBS 1X.
Lượng trypsin 1X là 7ml/ phôi. Giữ bình trypsin ở nhiệt độ 37 0C trong khoảng 15-20 min. Quan sát tế
bào đã được trypsin hoàn tất. Dùng một lượng 2 % FBS so với lượng trypsin đã dùng để trung hòa
dung dịch.

Bước 3. Loại bỏ trypsin: Ly tâm tế bào sau trypsin 1500 vòng/ min, trong 15 min ở nhiệt độ 4 0C.
Loại bỏ huyễn dịch, thu cặn tế bào.

14
 TCVN 8685-XX : 2019
Bước 4. Cân bằng môi trường và đếm số tế bào: Rất nhẹ nhàng, hòa tan tế bào trong 6ml môi
trường đầy đủ (dùng pipet 5 ml). Đếm tế bào: Pha loãng tế bào 100 lần (10 l trong 990 l môi trường
không đầy đủ), dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào có trong 1 ml.

Bước 5. Cấy chuyển tế bào: Đánh dấu bình nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần
cấy chuyển). Pha loãng tế bào đến 10x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ (5-10 % huyết thanh bào
thai bò), vừa đủ thể tích cần nuôi cấy. Chia huyễn dịch tế bào vào các đĩa và chai nuôi cấy (2ml/giếng
đĩa, 6ml/chai T25, 15ml/ chai T75).

Bước 6. Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển: Giữ ở 37 0C, 5 % CO2, theo dõi sự phát triển của tế
bào. Trong khoảng 2 ngày tế bào bám đáy 100 % chuyển sang thực hiện Plaque.

B.2.2 Plaque

Bước 1: Pha loãng vi rút

Cho vào 8 ống eppendorf 900 l dung dịch A và đánh số thứ tự từ 1-8.

Chuyển vào ống 1 100l huyễn dịch vi rút Marek. Pippete vài lần. Vortex ống mẫu.

Lần lượt chuyển 100l huyễn dịch vi rút từ ống 1 sang ống 2. Thực hiện lần lượt cho đến ống 8.

Bước 2: Gây nhiễm vi rút trên đĩa 6 giếng

Loại bỏ môi trường trên đĩa 6 giếng.

Gây nhiễm 0.4 ml vi rút ở các nồng độ khác nhau/giếng, giếng đối chứng tế bào cho 0.4 ml
dung dịch A.

1 2 3

A 10-3 10-4 10-5

B 10-6 10-7 TB

Ủ 37 0C 5 % CO2 trong 1h.

Loại bỏ môi trường gây nhiễm.

Rửa 2 ml dung dịch A/giếng.

Bước 3: Phủ thạch

Cho vào mỗi giếng 2 ml dung dịch D.

Để nhiệt độ phòng trong 15-20 min cho đông thạch.

Lật ngược đĩa.

Nuôi tủ 37 0C 5 % CO2 trong 2 ngày.

15
 TCVN 8685-XX : 2019
Bước 4: Nhuộm tế bào

Phương pháp neutral Red: Cho 2 ml dung dịch G/giếng. Nuôi tủ 37 0C 5 % CO2 trong 1 ngày.
Đếm plaque sau 1 ngày

Phương pháp Crystal Violet thêm 2 ml dung dịch H/giếng. Để ở nhiệt độ phòng trên 12 h. Cho
đĩa vào khay nước loại bỏ thuốc nhuộm và loại bỏ lớp thạch phía trên. Đọc kết quả

Bước 5: Tính kết quả

Đơn vị mảng bám PFU/ml: X

Số mảng bám ở nồng độ pha loãng cao nhất : A

Độ pha loãng virus cao nhất mà vẫn còn mảng bám: B

Lượng virus gây nhiễm: n

X = A x 1/n x B (PFU / 1 ml)

Hoặc X = A x B ( PFU / 0.5ml)

Vd: tại nồng độ pha loãng 10-5 có số mảng bám là 14 và lượng virus gây nhiễm là 0.4 ml thì X
sẽ được tính là:

X = 14 x 1/0.4 x 105= 3.5 x 106 ( PFU/1ml)

16
 TCVN 8685-XX : 2019

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Asean Standard Requirements for Marek’s Disease Vaccine, live.

[2] OIE Terrestrial Manual, 2012, Marek’s disease, Chapter 2.3.13.
[3] 16VR-10KN1 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Marek nhược độc.
____________________

17