BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN

OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI
LANG CAO SẢN NHẬT BẢN
(IPOMOEA BATATAS L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2009

 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
……………………….

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN

OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI
LANG CAO SẢN NHẬT BẢN
(IPOMOEA BATATAS L.)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG

Buôn Ma Thuột, năm 2009

 i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan: ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các
số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các
ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

 ii

LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:

Người thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng ñã tận tình hướng
dẫn chỉ bảo và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận
văn.
TS. Phan Văn Tân ñã tạo ñiều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho tôi trong
thời gian học tập và thực hiện luận văn tại bộ môn sinh học thực vật.
ThS. Nguyễn Đình Sỹ ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong
suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tất cả các thầy cô giáo Khoa Sau ñại học, Khoa KHKT&CN Trường
Đại học Tây Nguyên.
Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị và các bạn ñồng nghiệp Trường
THCS Đoàn Kết ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi
trong suốt thời gian công tác và học tập.
Tất cả các anh, chị và các bạn trong lớp cao học Sinh học thực nghiệm
khóa 1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện luận văn.
Chị Tuyến, em Ngọc, em Bình ở Bộ môn Sinh học thực vật ñã tạo ñiều
kiện thuận lợi, ñộng viên và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian
thực hiện ñề tài này.
Cuối cùng xin gửi lòng biết ơn ñến tất cả những người thân trong gia
ñình ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi
học tập và làm việc trong suốt thời gian qua..
Xin chân thành cảm ơn!
NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN
 iii

MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt ..................................................................................................i
Danh mục ảnh ..................................................................................................ii
Danh mục bảng ................................................................................................iv
Danh mục hình .................................................................................................v

MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................3
1.1. Tổng quan về cây khoai lang .........................................................3
1.1.1 Đặc ñiểm sinh học ....................................................3
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang ...............7
1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang ........................8
1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang ............................9
1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................12
1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................12
1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô .........................14
1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................15
1.2.4 Các bước nhân giống invitro ..........................................15
1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy .................................................15
1.2.6. Mẫu cấy ...........................................................................17
1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật ................................18
1.2.8. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ............................19
1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................25
1.4 Sự phát sinh hình thái ..................................................................26
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam ..........28
 iv

1.6. Tổng quan về Chitosan .............................................................29

1.6.1. Công thức cấu tạo ......................................................29
1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan .................31
CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........40
2.1. Nội dung nghiên cứu ...................................................................40
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................40
2.2.1. Vật liệu, hóa chất ...........................................................40
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................41
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến
sức sống của mô nuôi cấy ........................................................41
2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường ñến sự hình thành
protocorm .................................................................................44
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt
thân khoai lang in vitro ......................................................46
2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai
lang in vitro ....................................................................48
2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer
ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy
mô ......................................................................................50
2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê ...............................................52
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................53
3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang ........................................................................53
3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ñến sức sống của
chồi mầm từ củ khoai lang .............................................. 53
 v

3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các
nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang ........................................................................... 57
3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng
ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang.............................................................................69
3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm
.............................................................................................................62
3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng ñến hình
thành chồi và rễ cây con trong in vitro .................................................65
3.3.1. Ảnh hưởng của N6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành chồi và tăng trưởng
chồi cây khoai lang ......................................................65
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác
nhau ñến sự hình thành rễ cây khoai lang ................................69
3.4. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả
năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô .......................................75
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................81
KẾT LUẬN .................................................................................................81
ĐỀ NGHỊ .....................................................................................................81
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................82
PHỤ LỤC
 vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Acid abscisic

BA N6 – benzyladenine
cs cộng sự
CV Coefficient of Variation
GA3 Gibberellin
MS Murashige và Skoog
NAA Napthalen acetic acid
IAA Idol – 3 – acetic acid
IBA Indol – 3 – btyric acid
TDZ Thidiazuron
JA Jasmonic acid
 vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ở các nồng ñộ và thời gian
khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy .........................................................................................55
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy .......................................................................59
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy .......................................................................61
Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm
sau 40 ngày nuôi cấy ............................................................................64
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ
ñốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy .....................67
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai
lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy ..............................................72
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy ......................................77
 viii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin ............................................19

Hình 1.2. Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp ............................19
Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin ............................................20
Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA4 thành các GA
khác .......................................................................................................21
Hình 1.5. Cấu trúc của ABA .......................................................................22
Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen .....................................................................22
Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ .........................................................................23
Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) .......................31
Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) ....................................31
Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) ...............31
Hình 1.11. Cơ chế hoạt ñộng của Chitosan ..................................................39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ñến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1% (A), 0.3% (B),
0.5% (C) ................................................................................................56
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy ......................................................................................60
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy .........................................................................................62
Hình 3.4. Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy ........................................68
 ix

Hình 3.5. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy ..........................68
Hình 3.6. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy .................... 72
Hình 3.7. Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy .............................................73
Hình 3.8. Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài
rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy ................73
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến chiều cao chồi của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày ....................................................78
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng chồi
tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày.
...............................................................................................................78
 1

MỞ ĐẦU
Khoai lang (Ipomoea batatas L. (Lam) là cây lương thực quan trọng ñược
trồng ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ la tinh. Khoai lang không
những chỉ có công dụng làm lương thực cho người, thức ăn cho gia súc mà
còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm. Người ta có thể
chế biến rượu, cồn, xiro ... từ khoai lang. Tinh bột khoai lang còn dùng trong
công nghiệp giấy và hồ sợi. Một số nước trên thế giới dùng khoai lang chế
biến axit xitoric, dextrin, lấy tinh bột dùng trong y học. Khoai lang chứa nhiều
men amilaza biến tinh bột thành ñường mạch nha nên là nguồn nguyên liệu
tốt cho công nghiệp sản xuất loại men này.
Theo thống kê 2006 của Sở Nông Nghiệp – PTNT Đăk Nông và Đăk
Lăk, khoai lang cao sản xuất khẩu ñang phát triển mạnh với diện tích ở tỉnh
Đăk Nông là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha. Trong thời kỳ ñầu, năng suất
khoai lang ñạt từ 20-25 tấn/ha, giá bán cho suất khẩu là 5 triệu ñồng /tấn, ñem
lại thu nhập cao cho nông dân. Tuy nhiên, sau 5 năm phát triển năng suất
khoai lang suy giảm gần 40-50%, chỉ còn 12-15 tấn/ha, làm giảm thu nhập
của người nông dân và sản suất không bền vững cả về kinh tế và môi trường.
Chitosan và chitosan oligomer là các chất hoạt hóa một số gen thực vật,
bằng cách tác ñộng trên promoter của trên 20 gen hệ thống ñề kháng của thực
vật ñể tăng cường tổng hợp enzyme chitanase, β- 1,3-glucanase, RNAse,
proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp lignin và kháng sinh thực vật
phytoalexin. Chính vì vậy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sức ñề
kháng của cây với các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus [41].
Chitosan và chitosan oligomer làm tăng khả năng kháng bệnh rỉ sắt
(Phakopspora foiae) của ñậu tương (N.A. Dung, 2002) [30]. Suwalee (2002)
công bố phun chitosan cho ngô với nồng ñộ 100 ppm có khả năng hạn chế
70% bệnh bạc lá[64]. Ngoài ra còn nhiều công bố khẳng ñịnh khả năng kháng
 2

nấm bệnh của chitosan ñối với thực vật, như kháng nấm pythium, Sclerotium,
Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A. Dung, 2004, R.D. Park, 2002).
Chitosan oligomer còn ñược coi là nhóm ñiều hòa sinh trưởng thực vật thế
hệ mới [68]. Chitosan oligomer có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng hàm
lượng diệp lục, tăng số lượng nốt sần cố ñịnh ñạm và tăng năng suất của lạc
[33]. Chitosan oligomer làm tăng cường ñộ quang hợp của lúa, lạc trong thủy
canh [42]. Chitosan oligomer làm tăng chiều dài rễ, kích thước cây con trong
nuôi cấy mô [50].
Với mục ñích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông
nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,
không sâu bệnh, giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi cấy mô. Chúng tôi ñề suất
nghiên cứu ñề tài: ‘‘Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy
mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’
Mục tiêu của ñề tài :
• Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào trong invitro.
• Đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung chitosan
oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang.
 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây khoai lang

1.1.1 Đặc ñiểm sinh học
Vị trí phân loại:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (class): Magnoliopsida
Bộ (ordo): Solonales
Họ(familia): Convolvulaceae
Chi (genu): Ipomoea
Loài (species): Ipomoea batatas L.
Khoai lang trên thế giới chủ yếu ñược phân bố ở các vùng nhiệt ñới,
á nhiệt ñới châu Á, châu Phi và châu Mỹ la tinh. Có nguồn gốc từ khu vực
nhiệt ñới Châu Mỹ, ñược con người trồng cách ñây khoảng 5000 năm. Nó
ñược phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Cariber, ñã
ñược biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polinesia.
Ngày nay khoai lang ñược trồng khắp trong các khu vực nhiệt ñới và ôn ñới
ẩm với lượng nước ñủ ñể hỗ trợ sự phát triển của cây. Nước ta nằm trong khu
vực nhiệt ñới gió mùa, nóng, ẩm, nhiệt ñộ cao, mưa nhiều, lượng mưa phân
bố tương ñối ñều nên rất thuận lợi cho cây khoai lang sinh trưởng và phát
triển, do ñó có thể trồng quanh năm.
Khoai lang (Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với rễ củ
lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ñược gọi là củ khoai lang và nó là một
nguồn cung cấp rau củ quan trọng, ñược sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn
lương thực. Các lá non và thân non ñược sử dụng như cũng ñược sử dụng như
 4

một loại rau. Khoai lang có họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) có
nguồn gốc Nam Mỹ.
Là cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình
trái tim hay lá xẻ thùy hình chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung
bình. Rễ củ ăn ñược, hình dạng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu
ñỏ, tía, nâu hay trắng, bên trong củ có màu vàng, trắng, cam, hay tím.
Khoai lang có khối lượng ñường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng
lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang ñược sử dụng củ và lá
ñể làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần ñây ñang
ñược nghiên cứu ñể làm màng phủ sinh học ( bioplastic).
Do ñặc ñiểm tính ña dạng của giống khoai lang, hơn nữa trong quá
trình trồng trọt do chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo nên ñã hình thành
nhiều loại hình, nhiều giống khác nhau.
Khoai lang không chịu ñược sương giá, phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ
trung bình khoảng 24 °C (75 °F). Khoai lang ít khi ra hoa nếu khoảng thời
gian ban ngày vượt quá 11 giờ. Chúng ñược nhân giống chủ yếu bằng các
ñoạn thân (dây khoai lang) hay rễ hoặc bằng các rễ bất ñịnh mọc ra từ các rễ
củ trong khi lưu giữ bảo quản. Trong các ñiều kiện tối ưu với 85-90 % ñộ ẩm
tương ñối ở 13-16 °C (55-61 °F), củ khoai lang có thể giữ ñược trong vòng 6
tháng. Nhiệt ñộ thấp hoặc cao hơn ñều nhanh chóng làm hỏng củ.
Khoai lang phát triển tốt trong nhiều ñiều kiện về ñất, nước và phân bón.
Nó cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc trừ dịch hại là ít khi phải dùng tới.
Do nó ñược nhân giống bằng các ñoạn thân nên khoai lang là tương ñối dễ
trồng. Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển của cỏ dại
nên việc diệt trừ cỏ cũng tiêu tốn ít thời gian hơn. Trong khu vực nhiệt ñới,
khoai lang có thể ñể ở ngoài ñồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu vực
ôn ñới thì nó thường ñược thu hoạch trước khi sương giá bắt ñầu. Khoai lang
 5

có khả năng thích ứng với nhiều loại ñất khác nhau, nhưng sinh trưởng tốt
nhất trên các loại ñất thoáng khí như ñất thịt nhẹ và ñất pha cát. Thời gian
sinh trưởng của cây khoai lang ngắn ngày nhưng lại cho năng suất cao, do ñó
cần phải bón nhiều phân và ñủ dạng cần thiết. Vì vậy, nói chung ñiều kiện
khí hậu, thời tiết ở nước ta cho phép trồng khoai lang quanh năm, nhưng cũng
cần lưu ý tới những ñặc ñiểm riêng của từng vùng khí hậu khác nhau ñể bố trí
thời vụ cho thích hợp.
 6

Ảnh 1.1. Cánh ñồng trồng khoai lang

Ảnh 1.2. Củ khoai lang cao sản Nhật Bản (Benniazuma)

 7

1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang
+ Kỹ thuật nhân giống thông thường:
Khoai lang ñược nhân giống vô tính bằng chồi củ giống và hom giống
của dây sau khi thu hoạch củ từ vụ trước. Ngoài các yếu tố về ñất ñai, thời vụ,
phân bón, kỹ thuật canh tác, ñặc ñiểm giống... thì ñộ dài và chất lượng hom
giống và cách trồng ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất củ.
Ở Malaysia, người ta trồng hom 6 mắt với ñộ sâu 2 mắt.
Ở Georgia thường trồng hom khoai lang dài 30 – 40cm với 2 – 3 mắt
dưới ñất cho năng suất cao hơn hom giống ngắn 20 – 25cm.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) khuyến cáo
trồng hom giống dài 30cm với 3 mắt dưới ñất.
Ở Trung Quốc, hom giống 7 mắt ñược sử dụng phổ biến trong sản
xuất.
Ở Việt Nam, phần lớn các qui trình hướng dẫn ñều cho rằng: hom
giống cắt dài 25 – 30cm ở ñoạn 1 và ñoạn 2 của những dây mập mạnh không
sâu bệnh. Trồng nông nối liền theo chiều dọc luống, mỗi mét dài trồng 5 hom
với khoảng cách từ 18 – 22cm, lấp ñất sâu 5 – 6cm.
Công ty thực phẩm Đà Lạt – Nhật Bản (DJF), ñơn vị trực tiếp nhập
giống và thu mua khoai lang nhật ñã hướng dẫn cách trồng khoai lang nhật
như sau: trồng cây cách cây 25cm, hàng cách hàng 1m, mật ñộ 25000 cây/ha.
Hom ñược cắt xong ñem về rãi nơi thoáng mát từ 1 ñến 2 ngày trước khi
trồng sẽ giúp hom nhanh ra rễ, nảy chồi hơn.
Theo kinh nghiệm trồng khoai lang giống Nhật Bản ở xã Đăc Bup So,
huyện Tuy Đức, tỉnh ĐăkNông thì trước hết là cách ñặt giống, bao giờ cũng
lấp ñất phủ hết, chỉ ñể ngọn nhô lên 3 -5cm, nếu ñể ngọn nhô lên quá cao thì
hom dễ bị táp nắng và dễ bị sâu ñục thân dẫn ñến suy dinh dưỡng.
 8

Tuy nhiên, phương pháp này tốn công, vườn ươm lớn và phụ thuộc vào
ñiều kiện bảo quản, cây thiếu sức ñề kháng với virus gây bệnh. Vì vậy ñể sản
xuất ra khối lượng lớn cây giống sạch bệnh có thể mong chờ ở nuôi cấy mô.
Trên thế giới và trong nước ñã có những báo cáo về nghiên cứu tái sinh cây
khoai lang in vitro qua con ñường phát sinh phôi soma và con ñường phát
sinh cơ quan.
1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang
Để tạo giống cho năng suất cao, phẩm chất tốt, sạch bệnh, trên thế giới
ñã nghiên cứu nhân giống khoai lang bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tuy nhiên
những nghiên cứu về nuôi cấy mô khoai lang trên thế giới còn rất hạn chế.
Hwang, Robert (1983) nghiên cứu nuôi cấy mô khoai lang bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô rễ sử dụng môi trường MS với nồng ñộ khoáng và inositol
cao. Sử dụng chóp ngọn, chồi nách, mẩu lá hoặc mẩu cuống lá non. Được
ñem khử trùng bề mặt bằng Clorox 10% (0,52% NaOCl), rửa nhẹ 2 lần với
nước cất [49].
Kuo, Shen (1985) nghiên cứu nhân giống khoai lang sạch virus sử
dụng mô lá và ñỉnh sinh trưởng. Mẫu mô nuôi cấy ñược kiểm tra virus bằng
kỹ thuật ELISA[24].
Daniel (1993) ñã xây dựng hệ thống nhân giống cho những loài có sinh
khối lớn như cây khoai lang bằng phương pháp tạo phôi soma từ ñỉnh ngọn 1-
2 lá mầm trên môi trường có bổ sung 2,4D cho thấy sự hình thành phôi khi
cấy chuyền phôi calli hoặc khối tế bào sang môi trường có 2,4 D mới và phôi
có lá mầm có khả năng hình thành cây mới [28].
Makoto (1993) ñã nghiên cứu sự hình thành củ khoai lang in vitro từ
mô rễ cây khoai lang in vitro. Sau 6-7 nuôi cấy ñường kính của rễ lớn nhất
lớn hơn 2mm dưới tác dụng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật JA trong
 9

môi trường ñặc và BA trong môi trường lỏng, phần rễ phình to ra có màu ñỏ,
màu tự nhiên của cây trồng này[53].
Podobo (1995) nghiên cứu nhân giống khoai lang từ lá theo quy trình
gồm 2 bước: nuôi cấy mô lá trên môi trường MS và sau ñó chuyển sang môi
trường MS bổ sung zeatin riboside. Kết quả cho thấy rằng mô lá của các
giống khoai lang ñược cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,2mg/l-1 2,4 D thì
có 19/27 giống có biểu hiện sự tái sinh chồi, 8 giống không có phản ứng.
Trong ñó, giống có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là PI 318846-3 (78,6%) và khi
chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.2mg/l-1 zeatin riboside thì giống này
cũng có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (33,3%).[20]
Isabirye (2007) nghiên cứu sự thoái hóa của ñất trồng sắn và khoai lang
ở những khu vực nghèo, ñầu tư thấp ở Uganda. Các tác giả ước tính lượng
dinh dưỡng mất ñi cho 1 ha khoai lang là 45 kg N/ha/năm, 8 kg P/ha/năm và
55 kg K/ha/năm[51]. Ankumah (2003) nghiên cứu hiệu quả của bón N ñến
năng suất và hiệu quả sử dụng N của 4 giống khoai lang [37]. Ở Việt Nam,
Viện cây lương thực ñưa ra qui trình thâm canh các giống khoai lang cao sản
là 20 tấn phân hữu cơ, 120 kg N, 900 kg super lân, 450 kg Kali[58].
1.1.4 Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang
Khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng của Việt Nam,
là cây trồng lấy củ có thời gian sinh trưởng ngắn khoảng 90 – 110 ngày, chịu
hạn, chịu ñất xấu, ñầu tư thấp, ít chăm sóc, ít sâu bệnh, nên ñược nông dân ưa
trồng. Với các giống cao sản, thâm canh chăm sóc tốt, khoai lang có thể cho
năng suất cao 20 – 25 tấn/ha và tiềm năng năng suất của khoai lang có thể ñạt
40 – 50 tấn/ha. Vì vậy cây khoai lang là cây xóa ñói giảm nghèo cho nhiều
nông dân ở nhiều ñịa phương, trong ñó có Tây Nguyên trong những năm gần
ñây.
 10

Theo thống kê của FAO (2007) của Việt Nam năm 2005 là 205.000 ha
với năng suất là 7,56 tấn/ha và sản lượng ñạt trên 1,5 tấn. Theo ñánh giá của
FAO, năng suất trung bình khoai lang của nước ta khá thấp bởi nhiều nguyên
nhân [39]:
- Do chưa có cơ cấu giống khoai lang tốt, có năng suất cao, chịu thâm canh và
phù hợp với từng vùng.
- Giống sau nhiều năm trồng bị thoái hóa.
- Nông dân có tâm lý trồng khoai không ñầu tư thâm canh.
Đăk Nông là tỉnh ñi ñầu trong trồng và xuất khẩu khoai lang cao sản
Nhật Bản. Từ năm 2004, Sau khi giống khoai lang nhật bản (Benniazuma)
ñược du nhập vào ñịa bàn tỉnh Đăk Nông ñến nay, diện tích gieo trồng khoai
lang của tỉnh Đăk Nông ngày càng ñược mở rộng. Tổng diện tích khoai lang
năm 2004 là 1,917 ha, sản lượng 9,251 tấn, năm 2005 là 2,333 ha, sản lượng
21,668 tấn (khoai lang Nhật Bản Benniazuma chiếm 80% diện tích và sản
lượng).
Năm 2006 ước thực hiện ñược 4.138 ha, sản lượng 42,795 tấn. Trong
ñó tập trung chủ yếu ở các huyện (huyện Đăk Song diện tích: 2,933 ha, sản
lượng: 30,994 tấn; huyện Đăk R’Lấp diện tích: 706 ha, sản lượng: 7,296 tấn;
huyệnKrông Nô diện tích: 127 ha, sản lượng: 1,365 tấn) khoai lang nhật bản
Benniazuma chiếm 95% diện tích và sản lượng.
Khác với cây khoai lang truyền thống, sản phẩm chỉ phục vụ nhu cầu
nội ñịa và làm thức ăn gia súc. Cây khoai lang Nhật Bản (Benniazuma) là cây
hàng hóa ñem lại hiệu quả kinh tế cao. Nếu ñầu tư thâm canh trên một ñơn vị
diện tích có thể ñạt ñược (vụ hè thu: 32.000.000ñ/ha; vụ thu ñông:
30.000.000ñ/ha và vụ ñông xuân có tưới nước: 45.000.000ñ/ha).
 11

Định hướng phát triển diện tích, sản lượng cây khoai lang của Đak Nông
Hạng mục Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010
Diện tích (ha) 4.300 4.600 4.800 5.000
Sản lượng (tấn) 43.000 46.000 48.000 50.000

Trong những năm gần ñây, Viện Cây lương thực, Viện Khoa học Nông
nghiệp Việt Nam lai tạo một số giống khoai lang có năng suất cao như KB1,
KB4 và TV1, năng suất có thể ñạt từ 20 – 25 tấn/ha. Tuy nhiên nông dân
thường tự ñể giống bằng dây hoặc củ trong nhiều năm liền, giống bị thoái hóa
và tích lũy nhiều bệnh cho vụ sau. Do ñó, giống tốt, sạch bệnh là yếu tố quyết
ñịnh ñể cho năng suất cao, phẩm chất tốt và hiệu quả canh tác khoai lang.
Nguyễn Du Sanh, Nguyễn Thanh Dũng(2004) ñã nghiên cứu các thay ñổi
về cấu trúc và sinh lý trong quá trình tạo củ ở cây khoai lang từ các ñoạn thân
dài 30 – 40cm trên hai giống trồng Hưng Lộc (HL4) và giống ñịa phương
(Gạo) làm cơ sở cho việc tăng năng suất của các cây trồng lấy củ [13].
Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch
(2004) ñã xây dựng ñược qui trình tái sinh in vitro một số giống khoai lang
Việt Nam ( giống Chiêm Dâu, Nông nghiệp 31 và Lim)[2].
Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2005) ñã nghiên cứu tái sinh in
vitro các giống khoai lang Keganesengan, Kokei 14 và Satsuma Hikari từ
mô lá qua kiểu tái sinh chồi bất ñịnh và tái sinh theo con ñường sinh phôi
soma qua nuôi cấy tạo mô sẹo từ ñỉnh sinh trưởng. Khoảng 1 tuần ñến 1 tháng
thấy một số chồi tái sinh từ mô sẹo, xuất hiện thường ở vùng gân chính vị trí
gốc lá. Ngoài ra, tác giả còn nhận thấy hệ rễ trên môi trường MS không chất
sinh trưởng sau 3 ñến 4 tuần nuôi cấy ñã tái sinh chồi trên một số rễ to, ñôi
khi hình thành từ rễ nhỏ [5].
 12

1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tế bào thực vật có tính toàn thế (totipotency), tế bào ñơn hoặc protoplast
thực vật ñều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ñiều kiện quan trọng
ñể ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Sự phát sinh hình thái
(morphogenesis) hoặc khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào, một
cụm tế bào (mô sẹo), một mảnh lá, ñã ñược thực hiện trên hàng trăm loài thực
vật, hầu hết tập trung vào các cây trồng quan trọng.
Ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in
vitro) ñã ñược Haberlandt thử nghiệm từ năm 1902 nhưng do ông ñã sử dụng
các tế bào của cây một lá mầm nên ñã thất bại. Năm 1919, A. Carrel nuôi cấy
thành công mô ñộng vật, nhưng cho ñến năm 1934 mô thực vật mới ñược
nuôi cấy.
Năm 1934, White ñã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn
của các tế bào rễ cà chua ñược nuôi cấy mô.
Năm 1941, Van Overbeck ñã chứng minh tác dụng tốt của nước dừa trong
nuôi cấy phôi cây họ cà. Sau ñó Steward và Milles (1952) cũng xác nhận tầm
quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt.
Năm 1951, Skoog và Miler phát hiện ra các hợp chất có khả năng ñiều
khiển sự nhân chồi.
Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thủy phân của tinh dịch cá bẹ có tác
dụng kích thích sinh trưởng rất rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây
thuốc lá.
Năm 1957, Skoog và Miller ñã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong
nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng ñộ tương ñối của
auxin/cytokinin và từ ñó ñưa ra quan niệm ñiều khiển hoocmon trong quá
trình hình thành cơ quan ở thực vật.
 13

Năm 1962, Murashige và Skoog ñã thành công trong việc cải tiến môi
trường nuôi cấy, ñánh dấu một bước tiến quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy
mô. Môi trường của họ ñã ñược dùng làm môi trường cơ bản cho việc nuôi
cấy nhiều loại cây và cho ñến nay vẫn còn ñược sử dụng rộng rãi.
Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi
cấy ñỉnh sinh trưởng và lan là cây nuôi cấy mô ñầu tiên ñược thương mại hóa.
Từ ñó ñến nay nhiều loại cây khác nhau ñã ñược nuôi cấy thành công và
ñưa vào thương mại hóa.
Năm 1964, Ball là người ñầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi
ngọn. Ông ñã thành công trong việc chuyển mô nuôi cấy thành cây con ở cây
sen cạn và cây White lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu.
Năm 1966, Guha và cộng sự ñã tạo ñược cây ñơn bội từ nuôi cấy túi phấn
của cây cà ñộc dược (Datura inoxia).
Năm 1978, Melchers và cộng sự ñã lai tạo thành công protoplast của cà
chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở
thực vật. Tuy nhiên, việc nhân giống cây in vitro vẫn chưa hoàn thiện. Sau ñó,
nhiều nhà nghiên cứu ñã khám phá ra những thành phần quan trọng, cần thiết
cho sự phát triển của tế bào ñược nuôi cấy [19].
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học, nông
nghiệp và y dược học...
Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã hướng về những ứng
dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với cây trồng. Nhờ tiến bộ của khoa học
kỹ thuật ở những ngành có liên quan, ngành nuôi cấy mô thực vật ñã ñược
trang bị hiện ñại và trở nên quan trọng trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn
sản suất. Các nhà thực vật học ñã áp dụng phương pháp này với mục ñích sau:
 14

- Đối với lĩnh vực cải tiến cây trồng: Vi nhân giống; lập thư viện DNA;
bảo tồn in vitro; tạo các biến dị soma; lai tế bào soma; chọn giống
chống chịu sâu bệnh; lai xa…
- Đối với nghiên cứu di truyền học:
• Tạo ra một quần thể lớn và ñồng nhất trong một thời gian ngắn, vẫn
giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ.
• Tạo các giống mới có năng suất và phẩm chất cao bằng phương
pháp chuyển gen.
• Tạo ñược nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (thân, phiến lá,
hoa, hạt phấn,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện ñược.
• Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách lấy mô phân sinh ngọn.
1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô
Phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã ñược ứng dụng vào các mục ñích
sau:
• Tạo quần thể lớn và ñồng nhất về di truyền trong khoảng thời gian
ngắn, với diện tích và không gian nhỏ trong phòng thí nghiệm, có thể
kiểm soát ñược các ñiều kiện lý hóa ảnh hưởng ñến sinh trưởng của
cây.
• Tạo ñược nhiều cây con từ các mô và cơ quan của cây (lóng, thân,
phiến lá, hoa, hạt phấn, noãn, chồi, phát hoa) mà ngoài tự nhiên không
thực hiên ñược.
• Làm sạch nguồn virus gây bệnh cho cây bằng cách nuôi cấy ñỉnh sinh
trưởng.
• Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học và nhân nhanh
các giống chọn ñược.
 15

1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy mô sẹo.
- Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng.
- Nuôi cấy tế bào ñơn.
- Nuôi cấy protoplast – chuyển gen.
- Nuôi cấy hạt phân ñơn bội.
- Nuôi cấy phôi.
1.2.4 Các bước nhân giống invitro
Nhân giống vô tính thực vật trong in vitro thường trải qua các bước sau:
- Khử trùng mô cấy
- Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng
- Tạo thể nhân giống invitro
- Nhân giống invitro
- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy
Một trong những bước quan trọng ñầu tiên quyết ñịnh ñến sự thành
công hay thất bại trong nhân giống in vitro cây ñầu dòng nói chung và cây
khoai lang nói riêng là việc khử trùng mẫu cấy ñể ñưa chúng vào nuôi cấy
trong ñiều kiện vô trùng. Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện
nay là sử dụng các hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Hiệu quả diệt
nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian, nồng ñộ xử lý và khả
năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy. Để tăng
tính linh ñộng của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các
chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 20, Tween 80, Fotoflo, Teepol
hoặc có thể xử lý phối hợp với cồn 70%. Một hóa chất ñược lựa chọn cho quá
trình vô trùng mẫu cấy phải bảo ñảm hai thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh
 16

vật tốt và không hoặc có mức ñộ ñộc thấp ñối với mẫu thực vật. Trong các
loại hóa chất trên, NaOCl, H2O2 và Ca(OCl)2 hay ñược dùng hơn vì chúng có
mức ñộ ñộc tính thấp ñối với mẫu và không có biểu hiện ức chế sinh
trưởng[19].
Theo Lê Thị Thu Về và cộng sự (1999), khi xử lý các củ hoa loa kèn
bằng HgCl2 ở nồng ñộ 0,1% cho thấy ở thời gian xử lý 10 phút, số mẫu ñưa
vào ñạt 100%[16].
Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007), khi nhân giống cây Pơmu
nhận thấy khi khử trùng mẫu chồi ñỉnh và chồi bên bằng Natri hypochloride
10% trong 12 phút thu ñược tỷ lệ mẫu sống cao nhất (50,63%) [1].
Tuy nhiên, ñối với một số loại cây cần phải xử lý kết hợp hai loại chất
khử trùng thì mới ñem lại hiệu quả khử trùng cao. Huỳnh Thị Huế Trang và
cộng sự (2007), nuôi cấy phân sinh mô chồi hoa huệ trắng ñã khử trùng bằng
dung dịch sodium hypochloride (dưới dạng thương phẩm là Clorox) với tỷ lệ
1:1 trong 30 phút sau ñó rửa lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và khử trùng
lại bằng dung dịch thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 phút [15]
Dương Lan Oanh và cộng sự (2007), nghiên cứu về sự nhân chồi
và phát triển rễ của cây dứa cảnh ñã xử lý, mẫu bằng Clorox 10% trong 10
phút sau ñó rửa lại bằng nước cất vô trùng và khử trùng mẫu lại bằng thuỷ
ngân clorua 0,2% cho thấy ở thời gian xử lý 8 phút số mẫu sống ñạt tỷ lệ cao
nhất (85%)[12].
Khưu Hoàng Minh và cộng sự (2007), nghiên cứu vi nhân giống cây
Trai Nam bộ cho thấy khi sử dụng riêng rẽ canxi hypochloride ñể vô trùng
mẫu Trai thực sinh thì ở nồng ñộ 25% trong 30 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao
nhất là 4,4%. Nhưng khi sử dụng nồng canxi hypochloride 25% trong 30 phút
kết hợp với HgCl2 0,05% trong 15 phút thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng lên
6,2%[11].
 17

Khoai lang là cây thân thảo dạng dây leo hoặc bò trên mặt ñất, củ nằm
trong ñất và ñược trồng trong vùng sinh thái rộng lớn, do ñó sự lựa chọn mẫu
ñể kiểm soát và xử lý mầm bệnh là hết sức khó khăn. Hwang, Robert (1983)
ñã tiến hành khử trùng bằng Clorox 10% (0,52% NaOCl) với mẫu là chóp
ngọn, chồi nách, mẫu lá hoặc mẫu cuống lá non[49].
1.2.6. Mẫu cấy
Mẫu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các
cơ quan hay bộ phận của cây như chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,
thân, các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ mầm), các cơ quan dự trữ (củ, căn
hành...). tùy theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít
hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm). Các cấu trúc thực vật ñược bao kín (lá
mầm, phôi, mô thịt trong quả...) thường không chứa hoặc có rất ít vi sinh vật,
ngược lại, các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc với ñất, nước như rể, củ, thân
thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn.
Kuo, Shen (1985) nghiên cứu nhân giống khoai lang sạch virus sử dụng
mô lá và ñỉnh sinh trưởng[24].
Belarmino (1993), Nguyễn Hữu Hỗ, Nguyễn Văn Uyển (2005) nhận
thấy rằng trong môi trường MS có 2mg/l NAA và 0.1mg/l BA, mẫu cấy
từ lá hình thành mô sẹo rất nhanh (từ vài ngày ñến 1 tuần) ở vị trí vết cắt, sau
ñó mô sẹo này ñược cấy chuyền sang môi trường MS không chất sinh trưởng,
khoảng 1 tuần ñến 1 tháng thấy một số chồi tái sinh từ mô sẹo, xuất hiện
thường ở vùng gân chính vị trí gốc lá. Ngoài ra, tác giả còn nhận thấy hệ rễ
trên môi trường MS không chất sinh trưởng sau 3 ñến 4 tuần nuôi cấy ñã tái
sinh chồi trên một số rễ to, ñôi khi hình thành từ rễ nhỏ[5],[22].
Các giống khác nhau, vị trí mẫu các loại mẫu cấy khác nhau
sẽ phản ứng và cho kết quả khác nhau trên cùng một ñiều kiện nuôi cấy.
Podobo và cộng sự (1995) nhận thấy rằng mô lá của các giống khoai lang
 18

ñược cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.2mg/l-1 2,4 D thì có 19/27 giống
có biểu hiện sự tái sinh chồi, 8 giống không có phản ứng. Trong ñó, giống có
tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là PI 318846-3 (78.6%) và khi chuyển sang môi
trường MS bổ sung 0.2mg/l-1 zeatin riboside thì giống này cũng có tỷ lệ tái
sinh chồi cao nhất (33.3%). Cũng theo Podobo và cộng sự (1995) mẫu từ các
vị trí lá khác nhau (lá thứ nhất ñến lá thứ 6 từ ngọn xuống), kết quả là mẫu lá
ở vị trí thứ 3 có khả năng tái sinh chồi cao nhất (91.67%) so với các vị trí
khác. Các lá càng già thì tỷ lệ tái sinh càng thấp [20].
1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
Công thức môi trường của Murashige và Skoog (1962, MS) là thích hợp
cho phần lớn các trường hợp nuôi cấy in vitro.
Môi trương gồm các nhóm chất căn bản sau:
• Các chất vô cơ ña lượng: N (NO3 và NH4), P, K, S, Ca, và Mg.
• Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo.
• Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin, ...) mà quan trọng nhất là
thiamine (vitamin B1) dưới dạng thiamine – HCL
• Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose.
• Các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin và cytokinin, kích
thích sự phân bào, kiểm soát sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào
và phát sinh hình thái. Các auxin thường dùng: 2,4-D (2,4
Dichlorophenoxyaceticacid), IAA (indole-aceticacid), IBA (indole 3-
butyric acid). Các cytokinin có BAP (6-benzylaminopurine), zea
(zeatin),... Ngoài ra còn có GA (gibberillic acid) và ABA (abscisic
acid).
• Agar sử dụng cho môi trường ñặc. Hệ thống chiếu sáng hợp lý cần cho
sự phát triển của tế bào thực vật[7].
 19

Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay ñổi tùy theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và cơ quan ñược nuôi cấy. Nhiều yếu tố của môi trường ñã
ñược nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu như môi trường khoáng cơ
bản, nồng ñộ và các loại ñường, chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật.
Theo Belarmino (1993), môi trường MS + 2mg/l NAA + 0.1mg/l BA
tương ñối thích hợp ñối với nhiều giống khoai lang trong việc tạo mô sẹo lá
và tạo ñiều kiện cho việc tái sinh khi mô lá ñược chuyển sang môi trường
không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật [22].
Môi trường cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất ở giống khoai lang Chiêm dâu
là môi trường MS có bổ sung 1ppm/l BA + 0.5ppm/l NAA và giống khoai
lang NN31 là môi trường MS có bổ sung 1ppm/lBA + 0.1ppm/l IAA, chồi
ñược hình thành là chồi ñơn và tái sinh từ mô sẹo [2]).
A. Porobo Dessai và cs (1995) báo cáo rằng giống khoai lang PI 318846.3
có khả năng tái sinh cây luôn cao nhất (80%) khi nuôi cấy trên môi trường
MS + 2,4 - D (0,2mg/l) trong 3 ngày và sau ñó chuyển sang môi trường MS +
zeatin riboside (0,2mg/l)[20]
1.2.8. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
Hormon thực vật là những hợp chất hữu cơ do thực vật sản xuất di
chuyển từ nơi tổng hợp ñến nơi tác dụng, ñiều khiển sự sinh trưởng hay một
quá trình sinh lý của thực vật với một liều lượng rất nhỏ (Davies, 1995)[17].
Chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm hormon thực vật và các hợp
chất hữu cơ do con người hoặc vi sinh vật tổng hợp có tác dụng ñiều hòa sự
sinh trưởng ở thực vật. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật không phải là
chất dinh dưỡng, các vitamin hay những nguyên tố thiết yếu cho thực vật
[17].
Hiện nay các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược chia thành 5 nhóm
chính: auxin, gibberillin, cytokinin, acid abscisic và ethylen.
 20

+ Auxin
Auxin là nhóm chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược khám phá ñầu
tiên (1880) bởi các thí nghiệm của Darwin và Francis, con trai của ông về
hiệu ứng ánh sáng trên sự cong của diệp tiêu cây yến mạch (Avena sativa) và
sự phát hiện của Went (1982) về vai trò kích thích sự kéo dài tế bào của auxin
(Bùi Trang Việt,2000). Mười năm sau, cấu trúc của auxin ñược xác ñịnh ñó là
indoleacetic acid (IAA) [63]
Auxin có vai trò quan trọng trong sự phân chia, mở rộng và kéo dài tế
bào, ñiều này liên quan tới sự giãn nở của vách tế bào, tính ưu tính ngọn,
hướng ñộng, lão suy, rụng, ñậu và tăng trưởng, tính cái của hoa, ñiều khiển sự
hình thành rễ, tăng hô hấp tế bào và mô nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong
sự hình thành phôi (bao gồm cả phôi hợp tử và phôi sooma). Auxin còn làm
tăng hoạt tính của các enzim, ảnh hưởng mạnh ñến trao ñổi chất của nitrogen,
tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng ñường trong môi trường [17]
Auxin ñược hình thành chủ yếu ở ngọn thân, lá non, hột ñang phát
triển. Sau ñó auxin di chuyển xuống rễ kích thích hình thành rễ bất ñịnh.
Trong thực vật bậc cao, auxin di chuyễn hữu cực từ tế bào này qua tế bào
khác, từ ñỉnh chồi xuống dưới gốc thân (hình 1.1)

Hình 1.1. Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin

 21

Sự di chuyễn hữu cực này ñóng vai trò quan trọng trong sự sinh phôi
(bao gồm cả phôi hợp tử và phôi soma) [25].
Trong rễ, sự di chuyển của auxin phức tạp hơn. Khi sử dụng ñồng
vị phóng xạ, Mitchell và cs, (1975) và Tsurumi và cs, (1978) nhận thấy rằng
sự di chuyển của auxin là có tính hướng ngọn trong mạch chính của rễ (di
chuyển từ gốc rễ ñến ngọn rễ) tuy nhiên cũng có bằng chứng cho thấy auxin
có thể di chuyển hướng gốc ở gần ngọn rễ và vùng kéo dài rễ [54]. Cấu trúc
của một số dạng auxin: IAA, NAA, 2,4-D (hình 1.2)

Hình 1.2: Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (NAA, 2,4-D)
(Smith,1997)
Sự hình thành và phát triển rễ bất ñịnh phụ thuộc vào sự di chuyển
và nồng ñộ của auxin. Sử dụng auxin trong nuôi cấy in vitro như là một nghệ
thuật, ở nồng ñộ thấp, auxin kích thích sự tạo rễ bất ñịnh nhưng ở nồng ñộ cao
lại kích thích hình thành mô sẹo.
+ Cytokinin
Cytokinin có vai trò tác ñộng ñến tất cả các giai ñoạn sinh trưởng và
phát triển của thực vật, từ sự kích thích phân chia tế bào, sự phát sinh cũng
như tăng trưởng chồi, thúc ñẩy sự hình thành các chồi nách bằng cách ức chế
ưu tính ngọn, ức chế sự hình thành rễ ñến sự hình thành hoa và trái. Cytokinin
là chậm sự phân hủy diệp lục tố, do ñó làm chậm sự lão hóa của lá, làm tăng
quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein, ñiều chỉnh nồng ñộ Ca2+ trong tế
 22

bào (Smith, 1997; Bùi trang Vệt, 2000). Cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu ở
ngọn rễ, hột ñang phát triển.
Một số dạng cytokinin thường gặp: zeatin, BA, kinetin (hình 1.3)

Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin (Smith, 1997).

+ Gibberellin
Gibberellin là một nhóm chất lớn. Hiện nay các nhà khoa
học ñã xác ñịnh ñược trên 90 chất có hoạt tính gibberellin, và tất cả các chất
ñó ñều ñược tách chiết từ thực vật hoặc từ vi sinh vật nhờ phản ứng tổng hợp
(Mai Trần Ngọc tiếng, 2002). Gibberellin ñóng vai trò quan trọng trong sự
kéo dài thân và cuống hoa của cây dài ngày, là hormon quan trọng trong sự ra
hoa, kích thích sự nảy mầm, ñậu và tăng trưởng trái, tính ñực của hoa, giúp sự
phân hóa các tế bào tượng tầng thành libe và mộc. Ở mức phân tử, gibberellin
làm cho Ca2+ di chuyển nhanh vào chất trong suốt của tế bào và làm rộng tế
bào bằng cách ảnh hưởng trên vách, nhưng không ảnh hưởng trên bơm proton
như tác ñộng của auxin.
Các gibberellin khác nhau là Ax hay GAx ñược ñánh số theo thứ tự
khám phá.
Cấu trúc của một số gibberellin thường gặp (hình1. 4).
 23

Khung gibbane

Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA4 thành các
GA khác (Smith, 1997)
+ Acid abscisic
Acid abscisic (ABA) là chất ñược ly trích ñầu tiên trên cây bông. Tính
chất của ABA là cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm
sự kéo dài lóng, liên quan tới sự sinh phôi và trưởng thành của hột, kích thích
sự lão suy và rụng của nhiều loại trái và lá. ABA có vai trò quan trọng trong
sự ñóng mở của khí khẩu. Khi nồng ñộ ABA cao, khí khẩu trong lá ñóng lại.
Thông qua cơ chế này, ABA giúp cho cây tự bảo vệ khi gặp ñiều kiện khô
hạn của môi trường. Acid abscisic là một sesquiterpen (hình 1.5), ñược tổng
hợp ở rễ, lá non, hột. ABA ñược vận chuyển cả trong mạch mộc và libe tùy vị
trí nó sinh ra.

Hình 1.5. Cấu trúc của ABA (Smith, 1997)

 24

+ Ethylen
Ethylen là một chất khí có cấu trúc ñơn giản (CH2=CH2) (hình1.6), có
vai trò trong sự gỡ miên trạng của hột, tăng trưởng và phân hóa (chồi và rễ),
tạo rễ bất ñịnh, rụng lá và trái, tính cái của hoa, lão suy (hoa, trái), chín trái.
Ethylen ñược tổng hợp ở trong trái chín, mô lão suy và ở những mô
chịu “stress”, do ñó, ethylen ñược xem như là một hormon vết thương, giúp
cho cây giảm bớt sự nhiểm trùng.

Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen (Smith, 1997).

+ Thidiazuron (TDZ)
Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) là một chất hóa
học ñược tổng hợp, tan nhiều trong ethanol, là một ứng cử viên ñể trở thành
một trong những chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật.
TDZ ñã ñược sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật bởi nó thể
hiện ñồng thời tính chất mạnh của auxin và cytokinin (Murthy và cs, 1998) dù
cấu trúc của nó khác hẳn với cấu trúc của auxin và cytokinin [56](hình 1.7)

Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ

Trong ñiều kiện in vitro, nhiều công trình nghiên cứu ñã ñược công bố
về vai trò của TDZ trong sự phát sinh hình thái bao gồm sự tạo mô sẹo, sự
phát sinh chồi, sự tạo phôi soma.
 25

- Tạo mô sẹo: thông thường, khi cảm ứng tế bào tạo mô sẹo, chúng ta
thường sử dụng auxin như NAA hay 2,4-D. TDZ với hàm lượng thấp cũng có
khả năng tạo ñược mô sẹo (Capelle và cs, 1983) và khối mô sẹo thường có
những nốt nhỏ màu xanh [56].
- Tạo chồi: TDZ ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu sự tạo chồi trên nhiều
ñối tượng khác nhau, từ những cây ăn trái nhiệt ñới cho tới những cây tạo củ.
Kerns và cs (1986), Fellman và cs (1987), Fiola và cs (1990) và Malik và cs
(1992a, 1992b) ñã kết luận rằng sự tạo chồi trên môi trường có bổ sung DTZ
với hàm lượng thấp thì hiệu quả hơn so với các cytokinin khác. Đặc biệt, sự
tác ñộng của chúng trên sự tạo chồi ở những loài thân gỗ là hiệu quả nhất
(Briggs và cs, 1988; Baker và cs, 1993).
- Tạo phôi soma: cảm ứng sự tạo phôi soma thường sử dụng phối hợp
ñồng thời hai loại chất ñiều hòa là auxin và cytokinin với tỉ lệ khác nhau,
trong khi TDZ với một mình nó có thể tạo ñược phôi soma (Saxena và cs,
1992; Visser và cs, 1992; Gill và cs, 1993). Trên nhiều loại cây khác nhau,
nhiều tác giả ñã sử dụng TDZ trong môi trường ñể cảm ứng sự tạo phôi soma
như thuốc lá (Gill và cs, 1993), ñậu xanh (Murthy và cs, 1995), cây phong lữ
(Visser và cs, 1992), neem (Murthy và cs, 1998), cacao (Li và cs, 1998).
1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong
công nghệ sinh học. Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen ñể tạo các giống
cây trồng mới, chúng ta ñều cần ñến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì
phương pháp này có những ưu ñiểm ñáng kể:
- Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn.
- Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền.
- Có thể thực hiện bất kỳ ñịa ñiểm nào.
 26

- Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không ñòi hỏi phải có một
diện tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao.
- Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương
pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh.
- Dễ dàng học hỏi và trao ñổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế
giới.
- Bảo quản giống dễ dàng bằng cách tạo ra thể phôi hoặc bảo quản
lạnh [8].
1.4. Sự phát sinh hình thái
+ Định nghĩa
Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng ñể chỉ những thay ñổi
của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm
sự phát sinh chồi bất ñịnh, phát sinh rễ bất ñịnh, tạo phôi soma, v.v.
Phát sinh hình thái là một trong những vấn ñề căn bản và phức tạp nhất
của sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình
thái và cấu trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố
liên quan trong các biến ñổi hình thái và cấu trúc ñó. Do ñó, không có một kỹ
thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh ñược tất cả mọi khía
cạnh của nó. Những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải
phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học ñều có thể giúp ta tìm hiểu
hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai
phương pháp thường ñược dùng nhất là:
- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến ñổi
phát triển sau ñó.
- Nuôi cấy in vitro trong ñiều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần
tách rời của một cơ thể thực vật. Trong phương pháp này, nên áp dụng các
 27

chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh vì mẫu cấy có kích thước nhỏ,
rất khó tiến hành nghiên cứu sinh lý học.
Trong phát sinh cơ quan, chồi thường ñược cảm ứng và tăng trưởng
trước, rễ ñược tạo ra sau. Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau ñó mới hình
thành chồi như trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi ñược cảm ứng bởi
Agrobacterium rhizogenes (James và cs, 1988).Với những cây thân gỗ cứng,
chồi thường ñược cảm ứng trực tiếp từ bộ lá.
+ Sự phát sinh chồi bất ñịnh
Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sự tạo chồi nhằm nhân
nhanh ñể tạo một số lượng chồi lớn với những ñặc tính ñồng nhất và giống
với cây mẹ. Sự tạo chồi in vitro có thể từ nuôi cấy cơ quan, mô hay tế bào trên
môi trường có hàm lượng cytokinin kết hợp với auxin. Tỉ lệ về hàm lượng của
hai loại hormon này là rất quan trọng. Nồng ñộ cytokinin cao hơn auxin thì
mẫu có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại, nếu nồng ñộ auxin cao hơn
cytokinin thì mẫu có khuynh hướng tạo rễ.
Trong sự tạo chồi, hoặc là chồi ñược tạo trực tiếp hoặc thông qua mô
sẹo. Các tế bào của mô cấy ñược cảm ứng bởi môi trường ñể phản biệt hóa trở
về trạng thái sinh mô. Những tế bào sinh mô ñược cảm ứng ñể có khả năng
biệt hóa trở lại tạo một cơ quan chồi mới ñược gọi là chồi bất ñịnh.
Chồi thường ñược cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi (vùng nhu
mô vỏ) nên thường ñược xem là có nguồn gốc ngoại sinh.
+ Sự phát sinh rễ bất ñịnh
Sự tạo rễ trên nhánh cây hoặc chồi in vitro gọi là sự tạo rễ bất ñịnh,
gồm ít nhất là hai giai ñoạn có thể phân biệt ñược dưới kính hiển vi (Mai Trần
Ngọc tiếng và cs, 1980):
- Giai ñoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc
hoặc chu luân, giai ñoạn này ñược khởi phát bởi auxin ở nồng ñộ cao. Auxin
 28

kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, ñồng thời giúp sự phân
hóa của các mô dẫn.
- Giai ñoạn kéo dài sơ khởi rễ ñược kích thích bởi auxin ở nồng
ñộ thấp.
Điều quan trọng là nồng ñộ của auxin kích thích giai ñoạn tạo sơ khởi
rễ nhưng có thể ức chế giai ñoạn kéo dài rễ và ngược lại [17].
Auxin tự nhiên không bền (bị oxi hóa trong vài ngày dưới ánh sáng),
nên trong thực tế người ta thường dùng các auxin tổng hợp ít bị phân hủy
như: indole-3-butyric acid (IBA), anpha–naphtalenacetic acid (NAA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4 – D). Tùy vào mục ñích và ñối tượng nghiên
cứu mà chúng ta sử dụng các loại auxin với nồng ñộ khác nhau.
1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960
ở miền Nam và ñầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ
năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành
trong cả nước ñã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ
cao ñể phát triển lĩnh vực nuôi cây mô này và ñã mang lại nhiều thành tựu
nổi bậc:
Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm ñể ñưa ra sản
xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ ñiển, nhờ vậy mà một người có
thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng.
Ở miền Bắc, nhân bản vô tính ở thực vật ñược ứng dụng hầu hết các
nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương – loại gỗ
tiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, Chè Vang – một
loại chè rất khó trồng. Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu
hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía...
 29

Từ năm 2001 ñến nay, Sở Khoa Học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng
năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla.
Trung tâm ứng dụng và chuyễn giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh
phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ñể nhân
giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở ñịa phương.
Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu
vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây
trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách
hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử sụng cây giống từ nuôi cấy mô.
Năm 2002, ThS. Lê Thị Kim Đào và cs tại Trung tâm ứng dụng khoa
học kỹ thuật Bình Định ñã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm Hương,
bạch ñàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô
cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao.
Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô ñã có những bước ñột phá mới:
nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, từ một số tế bào gốc
của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học
viện Quân y ñã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ
quy trình chỉ mất 10 ñến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6
năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi
nguy cơ tuyệt chủng, ñặc biệt là loài lan Hài Hồng – loài lan duy nhất có
hương thơm trên thế giới...
1.6. Tổng quan về Chitosan
1.6.1. Công thức cấu tạo
Chitin là một polymer sinh học có trong thành phần cấu tạo nên vỏ của
các loài giáp xác như : tôm, cua vỏ các loài côn trùng, thành tế bào sợi nấm.
Chitin là một polymer ñược cấu tạo từ gốc N-acetyl – Glucosamine. Chitin là
một polymer bền, khó tan, khó tương tác hóa học. Khi deacetyl hóa chitin
 30

trong NaOH ñậm ñặc sẽ thu nhận ñược sản phẩm chitosan (polyglucosamine)
[50].
Chitosan dễ tan trong acid hữu cơ như acid lactic, acetic. Khi phân hủy
chitosan bằng các tác nhân khác nhau như acid HCL, enzyme chitosanse,
cellulase hoặc bức xạ maga sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều dài mạch ngắn
hơn gọi là chitosan oligomer. Công thức hóa học của các hợp chất trên như
sau:

CH2OH CH2OH CH2OH

NH NH NH
C O C O C O
CH3 CH3 CH3

Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine)

CH2OH CH2OH CH2OH

NH2 NH2 NH2

Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine)

 31

CH2OH CH2OH

NH2 NH2

Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine)

1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan

Chitin, chitosan và chitosan oligomer ñều là các sản phẩm có nguồn
gốc tự nhiên, không ñộc, có khả năng phân hủy sinh học và không gây ô
nhiễm môi trường. Được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y dược học,
nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
1.6.2.1. Trong công nghiệp
Chitin, chitosan ñược ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp,
như dùng ñể sản xuất tơ cao cấp trong công nghiệp dệt, sản phẩm bền ñẹp,
thoáng mát. Chitin, chitosan còn ñược sử dụng trong công nghiệp in, sản xuất
mực in, giấy cao cấp. Nhờ khả năng tự phân huỷ sinh học, chitin, chitosan
ñang ñược chú ý ñể sản xuất bao bì, bao gói tự hủy ñể giảm ô nhiễm do các
polymer tổng hợp như túi nilon, PE, PP. Ngoài ra, trong công nghệ sinh học,
chitin, chitosan còn ñược sử dụng làm vật liệu cố ñịnh enzyme, tế bào sử
dụng trong các qui trình công nghệ sản xuất tự ñộng, liên tục (Hirano, 1996 ,
Nguyen Anh Dzung, 1998, 1999). Chitosan còn ñược ứng dụng trong công
nghiệp thực phẩm như bảo quản các sản phẩm thực phẩm ñể hạn chế mốc,
nhiễm khuẩn.
 32

1.6.2.2. Trong y dược học

Hiện nay, chitosan, chitosan oligomer và glucosamine ñược nghiên cứu
và sử dụng rộng rãi trong y học. Chitosan ñược sử dụng như là thực phẩm
dinh dưỡng (health food). Chitosan có tác dụng làm giảm cholesterol trong
máu, tăng cường hệ thống miễn dịch và có tác dụng hấp thụ lipid và giảm béo
[43].
Chitosan còn ñược sử dụng làm màng chữa bỏng, màng phủ vết thương
(wound dressing), chỉ phẫu thuật tự hoại, làm mỹ phẩm.
Chitosan oligomer có tác dụng làm tăng hoạt tính lysozyme từ 4,4 U/ml
lên 9,2 U/ml sau 5 ngày uống [43]. Chitosan oligomer còn có tác dụng ñiều
hoà hệ thống miễn dịch của cơ thể, chống khối u (Theo Newletter, 11/2000).
1.6.2.3. Trong Nông nghiệp
Chitin, chitosan và chitosan oligomer ñang ñược nghiên cứu và từng
bước ñưa vào ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp.
+ Sử dụng bón vào ñất
Khi bón vào ñất, chitin và chitosan sẽ phân hủy hoàn toàn trong ñất
sau 1-2 tháng, có tác dụng làm tăng vi sinh vật có lợi cho ñất như xạ khuẩn
Actinomyces (2,4 .105 lên 2,0. 109), nấm mốc Aspergillus (2,4.105 lên 7,4.
107) sau 2 tuần bón vào ñất. Đặc biệt, nấm gây bệnh Fusarium oxysporum
giảm thiểu ñáng kể từ 103 xuống ức chế hoàn toàn (Hirano, 1996). Nguyễn
Anh Dũng (2005) khi sử dụng chitosan oligomer tưới cho tiêu KTCB cho
thấy sau 3 tháng, 3 lần tưới với nồng ñộ 0.01-0.05%, số lượng xạ khuẩn, nấm
mốc tăng rõ rệt, trong khi ñó số lượng Fusarium gây bệnh giảm ñáng kể.
+ Bảo quản nông sản thực phẩm
Ghaouth 1996 nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các
loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum,
chitosan bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm
 33

gây hư thối và ức chế hô hấp. Fajado (1994) cho thấy chitosan ức chế nấm
mốc sinh ñộc tố A. flavus trên lạc, ñậu tương. Sử dụng chitosan ñể bảo quản
trái cây cũng rất ñược chú ý. Chitosan ñã ñược sử dụng ñể bảo quản xoài,
cam, dâu tây (Piyabutr, 2002, Varaporn, 2002, Chucheep, 2002). Sử dụng
chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo dài thời gian bảo quản 15 ngày ở
nhiệt ñộ phòng so với ñối chứng.
+ Kích thích tăng trưởng thực vật
Hiện nay chitosan oligomer ñược xếp vào nhóm ñiều hòa sinh trưởng
thế hệ mới [68], ñang ñược nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật
cho phong lan [46].
Theo Zubay (2000) thì ngoài 5 nhóm ñiều hòa sinh trưởng thực vật
cổ ñiển ñã ñược xác ñịnh và sử dụng là: auxin, gibberellin, cytokinin, ethylen
và absicic thì còn có một nhóm ñiều hòa sinh trưởng mới là oligosaccharins.
Oligosaccharins là các oligosaccharide chứa vài chục ñơn vị.
Oligosaccharins là những tín hiệu phân tử (molecular signals) hoạt hóa và
ñiều hòa một số hệ thống gen của thực vật.
Hadwiger (2002), chứng minh rằng chitosan oligomer là tín hiệu phân
tử hoạt hóa trên 20 loại gen khác nhau của thực vật. Ngoài ra, nhiều kết
quả nghiên cứu cũng cho thấy oligoalginate, chitosan oligomer có thể kích
thích sinh trưởng của thực vật gián tiếp, trực tiếp qua tăng hàm lượng diệp lục
tố trong lá, kích thước lục lạp tăng, tăng cường ñộ quang hợp của cây[41].
Chavagrit (2002), thử nghiệm chitosan chiếu xạ ñể kích thích sinh
trưởng cho phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20-60% so với
ñối chứng ở nồng ñộ thích hợp nhất là 50 ppm. Sasitorn (2002) phun chitosan
cho rau cải ñể tăng năng suất từ 13-31%.
Hirano (1996), khi sử dụng chitosan oligomer xử lý củ giống khoai tây
làm tăng năng suất khoai tây lên 50% so với ñối chứng. Kume, Nagasawa
 34

(2000) khi bổ sung chitosan olygomer vào dung dịch thủy canh làm tăng
quang hợp, chiều dài rễ, sinh khối của lạc, lúa. Khyn Lay Nge, Steven (2006)
nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer như là chất kích thích sinh trưởng thay
thế các chất kích thích sinh trưởng truyền thống trong nuôi cấy mô phong lan.
Nồng ñộ chitosan oligomer sử dụng tối ưu cho tạo protocorm là 15 ppm và
tạo cây con là 20 ppm. Khối lượng phân tử tối thích từ 1, 10 kDa. Nguyen
Anh Dung (2004) thí nghiệm trên ñậu tương cho thấy làm sinh trưởng, nốt
sần và năng suất lên 36% so với ñối chứng khi sử lý hạt giống với chitosan
oligomer. Nguyen Anh Dung (2001) nghiên cứu phun chitosan oligomer cho
rau cải xanh, với nồng ñộ 25 ppm làm tăng năng sưất từ 20-30% so với ñối
chứng.
Cơ chế tác ñộng của chitosan, chitosan oligomer ñã ñược làm sáng tỏ
bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Hadwiger (2002) ñã chứng minh chitosan
oligomer là tín hiệu phân tử hoạt hoá và tăng cường hoạt ñộng của hàng loạt
gen trong hệ thống ñề kháng của thực vật và các gen liên quan ñến trao ñổi
chất như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cường tổng hợp phytoalexin,
proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp xenlulose, lignin,…
Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là chitosan
oligomer còn khá mới mẻ. Nguyễn Quốc Hiến (1999) có nghiên cứu thu nhận
các oligoalginate tách ra từ rong biển ñể sử dụng trong nông nghiệp. Sau ñó,
Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà (1999) cũng nghiên cứu chế tạo
chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma. Tuy nhiên, phương pháp này
còn có nhiều nhược ñiểm so với phương pháp enzyme là giá thành cao, các
phân ñoạn oligomer có khối lượng phân tử không tập trung, vì vậy hoạt tính
sinh học thường thấp.
Lê Quang Luân (2002) cũng nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer
ñược cắt bằng bức xạ gama trong nuôi cấy mô thực vật. Kết quả cho thấy,
 35

chitosan chiếu xạ gama với liều 100 kGy có hiệu ứng kích thích sinh trưởng
của 4 loại cây nuôi cấy mô là: dâu tây, Limonium latifolium, Eustoma
grandiflorum and Chrysanthemum morifolium. Limpanavech (2008), chứng
minh rằng chitosan oligomer với mức ñộ deacetyl hóa 80% ñã làm tăng kích
thước của lục lạp và bó mạch (vascular bundle) ở cây hoa lan Dendrobium,
nồng ñộ thích hợp là 10-50 ppm.
Tác giả cũng chứng minh rằng phun chitosan oligomer làm cho cây ra
hoa sớm hơn, số lượng cụm hoa/cây, số hoa/cum hoa cũng tăng lên so với ñối
chứng.
Nguyễn Anh Dũng (2002, 2004), nghiên cứu phun chitosan oligomer
(dp=8-16) lên cây ñậu tương và lạc. Kết quả cho thấy ở nồng ñộ phun 30
ppm làm tăng hàm lượng diệp lục trong lá ñậu tương và lạc lên từ 17-
32%[30],[32].
Nguyễn Anh Dũng (2007), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan,
chitosan oligomer ñến hàm lượng diệp lục khi phun lên lá cà phê. Kết quả cho
thấy, ñối với chitosan thì nồng ñộ thích hợp là 80 ppm, và 50 ppm với
chitosan oligomer[36].
Nge (2006), cũng nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer trong nuôi cấy
mô hoa lan Dendrobium thay thế các chất kích thích sinh trưởng truyền thống.
Tác giả khảo sát nồng ñộ chitosan oligomer, khối lượng phân tử và nguồn
chitosan oligomer sản xuất từ nấm và từ vỏ tôm. Kết quả thấy chitosan
oligomer có khối lượng phân tử 1-10 kDa có hoạt tính kích thích sinh trưởng
mạnh nhất, làm tăng khối lượng của protocorm của mô hóa lan lên nhiều
lần[46].
Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng của
protocorm, kết quả của tác giả cho thấy nồng ñộ thích hợp của chitosan
oligomer 10 kDa là từ 10-15ppm và nguồn chitosan oligomer từ nấm có hoạt
 36

tính mạnh kích thích sinh trưởng hơn từ vỏ tôm. Ảnh hưởng của nồng ñộ
chitosan oligomer 10kDa từ nấm ñến số lượng, khối lượng chồi lan, kết quả
cho thấy nồng ñộ thích hợp là 20ppm.
Nguyễn Quốc Hiến và Nagasawa (2000), nghiên cứu ảnh hưởng của
oligoalginate (cắt bằng bức xạ gamma) ñến quang hợp, sinh trưởng của lúa
mì, ñậu lạc, lúa bằng cách bổ sung vào dung dịch thủy canh. Kết quả cho
thấy, oligoalginate, chitosan oligomer làm tăng cường ñộ quang hợp của các
loại cây thí nghiệm lên 30-40%, sinh khối, chiều dài rễ của các loại cây này
ñều tăng mạnh so với ñối chứng[4].
Với các thí nghiệm trên ñồng ruộng, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy
chitosan oligomer có tác dụng tăng hàm lượng diệp lục trong lá, kích thích
tăng trưởng và tăng năng suất cây trồng.
Chibu (2001), nghiên cứu hiệu ứng kích thích sinh trưởng của chitosan
100 kDa trên một số cây trồng và nhiều cách như tưới vào ñất, phun lên lá.
Kết quả cho thấy lá của các loại cây trồng như xà lách, cà chua, lúa cạn xanh
ñậm, năng suất tăng mạnh so với ñối chứng và nồng ñộ sử dụng từ 0.1-0.5%
tùy loại cây trồng[27].
Nguyễn Anh Dũng cũng nghiên cứu thử nghiệm hiệu lực của chitosan
oligomer trên nhiều loại cây trồng trên các thí nghiệm ñồng ruộng như trên
cây ñậu tương (2002), ñậu lạc (2004), trên cây lúa (2006), cây bông vải (năm
2005, 2007), cây cà phê (2007).
Nguyễn Anh Dũng (2002), nghiên cứu xử lý hạt giống (coating seed)
ñậu tương ñã làm tăng năng suất ñậu tương lên 36%. Kết quả nghiên cứu trên
cây lạc (2004) cho thấy nồng ñộ thích hợp là 40ppm có tác dụng kích thích
tăng trưởng chiều cao cây, sinh khối, và số cành hữu hiệu[3].
 37

So sánh hiệu quả kích thích tăng trưởng và năng suất lạc của chitosan
oligomer với một số loại phân bón lá khác trên thị trường cho thấy chitosan
oligomer hiệu quả cao hơn nhiều.
Thử nghiệm chitosan oligomer với nồng ñộ 30-40 ppm trên cây lúa
ñược thực hiện tại Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long cho kết quả khả quan,
chitosan oligomer làm tăng năng suất lúa xấp xỉ 20% và hiệu quả cao hơn một
số phân bón lá khác. Kết quả nghiên cứu này cho thấy năng suất tăng là do
chủ yếu tăng số hạt chắc/bông và % hạt chắc.
Nitar (2004), cũng nghiên cứu thử nghiệm trên cây lúa cho kết quả
tương tự. Tác giả xử lý hạt giống với nồng ñộ 30ppm, và phun tiếp 2 lần/vụ
ñã làm tăng năng suất lúa tới 40% ở Myanmar[57].
Nguyễn Anh Dũng (2006) nghiên cứu thử nghiệm chitosan oligomer
trên cây lúa tại huyện Ea Kar, tỉnh Đak Lak cho kết quả ở nồng ñộ phun 40
ppm làm gia tăng năng suất 12.35% so với ñối chứng và ñạt hiệu quả cao hơn
so với hai chế phẩm Grow và AC. Đặc ñiểm của ô thí nghiệm phun chitosan
oligomer là lá lúa vẫn còn giữ màu xanh khi lúa ñã chín. Vì vậy khả năng
quang hợp, tích lũy chất khô ở thí nghiệm phun chitosan oligomer mạnh hơn,
vì vậy cho tỷ lệ hạt chắc mẩy cao hơn[35].
Thí nghiệm phun chitosan oligomer trên cây bông vải tại Trung tâm
Nghiên cứu bông Tây Nguyên của Nguyễn Anh Dũng và Phạm Xuân Hưng
(2007) cũng cho kết quả rất khả quan. Kết quả cho thấy chitosan oligomer
có tác dụng kích thích sinh trưởng chiều cao cây. Sự khác biệt về chiều cao
cây ở công thức có phun chitosan oligomer với ñối chứng là có ý nghĩa thống
kê. Ảnh hưởng của chitosan ñến các chỉ tiêu cấu thành năng suất cho thấy
chitosan oligomer có tác dụng làm tăng số quả/bông và số quả/m2. Riêng khối
lượng của quả thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Năng suất thực
thu của thí nghiệm phun chitosan oligomer tăng so với ñối chứng chăm sóc
 38

theo qui trình của công ty từ 15-40%[37].

Sarathchandra (2004), nghiên cứu xử lý hạt và phun lên lá cho cây kê.
Thời gian ngâm hạt là 3-9 h. Kết quả chitosan làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt
kê và sức sống của cây con cũng như các chỉ tiêu sinh trưởng khác như chiều
cao cây, chiều dài bông, số hạt trên bông và khối lượng 1000 hạt[61].
Uddin (2004), nghiên cứu phun chitosan và một số ñường
monosaccharide lên hoa Cát tường Lisianthus (Eustoma grandiflorum). Kết
quả cho thấy chitosan làm tăng số nụ hoa và tăng hàm lượng anthocyan, nhờ
vậy màu sắc của hoa ñậm ñà hơn[67].
Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác của Sasitorn (2002) phun chitosan
cho rau cải tăng năng suất từ 13-31%. Nguyễn Quốc Hiến (1998, 2000) phun
oligoalginate cho hoa cúc, trà, mía, lúa làm tăng năng suất từ 10-15%.
+ Thuốc BVTV sinh học
Chitosan và chitosan olygomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng thực
vật, tăng số lượng vi sinh vật có lợi và hạn chế các nấm gây hại trong ñất,
hoạt hóa tăng cường hệ thống ñề kháng của thực vật. Cơ chế hoạt ñộng của
chitosan theo sơ ñồ của Gueddari (2004) như sau:

Chitosan

Cơ chế trực tiếp Cơ chế gián tiếp

Cây trồng Tăng vsv ñối kháng

Nhận biết phân tử
Kích thích cơ chế Cảm ứng hệ thống
kháng chủ ñộng ñề kháng
Hoạt tính kháng
Vi sinh vật

Vi sinh vật gây bệnh Chitinase

Hình 1.11: Cơ chế hoạt ñộng của Chitosan

 39

Suwalee (2002), thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô ñể trị bệnh bạc
lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng ñộ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và
an toàn hơn so với các loại thuốc BVTV trên thị trường[64]. Nguyễn Anh
Dũng (2004) nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và chitosan oligomer cải
biến ñể kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho lạc
Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita, số
lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6-8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3
tháng. Rabea (2008) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử dụng
làm thuốc trừ nấm và trừ sâu[59].
Tóm lại, trên thế giới trong những năm gần ñây ñã có nhiều nghiên cứu
ứng dụng của chitosan, chitosan oligomer trong nông nghiệp như kích thích
sinh trưởng, kháng bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu
còn ở qui mô phòng thí nghiệm, ít có các nghiên cứu thực tế trên ñồng ruộng.
Đặc biệt là các nghiên cứu trên ñồng ruộng với các loại cây công nghiệp ngắn
ngày như bông vải, lạc và ñậu tương.
 40

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của mô
cấy
+ Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường ñến hình thành
protocorm.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ auxin/cytokinin ñến hình thành
chồi, rễ cây con trong invitro.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh truởng
của khoai lang nuôi cấy mô.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu, hóa chất
Củ khoai lang thuộc giống khoai lang cao sản Nhật Bản mua ở chợ
Tân Thành, thành phố Buôn Ma Thuột.
Củ khoai lang ñược rửa sạch dưới vòi nước chảy, ủ chúng trên lớp
bông gòn ẩm trong rổ nhựa sạch. Củ khoai lang ñược tưới ẩm 1 lần/ngày cho
ñến khi chồi mầm phát triển ñủ tiêu chuẩn ñề ra của thí nghiệm.
Chồi mầm lấy từ củ khoai lang khoảng 1,5 – 2 cm ñược rửa sạch dưới vòi
nước chảy khoảng 30 phút, lắc cồn 70o trong 1 phút, ngâm chúng vào dung
dịch nước tẩy javel với nồng ñộ 30% (v/v) trong 20 phút sau ñó ñược rửa lại
bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy 3 lần. Chồi mầm sau khi khử trùng ñược
cấy vào bình tam giác (V = 330 ml) chứa 65 ml môi trường MS (Murashige
và Skoog, 1962) có bổ sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l. Bình chứa mẫu
ñược ñặt trong phòng nuôi cây của phòng thí nghiệm bộ môn sinh học thực
vật – trường Đại học Tây Nguyên có thời gian chiếu sáng là 10 giờ/ngày,
nhiệt ñộ phòng 25 ± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5% .
 41

Chồi non vô trùng ñược ñưa vào nuôi in vitro là nguồn nguyên liệu cho
các thí nghiệm tiếp theo.
Chitosan oligomer sản xuất từ vỏ tôm cua có khối lượng phân
tử 10.000Da
Các hóa chất nuôi cất mô thực vật như NAA, IBA, các vitamin,
NaNO3, K2HPO4, MgSO4, CaCl2, NaHClO3, H2O2, … là hóa chất tinh khiết.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức
sống của mô nuôi cấy
Thí nghiệm 2 yếu tố: thời gian khử trùng và nồng ñộ chất khử trùng
với 3 lần lặp lại. Nghiên cứu thử nghiệm 3 loại chất khử trùng thông dụng
trong nuôi cấy mô là 3 chất khử trùng là hydro peroxyde, Natri hypochloride
và thuỷ ngân clorua.
Chồi mầm phát triển từ củ khoai lang trong ñiều kiện phòng
thí nghiệm ñược dùng làm nguồn nguyên liệu ban ñầu ñể thu nhận mẫu.
Chồi mầm có kích thước từ 1,5-2 cm ñược rửa sạch dưới vòi nước chảy
khoảng 30 phút, lắc cồn 70o trong 1 phút, ngâm chúng vào các dung dịch khử
trùng với nồng ñộ và thời gian theo yêu cầu của thí nghiệm. Sau ñó rửa sạch
lại bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy 3 lần. Mẫu ñược cấy vào bình tam giác
có chứa 65 ml môi trường. (Ảnh 2.1;2.2)
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
có bổ sung saccharose (công ty ñường Biên Hòa, Đồng Nai) 30g/l, agar (Công
ty TNHH Hải Long, Hảo Phòng) 7,5g/l. pH của môi trường ñược ñiều chỉnh
về 5.8 bằng KOH 1N và HCl 1N, sau ñó môi trường ñược hấp khử trùng ở
121oC trong thời gian 20 phút.
Bình tam giác chứa mẫu ñược nuôi trong phòng nuôi cây dưới thời gian
chiếu sáng là 10 giờ/ngày, nhiệt ñộ phòng 25 ± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5%.
 42

Bố trí thí nghiệm:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khử
trùng ñến sức sống của chồi mầm khoai lang.
Nghiệm thức Nồng ñộ hydro Thời gian khử trùng
peroxyde % (v/v) (phút)
N10T10 10 10
N10T15 10 15
N10T20 10 20
N20T10 20 10
N20T20 20 20
N20T30 20 30
N30T10 30 10
N30T20 30 20
N30T30 30 30

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian
khử trùng ñến sức sống của chồi mầm khoai lang.
Nghiệm thức Nồng ñộ Natri Thời gian khử trùng
hypochloride % (v/v) (phút)
N10T10 10 10
N10T20 10 20
N10T30 10 30
N20T10 20 10
N20T20 20 20
N20T30 20 30
N30T10 30 10
N30T20 30 20
N30T30 30 30
 43

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thuỷ ngân clorua ở các nồng ñộ và thời gian
khử trùng ñến sức sống của chồi mầm khoai lang.
Nghiệm thức Nồng ñộ HgCl2 % (v/v) Thời gian khử trùng
(phút)
N0.1T5 0.1 5
N0.1T10 0.1 10
N0.1T15 0.1 15
N0.3T5 0.3 5
N0.3T10 0.3 10
N0.3T15 0.3 15
N0.5T5 0.5 5
N0.5T10 0.5 10
N0.5T15 0.5 15

Mỗi thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với
2 yếu tố. Mỗi nghiệm thức có 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 3 mẫu, ñược lặp
lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi:
• Tỷ lệ mẫu không nhiễm trên tổng số mẫu cấy ban ñầu
• Số mẫu phát triển tốt và có khả năng tạo chồi.

Ảnh 2.1 Chồi mầm từ củ khoai lang ñược thu nhận ñể lấy mẫu khử trùng
 44

Ảnh 2.2 Mẫu chồi mầm từ củ khoai lang sau khi khử trùng ñược cấy vào môi
trườngMS
2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường ñến sự hình thành
protocorm
Mẫu cấy là mô sẹo từ gốc cây khoai lang cấy trong môi trường MS
có bổ sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l, BA 1mg/l, Kinetin 1mg/l ñược 30
ngày. Mỗi mô sẹo từ gốc cây ñược cắt ra làm 6 phần bằng nhau. Mẫu ñược
cấy trong bình tam giác có chứa 65ml môi trường (Ảnh 2.3; 2.4). Bình tam
giác chứa mẫu ñược nuôi trong tối ở phòng thí nghiệm với nhiệt ñộ phòng 25
± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5% .
Thí nghiệm sử dụng 5 loại môi trường nuôi cấy cải biến trên cơ sở
môi trường MS: ½ MS; 2/3 MS; MS; MS + 200mg/l KH2PO4; MS + 100ml/l
nước dừa. Tất cả 5 loại môi trường này ñều có bổ sung saccharose 30g/l, agar
7,5g/l, chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật NAA 5mg/l và Kinetin ở các nồng
 45

ñộ 5mg/l; 10mg/l; 15mg/l. pH của môi trường ñược ñiều chỉnh về 5.8 bằng
KOH 1N và HCl 1N, sau ñó môi trường ñược hấp khử trùng ở 121oC trong
thời gian 20 phút.
Bố trí thí nghiệm:
NT Môi trường NAA (mg/l) Kinetin (mg/l)
1 MS 5 5
2 MS 5 10
3 MS 5 15
4 ½ MS 5 5
5 ½ MS 5 10
6 ½ MS 5 15
7 2/3 MS 5 5
8 2/3 MS 5 10
9 2/3 MS 5 15
10 MS + 200mg/l KH2PO4 5 5
11 MS + 200mg/l KH2PO4 5 10
12 MS + 200mg/l KH2PO4 5 15
13 MS + 100ml/l nước dừa 5 5
14 MS + 100ml/l nước dừa 5 10
15 MS + 100ml/l nước dừa 5 15

Thí nghiệm gồm 15 nghiệm thức ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
yếu tố. Mỗi nghiệm thức có 4 bình tam giác với 6 mẫu/bình, ñược lặp lại 3
lần.
Chỉ tiêu theo dõi:
• Thời gian hình thành protocorm (ngày)
• Tỷ lệ hình thành protocorm (%)
 46

Ảnh 2.3. Mô sẹo từ gốc thân cây khoai lang Ảnh2.4. Mỗi mô sẹo ñược cắt
30 ngày tuổi ñược chọn ñể thu nhận mẫu thành 6 phần và cấy vào bình
tam giác

2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân khoai lang
in vitro
Đốt thân cây khoai lang sau 30 ngày nuôi cấy (mỗi ñốt thân dài 1cm)
ñược sử dụng trong thí nghiệm (Ảnh 2.5; 2.6).
Mẫu ñược cấy trên 65 ml môi trường chứa trong bình tam giác. Môi
trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l,
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật:
- BA với nồng ñộ thay ñổi : 0; 1; 2mg/l
- Kinetin với nồng ñộ thay ñổi là: 0; 1; 2mg/l
- pH của môi trường ñược ñiều chỉnh về 5.8 bằng KOH 1N và HCl 1N, sau
ñó môi trường ñược hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút.
- Bình tam giác chứa mẫu ñược nuôi trong phòng nuôi cây dưới thời gian
chiếu sáng là 10 giờ/ngày, nhiệt ñộ phòng 25 ± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5%.
 47

Bố trí thí nghiệm:

Nghiệm thức Nồng ñộ BA (mg/l) Nồng ñộ KN (mg/l)
B0K0 0 0
B0K1 0 1
B0K2 0 2
B1K0 1 0
B1K1 1 1
B1K2 1 2
B2K0 2 0
B2K1 2 1
B2K2 2 2

Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2
yếu tố, mỗi nghiệm thức có 4 bình, với 4 mẫu/bình, ñược lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy:
- % mẫu bật chồi
- Chiều cao chồi (mm)
- Số lá
- Khối lượng chồi tươi (g)
- Khối lượng chồi khô (g)
- Số rể
- Chiều dài rễ (mm)
- Khối lượng rễ tươi (g)
- Khối lượng rễ khô (g)
 48

Đốt thân

Đốt thân

Đốt thân

Đốt thân

Ảnh 2.5 Cây khoai lang in vitro 30 ngày Ảnh 2.6 Các ñốt thân ñược thu
tuổi và các vị trí ñốt thân ñược chọn ñể nhận và cấy vào bình tam giác
thu nhận mẫu cấy

2.2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai lang in vitro
Chồi ngọn từ cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy (chồi có 2
lá thật) ñược sử dụng trong thí nghiệm (ảnh 2.7; 2.8).
Mẫu ñược cấy trên 65 ml môi trường chứa trong bình tam giác. Môi
trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l, agar 7,5g/l,
chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật:
 49

- IBA với nồng ñộ thay ñổi: 0; 1; 2 mg/l

- NAA với nồng ñộ thay ñổi : 0; 1 mg/l
pH của môi trường ñược ñiều chỉnh về 5.8 bằng KOH 1N và HCl 1N,
sau ñó môi trường ñược hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút.
Bình tam giác chứa mẫu ñược nuôi trong phòng nuôi cây dưới thời gian chiếu
sáng là 10 giờ/ngày, nhiệt ñộ phòng 25 ± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5%.
Bố trí thí nghiệm:
Nghiệm thức Nồng ñộ IBA (mg/l) Nồng ñộ NAA (mg/l)
I0N0 0 0
I0N1 0 1
I1N0 1 0
I1N1 1 1
I2N2 2 0
I2N1 2 1

Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2
yếu tố. Mỗi nghiệm thức có 4 bình, với 3 mẫu/bình, ñược lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy:
- % ra rễ
- Số rễ
- Chiều dài rễ (mm)
- Khối lượng rễ tươi (g)
- Khối lượng rễ khô (g)
- Số lá
- Chiều cao chồi (mm).
 50

Ảnh 2.7. Chồi ngọn cây khoai Ảnh 2.8. Các chồi ngọn ñược cấy
lang 30 ngày tuổi ñược chọn làm vào bình tam giác
mẫu cấy

2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh
trưởng của khoai lang nuôi cấy mô
Đốt thân từ cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy ñược sử dụng
trong thí nghiệm (ảnh 2.9; 2.10).
Mẫu ñược cấy trên 65 ml môi trường chứa trong bình tam giác. Thí
nghiệm sử dụng môi trường tối ưu từ nội dung 2.3 (2mg/l BA + 1mg/l
Kinetin) có bổ sung 5 nồng ñộ chitosan khác nhau: 0; 10; 20; 30; 50 ppm.
pH của môi trường ñược ñiều chỉnh về 5.8 bằng KOH 1N và HCl 1N, sau ñó
môi trường ñược hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút.
Bình tam giác chứa mẫu ñược nuôi trong phòng nuôi cây dưới thời gian chiếu
sáng là 10 giờ/ngày, nhiệt ñộ phòng 25 ± 2oC, ñộ ẩm phòng 60 ± 5%.
Bố trí thí nghiệm:
 51

NT BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Chitosan oligomer ppm/l

C0 2 1 0
C10 2 1 10
C20 2 1 20
C30 2 1 30
C50 2 1 50
Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức ñược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1
yếu tố. Mỗi nghiệm thức có 4 bình, với 4 mẫu/bình, ñược lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy:
- % mẫu bật chồi - Chiều cao chồi (mm)
- Số lá - Khối lượng chồi tươi (g)
- Khối lượng chồi khô (g) - Số rể
- Chiều dài rễ (mm) - Khối lượng rễ tươi (g)
- Khối lượng rễ khô (g).

Đốt thân

Đốt thân

Đốt thân

Đốt thân

Ảnh 2.9 Cây khoai lang in vitro 30 ngày Ảnh 2.10 Các ñốt thân ñược thu
tuổi và các vị trí ñốt thân ñược chọn ñể nhận và cấy vào bình tam giác
thu nhận mẫu cấy
 52

2.2.2.6. Xử lý số liệu thống kê

Phần mềm thống kê MSTACTC (Đại học Michigan, Mỹ) ñược sử dụng
ñể phân tích các số liệu thu nhận ñược trên tất cả các thí nghiệm.
 53

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang
3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng thuỷ ngân clorua ñến sức sống của
chồi mầm từ củ khoai lang
Chồi mầm từ củ khoai lang sau khi xử lý bằng thuỷ ngân clorua ở các
mức nồng ñộ 0,1%; 0,3%; 0,5% trong thời gian 5; 10; 15 phút ñược cấy trên
môi trường MS. Sau thời gian 3 tuần cho thấy sự phản ứng rõ rệt của mẫu ñối
với chất khử trùng thuỷ ngân clorua ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau. Tỷ
lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống bật chồi và mẫu chết là những chỉ tiêu ñánh giá
khả năng khử trùng của thuỷ ngân clorua lên chồi mầm từ củ khoai lang(bảng
3.1).
Kết quả ở hình 1 (A,B,C) cho thấy ở mức thời gian 5 phút, tỷ lệ sống
sót của mẫu tỷ lệ thuận với nồng ñộ xử lý. Nồng ñộ xử lý càng cao thì tỷ lệ
mẫu sống càng cao và tỷ lệ mẫu nhiểm giảm xuống, ở nồng ñộ thuỷ ngân
clorua 0,5% trong 5 phút số mẫu ñưa vào ñạt 100%.
Tuy nhiên, khi tăng thời gian xử lý lên 10 phút thì tỷ lệ mẫu sống bật
chồi lại tỷ lệ nghịch với nồng ñộ xử lý. Nồng ñộ xử lý càng cao thì tỷ lệ sống
sót của mẫu càng giảm. Ở nồng ñộ thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 phút cho
thấy tỷ lệ mẫu sống ñạt 100% (100%; 50%; 20% tương ứng với nồng ñộ xử lý
0,1%; 0,3%; 0,5% trong 10 phút), ñồng thời tỷ lệ mẫu bị chết lại tăng lên khi
tăng nồng ñộ xử lý (80% mẫu chết ở nồng ñộ 0,5%). Ở mức thời gian 15 phút
khi tăng nồng ñộ thuỷ ngân clorua lên 0.3% thì tỷ lệ mẫu sống bật chồi cao
nhất là 60% nhưng khi tăng nồng ñộ thuỷ ngân clorua lên 0,5% sau 1 tuần thì
mẫu chết hoàn toàn. Ở hình 1C cho thấy ở nồng ñộ thuỷ ngân clorua 0,5% với
 54

các mức thời gian khác nhau thì không có mẫu nào bị nhiểm nhưng tỷ lệ mẫu
sống sót giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng dần khi tăng thời gian xử lý (bảng 3.1).
Trong hai nghiệm thức N0,1T10 và N0,5T5 cho thấy tỷ lệ mẫu sống bật
chồi ñều ñạt 100% sau 3 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, khả năng tăng trưởng của
chồi lại khác nhau trong hai nghiệm thức này. Ở nghiệm thức N0,1T10 sau 10
ngày chồi ra rễ và ñược 1 lá thật, sau 21 ngày chồi ñược 4 lá thật (ảnh 3.1).
còn ở nghiệm thức N0,5T5 sau 15 ngày chỉ có khoảng 30% mẫu bật chồi mới
ra ñược 1 lá thật, các mẫu còn lại có bật chồi nhưng phát triển rất chậm và sau
21 ngày khả năng phát triển của chồi trong nghiệm thức này không thay ñổi
nhiều.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng thuỷ ngân clorua ở các
nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ
củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy
% mẫu nhiễm
Nghiệm thức % mẫu % mẫu % mẫu % tổng % mẫu
nhiễm nấm nhiễm nấm nhiễm số mẫu bật chồi
và khuẩn khuẩn nhiễm
a
N0,1T5 3,3 23,3 13,3c 40a 60b
b
N0,1T10 0 0 0d 0c 100a
N0,1T15 0 0b 0d 0c 50c
N0,3T5 0 23,3a 13,3c 37ab 63,3b
N0,3T10 0 0b 30b 30b 50c
b
N0,3T15 0 0 40a 40a 60b
N0,5T5 0 0b 0d 0c 100a
N0,5T10 0 0b 0d 0c 20d
N0,5T15 0 0b 0d 0c 0e
ANOVAz
Nồng ñộ NS ** ** ** **
Thời gian NS ** NS ** **
Nồng ñộ x Thời gian NS ** ** ** **
CV (%) 51,9 8,0 5,3 3,9 1,7
z
**, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
Duncan’s Multiple Range Test.
 55

0.1%

(%)
120

100

80

60

40

20

0
5 10 15
A Thời gian xử lý (phút)

0.3%
(%)

70

60

50

40

30

20

10

0
5 10 15
B Thời gian xử lý (phút)
(%)

0.5%
% nấm + khuẩn
120

100 % nấm

80 % khuẩn
60 % Tổng nhiểm
40
% Mẫu bật chồi
20
% chết
0
5 10 15
C Thời gian xử lý (phút)

Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng thuỷ ngân clorua ñến sức sống
của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1% (A),
0.3% (B), 0.5% (C)
 56

Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật ñều có thể ñược sử dụng ñể nuôi
cấy nhưng mức ñộ thành công phụ thuộc vào hệ thống môi trường sử dụng,
loài thực vật nuôi cấy và sự khử trùng mẫu cấy thành công ñể thu ñược một
lượng lớn mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng [10]. Khoai lang
là một loài cây thân thảo, có thân bò trên mặt ñất, củ nằm trong ñất cho nên
việc khử trùng mẫu tương ñối khó khăn. Trong thí nghiệm này, mẫu ñược
chọn là chồi mầm từ củ khoai lang. Tác nhân vô trùng ngoài diệt nấm khuẩn
còn ảnh hưởng ñến mô cấy, vì vậy việc lựa chọn hóa chất phải căn cứ vào
mức ñộ nhiễm, sự mẫn cảm của mẫu, nồng ñộ xử lý và thời gian xử lý thích
hợp.
Đối với chất khử trùng là thuỷ ngân clorua, kết quả thu nhận ñược khi
so sánh trên 3 nồng ñộ ở 3 mức thời gian khử trùng khác nhau ñã chứng minh
ñiều ñó. Tỷ lệ mẫu sống và bật chồi 100% khi mẫu ñược xử lý ở nồng ñộ thuỷ
ngân clorua 0,1% trong 10 phút. Kết quả này cũng tương tự với hoa loa kèn
(Lê Thi Thu Về và cs, 1999)[16]. Khi tăng nồng ñộ lên 0,3% và 0,5% và thời
gian xử lý lên 15 phút thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm giảm ñi nhưng tỷ lệ mẫu chết
tăng lên. Giữa hai nghiệm thức thuỷ ngân clorua 0.1% trong 10 phút và thuỷ
ngân clorua 0,5% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm là giống nhau
(100%) sau 3 tuần nuôi cấy .Tuy nhiên, khả năng tăng trưởng của chồi trong
hai nghiệm thức này là khác nhau. Ở nghiệm thức thuỷ ngân clorua 0,1%
trong 10 phút sau 10 ngày nuôi cấy chồi ra rễ và ñược 1 lá thật, sau 21 ngày
chồi ñược 3 lá thật còn ở nghiệm thức thuỷ ngân clorua 0.5% trong 5 phút sau
15 ngày nuôi cấy chỉ có khoảng 30% mẫu bật chồi mới ra ñược một lá thật,
các mẫu còn lại có bật chồi nhưng chồi phát triển rất chậm và sau 21 ngày khả
năng phát triển của chồi trong nghiệm thức này không thay ñổi nhiều. Điều ñó
cho thấy việc xử lý thuỷ ngân clorua ở nồng ñộ cao ñối với mẫu chồi mầm từ
củ khoai lang ñã làm biến ñổi một số cấu trúc trong tế bào như phá hủy vách
 57

tế bào ở phần vỏ và phần mẫu tiếp xúc với hóa chất làm ngăn cản việc hấp
thụ chất dinh dưỡng của tế bào dẫn tới ức chế sự sinh trưởng và giảm tỷ lệ
sống sót của mẫu cấy.
3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng
ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang
Mẫu sau khi ñược khử trùng và cấy vào môi trường, nếu không
bị nhiễm sau một tuần sẽ thích nghi với môi trường và bắt ñầu phát triển trở
lại. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi ñược xử lý ở các nồng ñộ và thời
gian khác nhau. Kết quả thống kê ở bảng 3.2 cho thấy sự khác biệt rất có ý
nghĩa trên các chỉ tiêu tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu bật chồi.
Đối với các mẫu ñược xử lý ở nồng ñộ Natri hypochloride cao hay thời
gian xử lý lâu thì chồi kém phát triển hoặc gần như không phát triển ñược và
tỷ lệ mẫu bị chết cao do phần mô bên ngoài bị tổn thương, có màu trắng ñục.
Hình 3.2 cho thấy số mẫu nhiểm tỷ lệ nghịch với nồng ñộ xử lý. Khi
tăng nồng ñộ xử lý lên càng cao thì tỷ lệ mẫu bị nhiễm càng thấp. Ở nồng ñộ
natri hypochloride thấp và thời gian xử lý ngắn (N10T10) thì tỷ lệ mẫu cấy bị
nhiễm cao nhất (83,3%), trong ñó tới 36,7% số mẫu bị nhiễm cả nấm và vi
khuẩn (bảng 3.2). Ở nghiệm thức N20T30 có tỷ lệ mẫu sống và bật chồi cao
nhất(76,7%). Khi tăng nồng ñộ xử lý lên 30% thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống
còn 20% nhưng số mẫu chết tăng lên theo các mức thời gian (30%, 33,3%,
43,3% tương ứng với thời gian xử lý 10; 20; 30 phút) chứng tỏ mẫu cấy rất
mẫn cảm với chất khử trùng (hình 3.2)
 58

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng
ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ
khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy

% mẫu nhiễm
% mẫu % mẫu % mẫu % tổng % mẫu
Nghiệm thức nhiễm nhiễm nhiễm số mẫu bật
nấm và nấm khuẩn nhiễm chồi
khuẩn
N10T10 36,7 26,7 20bc 83,3a 16,7f
N10T20 30 30 23,3b 83,3a 16,7f
N10T30 26,7 23,3 23,3b 73,3b 26,7f
N20T10 10 13,3 36,7a 60c 40cd
N20T20 10 6,7 36,7a 50d 50b
N20T30 3,3 6,7 13,3de 23,3e 76,7a
N30T10 3,3 3,3 16,7cd 23,3e 46,7bc
N30T20 6,7 6,7 10e 23,3e 43,3bcd
N30T30 3,3 3,3 13,3de 20e 36,7d
ANOVAz
Nồng ñộ ** ** ** ** **
Thời gian NS NS * ** **
Nồng ñộ x Thời gian NS NS ** ** **
CV (%) 36,5 42,4 24,3 9,0 11,5
z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01, 0,05 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
Duncan’s Multiple Range Test.
 59

(%)
90
% tổng nhiểm
80 % mẫu bật chồi
% mẫu chết
70

60

50

40

30

20

10

0
N10T10 N10T20 N10T30 N20T10 N20T20 N20T30 N30T10 N30T20 N30T30
Nghiệm thức

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần
nuôi cấy
3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời
gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang.
Chồi mầm từ củ khoai lang sau khi xử lý bằng hydro peroxyde ở các
nồng ñộ và thời gian khác nhau ñược cấy trên môi trường MS. Sau 3 tuần cho
thấy sự phản ứng rõ rệt của mẫu ñối với chất khử trùng hydro peroxyde. Sự
khác biệt rất có ý nghĩa ñược thể hiện trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi.
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy ở nồng ñộ 30% trong 10 phút, số mẫu sống
và bật chồi cao nhất là 50%. Ở nồng ñộ 30% khi tăng thời gian lên 20 phút và
30 phút thì tỷ lệ mẫu sống và bật chồi giảm xuống (26,7% và 20%), số mẫu
nhiễm cũng giảm xuống nhưng xuất hiện mẫu chết có màu nâu ñen. Ở nồng
ñộ 10% và 20% trong 10 phút số mẫu bị nhiễm là 100% trong tất cả các
nghiệm thức (bảng 3.3, hình 3.3). Vậy khử trùng mẫu chồi mầm từ củ khoai
lang bằng hydro peroxyde ở nồng ñộ 30% trong 10 phút là tốt nhất.
 60

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ
và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy
% mẫu nhiễm
% mẫu % % mẫu % tổng
Nghiệm thức nhiễm mẫu nhiễm số mẫu % mẫu bật
nấm và nhiễm khuẩn nhiễm chồi
khuẩn nấm
N10T10 0d 40a 60a 100a 0d
N10T15 13,3b 30b 56,6ab 100a 0d
N10T20 0d 40a 60a 100a 0d
N20T10 36,6a 30b 33,3c 100a 0d
N20T20 3,3cd 3,3e 53,3b 60b 40ab
N20T30 6,6bcd 23,3c 23,3de 53,3bc 46,7a
N30T10 10bc 16,6d 23,3de 50cd 50a
N30T20 10bc 23,3c 20e 53,3bc 26,7bc
N30T30 3,3cd 13,3d 26,6d 43,3d 20c
ANOVAz
Nồng ñộ * ** ** ** **
Thời gian ** NS NS ** NS
Nồng ñộ x Thời gian ** * * ** **
CV (%) 7,8 3,6 2,2 1,4 4,8
z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01, 0,05 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
Duncan’s Multiple Range Test.
 61

%
120
%mẫu nhiễm
% mẫu bật chồi
100

80

60

40

20

0
N10T10 N10T15 N10T20 N20T10 N20T20 N20T30 N30T10 N30T20 N30T30

nghiệm thức

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần
nuôi cấy

Ảnh 3.1 Chồi ñược hình Ảnh 3.2 Chồi ñược hình Ảnh 3.3 Chồi ñược hình
thành và phát triển ở nồng thành và phát triển ở nồng thành và phát triển ở nồng
ñộ thuỷ ngân clorua 0,1% ñộ natri hypochliride ñộ Hydro peroxyde 30%

trong 10 phút sau 3 tuần 20% trong 30 phút sau 3 trong 10 phút sau 3 tuần

nuôi cấy tuần nuôi cấy nuôi cấy

 62

3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm
Mẫu cấy là mô sẹo từ gốc cây khoai lang in vitro 30 ngày tuổi. Mẫu sau
khi cấy vào các thành phần môi trường khác nhau ñều có phản ứng và biểu
hiện khác nhau tùy từng loại môi trường. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy ở các
nghiệm thức 6, 9, 12, 15 ñều có 17% mẫu tạo protocorm. Trên môi trường
MS có bổ sung 200mg/l KH2PO4 + NAA 5mg/l + Kinetin 15mg/l (NT 12)
mẫu bắt ñầu tạo protocorm sau 4 ngày nuôi cấy, nghiệm thức 6 và 15 mẫu bắt
ñầu tạo protocorm sau 7 ngày nuôi cấy và nghiệm thức 9 mẫu bắt ñầu tạo
protocorm sau 10 ngày nuôi cấy nhưng hình thái chồi rất nhỏ và phát triển
chậm. Sau 40 ngày nuôi cấy chồi ñạt 0.4cm và sau 70 ngày nuôi cấy chồi vẫn
không phát triển thêm (bảng 3.4, ảnh 3.4;3.5; 3.6; 3.7).
Sự phản ứng giống nhau của các mẫu tạo protocorm ở các nghiệm thức
trên là do tác ñộng của cùng một nồng ñộ NAA 5mg/l và Kinetin 15mg/l.
Trên 5 môi trường khác nhau, khi bổ sung một lượng chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật như nhau thì các môi trường MS cải tiến hình thành
protocorm tốt hơn trên môi trường MS.
Ở ngày thứ 70, ña số các mẫu ñều tạo rễ, ở các môi trường có bổ sung
NAA 5mg/l + Kinetin 5mg/l mô sẹo phát triển lớn lên có màu vàng nhạt, rễ to
và dài khoảng 4cm có màu trắng. Các môi trường có bổ sung NAA 5mg/l +
Kinetin 10mg/l hầu như các mẫu ñều hóa nâu và chết.
 63

Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành
protocorm sau 40 ngày nuôi cấy
NT Môi trường NAA Kinetin Thời gian Tỷ lệ hình
(mg/l) (mg/l) hình thành thành
protocorm protocorm
(ngày) (%)
1 MS 5 5 0
2 MS 5 10 0
3 MS 5 15 0
4 ½ MS 5 5 0
5 ½ MS 5 10 0
6 ½ MS 5 15 7 17
7 2/3 MS 5 5 0
8 2/3 MS 5 10 0
9 2/3 MS 5 15 10 17
10 MS + 200mg/l KH2PO4 5 5 0
11 MS + 200mg/l KH2PO4 5 10 0
12 MS + 200mg/l KH2PO4 5 15 4 17
13 MS + 100ml/l nước dừa 5 5 0
14 MS + 100ml/l nước dừa 5 10 0
15 MS + 100ml/l nước dừa 5 15 7 17

Do hạn chế về thời gian, kết quả thí nghiệm về tạo protocorm còn hạn
chế. Chúng tôi ñề nghị các nghiên cứu sau tiếp tục nghiên cứu ñể hoàn thiện
qui trình nuôi cấy mô khoai lang cao sản.
 64

Ảnh 3.4 Protocorm hình thành Ảnh 3.5 Protocorm hình thành
trên môi trường ½ MS +NAA trên môi trường 2/3 MS + NAA
5mg/l + Kinetin 15mg/l 5mg/l + Kinetin 15mg/l

Ảnh 3.6 Protocorm hình thành Ảnh 3.7 Protocorm hình thành
trên môi trường MS + 200mg/l trên môi trường MS + 100ml/l
KH2PO4 NAA 5mg/l + Kinetin nước dừa NAA 5mg/l + Kinetin
15mg/l 15mg/l
 65

3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng ñến hình
thành chồi và rễ cây con trong in vitro
3.3.1. Ảnh hưởng của N6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các nồng ñộ và
tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành chồi và tăng trưởng chồi cây khoai lang
Trên cây khoai lang in vitro 30 ngày tuổi, các ñốt thân ñược chọn ñể
lấy mẫu. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi ñược nuôi cấy trên môi
trường MS có sự thay ñổi nồng ñộ BA và Kinetin. Kết quả phân tích thống
kê ở ngày thứ 30 cho thấy rằng với các chỉ tiêu khối lượng chồi tươi, khối
lượng chồi khô, số rễ, chiều dài rễ, khối lượng rễ tươi, khối lượng rễ khô thì
không có sự khác biệt trên tất cả các nghiệm thức ñược khảo sát nhưng sự
khác biệt rất có ý nghĩa trên các chỉ tiêu số lá và chiều cao chồi (bảng 3.5).
Theo quan sát thấy sau 10 ngày nuôi cấy thì 100% mẫu cấy ñều bật
chồi trên tất cả các nghiệm thức. Trong quá trình phát sinh hình thái, sự bật
chồi chỉ xuất hiện ở một vùng nhất ñịnh là nách lá có sự xuất hiện của chồi
ngủ và mỗi ñốt thân chỉ tạo ñược một chồi. Nhưng mẫu cấy có sự phản ứng
khác biệt rõ rệt với sự thay ñổi của nồng ñộ BA và kinetin thể hiện qua số lá
trên chồi. Nếu môi trường MS không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thì số
lá trung bình trên cây là rất thấp (3,8 lá/cây). Nếu môi trường có bổ sung chất
ñiều hòa sinh trưởng (BA 1mg/l và Kinetin 1mg/l) thì có số lá trung bình trên
cây là cao nhất (5,3 lá/cây) (bảng 3.5, hình 3.4).
Về chỉ tiêu chiều cao chồi cũng cho kết quả tương tự, trên môi trường
không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật thì chiều cao chồi trung
bình là thấp nhất (9mm). Trên môi trường có bổ sung chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật với BA 2mg/l và kinetin 1mg/l thì chiều cao chồi tăng lên rất
rõ rệt (56mm), trong khi ñó số lá trung bình ở nghiệm thức này là 4,8 lá/cây.
Nhưng khi tăng nồng ñộ chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên với BA 2mg/l
và kinetin 2mg/l thì chiều cao chồi lại giảm xuống (44,7mm) và số lá trung
 66

bình ở nghiệm thức này chỉ là 4 lá/cây (bảng 3.5, hình 3.4). Trong khi ñó chỉ
tiêu về khối lượng chồi tươi và khối lượng chồi khô không có sự khác biệt
trên tất cả các nghiệm thức ñược khảo sát. Ở nghiệm thức B0K2 có khối lượng
chồi tươi và khối lượng chồi khô cao nhất (0,62g; 0,043g), mặc dù có chiều
cao chồi thấp hơn trong nghiệm thức B2K1 nhưng thân các cây trong nghiệm
thức này mập ñều hơn (bảng 3.5).

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng
chồi từ ñốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy
NT % Chồi Rễ
mẫu Số lá Chiều Khối Khối Số rễ Chiều Khối Khối
bật cao chồi lượng lượng dài rễ lượng lượng
chồi (mm) chồi chồi (mm) rễ tươi rễ khô
tươi khô (g) (g) (g)
(g)
B0K0 100 3,8c 9,0e 0,41 0,030 1,8 251,9 0,12 0,010
B0K1 100 5,1a 21,6d 0,55 0,039 2,5 309,0 0,15 0,011
B0K2 100 4,9ab 38,6 c
0,62 0,043 3,9 321,7 0,18 0,013
B1K0 100 4,8abc 37,1c 0,55 0,040 3,2 379,4 0,25 0,025
B1K1 100 5,3a 45,9b 0,47 0,036 5,2 164,7 0,08 0,007
B1K2 100 5,0ab 46,5b 0,48 0,036 4,4 90,7 0,07 0,006
B2K0 100 4,8abc 39,9 c
0,37 0,029 3,3 154,8 0,05 0,005
B2K1 100 4,8abc 56,0a 0,50 0,037 4,0 58,8 0,02 0,002
B2K2 100 4,0bc 44,7b 0,36 0,034 4,3 66,2 0,04 0,003
ANOVA
BA * ** * NS ** NS NS *
KINETIN ** ** NS NS ** ** ** NS
BA x K ** * NS NS NS NS NS NS
CV (%) 7,9 18,7 19,7 17,3 22,1 21 28,2 67,4
z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01, 0,05 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
Duncan’s Multiple Range Test.
 67

số lá 6

0
B0K0 B0K1 B0K2 B1K0 B1K1 B1K2 B2K0 B2K1 B2K2
Nghiệ m thức

Hình 3.4 Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy

60
mm

50

40

30

20

10

0
B0K0 B0K1 B0K2 B1K0 B1K1 B1K2 B2K0 B2K1 B2K2
Nghiệm thức

Hình 3.5 Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy

Sau 10 ngày nuôi cấy, nhận thấy ở tất cả các nghiệm thức ñều
có sự hình thành chồi từ các ñoạn thân mang chồi nách (1cm). Trong
quá trình phát sinh hình thái, sự bật chồi chỉ xuất hiện ở vùng nách lá nơi
có chồi ngủ. Điều này có thể do hai nguyên nhân: (i) về mặt cấu tạo, chồi ngủ
 68

là những chồi nách ở trong trạng thái nghỉ, không hoạt ñộng trong thời gian
dài, nó có thể là chồi sinh dưỡng hoặc chồi hoa vì vậy khi gặp ñiều kiện thuận
lợi chúng sẽ nhanh chóng phát triển. (ii) Cytokinin kích thích sự phát triển của
chồi và khởi phát sự phát sinh chồi ở nồng ñộ thích hợp. Do ñó khi mẫu ñược
cấy vào môi trường thì chồi ngủ lập tức ñược kích thích phát sinh chồi. Sau
30 ngày nuôi cấy, ở những môi trường hoặc chỉ có bổ sung kinetin hoặc chỉ
có BA thì chiều cao chồi có tăng hơn so với ñối chứng nhưng lại thấp hơn khi
có sự kết hợp giữa hai loại Cytokinin. Trong môi trường chứa BA 2mg/l +
Kinetin 1mg/l lại có chiều cao chồi lớn nhất (56mm) trong khi ñó có số lá là
4,8 lá/cây không có sự khác biệt so với nghiệm thức B1K1. Điều này ñúng với
nhận ñịnh rằng ở một số loài thực vật, khi áp dụng phối hợp vài loại
Cytokinin với nhau sẽ làm tăng hiệu quả tăng sinh chồi như Corylus avelana
(Anderson, 1984), Cucumisnelo (Kathal và cs, 1988),[10]. Trên những ñối
tượng khác như nuôi cấy chồi Gynura sarmentosa (Cailloux, 1978) cũng ñã
kết luận rằng BA, Kinetin, 2-ip ñều kích thích sự tạo chồi khi sử dụng riêng
rẽ, nhưng mỗi chất ñều gây ra sự bất bình thường ở một vài chồi, chồi ñược
tạo ra khỏe mạnh và tăng trưởng nhanh khi phối hợp cả 3 chất cùng lúc. Như
vậy nồng ñộ BA có ảnh hưởng lớn trong quá trình tạo chồi và tăng trưởng
chồi. BA thuộc nhóm Cytokinin nên hàm lượng Cytokinin ngoại sinh cao sẽ
dẫn ñến hàm lượng Cytokinin nội sinh cao. Có thể mẫu cấy ñã hấp thu
Cytokinin từ ngoài môi trường hoặc sự hiện diện của Cytokinin ñã kích thích
sự tổng hợp các Cytokinin nội sinh.
Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (1989), Salisburg (1991) các Cytokinin
trong môi trường nuôi cấy giúp phá vỡ miêng trạng, thúc ñẩy sự phát triển của
chồi, kích thích sự phân chia, phân hóa và gia tăng kích thước tế bào. Ngoài
ra còn có tác dụng trong việc huy ñộng nguồn dinh dưỡng từ môi trường và
thức ñẩy quá trình tổng hợp prôtêin nên các ñốt thân kéo dài ra, trong khi các
 69

chỉ tiêu khác có sự khác biệt không lớn [8]. Tuy nhiên, nếu tăng nồng ñộ
Cytokinin lên (BA 2mg/l + Kinetin 2mg/l) thì chiều cao chồi giảm ñi và chồi
phát triển chậm, có lẽ nồng ñộ Kinetin cao ñã ức chế sự tăng trưởng của chồi.
Các chỉ tiêu về rễ trong thí nghiệm này không có sự khác biệt, nhưng ở các
môi trường không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật hoặc chỉ bổ
sung một trong hai chất thì số rễ cũng thấp hơn khi bổ sung vào môi trường cả
hai loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật (B1K1 có số rễ cao nhất là 5.2
rễ/cây). Nếu tăng nồng ñộ Cytokinin lên B2K1 hoặc B2K2 thì số rễ giảm xuống
(4 rễ/cây). Kết quả này ñúng với kết luận của Narayanaswamy (1994), Dương
Công Kiên (2006) là nồng ñộ cao của Cytokinin kìm hãm sự hình thành và
phát triển của rễ [8]

a b

Ảnh 3.8 Cây khoai lang hình thành và phát triển từ ñốt thân sau 30 ngày nuôi cấy
(a) Cây trên môi trường MS không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
(b) Cây trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và Kinetin 1 mg/l
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến
sự hình thành rễ cây khoai lang
Chồi ngọn (3 lá thật) của cây khoai lang in vitro 30 ngày tuổi ñược
chọn ñể lấy mẫu. Sau 10 ngày nuôi cấy mẫu chồi ñã tạo rễ trên tất cả các môi
 70

trường nhưng có sự thay ñổi về số lượng, chiều dài rễ và hình thái rễ. Kết quả
phân tích thống kê ở ngày thứ 30 cho thấy sự khác biệt rất có ý nghĩa trên các
chỉ tiêu số rễ, chiều dài rễ và chiều cao chồi. Ở nghiệm thức I0N0 không bổ
sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật cây ra rễ chậm nhất, sau 30 ngày chỉ
tạo ñược 6,5 rễ nhưng lại có chiều dài rễ dài nhất (189,1 mm/rễ dài nhất), hình
thái rễ dài, nhỏ, mỏng và có màu trắng (bảng 3.6, hình 3.7, ảnh 3.9)
Trên môi trường MS có bổ sung NAA và IBA với nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau thì cây có số lượng rễ và chiều dài rễ cũng rất khác nhau.
Ở nghiệm thức I2N1, sau 30 ngày nuôi cấy có số rễ trung bình cao nhất (21 rễ)
nhưng chiều dài rễ lại ngắn nhất (30,7 mm/rễ dài nhất), các rễ mọc trong môi
trường to, ngắn nhưng các rễ mọc trên bề mặt môi trường lại dài hơn, mỏng
hơn. Mặc dù chiều dài rễ ở nghiệm thức này thấp hơn trong môi trường không
bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật nhưng chiều dài rễ ở từng cây
tương ñối ñồng ñều nhau (từ 25 – 40 mm).
Tuy nhiên khi xét về chỉ tiêu chiều cao chồi và số lá thì thấy rằng
ở nghiệm thức I1N0 có số lá cao nhất (6,1 lá/cây) và chiều cao chồi cao nhất
(56,4 mm) trong khi ñó số rễ không có sự khác biệt so với nghiệm thức I2N1
(20 rễ/cây ) và có chiều dài rễ là 50 mm/ rễ dài nhất. Như vậy khi tăng nồng
ñộ auxin lên cao thì có tác dụng tạo nhiều rễ nhưng lại kìm hãm sự kéo dài
của rễ và sự tăng trưởng của chồi (bảng 3.6, hình 3.8).
Các chỉ tiêu khối lượng rễ tươi và khối lượng rễ khô không có sự khác
biệt trên tất cả các nghiệm thức ñược khảo sát (bảng 3.6).
 71

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây
khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy
Chồi Rễ
Nghiệm Số lá Chiều % ra Số rễ Chiều Khối Khối
thức cao chồi rễ dài rễ/ rễ lượng rễ lượng rễ
(mm) dài nhất tươi (g) khô (g)
(mm)
I0N0 5,8 30,9c 100 6,5b 189,1a 0,16 0,021
I0N1 5,8 43,9b 100 16,3a 71,9b 0,27 0,030
I1N0 6,1 56,4a 100 20,0a 50,0bcd 0,33 0,026
I1N1 5,0 37,1bc 100 19,0a 62,2bc 0,42 0,036
I2N0 5,1 42,1b 100 17,3a 31,9cd 0,25 0,021
I2N1 3,3 39,9b 100 21,0a 30,7d 0,28 0,021
ANOVAz
IBA NS NS ** NS * **
NAA NS NS * * * **
IBA x NAA NS * * * NS NS
CV (%) 20,3 15,3 18,6 24 17,2 15,9
z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01;0,05 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
LSD.
mm

60
50
40
30
20
10

0
I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1
Nghiệm thức

Hình 3.6 Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy
 72

Số rễ
25

20

15

10

0
I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1
Nghiệm thức

Hình 3.7 Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy

200
chiều cao chồi (mm)
180 số rễ
chiều dài rễ (mm)
160

140

120

100

80

60

40

20

0
I0N0 I0N1 I1N0 I1NI I2N0 I2N1

Hình 3.8 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài
rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy
 73

a b

Ảnh 3.9 Cây khoai lang hình thành và phát triển từ chồi ngọn sau 30 ngày nuôi cấy
(a) Cây trên môi trường MS không bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật
(b) Cây trên môi trường MS có bổ sung IBA 1mg/l .

Trong sự hình thành rễ, ñặc biệt là rễ phụ (giâm cành, chiếc cành, ñặc
biệt là nuôi cấy mô) hiệu quả của auxin là rất ñặc trưng. Sự hình thành
rễ phụ có thể ñược chia làm 3 giai ñoạn: giai ñoạn ñầu là sự phản phân hóa
tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng là
mầm rễ sinh trưởng và rễ phụ chọc thủng vỏ ra ngoài [18]. Sau 10 ngày nuôi
cấy, mẫu chồi ñã tạo rễ trên tất cả các môi trường, sau 30 ngày nuôi cấy số rễ
cao nhất ở nghiệm thức IBA 2mg/l + NAA 1mg/l là 21 rễ/cây, khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở mức p ≤ 0,05 so với ñối chứng (6,5 rễ/cây) nhưng không có
sự khác biệt với các nghiệm thức còn lại.
Trên cây khoai lang khi sử dụng kết hợp cả hai loại IBA và NAA cho
kết quả tạo rễ khả quan hơn khi sử dụng riêng rẽ từng loại. Trong nuôi cấy rễ
bất ñịnh từ mô sẹo trên sâm ngọc linh của Nguyễn Trung Thành (2007) cũng
nhận thấy kết quả tương tự với 2mg/l IBA và 4mg/l NAA cho số rễ cao nhất
 74

và cũng cho thấy IBA là thích hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất
ñịnh, số rễ non ñược hình thành trên môi trường bổ sung IBA nhiều hơn so
với NAA [14]. Có thể nói auxin ñã tác ñộng rất mạnh trong quá trình tạo rễ
của cây khoai lang. Ở môi trường I0N0, không có mặt của chất ñiều hòa sinh
trưởng thực vật cây vẫn tạo ñược rễ là do trong cây ñã có sẵn một lượng auxin
nội sinh ñủ ñể kích thích sự ra rễ của chồi. Lượng IBA và NAA ñược bổ sung
vào môi trường ñã kích thích mạnh mẽ sự ra rễ. Để khởi xướng sự phản phân
hóa tế bào mạnh mẽ thì cần hàm lượng auxin khá cao nhưng ở các giai ñoạn
sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn và có khi nồng ñộ auxin cao còn gây ức
chế sự sinh trưởng của rễ [18]. Điều ñó ñúng với kết quả thí nghiệm này ở chỉ
tiêu chiều dài rễ, chiều dài rễ dài nhất ở nghiệm thức I0N0 là 189,1mm và thấp
nhất ở nghiệm thức I2N1, là 30,7mm.
Tuy nhiên, khi xét về chiều cao chồi và số lá trong thí nghiệm
thì thấy ở nghiệm thức I1N0 có số lá cao nhất (6,1 lá/cây) và chiều cao chồi
cao nhất (56.4mm) cao hơn hẳn so với ñối chứng (30,9mm) và các nghiệm
thức có bổ sung cả hai loại auxin, trong khi ñó số rễ và chiều dài rễ cũng
không khác biệt so với các nghiệm thức có bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng,
ñặc biệt là nghiệm thức I2N1.
Theo Vũ Văn Vụ, (1999) auxin ảnh hưởng kích thích mạnh mẽ lên rất
nhiều các quá trình sinh trưởng và các hoạt ñộng sinh lý trong cây mà ñặc
trưng nhất là các quá trình sinh trưởng của cây thông qua sự sinh trưởng giãn
của tế bào. Vai trò của auxin ở ñây là gây nên sự giảm pH cho thành tế bào
bằng cách hoạt hóa bơm proton (H+) nằm trên màng sinh chất ngoài, khi có
mặt của IBA thì bơm proton hoạt ñộng và bơm H+ vào thành tế bào. Chính ion
H+ ñã hoạt hóa enzym phân giải các cầu nối ngang polysaccarit giữa các sợi
cenllulose với nhau, làm cho các sợi cenllulose tách rời nhau và rất dễ dàng
trượt lên nhau. Dưới ảnh hưởng của sức trương tế bào do không bào hút nước
 75

vào mà các sợi cenllulose ñã mất liên kết, lỏng lẻo làm cho thành tế bào giãn
ra [18]. Nhưng khi tăng nồng ñộ IBA lên hoặc có sự kết hợp cả hai loại auxin
(ở các nghiệm thức I1N1, I2N0 I2N1) thì chiều cao cây bị giảm ñi. Điều này
chứng minh thêm một ñiều rằng nồng ñộ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn
cản sự phát sinh hình thái [10].

I0N0 I0N1 I1N0 I1N1 I2N0 I2N1

Ảnh 3.10 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai
lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy

3.4. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả
năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô
Các ñốt thân thu nhận từ cây khoai lang in vitro 30 ngày tuổi ñược
chọn làm mẫu cấy. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi ñược nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và Kinetin 1mg/l và chitosan
oligomer ở các nồng ñộ khác nhau. Kết quả thống kê ở ngày thứ 30 cho thấy
sự khác biệt rất có ý nghĩa trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi.
Sau 10 ngày nuôi cấy tất cả các mẫu ñều bật chồi nhưng mẫu cấy
có sự phản ứng rõ rệt với sự thay ñổi của nồng ñộ chitosan oligomer và so với
ñối chứng thể hiện qua các chỉ tiêu theo dõi mà ñặc biệt nổi bật là số lá, chiều
cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ.
 76

Theo kết quả phân hạng thì ở nghiệm thức C20 có số lá là 5,9 lá/cây,
cao hơn so với ñối chứng (3,2 lá/cây). Chiều cao chồi và khối lượng chồi tỷ lệ
thuận với nồng ñộ chitosan oligomer. Nồng ñộ chitosan oligomer càng cao thì
chiều cao chồi và khối lượng chồi càng lớn, ở nghiệm thức C50 có chiều cao
chồi 40,7mm và khối lượng chồi tươi 0,311g (bảng 3.7; hình 3.9;3.10). Kết
quả thử nghiệm khi ñưa cây ra ngoài vườn ươm cũng cho thấy những cây
ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chitosan oligomer có sức sống
cao và khả năng kháng bệnh tốt hơn so với những cây ñược nuôi cấy trong
môi trường không có bổ sung chitosan oligomer.

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy
Nghiệm Chồi Rễ
thức Số lá Chiều Khối Khối Số rễ Chiều Khối Khối
cao lượng lượng dài rễ lưởng rễ lượng
chồi chồi tươi chồi khô (mm) tươi (g) rễ khô
(mm) (g) (g) (g)
C0 3,2b 20,0b 0,122c 0,011b 2,7d 77,5d 0,017 0,002
C10 4,5a 24,0b 0,158bc 0,013bc 2,9cd 86,8c 0,028 0,004
C20 5,9a 37,0a 0,237abc 0,022a 3,7b 108,5a 0,037 0,004
a a ab a a b
C30 5,1 38,1 0,287 0,024 4,5 98,3 0,052 0.005
a a a a c e
C50 5,3 40,7 0,311 0,021 3,1 40,5 0,020 0,002
z
ANOVA ** * ** * * * NS NS
CV (%) 17.1 28,9 30,3 29,8 21,7 35,8 42,6 34,1
z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; 0,05 hoặc không có sự khác biệt.
a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng
LSD
 77

mm
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
C0 C10 C20 C30 C50
Nồng ñộ chitos an (ppm )

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến chiều cao chồi của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày
g

0.35
khối lượng chồi tươi(g)
khối lượng chồi khô(g)
0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
C0 C10 C20 C30 C50
Nồng ñộ chitos an (ppm )

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng chồi
tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày
 78

Ảnh 3.11 Cây khoai lang trong môi trường MS + BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l
sau 30 ngày nuôi cấy

Ảnh 3.12 Cây khoai lang trong môi trường MS + BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l +
chitosan oligomer 50ppm sau 30 ngày nuôi cấy
 79

Thí nghiệm sử dụng môi trường tối ưu ñể nghiên cứu sự bật chồi và
tăng trưởng chồi làm ñối chứng khi bổ sung chitosan oligomer từ vỏ tôm có
khối lượng phân tử là 10.000 Da với các nồng ñộ khác nhau.
Sau 30 ngày nuôi cấy nhận thấy ở tất cả các nghiệm thức ñều có sự
hình thành chồi từ các ñoạn thân mang chồi nách và có sự phản ứng rõ rệt với
sự thay ñổi của nồng ñộ chitosan oligomer so với ñối chứng. Ở môi trường C0
(BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l) có chiều cao chồi thấp nhất (20mm) so với các
nghiệm thức còn lại có bổ sung chitosan oligomer và nồng ñộ chitosan
oligomer càng cao thì chiều cao chồi càng lớn. Ở nghiệm thức C50 có chiều
cao chồi cao nhất là 40,7mm, kết quả này chứng minh thêm một ñiều rằng
chitosan oligomer ñược coi là một chất ñiều hòa sinh trưởng thế hệ mới
(Zubay, 1989).
Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô ở hoa lan của Khin Lay Nge (2006)
cũng cho thấy khi bổ sung chitosan oligomer ở nồng ñộ 15ppm thì mô sẹo
phát triển rõ rệt so với môi trường không bổ sung chitosan oligomer khi nuôi
cấy trong môi trường lỏng và 20ppm trong môi trường ñặc ñể tạo cây con với
chitosan oligomer 1kDa. Tương tự với tác dụng của chitosan có khối lượng
phân tử thấp trong nghiên cứu tái sinh phôi xoma từ mô sẹo của cà rốt và tái
sinh rễ, chồi ở cây dâu tây [46]. Về chỉ tiêu số rễ, ở nồng ñộ chitosan
oligomer 30ppm có số rễ cao nhất là 4,5 rễ/cây, khi tăng nồng ñộ lên 50ppm
thì số rễ giảm xuống chỉ còn 3,1 rễ/cây. Đối với chiều dài rễ ở nồng ñộ
chitosan oligomer 20ppm có chiều dài rễ dài nhất là 108.5mm, khi tăng nồng
ñộ lên 50ppm thì chiều dài rễ chỉ còn 40.5mm. Như vậy có thể nói chitosan
oligomer ở nồng ñộ cao có tác dụng ñối với sự tăng trưởng chồi nhưng lại ức
chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của rễ.
 80

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY KHOAI LANG CAO SẢN
NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN-
VITRO

Chồi mầm từ
củ khoai lang

Xử lý thuỷ ngân clorua

0,1% trong 10 phút

½ MS + NAA 5mg/l
+ Kinetin 15 mg/l Tạo thành cụm chồi
Chồi vô trùng gồm nhiều thể chồi
(Thể protocorm)

Môi trường tạo rễ

MS + IAA 1mg/l

Cây con

MS + BA 2mg/l Cây con cao

+ Kinetin 1mg/l 5-7 cm, 4-5 lá
+ Chitosan 50ppm

Ra vườn ươm
 81

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN:
1. Chất khử trùng thích hợp nhất cho khoai lang là thuỷ ngân clorua, ở
nồng ñộ 0,1% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống và bật chồi 100%.
2. Trên các môi trường ½ MS; 2/3 MS; MS + 200mg/l KH2PO4; MS +
100ml/l nước dừa có bổ sung 5mg/l NAA và 15mg/l Kinetin có hình
thành protocorm nhưng tỷ lệ rất thấp (17%) và chồi không phát triển.
3. Môi trường tốt nhất cho sự bật chồi và tăng trưởng chồi là môi trường
MS có bổ sung 30g/l saccharose + 7,5g/l agar + 2mg/l BA + 1mg/l
Kinetin cho chiều cao chồi cao nhất là 56mm, sinh khối tươi 0,5g, sinh
khối khô 0,037g.
4. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ là môi trường MS có bổ sung
30g/l saccharose + 7,5g/l agar + 1mg/l IBA cho số rễ/cây là 20 rễ, chiều
dài rễ là 50mm và chiều cao chồi là 56,4mm
5. Chitosan oligomer có ảnh hưởng rõ rệt ñến sự sinh trưởng của chồi cây
khoai lang. Trên môi trường tối ưu cho sự bật chồi và tăng trưởng chồi
(2mg/l BA + 1mg/l Kinetin) có bổ sung 50ppm Chitosan oligomer cho
số lá 5,3 lá/cây, chiều cao chồi cao nhất là 40,7mm, khối lượng chồi
tươi 0,311g, khối lượng chồi khô 0,021g cao hơn nhiều so với ñối
chứng.
ĐỀ NGHỊ:
Đề nghị các nghiên cứu tiếp theo nên tiếp tục nghiên cứu ñể hoàn thiện
qui trình:
1. Tiếp tục nghiên cứu về môi trường tạo protocorm.
2. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer
trên 50 ppm lên khả năng sinh trưởng của cây khoai lang cao sản
Nhật Bản.
 82

3. Tiếp tục nghiên cứu các ñiều kiện ánh sáng, giá thể ñể ñưa cây
con ra vườn ươm.
 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt
1. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh(2007), “Nhân giống cây Pơmu
(Fokienia hodginsii)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học
sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 647-649.
2. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang
Thạch(2005), “Nghiên cứu tái sinh in vitro một số giống khoai lang Việt
Nam”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp số
,http://www.hua.edu.vn.
3. Nguyễn Anh Dũng(2004), Nghiên cứu cố ñịnh Bacillus subtilis trong hạt
chitosan, Kỷ yếu nghiên cứu khoa học Đại học Tây Nguyên, NXB Nông
nghiệp, trang 173-178.
4. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quan Luân(2000), Chế tạo chitosan
oligomer bằng kỹ thuật bức xạ, Tạp chí hoá học, tập 28, số 2, trang 22-
24.
5. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển(2005), “Nghiên cứu hai kiểu tái
sinh in vitro cây khoai lang Ipomoea batatas L.” Những vấn ñề nghiên
cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 1242-
1245.
6. Dương Công Kiên(2002), Nuôi cấy mô thực vật, Đại học Quốc gia TP.
Hồ Chí Minh.
7. Dương Công Kiên(2003), Nuôi cấy mô thực vật (II), Đại học Quốc gia
TP. Hồ Chí Minh.
8. Dương Công Kiên(2006), Nuôi cấy mô thực vật (III), Đại học Quốc gia
TP. Hồ Chí Minh.
9. Đinh Thế Lộc(1995). Cây khoai lang, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
10. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên(2002), Đại học Quốc gia TP. Hồ
 84

Chí Minh.
11. Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh(2007, “Vi nhân giống cây trai Nam
Bộ (Fagarea cochinchinensis A. Chev.)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ
bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 763-765.
12. Dương Lan Oanh, Đỗ Khắc Thịnh, Ngô Thị Bích(2007), “Nghiên cứu
ảnh
hưởng của môi trường nuôi cấy, chất ñiều hòa sinh trưởng (BA, NAA)
ñến
sự nhân chồi và phát triển rễ của cây dứa cảnh”, Hội nghi khoa học,
Công
nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa,
Nhà XB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, 323-331.
13. Nguyễn Du Sanh, Nguyễn Thanh Dũng(2004), “Sự tạo củ ở khoai lang
(Ipomoea batatas)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học
sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 591-594.
14. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Peak Kee Youep(2007), “Nuôi cấy
rễ bất ñịnh của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”,
Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB
Khoa học Kỹ thuật, 828-831.
15. Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn(2007),“Phục
hồi giống hoa Huệ trắng (Polianthes Tuberosa linn.) nhiễm bệnh chai
bông bằng nuôi cấy phân sinh mô chồi”, Hội nghi khoa học, Công nghệ
sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa,
Nhà XB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, 141-152.
16. Lê Thị Thu Về, Đỗ Năng Vịnh, Lê Huy Hàm(1999), “Nhân nhanh các
giống hoa loa kèn mới”, Báo cáo khoa học, Nhà XB Khoa học Kỹ
thuật, 889-895.
 85

17. Bùi Trang Việt(2000), Sinh lý thực vật ñại cương, Phát triển, Nhà XB
ñại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
18. Vũ Văn Vụ(1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục.
19. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp(2006), Công nghệ sinh
học, (2), Nhà XB Giáo Dục.

Tiếng anh
20. A. Porobo Dessai, R. M Gosukonda, E. Blay., “Plant regeneration of
sweet potato (Ipomoea batatas L.) from leaf explant in vitro using a two
stage proocol”, Scientia Horticulture, 62,217-224.
21. Baker, B.S. and Bhatia, S. K.(1993), “Factors effecting adventious shoot
regeneration from leaf explants quince (Cydonia oblonga)” Plant Cell
Tissue Organ Cult., 35, pp. 273-277.
22. Belarmino MM. (1993). In vitro culture of sweet potato (Ipomoea
batatas Lam.) and yam (Dioscorea spp.) for pathogen elimination and
micropropagation. Proceedings of the Southeast Asian Regional
Workshop on Adapted Propagation Techniques for Commercial Crops of
the Tropics, Feb. 7-12, Ho Chi Minh City, Vietnam, IFS (Sweden) / BRC
– NCSR VN (Vietnam), pp. 231-239.
23. Briggs, B.A., McCulloch, S.M. and Edick,L.A.(1998),
“Micropropagation of azaleas using thidiazuron”, Acta Hortic, 226, pp.
205-208.
24. C. G. Kuo, B.J. Shen, 1985, Virus free sweet potato storage roots devived
from meristem-tips and leaf-cuttings, Scientia Horticulture, 26, 231-240.
25. Cooke, T.J., Racusen, RH. And Cohen, J.D.(1993), “The role of auxin in
plant embryogenesis”. Plant Cell 5, pp. 1494 -1495.
26. Capelle, S.C., Mok, D.W.S., Kirchner, S.C.(1983), “Effects of TDZ on
 86

cytokinin autonomy and the metabolism of N6-(DELTA2-isopentenyl)[8-

14C] adenosine in callus tissuses of Phaseolus lunatus L.” Plant Physiol,
73, pp. 796-802.
27. Chibu, H., Shibayama, H. (2001), Effects of chitosan application on the
growth of several crops, Chitin chitosan in Life science, 235-239
28. Daniel J. Cantliffe(1993), “Advanced propagation systems for biomass
species: a model system based on sweet potato”,Biomass and Bioenergy,
pp.63-69.

29. Dzung, N.A., Thang, N.T., 2001, Preparation of chitosan and

oligoglucosamine from sea by product and applications for agriculture,

Proceedings of Scientific Conference of Tropical Biological Institute,

Agriculture Publisher, 162-169.

20. Dzung, N.A., Thang, N.T., 2002, Effects of oligoglucosamine prepared

enzyme degradation on the growth of soy bean, Advances in Chitin

Science, Vol. V, 463-467.

31. Dzung, N.A; Khanh, V.T.P, 2003, Effects of oligoglucosamine and

modified oligoglucosamine on growth inhibition of E.coli, Advances in

Chitin, Vol. VII, pp.240-243.1.

32. Dzung,N.A; Khanh, V.T.P.(2004), Proceedings of 6th Asia-Pacific Chitin
and Chitosan Symposium, Singapore. (in printing).
33. Dzung, N. A., Thang, N. T. 2004. Effect of oligoglucosamine on the
gowtrh and development of peanut (Arachis hypogea L.).In Proceedings
of The 6th Asia-Pacific on Chitin, Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D.
Hutmacher and L. L. Yong. Singapore, ISBN: 981-05-0904-9.
34. Dzung, N. A. 2005. Application of chitin, chitosan and their derivatives
 87

for agriculture in Vietnam. J. Chitin Chitosan 10(3): 109-113.

35. Dzung, N. A., Thuoc, V. 2006. Study on effects of chitosan oligomer on
the growth development and disease resistance of rice. In Advances in
Chitin Science and Technology. Ed. S. W. Kim, H. K. No and R. D. Park.
Hanrimwon Seoul. ISBN: 89-5708-110-0, 381-383.
36. Dzung, N. A. 2007. Chitosan and their derivatives as prospective
biosubstances for developing sustainable eco-agriculture. in Advances in
Chitin Science X. Ed. S. Senel, K. M. Varum, M. M. Sumnu, A. A.
Hincal. 453-459.
37. Fellman, C.D., Read, P.E. and Hosier, M.A.(1987), “Effects or
thidiazuron and CPPU on meristem formation and shoot proliferation”,
Hort. Sci., 22, pp. 1197-1201.
38. Fiola, J.A., Hassan, M.A., Swartz, H.J., Bors, R.H. and McNicols, R.
(1990), “Effects or thidiazuron, light fluence rates and kanamicin on in
vitro shoot organogenesis from excised Rubus cotyledons and leaves,
Plant Cell Tiss. Org. Cult., 20 pp. 223-228.
39. Food Crops at the FAO and FAOSTAT: http://wwwfao.org
40. Gill, R., Saxena, P.K. (1993),” Somatic embryogenesis in Nicotiana
tabacum L. induction by DTZ of direct embryo differentiation from
cultured leaf discs”, Plant Cell Rep, 12, pp. 154 – 159.
41. Hadwiger, Klosterman, S.J and Choi, J,J, 2002, Advances in Chitin
Science, Vol. V, pp. 452-457.

42. Hien, N.Q., Nagasawa, N, 2000, Radiation Physics and Chemistry, 59,

97-101.

43. Hirano, S. 1996. Chitin biotechnology applications. Biotechnol. Annual

Review 2: 237-258.
 88

44. Hirano, S., 1996, Biotechnology Annual Review, 2, 237-258.

45. Kerns, H.R. and Meyer, M.M. Jr.(1986), “Tissue culture propagation of
Acer freemanni using thidiazuron to stimulate shoot tip proliferation”.
HortScience, 21, pp. 1209-1210.
46. Khin lay nge, Nitar New, Suwalee Chandrachang, Willem F.
Stevens(2006), “Chitosa as a growth stimulator in orchid tisse culture”
Plant Science 170, pp.1185-1190.
47. Li, Z., Traore, A., Maximova, S. and Guiltinan, M.J. (1998), “Somatic
embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao
(Theobroma cacao L.) using thidiazuron”, In Vitro Cell. Dev. Biol. –
Plant, 34, pp. 293 – 299.
48. Limpanavech, P., Chaiyasuta, S., Vongpromek, R. et al. 2008. Effect of
chitosan on floral production, gene expression and anatomical changes in
the Dendrobium orchid, Scientia Horticulturae 116: 65-72.
49. L. S. Hwang, R. M. Skirvin., 1983, Adventitous shoot formation from
sections of sweet potato grow in vitro, Scientia Horticulture, 20, 119-129.
50. Luan, L.Q., Nawasawa, N. 2002, Advances in Chitin Science, Vol. V,
468-474.
51. M. Isabirye , G. Ruysschaert, L. Van linden, J. Poesen, M.K. Magunda,
J. Deckers (2007), Soil losses due to cassava and sweet potato
harvesting: A case study from low input traditional agriculture. Soil &
Tillage Research, 92, pp. 96-103.
52. Malik,K.A. and Saxena, P.K.(1992), “Thidiazuron induceshighfrequency
shoot regeneration in intact deedlings of pea (Isum sativum L.),
chickpea(Cicer arietium L.) and Lentil (Lens culinaris Medik)”, Aust. J.
Plant Physiol, 19,pp. 731-740.
53. Makoto Nakatani(1993), “In vitro formation of tuberous roots in Sweet
 89

potato”, Jpn. J. Crop Sci. 63(1). 158-159.

54. Mitchell, E.K., Davies, P.J. (1975), “Evidence for three different systems
of movement of indoleacetic acid in intact root of Phaseolus cossineus”,
Physiol Plant, 33, pp.290-294.
55. Murthy, B.N.S., Murch, S.J. and Saxena, P.K.(1995), “TDZ induced
somatic embryogenesis in intact seedlings of peanut (Arachis hypogaea):
endogenus growth regulator levels nd significance of cotyledons”,
Physiol. Plant, 94, 99. 268 – 276.
56. Murthy, B.N.S., Murch, S.J. and Saxena, P.K.(1998), “Thidiazuron: a
potent regulator of in vitro plant morphogenesis”, In Vitro Cell. Dev.
Biol - plant, 34, pp. 267 – 275.
57. Nitar, N., Chandrkrachang, S. and Stevens, W.F. 2004. Application of
chitosan in Myanmar’s agricultural sector. in Proceedings of 6th Asia-
Pacific Chitin and Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D. Hutmacher and
L. L.Yong. Singapore, ISBN:981-05-0904-9.
58. R.O. Ankumah, V. Khan, K. Mwamba, K. Kpomblekou-A (2003), The
influence of source and timing of nitrogen fertilizers on yield and
nitrogen use efficiency of four sweet potato cultivars. Agriculture,
Ecosystems and Environment, 100, pp. 201-207.
59. Rabea, S., Badawy, M. E. I. Steven, C., (2008) In vitro assessment of N-
bezyl chitosan derivatives against some plant pathogenic fungi and
bacteria, European polymer Journal.
60. Ro Dong Park, Kyu Jong Jo, You Young Jo, Yu Lan Jin, (2002),
Advances in Chitin Science, Vol. V, 255-259.
61. Sarathchandra, R. G., Jaj, S.N. 2004. A chitosan formulation Alexa
induce Downy Mildew disease resistance and growth promotion in pearl
millet. Crop protection 23: 881-888.
 90

62. Saxena, P.K., Malix, K.A. and Gill, R.(1992), “Induction by TDZ of
somatic ombryogenesis in intact seedling of peanut”, Plata., 187, pp.
421- 424.
63. Smith, H.(1997), The Molecular of Plant Cells, Berkeley: University of
California Press.
64. Suwalee, Chandrkrachang, 2002, Advances in Chitin Science, Vol. V, pp.
458-462
65. Tsurumi, S., Ohwaki, Y.(1978), “Trasport of 14C-labeled indoleacetic
acid in Vicia root segments”, Plant Cell Physiol, 19, pp. 1195 – 1206.
66. Visser, C., Qureshi, J.A. and Gill, R. (1992), “Morphoregulatory role of
TDZ. Substitution of auxin and cytokinin requirement for the induction
of somatic embryogenesis in geranium hypocotyl cultures”, Plant
Physiol, 99, pp. 1704 – 1707.
67. Uddin, A.F.M.J., Hashimoto, F., Shimizu, K. et al. 2004.
Monosaccharides and chitosan sensing in bud growth and pental
pigmentation in Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn. Scientia
Horticulturae 100: 127-138.
68. Zubay, G.(1989), Biochemistry, Macmillan Publishing Company, New
York, pp. 290
 PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Môi trường MURASHIGE và SKOOG (1962)

Khoáng ña lượng Hàm lượng (mg/l)

NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2. 2H2O 440
MgSO4. 7H2O 370
KH2PO4 170

Khoáng vi lượng
H3BO3 6.20
MnSO4. 4H2O 22.30
ZnSO4. 4H2O 8.60
KI 0.83
Na2MoO4. 2H2O 0.25
CuSO4. 5H2O 0.025
CoCl2. 6H2O 0.025

Fe - EDTA
FeSO4. 7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3

Vitamin Morel and Wetmore (1951)

Panthotenat decalcium 1
Meso – inositol 100
Acid nicotinic 1
Pyridoxin – HCl 1
Thiamin 1
Biotin 0.001