Capitulo 2 O mundo de RNA e a origem da complexidade da vida Profa Dra Mariana Cabral de Oliveira (mcdolive @ib.usp.br) Departamento de Botanica Instituto de Biociéncias Universidade de Sao Paulo Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck (cfmmenck@usp.br) Departamento de Microbiologia Instituto de Ciéncias Biomédicas Universidade de Sao Paulo “Nada em Biologia faz sentido exceto a luz da Evolugao.” (Theodosius Dobzhansky) 2.1. FUNDAMENTOS DO “MUNDO DE RNA” No final da década de 1960, Orgel, Crick e Woese propuseram independentemente que 0 RNA precedeu a formacaio do DNA, baseado na tripla fungo que moléculas de RNA exercem nas células: mensageiro (mRNA), transportador ((RNA) ¢ riboss6mico (RNA, JelTares etal., 1998; Landweber etal., 1998; Szathméry, 1999). Descobertas mais recentes $6 vieram fortalecer essa hipétese: a existéncia de moléculas de RNA com capacidade catalitica, uma Propriedade que era considerada exclusiva das proteinas; a presenga de algumas moléculas idénticas ou muito semelhantes aos mon6meros de RNA em todos os seres vivos, que atuam como cofatores; 0 fato de o DNA nio ser quimicamente tao flexivel: e os desoxirribonucleotideos serem derivados dos ribonucleotfdeos ~além de um nimero crescente de fungdes celulares que estilo sendo associadas as moléculas de RNA. O termo “mundo de RNA” (RNA world, em inglés) foi cunhado por Gilbert (1986) para descrever um cenério onde a principal molécula ativa na origem da vida era 0 RNA. Isto foi proposto baseado nas descobertas de moléculas de RNA com propriedades cataliticas. Com adescoberta de RNA catalitico, resolveu-se um paradoxo do tipo “o ovo ou a galinha” sobre a origem da vida: dcidos nucléicos so essenciais & vida, mas parecem neeessitar das protefnas para funcionar, Entretanto, seo RNA funcionasse como fonte de informagio e também como enzima, as protefnas poderiam ter surgido posteriormente. A hipstese do mundo de RNA afirma que a reprodugo e 0 metabolismo das primeiras formas de vida dependiam das atividades cataliticas e replicativas do RNA, @ que tanto 6 DNA quanto as proteinas teriam assumido suas fungdes atuais posteriormente (Gilbert, 1986) O RNA € tinico na sua capacidade de armazenar informagio genética (em varios virus, como 0 da AIDS ¢ 0 da gripe) e de executar uma série de atividades cataliticas ‘introns autocataliticos, ribonuclease P, entre outros), uma propriedade que, até alguns anos atrés, se acreditava limitada 1S as proteinas. Nas células atuais, o RNA est envolvido em uma série de processos, como sintese protéica, replicagtio de DNA, processamento de RNA ete. As miltiplas fungdes exercidas pelo RNA dio apoio indireto para a hipétese do mundo de RNA, que considera os RNAS cataliticos atuais como remanescentes de uma época em que a vida teria 0 RNA como principal mediador de processos informacionais e cataliticos, ou seja, seriam verdadeiros fésseis moleculares Goyce, 1989) pitulo, pretendemos descrever e discutir 0 como um ancestral universal (progenota) com metabolismo baseado em RNA deu origem 4 diversidade de seres vivos atuais, que ém como material genético 0 DNA ¢ 0 restante do metabolismo realizado por RNA e protefnas. 2.2. O RNA CATALITICO Em 1977, foi descoberto que as seqiiéncias codificadoras de vérios genes eram interrompidas por seqiléncias nao codificadoras. Esta descoberta foi baseada na comparago entre a seqliéncia do DNA e do seu RNA correspondente. Essas seqliéncias intervenientes ou intercalantes foram denominadas introns, enquanto que as seqléncias codificantes foram denominadas exons. Ap6s a transcrigiio, os introns tém que ser removidos do pré-RNA (RNA splicing, em inglés) para originar 0 RNA “maduro”, que vai servir de molde para a tradugo de uma protefna, Essa remogtio tem que ser extremamente acurada gurar que os cédons sejam lidos corretamente. Cada cédon é composto por trés nucleotideos ¢ corresponde a um aminodcido. Portanto, se for inserido ou retirado um hucleotideo nessa seqiléncia, isso acarretard um erro de Ieitura das seqiiéncias de trios de nucleot{deos. Essas descobertas deram 0 prémio Nobel a Richard J. Roberts ¢ Philip A. Sharp em 1993. Introns so comuns em eucariotos (no niicleo e nas organelas), mas também j4 foram encontrados em arqueobactérias, eubactérias ¢ até em bacteriGfagos. NosBiologia Molecular e Evolugio - S.R. Matioli (ed.) eucariotos superiores, a maioria dos genes € interrompida e geralmente os introns so muito mais longos que os exons. Entretanto, no hé uma regra. Em levedura, por exemplo, a grande maioria dos genes no ¢ interrompida. Além disso, a distribuicdo, 0 ntimero e o tamanho dos introns variam enormemente (Lewin, 1997). Na década de 1980, foi descrito um grande néimero de introns, que foram separados em diferentes categorias, de acordo com suas caracterfsticas estruturais ¢ os mecanismos de remocao do pré-RNA. No inicio da década de 1980, Cech e seus colaboradores mostraram que alguns introns so capazes de catalisar sua propria remogao do pré- RNA sem a ajuda de protefnas. Esses introns foram denominados de autocataliticos (self-splicing, em inglés; Cech, 1988, 1990). Cech criow o termo ribozima para RNAs com propriedades catalfticas. © primeiro intron autocatalftico foi descrito no ciliado Tetrahymena thermophila pertence ao chamado grupo I. Introns do grupo Iso caracterizados por uma estrutura secundaria altamente conservada e pelo seu mecanismo de excisao, onde o intron catalisa diretamente as duas reagbes de transesterificagdo consecutivas requeridas para sua excisdo do transcrito primario (Cech e Bass, 1986). No primeiro estgio da reagao de autocatélise, o grupo OH-3' de uma guanosina (G) livre ataca a ligagao fosfodiéster 3' do dltimo nucleotideo (em geral uma uridina) do exon 5’. Essa uridina esté pareada com um nucleotideo do intron, em geral uma guanina. Esse ataque resulta na quebra da ligagiio 5' entre 0 exon 5'¢ 0 intron, No segundo estgio, o grupo OH 3' do exon 5’ ataca a ligagdo fosfodiéster apés o resfduo G terminal do intron, rompendo a ligacio 3! intron/exon e se ligando ao exon 3° (Figura 2.1). As duas reagdes de transesterificagio sio catalisadas pelo préprio intron, que funciona como uma enzima (Michel e Westhof, 1990). Doudna et al. (1989) mostraram que a capacidade catalitica de introns do grupo I reside em suas estruturas secundaria e tercidria, ¢ nao na sua estrutura priméria (seqliéncia de nucleotideos). Os introns do grupo II também podem ser autocataliticos, mas estes introns apresentam seqiiéncias de consenso ¢ 0 mecanismo de excisiio semelhantes aos introns que s4o removidos pela maquinaria riboprotéica (spliceosome, em inglés). Apesar de algum ceticismo inicial, hoje ja est plenamente comprovada a capacidade catalitica do RNA. Existe uma crescente quantidade de dados experimentais demonstrando que moléculas de RNA sio realmente catalisadoras surpreendentes e que sua ago no esta confinada a substratos de écidos nucléicos (Lazeano, 1994; Jeffares et al., 1998; Landweber et al., 1998). Varios trabalhos tém mostrado a participagao de moléculas de RNA. em diferentes atividades celulares. Potter ef al. (1995) verificaram na arqueobactéria Sulfolobus aexisténcia de uma endonuclease que contém uma molécula de RNA que catalisa a excistio e a maturagdo de rRNA. Esta molécula de RNA é muito semelhante a0 RNA U3 envolvido na maturagio do mRNA em eucariotos e, segundo aqueles autores, estaria presente antes da divergéncia entre a arqueobactérias ¢ os eucariotos, um verdadeiro féssil molecular! Young etal. (1991) mostraram que a polimerase do RNA III do bicho-da-seda requer um fator de transcrigiio que € composto por RNA. Fung ef al. (1995) apresentaram indicios de que pequenas moléculas de RNA citoplasmaticas 16 exon ol exons’ intron ss _-¢ = slHY/Ac=: a S + sou ) ‘exons igo Figura 2.1. Esquema da reago de autoprocessamento de um intron do grupo I. O grupo OH-3' de uma guanina (G) livre ataca a ligagao fosfodiéster 3° do wltimo nucleottideo (em geral uma uridina) do exon 5'. Essa uridina esta pareada com uma guanina do intron, O ataque resulta na quebra da ligagio 5‘entre o exon 5'e 0 intron. O grupo OH 3' do exon ataca a ligagdo fosfodiéster apds o res{duo G terminal do intron, rompendo a ligacdo 3' intron/exon e se ligando ao exon 3'.As duas reagdes de transesterificagdo sto catalisadas pelo préprio intron, que funciona como uma enzima e pode softer processos de circulatizagZo e hidrétise. hideise (RNA G8) esto envolvidas em termotolerancia no ciliado Tetrahymena thermophila. Além disso, existem diversas coenzimas © grupos prostéticos compostos por ribonucleotideos (como NAD e FAD) presentes em todos os seres vivos, 0S quais, na auséncia da protefna correspondente, atalisam reagdes quimicas similares &s que tomam parte como cofatores (Lazcano, 1994; Szathméty, 1999). As varias atividades cataliticas das ribozimas sero detalhadamente discutidas no Capitulo 3. As capacidades de autoprocessamento, clivagem, clongacio e ligagao colocam o RNA num papel central na evolugao pré-celular. Obviamente, nem todas as moléculas de RNA so remanescentes do mundo de RNA. Para Jeffares et al. (1998), as moléculas consideradas fésseis teria que apresentar uma ‘oumais das seguintes caracterfsticas: (1) ser catalitica como as proteinas sio melhores catalisadoras do que 0 RNA, ¢ improvavel que 0 RNA catalisador seja uma aquisi¢io recente do metabolismo; (2) ser ubiqua, indicando que js estava presente no timo ancestral comum de todos os seres vivos; (3) ter fungdo central no metabolismo — qualquer RNA que ocupe uma posicZo central no metabolismo celular dificilmente seria substitufdo. A existéncia do mundo de RNA requer ribozimas capazes de replicar RNA. Esse tipo de atividade catalitica foi demonstrado por Doudna e Szostak (1989). Além disso, seriam necessdrias as capacidades de tomar matéria-prima do meio (Supondo que as moléculas auto-replicativas de RNA jéestivessem envoltas por uma membrana) e de coletat energia de outras moléculas com ligagdes de alta ener; (Lazeano, 1994). O RNA nfo estaria solitério, masOliveira e Menck. Capitulo 2, © mundo de RNA. CRN A proteinas > (DNa—RNA+ proteinas +Replicagdo de RNA _*Interagao -Ribozimas genético e da Utilizagao de ligagdes ¢ Bag tradugiio de alta energia primitiva aminodcidos-RNA -Origem do cddigo +Sintetase do ATP + Trans ‘iptase reversa * Polimerase do DNA + Sintetase do ATP Figura 2.2, Esquema de um possivel cenério de transi¢o entre um organismo com metabolismo baseado em RNA até um organismo atual com metabolismo baseado em DNA, RNA ¢ proteinas (modificado de Lazcano,1994). acompanhado de diversas moléculas que poderiam funcionar como cofatores e substratos, incluindo fons metélicos, aminoécidos, polipeptideos, agticares, lipidios etc. Essa coexisténcia levaria & aquisigZo de outros grupos funcionais. A autoclivagem de alguns introns atuais, por exemplo, dependente de Mg“, 0 que sugere a existéncia de meta ribozimas (Gilbert, 1987). Outro exemplo de associag: existéncia de um terpendide hidrofébico ligado a um ribonucleotfdeo existente na membrana da bactéria ptirpura Rhodopseudomonas acidophila (Neunlist e Rohmer, 1985). A exist@ncia desse composto sugere que uma associagZo direta entre RNA ¢ lipidios pode ter existido, sendo que esse tipo de associacio pode ter facilitado a encapsulag3o das moléculas de RNA (Lazcano, 1994) A seqliéncia de eventos que levaram a sintese protéica direcionada por RNA provavelmente comegou com uma simples interagdo quimica entre aminodcidos ¢ mas eventualmente levou a uma transformagao completa da célula baseada em RNA (Lazcano, 1994), A primeira protocélula ¢, por definigao, um sistema envolto por membranas, composto de macromoléculas capazes de auto-replicagao e de catilise, com mecanismos de tomada de matéria-prima do meio e de obtencZo de energia (Deamer et al., 1994) (Figura 2.2). Os genomas de RNA das primeiras células teriam as seguintes propriedades, segundo Ohta (1994): a replicase do RNA seria ineficiente devido a uma alta taxa de erro em termos de substituigao de ‘nucleotfdeos; o material genético e funcional seria o mesmo, mas as duas formas de RNA deveriam ter-se diferenciado Jogo no inicio, sendo o material gendmico formado por RNA dupla fita (14 que RNA simples fita tem alta axa de hidrdlise, além do fato de que a transigdo de RNA para DNA seria facilitada se 0 RNA fosse dupla fita); varias funcdes genéticas ja deveriam existic a partir da diversificagio da primeira replicase do RNA; uma estrutura semelhante a um tRNA teria servido como marcagdo para a transcrigao (nesse caso, copiar 0 RNA genémico para RNA funcional); genoma de RNA deveria ter aumentado gradualmente para permitir uma maior diversidade funcional. 2.3. 0 APARECIMENTO DO CODIGO GENI TRANSIGAO PARA O “MUNDO DE RNP’ COEA A origem do cédigo genético ¢ do sistema de 17 tradugio foi uma das principais transigdes na evolugio € diversificago da vida. Essa transigio modificou radicalmente os sistemas vivos, permitindo a divisto de trabalho entre os écidos nucléicos (informacao) e as proteinas (catélise). A possibilidade de que genomas de DNA tenham aparecido antes do surgimento da sintese protéica nao pode ser completamente descartada, De acordo com a hipstese do mundo de RNA, a sintese protéica mediada por ribossomos surgit a partir da interagao entre aminodcidos e RNA. Existem evidéncias de que aminodcidos e oligopeptideos estavam presentes na “sopa” pré-bidtica na Terra primitiva (ver Capitulo 1). A sintese protéica é um proceso complexo que requer muitos componentes, como FRNA, RNA, mRNA e diversas protefnas como fatores de elongagio ¢ iniciagao, sintetases de aminoacil-tRNA, proteinas ribossOmicas, entre outras. Ainda nao se sabe com certeza como as ligagbes peptidicas so formadas no ribossomo, porém existem algumas evidéncias de que o RNA & o responsavel pela catilise (Noller, 1991; Nitta et al., 1998). Recentemente, foi selecionada uma ribozima capaz.de catalisar a formagio de uma ligago amida (Szathmdry, 1999). Um dos passos mais eriticos na origem da sintese protéica é a formacio de uma estrutura altamente complexa como o ribossomo (Poole et.al., 1998). Geralmente é assumido que, no infcio do mundo de RNA, a precisio da replicagao eta limitada e que, por isso, as moléculas de RNA nao deveriam ultrapassar algumas centenas de bases. A medida que a preciso da replicagio foi aumentando, moléculas maiotes puderam ser formadas. E possivel que os varios sitios ativos dos ribossomos tenham se formado como ribozimas individuais, posteriormente reunidos por recombinagio, formando os FRNA (Jeffares ef al,, 1998; Poole et al., 1998). Segundo Poole et al. (1998), a sintese protéica baseada numa molécula-molde de RNA teria se originado a partir de uma ribozima com atividade de polimerase do RNA © que adicionasse trinucleotfdeos (Figura 2.3). Considere uma molécula semelhante a um tRNA com trinucleotideos na posigao do anticédon; se estes forem complementares aos nucleotideos presentes na fita de RNA-molde, poderiam emparelhar com ela € o trinucleotideo poderia ser incorporado na nova fita. Uma vantagem de se adicionaremBiologia Molecular e Evolugo - $.R. Matioli (ed.) ve ARNA ativado 38 ARNA & © inativado ‘Ibe RNA | ~ t GO ativado Oc ( IN e fita nova a iO aes fita molde oN ™ Atividade catalitica da ribozima: decodificagio, clivagem eligagio Figura 2.3. Modelo para a origem da sintese protéica baseada numa molécula molde de RNA. 1. Um aminodcido com carga positiva ajudaria uma replicase de RNA a reconhecer 0 tRNA, aproximando os dois; 2. 0 ttinucleotideo no anticédon é adicionado a nova fita de DNA pela replicase de RNA através de clivagem e ligagio, semelhantes as realizadas pelos introns atuais; 3. O aminodcido € entio clivado do (RNA e este é liberado, semelhante & atividade do 23S tRNA atual (modificado de Poole et al. 1998). trinucleotideos, ao invés de nucleotideos isolados, seria que um néimero maior de pontes de hidrogénio manteria os nucleot{deos mais tempo no lugar. Como acatélise tealizada por ribozimas é mais lenta do que a realizada por protefnas, esse maior tempo de emparethamento seria bastante vantajoso. O problema da precistio de replicagao, discutido anteriormente, poderia ser minimizado em parte com a adigio de mais sitios de reconhecimento, como, por exemplo, a adigiio de um aminogcido ao (RNA. Ou seja, 0 cédigo genético ja poderia ter sido estabelecido no mundo de RNA (Nagel e Doolitle, 1995; Wetzel, 1995).A afinidade do complexo de replicagao por um tRNA ligado a um aminodcido poderia ser revertida com a clivagem do aminofcido, 0 que liberaria 0 tRNA. Este complexo de replicagao seria o proto-ribossomo. ‘A vantagem dese modelo é que varias das fungdes cataliticas presumidas podem ser testadas com a evolugao in vitro de tibozimas, Uma ribozima desenvolvida in vitro, por exemplo, foi capaz de ligar um aminodcido a um tRNA (Ilangasekare et al., 1995), A otigem da informacdo (mRNA) é provavelmente © passo mais dificil de se explicar. Segundo Poole et al (1998), 0s mRNAs podem ter surgido como produtos secundarios do processamento de RNA. Nesse modelo, as ribozimas seriam removidas do pré-RNA e as seqiiéncias flanqueadoras seriam reunidas, dando origem a novas seqiiéncias. As ribozimas atuais estio de modo geral localizadas nos introns, motivo pelo qual os autores chamam essa hipstese de introns precoces (introns-first, em inglés). 18 Ou seja, os introns que corresponderiam as moléculas de RNA catalfticas teriam surgido antes do que seus exons flangueadores. A fungao dos mRNAs teria surgido a partir de fragmentos de seqiiéncias que teriam sido juntados secundariamente. Pequenas moléculas de RNA nucleolar (snoRNAs, smal! nucleolar RNA, em inglés) sio processadas a partir de introns encontrados nos genes que codificam para proteinas ribossémicas e para chaperonas. Com base nesse fato, Poole et al. (1998) propdem que essas protefnas que silo universais- estariam provavelmente entre as ptimeiras protefnas a ter surgido na transigao entre o mundo de RNA © 0 metabolismo das células atuais, baseado em protefnas. As primeiras protefnas deveriam interagit com 0 RNA com baixa especificidade e deveriam atuar como chaperonas, ou seja, deveriam auxiliar ou facilitar 0 correto dobramento da molécula catalitica de RNA (ribozima). Muitas das chaperonas atuais esto envolvidas na resposta a0 choque térmico ¢ so denominadas de HSP (Heat Shock Proteins, em inglés). Poole etal, (1998) incluem na categoria de chaperonas as moléculas que se ligam a RNA e que no so em si cataliticas, como as protefnas ribossOmicas & aquelas ligadas & remogao de introns, entre outras, Polipeptideos carregados positivamente ligariam-se as moléculas de RNA carregadas negativamente, aumentando asuaestabilidade. O aumento da estabilidade nas estruturas tercidrias das ribozimas, que sem as protefnas seriam bastante dependentes das concentragdes de fons no meio (por exemplo, Mg™), permitiria um aumento na preciso da replicagio e, conseqiientemente, um aumento do tamanho das moléculas de RNA sendo replicadas. Esse aumento na precisio de replicagaio da informagao € fundamental para 0 surgimento da sfntese protéica, As proteinas sio catalisadores mais eficientes ¢ répidos que o RNA, pois possuem um néimero muito maior de grupos funcionais (20 aminodcidos) ¢ a capacidade de manter uma estrutura tercidria precisa (Jeffares et al., 1998). Atualmente, so raros os catalisadores que sio formados unicamente por RNA (alguns introns autocataliticos & ribozimas virais). Na maioria dos casos, os RNAS catalisadores esto associados a proteinas que ajudam a manter uma estrutura tercidria correta. A estrutura tercidria de moléculas de RNA varia com a concentragio de fons no meio, daf a necessidade de interagio com proteinas. Os ribossomos atuais parecem ser exatamente isso, ribozimas estabilizadas por protefnas. ‘Uma vez que as protefnas se apresentam muito mais eficientes como catalisadores do que as ribozimas, suasintese utilizagdo seriam vantajosas para os organismos (Jeffares etal., 1998). A partir dessa interagio entre os polipeptideos eas moléculas de RNA, teria surgido o chamado mundo de RNP (RNP = RNA + protefnas; Figura 2.2). 2.4. TRANSICGAO PARA O “MUNDO DE DNA” Atualmente, hé uma grande aceitagtio da hipétese do mundo de RNA. Apesar disso, todas as células vivas hoje tém como material informative 0 DNA. Dos seres vivos conhecidos, apenas os virus podem apresentar o RNA como portador de informagio genética, podendo existir com fitas simples ou duplas dessa molécula. Protefnas podem ser sintetizadas na auséncia de DNA, mas nao na de RNA.