PRACTICA No.

Electroforesis en gel de agarosa y visualización de ADN plasmídico

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en
gel de agarosa, en la cual las moléculas de ADN se separan en función de su tamaño. Esta técnica
consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa aplicando un
campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta
negativa las cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran
más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento.
Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro
de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con
afinidad por el ADN que se intercala entre los pares de bases y que tiene la particularidad de
fluorescer cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que
corresponden a moléculas de ADN.

MATERIAL

Puntas estériles.
Pipetas automáticas.
Agua destilada.
Tanques, camas y peines de electroforesis.
Fuente de alimentación.
Agarosa.
Microcentrífugas.
Vaso de precipitado (para desecho).
Erlenmeyer de 100 ml.
Microondas.
Balanza.
Cinta adhesiva.
TAE.

PROCEDIMIENTO

1. Fabricación del gel de agarosa al 1 % y preparación de la muestra

a. En un matraz mezclar una cantidad adecuada de agarosa (1 g) con tampón TAE
(100 ml). Calentar la mezcla (agarosa + TAE) con la ayuda de un microondas u
hornillo eléctrico hasta fundir y disolver completamente la agarosa (¡cuidado al
agitar el matraz, que la agarosa al calentarse puede salpicar abruptamente fuera
del matraz y producir serias quemaduras!).
b. En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado anteriormente + 10
μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de carga”.
c. Centrifugar ligeramente la mezcla SÓLO si hay demasiadas gotas repartidas
dentro del tubo, con objeto de recoger todo el volumen de muestra.
d. Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1% previamente
fabricado (éste se ha colocado con anterioridad sumergido en tampón TAE en una
e. Cerrar o tapar la cubeta de electroforesis, colocar los electrodos de tal forma que el
polo negativo quede al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo opuesto
del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente eléctrica continua
de 100-120 voltios
f. Detener la electroforesis tras unos 60 minutos o cuando el colorante haya recorrido
las tres cuartas partes del gel. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador
de luz ultravioleta de onda corta.

2. Tinción Rápida de Geles de Agarosa en 100x Fast Blast DNA Stain

Este protocolo permite una rápida visualización de las bandas de ADN en geles de agarosa en
alrededor de 15 minutos. Para una rápida tinción, el tinte Fast Blast DNA (500X) deberá ser diluido
a una concentración de 100X. Recomendamos usar 120 ml de Fast Blast a 100X para teñir dos
bandejas individuales de gel de agarosa de 7x7 cm ó 7x10 cm que las proveen los kits educativos
Bio-Rad. Si se usan otras bandejas, añada volumen suficiente de la solución del tinte hasta
sumergir completamente el gel.

Después de la electroforesis, los geles de agarosa deben ser retirados de su bandeja antes de ser
colocados en la solución para teñir. Esto se logra al sostener la base de la bandeja del gel con una
mano y, gentilmente, empujar el gel hacia fuera con el pulgar de la otra mano. Debido a que el gel
es frágil, se le debe de dar atención especial mientras es manipulado. Recomendamos
ampliamente el uso de una espátula larga u otra superficie de soporte para transferir el gel de un
contenedor a otro. La distinción requiere el uso de mínimio un contenedor largo de volumen de al
menos 500 ml, en cada mesa de estudiantes. Cada equipo puede utilizar contenedores de lavado
diferentes para cada paso, o simplemente usar un contenedor que se vacíe después de cada
lavado y rellenado para el siguiente.

Marque las bandejas con sus iniciales y salón. Se teñirán 2 geles por bandeja.

• Tinción de Geles
Remueva cada gel de su bandeja y cuidadosamente deslícela en la bandeja de tinción. Vierta
aproximadamente 120 ml del tinte a 100X en la bandeja de tinción. Si es necesario, añada más
solución al 100X para sumergir completamente los geles. Tiña los geles de 2-3 minutos, pero no
más de 3 minutos. El tinte puede ser usado de nuevo al menos 7 veces

• Enjuagado de Geles
Transfiera los geles en un contenedor largo que contenga 500-700 ml de agua tibia (40-55 oC) y
limpia. Después agite gentilmente en el agua por alrededor de 10 segundos para enjuagar.

• Lavado de Geles
Transfiera el gel en un contenedor largo con 500-700 ml de agua tibia limpia. Gentilmente agite el
gel en una plataforma que vibre por 5 minutos. Si no hay plataforma que vibre, mueva los geles
gentilmente en el agua una vez cada minuto.

• Lavado de Geles
Realice un segundo lavado como en el paso 4

• Registre Resultados

Tire el agua y examine los geles teñidos por bandas de ADN. Las bandas pueden aparecer
borrosas inmediatamente después del segundo lavado, pero se empezarán a plasmar en bandas
finas de 5-15 minutos después del segundo lavado. Esto es debido a que las moléculas de Fast
Blast migran en el gel y se adhieren más fuertemente al ADN.
Para obtener un máximo contraste, se necesitarán más lavados en agua tibia. Destiña hasta el
nivel deseado, pero no lave el gel en agua durante la noche. Si no puede completar el desteñido en
el tiempo permitido, puede transferir el gel a una solución de Fast Blast 1X para un teñido durante
la noche. Vea protocolo 2.
a) Coloque el gel en un fondo claro y registre sus resultados haciendo un diagrama como
se indica. Coloque una hoja clara de plástico o acetato sobre el gel. Con un marcador
 permanente, marque los orificios y los patrones de las bandas en la hoja de plástico
para hacer una réplica del gel. Remueva la hoja de plástico para análisis posteriores.
Los geles también pueden ser fotocopiados en una hoja amarilla de película
transparente para un contraste óptimo.
b) Secado del gel de agarosa para un registro permanente del experimento.
1) Deshágase de todas las líneas no marcadas con un cuchillo o navaja. Corte el
gel de arriba hacia abajo para remover las líneas que en las que no se
depositó muestra, dejando solamente las líneas 1-4.
2) Coloque el gel directamente sobre la cara hidrofílica de un pedazo de película
de soporte del gel (El agua formaría gotas en la cara hidrofóbica de un pedazo
de película de soporte del gel). Centre el gel en la película y remueva las
burbujas que se puedan formar entre el gel y la película. Coloque la película en
una toalla de papel y déjela secar en un área bien ventilada, asegurándose de
evadir el contacto directo con la luz. Mientras el gel se seca, se adherirá a la
película, aunque no se sumergirá. Si se mantiene sin alteraciones en la
película de soporte, el gel se secará completamente a temperatura ambiente
después de 2-3 días. El resultado será un registro plano, transparente y
durable del experimento.

ANEXO 1.

Solución tampón 10X TAE

2 litros 1 litro
(g) (g)
“Tris base” 216 108
Ácido acético glacial 110 21,05
Na2–EDTA 14,8 2,45
Agua destilada Hasta 2 litros Hasta 1 litro