FORMATO DE GUÍAS DE LABORATORIO

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UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
PROGRAMA DE QUÍMICA
LABORATORIO DE QUÍMICA DE PRODUCTOS NATURALES.
PROFESOR: PAULA LILIANA GALEANO GARCÍA. Qco. M.Sc.

PRÁCTICA N° 7. EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ANTOCIANINAS

TOTALES EN FRUTAS, MEDIANTE EL MÉTODO DEL DIFERENCIAL
DEL pH.

ANTOCIANINAS

Las antocianinas representan el grupo más importante de pigmentos

hidrosolubles detectables en la región visible por el ojo humano (Strack
y Wray, 1994). Estos pigmentos son responsables de la gama de colores
que abarcan desde el rojo hasta el azul en varias frutas, vegetales y
cereales, y se encuentran acumulados en las vacuolas de la célula. Las
antocianinas poseen diferentes funciones en la planta como son la
atracción de polinizadores para la posterior dispersión de semillas y la
protección de la planta contra los efectos de la radiación ultravioleta y
contra la contaminación viral y microbiana.

El interés por los pigmentos antociánicos y su investigación científica se

ha incrementado en los últimos años, debido no solamente al color que
confieren a los productos que las contienen sino a su probable papel en
la reducción de las enfermedades coronarias, cáncer, diabetes; a sus
efectos antiinflamatorios y mejoramiento de la agudeza visual y
comportamiento cognitivo. Por lo tanto, además de su papel funcional
como colorantes, las antocianinas son agentes potenciales en la
obtención de productos con valor agregado para el consumo humano.

A pesar de las ventajas que ofrecen las antocianinas como sustitutos

potenciales de los colorantes artificiales, factores como su baja
estabilidad y la falta de disponibilidad de material vegetal limitan su
aplicación comercial (Wrolstad, 2000).

ESTRUCTURA DE LAS ANTOCIANINAS Y COLOR

Las antocianinas son glucósidos de antocianidinas, pertenecientes a la

familia de los flavonoides, compuestos por dos anillos aromáticos A y B
unidos por una cadena de 3 C. Variaciones estructurales del anillo B
resultan en seis antocianidinas conocidas (Fig. 1).
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El color de las antocianinas depende del número y orientación de los

grupos hidroxilo y metoxilo de la molécula. Incrementos en la
hidroxilación producen desplazamientos hacia tonalidades azules
mientras que incrementos en las metoxilaciones producen coloraciones
rojas.

λMáx (nm)

Aglicona
R1 R2 Espectro- visible
Pelargonidin H H 494 (Naranja)
a
Cianidina OH H 506 (Naranja-
Rojo9
Delfinidina OH OH 508 (Azul- Rojo)
Peonidina OCH3 H 506 (Naranja-
Rojo)
Petunidina OCH3 OH 508 (Azul- Rojo)
Malvidina OCH3 OCH3 510 (Azul- Rojo)

Figura 1. Estructura de las antocianinas.

En la naturaleza, las antocianinas siempre presentan sustituciones

glicosídicas en las posiciones 3 y/o 5 con mono, di o trisacáridos que
incrementan su solubilidad. Dentro de los sacáridos glicosilantes se
encuentran la glucosa, galactosa, xilosa, ramnosa, arabinosa, rutinosa,
soforosa, sambubiosa y gentobiosa. Otra posible variación en la
estructura es la acilación de los residuos de azúcares de la molécula con
ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos pueden ser alifáticos, tales
como: malónico, acético, málico, succínico u oxálico; o aromáticos: p-
coumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico, o p-hidroxibenzóico.
Stintzing et al., 2002, demostraron que el tipo de sustitución glicosídica
y de acilación producen efectos en el tono de las antocianinas; es así
como sustituciones glicosídicas en la posición 5 al igual que acilaciones
aromáticas, producen un desplazamiento hacia las tonalidades púrpura.
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ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LAS ANTOCIANINAS

El interés en los pigmentos antociánicos se ha intensificado

recientemente debido a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas.
Durante el paso del tracto digestivo al torrente sanguíneo de los
mamíferos, las antocianinas permanecen intactas (Miyazawa et al.,
1999) y ejercen efectos terapéuticos conocidos que incluyen la
reducción de la enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos,
antitumorales, antiinflamatorios y antidiabéticos; además del
mejoramiento de la agudeza visual y del comportamiento cognitivo.Los
efectos terapéuticos de las antocianinas están relacionados con su
actividad antioxidante.

OBJETIVOS

Cuantificar el contenido de antocianinas totales en diferentes frutales,

mediante el método de diferencial de pH.

EQUIPOS Y REACTIVOS

Reactivo Cantida Equipo Cantidad

d
Cloruro de potasio 20 g Espectrofotometro 1
UV-Vis
Acetato de sodio 20 g Balanza analítica 1
Etanol ó metanol 100 ml Micropipeta 100- 2
100 μL
HCl 10 ml

Cada grupo de trabajo debe llevar 4 frutas diferentes, preferiblemente

de coloraciones rojas- moradas (uvas, fresas, moras, arándanos) y de la
región (uva caimarona, corozo, azulejo). No se debe repetir frutos entre
grupos (Ponerse de acuerdo).

Buffer pH: 1.0 (0,025 M de Cloruro de potasio).

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Buffer pH: 4.5 (0,4 M de Acetato de sodio).

METODOLOGÍA

1. Extracción de las antocianinas.

5 g de muestra de cada fruta por separado, se someten a maceración

con pequeñas cantidades de HCl (0,1- 1.0 %) en metanol o etanol. Se
filtra y se completa un volumen de 10 ml.

2. Determinación de la concentración de las antocianinas.

Para la obtención de la concentración de la antocianina, se utiliza el

método del diferencial de pH. La antocianina experimenta una
transformación reversible con los cambios de pH, manifestando una
variación en la absorbancia. La forma oxonium predomina a pH 1.0 y el
hemiacetal a pH 4.5. Este método permite una rápida y exacta medida
de la cantidad de antocianina total, incluso en presencia de pigmentos
degradados y otros compuestos interferentes.

- Calentar el equipo, encendiéndolo 30 min antes de iniciar las lecturas.

- Calibrar el equipo usando agua destilada.

- Tomar 300 μL del extracto metánolico y mezclar con 600 μL de buffer

pH:1.0, depositar en una cubeta

- Tomar 300 μL del extracto metánolico y mezclar con 600 μL de buffer

pH:4.5, depositar en una cubeta.

- Se lee la absorbancia de cada una de las mezclas colocadas en las

cubetas en un rango de 400- 700 nm, de tal manera que la absorbancia
sea menor de 0,8 UA.

- Se toma la lectura de los picos más altos a pH. 1.0 y a pH: 4.5, así
como las lecturas a 700 nm.

La concentración de antocianinas se calcula mediante la siguiente

ecuación:

A= (Aλ vis-máx - Aλ 700nm)pH: 1.0 - (Aλ vis-máx - Aλ 700nm)pH: 4.5

Donde:
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Aλ vis-máx: Es la lectura del pico más alto a pH:1.0 y a pH:4.5

Aλ 700nm: Es la lectura a 700 nm tanto a pH:1.0 y a pH:4.5

La concentración de la antocianina expresada como cianidina- 3-

glucósido en la muestra original se determina con la siguiente fórmula.

C(mg/L) = (A) * 482,82 * (1000/ε)FD

Donde:

449,2: Es la masa molecular de la cianidína-3-glucósido.

ε: Es la absortividad molar. (26.900 g/mol. cm)

FD: Es el factor de dilución.

ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

- Realizar diagrama de flujo de la metodología propuesta. (Presentar

antes de entrar al laboratorio).

- Profundizar el tema de antocianinas.

- Elaborar listado de materiales y entregar una semana antes al

profesor.

CUESTIONARIO

1. Esquematice las reacciones químicas que se llevan a cabo en el

experimento del laboratorio (Explicando el mecanismo).

2. Realice una búsqueda bibliográfica de investigaciones en torno a las

antocianinas reportadas en las frutas trabajadas en el laboratorio y la
actividad biológica que reportan. (Referenciar artículos científicos de
revistas indexadas).

BIBLIOGRAFÍA

MIYAZAWA T, NAKAGAWA K, KUDO M, MURAISHI K, SOMEYA K. Direct

Intestinal Absorption of Red Fruit Anthocyanins, Cyanidin-3-Glucoside
and Cyanidin-3,5-Diglucoside, Into Rats and Humans. J Agric Food Chem.
1999; 47:1083-1091.
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STINTZING FC, STINTZING AS, CARLE R, FREI B, WROLSTAD RE. Color

and Antioxidant roperties of Cyanidin-based Anthocyanin Pigments. J
Agric Food Chem. 2002; 50:6172-81.

STRACK D, WRAY V. The Anthocyanins. In: HARBONE JB, editor. The

Flavonoides. Advances in Research Since 1986. Boca Raton FL: CRC
Press; 1994. WROLSTAD R E. Anthocyanin Pigments-bioactivity and
Coloring Properties. J Food Sci. 2004; 69(5):C419-C425.