Professional Documents
Culture Documents
844 Fulltext 2533 1 10 20190917 8716 3973
844 Fulltext 2533 1 10 20190917 8716 3973
phòng thí nghiệm tạo được QD nhưng chưa có không có EDC/NHS. Ủ qua đêm sản phẩm sau
công bố nào giúp ứng dụng chúng làm chất đánh khi gắn với ure 8 M ở giá trị pH 3, 7, 9. Quan sát
dấu trong thực tế [5]. Trong nghiên cứu này, dưới kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại
chúng tôi tiến hành gắn định hướng kháng thể 60X với ánh sáng kích thích có bước sóng 480 nm
kháng tế bào Jurkat T lên bề mặt QD CdSe/ZnS để xác định cường độ sáng cùng sự tồn tại liên kết
thông qua protein cầu nối là protein A/G, và thử giữa GFP với QD thông qua sự đồng hiện diện tín
nghiệm khả năng đánh dấu tế bào Jurkat T của hiệu huỳnh quang của QD và GFP.
QD này. Khảo sát hiệu suất gắn ở các nồng độ protein
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP khác nhau
Khảo sát điều kiện tối ưu để gắn protein lên BSA được gắn ở các nồng độ phản ứng 20, 40,
chấm lượng tử 60, 80, 100 µg/mL lên QD trong đệm PBS 1X pH
7,4 không có EDC/NHS. Định lượng BSA dư
BSA được gắn lên chấm lượng tử CdSe/ZnS
bằng Bradford ở 595 nm và tính hiệu suất gắn.
bọc MPA (được cung cấp bởi phòng thí nghiệm
Tương tự, protein A/G được gắn lên QD ở hai
Bộ môn Vật lý ứng dụng, Khoa Vật lý - Vật lý kỹ
nồng độ phản ứng 20 và 60 µg/mL trong đệm
thuật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
PBS 1X pH 7,4, không có EDC/NHS. Định lượng
học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh) trong điều
protein A/G dư bằng Bradford ở 595 nm, tính hiệu
kiện có và không có EDC/NHS. Mỗi điều kiện
suất gắn.
được khảo sát với ba hệ đệm, mỗi hệ đệm bao
gồm đệm hoạt hoá và đệm gắn theo thứ tự: MES Kháng thể được gắn lên chấm lượng tử-protein
0,01 M pH 6 - MES 0,01 M pH 6; MES 0,01 M A/G (QD-pA/G) sau khi QD-pA/G đã được đảo
pH 6 - NaP 0,01 M pH 7,4 và MES 0,01 M pH 6 - với BSA 5 % trong 2 tiếng ở 10 oC để đảm bảo
PBS 1X pH 7,4. giữa QD và tế bào không có sự tương tác trực tiếp
bằng các liên kết không đặc hiệu. Bổ sung kháng
Quy trình gắn bao gồm ủ và đảo 0,25 mg QD
thể thỏ kháng tế bào Jurkat T [6] với tỉ lệ theo
với 99 µL đệm hoạt hóa, 8 µL EDC 0,2 M, 18 µL
khối lượng kháng thể:protein A/G đã gắn 3:1.
NHS 0,2 M ở nhiệt độ phòng 30 phút. Dừng phản
Phản ứng được tiến hành trong dịch ủ kháng thể
ứng bằng 8 µL 2-mercaptoethanol, để ở nhiệt độ
(Tris-base 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,2) và đảo
phòng 5 phút. Rửa hạt với đệm hoạt hóa hai lần
ở 10 oC trong 2,5 tiếng. Li tâm, thu dịch nổi để
bằng cách li tâm ở 10000 vòng/phút trong 3 phút,
định lượng kháng thể chưa gắn bằng Bradford ở
bỏ dịch nổi. Thêm 215 µL đệm gắn, 25 µL NaCl 3
595 nm và tính hiệu suất gắn kháng thể.
M, 10 µL BSA (7 mg/mL). Đảo ở 10 oC trong 2,5
giờ. Dừng phản ứng bằng 15 µL Tris 0,05 M pH Kiểm tra khả năng đánh dấu tế bào của QD-
8. Li tâm, thu dịch nổi để định lượng lượng BSA pA/G-kháng thể anti-pan T
chưa gắn bằng phương pháp Bradford với dung Đảo 0,005 mg QD-pA/G-kháng thể với 106 tế
dịch Bradford ở 595 nm. Tính hiệu suất gắn theo bào Jurkat T trong môi trường nuôi tế bào (RPMI
công thức: (lượng protein ban đầu lượng protein 1640 10 % FBS) với thể tích phản ứng là 250 µL,
không gắn)/(lượng protein ban đầu) × 100 %. Hạt ở 10 oC trong 30 phút. Li tâm, bỏ dịch nổi, hoà
sau khi gắn BSA được kiểm tra bằng phương cặn tế bào bằng 50 µL môi trường nuôi tế bào.
pháp chạy điện di trên gel agarose 0,5 %, chụp Quan sát kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang ở
phổ FT-IR, UV-Vis, và Photoluminescence (PL). độ phóng đại 40X với ánh sáng kích thích có bước
Kiểm tra độ bền liên kết giữa QD và protein sóng 480 nm.
BSA được gắn lên QD trong đệm PBS 1X pH 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
7,4 không có EDC/NHS. Ủ qua đêm sản phẩm sau Khảo sát điều kiện tối ưu để gắn protein lên
khi gắn với ure 8 M ở giá trị pH 3, 7, 9. Chụp phổ QD
FT-IR sản phẩm sau khi ủ để xác nhận sự tồn tại
Kết quả chạy điện di QD sau khi gắn BSA như
của liên kết giữa QD và protein. Tương tự, protein
trong Hình 1. Ở ba hệ đệm, QD gắn BSA khi có
GFP được gắn lên QD trong đệm PBS 1X pH 7,4
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: 59
CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 6, 2018
Hình 1. Phân tích sản phẩm gắn giữa QD với BSA trên gel agarose.
Chú thích: 1, 4, 7: QD; 2, 5, 8: QD-BSA; 3, 6, 9: QD-BSA có EDC/NHS
Kết quả chụp phổ UV-Vis thu được như trong nhỏ hơn MPA nên đỉnh hấp phụ của QD-BSA bị
Hình 2. Đỉnh phổ hấp phụ của QD dịch về phía bước sóng ngắn hơn so với hạt
CdSe/ZnS/MPA là 550 nm (MES-MES), 543 nm CdSe/ZnS/MPA. Bên cạnh đó, đỉnh hấp phụ của
(MES-NaP) và 547 nm (MES-PBS). Sau khi gắn QD-BSA trong hai trường hợp có và không có
BSA, bước sóng hấp phụ trở nên ngắn hơn: 529- EDC/NHS tương đương nhau. Chứng tỏ ở cả ba
533 nm (MES-MES), 538 nm (MES-NaP), 537 hệ đệm BSA gắn được lên QD trong cả trường
nm (MES-PBS). Do kích thước phân tử của BSA hợp có và không có EDC/NHS.
A Chấm lượng tử B
Chấm lượng tử-BSA
Chấm lượng tử-BSA+EDC/NHS
Độ hấp phụ (a.u)
Độ hấp phụ (a.u)
Hình 2. Phân tích kết quả gắn BSA lên QD bằng phổ UV-Vis trong hệ đệm MES-MES (A), MES-NaP (B), MES-PBS (C)
60 SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL
NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 6, 2018
Chấm lượng tử
A Chấm lượng tử-BSA
Chấm lượng tử-BSA+EDC/NHS
Cường độ phát
quang (a.u)
B C
phát quang
Cường độ
Cường độ phát
quang (a.u)
(a.u)
Bảng 1. Hiệu suất gắn BSA lên QD ở các hệ đệm khác nhau.
Đệm hoạt hóa MES 0,01 M pH 6 MES 0,01 M pH 6 MES 0,01 M pH 6
Đệm gắn MES 0,01 M pH 6 NaP 0,01 M pH 7,4 PBS 1X pH 7,4
EDC/NHS Không Có Không Có Không Có
a a,d b b,d c
Hiệu suất (%) 54,3 54,0 50,5 50,0 58,9 56,8c
Chú thích: a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống kê, với p <0,05
Kết quả chụp phổ PL được thể hiện trong Hình PBS cho hiệu suất gắn cao nhất, đặc biệt khi ở
3. Trong cả ba hệ đệm, bước sóng phát xạ trước điều kiện không có EDC/NHS (Bảng 1).
và sau khi gắn BSA không dịch chuyển nhiều Mặt khác, khi không sử dụng EDC/NHS thì
(dao động trong khoảng 571-577 nm). Chứng tỏ bước hoạt hóa là không cần thiết. Bên cạnh đó,
việc gắn BSA không làm thay đổi đáng kể kích hiệu suất gắn không thay đổi khi chỉ sử dụng đệm
thước hạt. Bên cạnh đó, cường độ phát quang PBS thay vì sử dụng hệ đệm MES-PBS. Do đó,
tương đối ổn định và có xu hướng tăng sau khi BSA được gắn trong đệm PBS 1X pH 7,4, kết quả
gắn BSA, đặc biệt trong hệ đệm MES-PBS và chụp phổ FT-IR thu được như trong Hình 4. Khi
MES-MES. Điều này cho thấy việc gắn BSA so sánh với đối chứng là QD (Hình 4 A) và BSA
không gây ảnh hưởng đến đặc tính của QD, mặt (Hình 4 B) trong khoảng 1000–2000 cm-1, QD
khác còn giúp tăng khả năng bảo vệ lõi, tăng gắn BSA trong cả trường hợp có và không có
cường độ phát quang. EDC/NHS đều có phổ đặc trưng với ba đỉnh ở số
Trong ba hệ đệm, hiệu suất gắn BSA khi có và sóng khoảng 1380, 1540, 1650 cm-1 (Hình 4 C, D).
không có EDC/NHS là như nhau, hệ đệm MES-
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: 61
CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 6, 2018
A B C D
Hình 4. Phân tích kết quả gắn BSA lên QD trong đệm PBS 1X pH 7,4 bằng phổ FT-IR.
Chú thích: A: QD; B: BSA; C: QD-BSA; D: QD-BSA có EDC/NHS.
Các kết quả trên cho thấy protein gắn được lên Kết quả chụp phổ FT-IR của những mẫu đã gắn
QD đạt hiệu suất cao nhất khi tiến hành trong đệm với BSA đều có những đỉnh đặc trưng và khác với
PBS 1X pH 7,4 và không cần sự hỗ trợ của phổ của các mẫu đối chứng (Hình 5). Bên cạnh
EDC/NHS. đó, trong cả ba trường hợp QD-BSA được xử lí
Kiểm tra độ bền liên kết giữa QD và protein với ure (Hình 5 E, F, G), phổ thu được tương tự
như phổ của mẫu QD-BSA không được xử lí
Do BSA gắn lên QD mà không cần xúc tác bởi
(Hình 5 D). Kết quả này chứng tỏ liên kết giữa
EDC/NHS nên đặt ra giả thiết liên kết giữa QD và
QD và BSA là liên kết bền dưới tác động của ure
protein không phải là một liên kết cộng hoá trị,
8 M ở các giá trị pH 3, 7, 9.
tức có thể là liên kết ion. Để kiểm tra giả thiết,
chúng tôi tiến hành các thí nghiệm kiểm tra độ Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh
bền của liên kết này. quang QD-GFP sau khi xử lí với ure 8 M ở các
giá trị pH khác nhau thu được như trong Hình 6.
A B C
D E F
Hình 5. Kiểm tra liên kết giữa QD và BSA dưới tác động của ure 8 M pH 3, 7, 9 bằng phổ FT-IR.
Chú thích: A: QD; B: BSA; C: QD-BSA; D: QD-BSA, ure pH 3; E: QD-BSA, ure pH 7; F: QD-BSA, ure pH 9
62 SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL
NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 6, 2018
A B C
D E F
G H I
Hình 6. Xác định độ bền liên kết giữa QD và protein dưới tác động của ure 8 M ở các giá trị
pH 3 (A, B, C), pH 7 (D, E, F), và pH 9 (G, H, I) dưới kính hiển vị huỳnh quang.
Chú thích: A, D, G: QD; B, E, H: QD-BSA; C, F, I: QD-GFP. Độ phóng đại 60X,
bước sóng kích thích 480 nm. Ảnh đại diện cho 3 lần lặp lại độc lập
Ở Hình 6 A, B, C, sau khi xử lí với ure 8 M pH Khảo sát hiệu suất gắn ở các nồng độ protein
3, độ sáng của QD giảm rõ rệt. Ở pH 7 và 9 (Hình khác nhau
6 D, E, F, G, H, I), độ sáng của QD không bị ảnh Hiệu suất gắn tương ứng với BSA ở các nồng
hưởng. Do cường độ huỳnh quang của QD phụ độ 20, 40, 60, 80, 100 µg/mL lần lượt là 33,5;
thuộc rất nhiều vào giá trị pH. Ở pH thấp, lớp vỏ 57,8; 73,2; 71,4; 71,7 %. Đồ thị so sánh hiệu suất
bọc của QD bị hư hại gây giảm khả năng bảo vệ tương ứng với các nồng độ BSA khác nhau được
lõi, làm cường độ sáng giảm hơn 80 % [8]. Ở thể hiện trong Hình 7. Hiệu suất tăng dần khi
nghiên cứu khác, cường độ sáng của QD bọc bởi nồng độ tăng từ 20 µg/mL lên 40 µg/mL và 60
MPA ổn định nhất tại pH 7,4, ở pH <6 QD µg/mL. Nhưng khi tăng từ 60 µg/mL lên 80
ZnSe/ZnS bọc MPA có nguy cơ bị tắt quang [9]. µg/mL và 100 µg/mL, hiệu suất không thay đổi.
Riêng ở Hình 6 C, dưới tác động của pH 3, huỳnh Nguyên nhân có thể là do khi tăng nồng độ BSA
quang màu xanh GFP trong mẫu không xác định phản ứng, mật độ phân tử BSA tăng, làm tăng khả
được là có hay không. Do khả năng phát huỳnh năng tiếp xúc giữa các phân tử BSA và QD giúp
quang của GFP chỉ ổn định ở pH 6-10, ở pH <6 hiệu suất gắn tăng. Khi mật độ BSA tăng đến một
cường độ huỳnh quang giảm mạnh [10]. Ở Hình 6 mức nhất định trong khi lượng hạt cố định thì xác
F và I, dễ dàng nhận ra màu xanh của GFP. suất tương tác giữa QD và BSA được giữ ổn định.
Chứng tỏ rằng, GFP vẫn gắn với QD sau khi xử lí
Với mục tiêu gắn một phân tử protein lên một
với ure 8 M ở pH 7 và 9.
QD, lượng protein sử dụng phải ở mức thấp nhất.
Các kết quả trên chứng tỏ rằng tuy không sử Vì thế, trong nhóm hiệu suất có sự khác biệt và
dụng EDC/NHS, liên kết bền giữa QD và protein nhóm không có sự khác biệt chúng tôi lựa chọn
vẫn được tạo thành. Liên kết này bền dưới tác nồng độ protein thấp nhất ở mỗi nhóm tương ứng
dụng của ure là chất gây phá vỡ các liên kết là 20 µg/mL và 60 µg/mL để áp dụng cho protein
không cộng hóa trị và bền ở các điều pH khác A/G.
nhau.
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: 63
CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 6, 2018
Hình 8. Kiểm tra khả năng bắt tế bào Jurkat T của kháng thể anti-pan T gắn trên QD ở
ánh sáng trắng (A, B, C) và ánh sáng huỳnh quang (D, E, F).
Chú thích: A, D: QD; B, E: QD-kháng thể; C, F: QD-pA/G-kháng thể. Độ phóng đại 40X, bước sóng kích
thích 480 nm. Ảnh đại diện cho 3 lần lặp lại độc lập.
Những kết quả trên cho thấy rằng, QD gắn với as fluorescent labels"., Nat. Methods, vol. 5, no. 9,
pp.763–775, 2008.
kháng thể thông qua protein A/G có khả năng bắt
[3]. A.M. Smith, X. Gao, S. Nie, Quantum dot nanocrystals
lên tế bào Jurkat T hiệu quả hơn QD gắn trực tiếp
for in vivo molecular and cellular imaging, Photochem
với kháng thể. Photobiol, vol. 80, no. 3, pp. 377–385, 2004.
4 KẾT LUẬN [4]. K.L. Gilroy, S.A. Cumming, A.R. Pitt, A simple,
Protein đã được gắn thành công lên QD trong sensitive and selective quantum-dot-based western blot
method for the simultaneous detection of multiple targets
đệm PBS 1X pH 7,4 và không cần sự hoạt hóa
from cell lysates, Anal. Bioanal. Chem., vol. 398, no. 1,
của EDC/NHS, thông qua một tương tác bền với pp. 547–554, 2010.
ure 8 M ở các điều kiện pH 3, 7, và 9. Việc gắn [5]. T.K. Anh, "Nghiên cứu xây dựng công nghệ chế tạo và
kháng thể anti-pan T lên QD thông qua protein ứng dụng của vật liệu nano phát quang và vật liệu quang
A/G giúp QD-pA/G-kháng thể có khả năng bắt điện polyme dẫn lai hạt kim loại nano". [Online].
lên tế bào Jurkat T hiệu quả hơn so với việc gắn Available:http://www.vast.ac.vn/component/detai/?view
=detai&id=26&cid=43. [Accessed: 27-Dec-2017].
trực tiếp kháng thể lên QD. Như vậy, chúng tôi đã
[6]. T.M. Thượng et al., "Tạo và thu nhận chọn lọc kháng thể
tạo ra được phức hợp QD-pA/G-kháng thể nhằm IgG kháng protein màng của tế bào Jurkat T", Sci.
bước đầu ứng dụng QD CdSe/ZnS làm chất phát Technol. Dev., 19, pp. 26–35, 2016.
huỳnh quang trong ứng dụng đánh dấu tế bào. [7]. X. He, L. Gao, N. Ma, "One-step instant synthesis of
protein-conjugated quantum dots at room temperature".
Sci. Rep., 3, pp. 2825, 2013.
Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu được tài trợ [8]. V. Kulvietis, G. Streckyte, R. Rotomskis, "Spectroscopic
bởi Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí investigations of CdTe quantum dot stability in different
Minh trong khuôn khổ đề tài 105/2017/HĐ- aqueous media", Lith. J. Phys., vol. 51, no. 2, pp. 163–
SKHCN. 171, 2011.
[9]. J. Ke, X. Li, Y. Shi, Q. Zhao, X. Jiang, "A facile and
TÀI LIỆU THAM KHẢO highly sensitive probe for Hg(ii) based on metal-induced
[1]. A.R. Santos et al., "The impact of CdSe/ZnS Quantum aggregation of ZnSe/ZnS quantum dots", Nanoscale, vol.
Dots in cells of Medicago sativa in suspension culture, J. 4, no. 16, pp. 4996, 2012.
Nanobiotechnology", vol. 8, no. 1, pp. 24, 2010. [10]. T.N. Campbell, F.Y.M. Choy, "The effect of ph on green
[2]. U. Resch-Genger, M. Grabolle, S. Cavaliere-Jaricot, R. fluorescent protein : a brief review further reading", Mol.
Nitschke, T. Nann, "Quantum dots versus organic dyes Biol. Today, 2, pp. 1–4, 2001.
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: 65
CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 6, 2018
Abstract—Quantum dots (QDs) have the potential to 80.7 % and 51.2 % of protein A/G at the
be used as a marker in research and supporting for concentration of 60 µg/mL and 20 µg/mL,
medical treatment because of their unique optical respectively, conjugated with QDs in phosphate
and electronic properties such as size-tuneable light buffer saline (PBS) without supporting of N-Ethyl-
emission, narrow emission, high photostability, etc. N’-(3dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-
With the goal of applying for biomarkers, QDs are hydroxysuccinimide (EDC/NHS). After attaching to
often attached with antibodies. In order to simplify protein A/G, anti-pan T antibody could recognize
the binding process, we experimented to attach and visualize Jurkat T cells. In conclusion, protein
adaptor protein, namely protein A/G to CdSe/ZnS A/G was conjugated successfully on QDs and
QDs covered by 3-mercaptopropionic acid (MPA). initially support for application in cell labeling.
Keywords—Quantum dots, protein A/G, anti-pan T antibody, Jurkat T cells, cell labeling