Capitulo 3 Ordenamiento de bacterias Carlos Padilla EspinozaCapitulo 3 ORDENAMIENTO DE BACTERIAS Carlos Padilla Espinoza 3.1, Ordenamiento de los seres vivos El ordenamiento de los seres vivos ha sido fundamental para iniciar el estudio de ellos. Es asi que las bacterias al igual que los demas organismos vivos se clasifican en géneros y especies seguin el diagrama binémico propuesto por Carlos Linneo. Su denominacién se hace en latin y su escritura se realiza en letra cursiva como por ej. Pseudomonas aeruginosa, donde en primer lugar se resenia el género en mayiiscula y a continuacion la designacién de especie en mintiscula. En apariencia esta formula es sencilla, pero basta realizar un par de razonamientos para evidenciar que tras ella existe una enorme complejidad. A diferencia de los seres superiores las bacterias no presentan diferenciadores morfolégicos importantes y los antecedentes de fésiles microbianos son escasos si se considera la enorme amplitud de esta forma de vida. Esto se entiende mejor al no existir una descripcién detallada que dé cuenta del proceso evolutivo de las formas mas antiguas de las bacterias. En segundo lugar, se debe considerar que las bacteriassufren diferentes tipos moleculares de mutacionesy procesosdetransferencia genética que producen grandes cambios capaces de modificar elementos estructurales y fisiolégicos de las mismas. 3.2. Agrupaciones de los seres vivos Como una forma de destacar los principales hitos de la taxonomia bacteriana, es importante citar al zodlogo aleman Ernst Heinrich Haeckel (1866) que propuso que, ademas del Reino Animal y del Reino Vegetal, debia existir un tercer Reino que comprendiera los organismos unicelulares. A este nuevo Reino Io llamé Protista. Su propuesta también fue denominada como la clasificacién de tres reinos. En general, el Reino Protista agrupaba a las bacterias, hongos, algas y protozoos. (Figura 3.1). Esta es probablemente la primera clasificacién donde se le da un trato taxonémico interesante a las bacterias. Mas tarde, Edouard Chatton (1932) dividié a las Ordenamientodebacteras | 33Protistas en Protistas superiores (Algas pardas y rojas, Hongos, Protozoos) y Protistas inferiores (Bacterias y algas verde azules, actuales cianobacterias). Plantae __Protixta eae digo.) Spoowing | ‘octent = yates | e ) { ee i | ¢ Oe of ufo TRA: pm g 1 “Sinner = ID Yad: px y qi Stine! ‘Monophyletischer Starumbaum der Organisment notin wd tet pit eet tn en Figura 3.1. La primera clasificacién con base cientifica fue propuesta por Ernest Haeckel en 1866 donde se incluian al Reino de las Plantas, Animales y Protista en el que se incorporaba a las bacterias, algas, hongos y determinados protozoos. Se observa la propuesta original del autor. Obtenido de httpy/blogcienciaalavista blogspot cl/2009/04/la-clasificacion-de-los-seres-vivos html 34 | Microbiologia FundamentalPosteriormente, en 1969, Robert Whittaker, realiza una clasificacién basada en los tipos de nutricién (fotosintesis, absorcién e ingestién), tipo celular y nivel de organizacién, considerando la existencia de 5 Reinos: Monera, que incluyea las bacterias ycianobacterias; Protista, que agrupa a microalgas y protozoos; Hongos, que incorpora a hongos uniy pluricelulares; Vegetal que incluye a plantas verdes pluricelulares y algas superiores; y finalmente el reino Animal que considera a los animales multicelulares. r i | | i | Phueetlares | | | { | poe | O F Principalmeote urea f | i | | 1 \ [ J igura 3.2. Clasificacién de cinco reinos propuesta por Robert Whittaker, fundamentada en la diferenciacién celular y los tipos de nutricién que presentan los seres vivos. En la base se sittia el Reino Monera (Unicos procariontes), para dar paso a Protista, Hongos, Plantas y Animales. Carl Woese basandose en sus estudios moleculares con ARN 16S propusola creacién de un Arbol Filogenético Universal que se compone de tres Dominios distribuidos en tres lineas Bacteria, Archaea y Eukarya (Figura 3.3; Tabla 3.1). En este contexto, hoy existen dos lineas muy diferentes de procariotas Bacteria y Archaea. Si bien estas lineas celulares se parecen morfolégicamente, difieren en sus aspectos moleculares, tales como que las bacterias poseen acide murdmico como parte constituyente del peptidoglican Ordenamiento debacteias | 35y sus lipidos de la membrana presentan Acidos grasos de cadena recta con enlaces éster, en cambio, las archibacterias no poseen Acido murémico en su pared y sus acidos grasos de membrana poseen cadenas aliféticas ramificadas. Se destaca que entre estas dos lineas de vida existen muchas otras diferencias y a su vez que entre estas y la linea Eucarya existen diferencias y similitudes moleculares. Actualmente, se acepta la presencia de 7 Reinos sugeridos por Ruggiero el afio 2015, los que se agrupan en dos superreinos, el Prokaryota y el Eukaryota. EI superreino Procaryota considera al Reino Bacteria, conformado por microorganismos procariotas y al Reino Archaea, que incorpora a procariotas con composicién de lipidos de membrana diferentes al de las bacterias. El superreino Eukaryota, incluye al Reino Plantae, compuesto por organismos pluricelulares fotosintéticos eucariotas y pared celular de celulosa; Reino Animalia, formado por organismos eucariotas pluricelulares heterotroficos; Reino Protozoa, al que se incorporan organismos eucariotas microscpicos , unicelulares y heterotréficos; Reino Fungi, al que se asocian organismos eucariotas uni y pluricelulares que presentan pared con quitina; Reino Chromista al que pertenecen organismos eucariotas_uni y pluricelulares muy variados, con y sin capacidad fotosintética Bacteria Archaea Eukarya “verde Myxomycota Spirochaetes Fllamentosa Entamosba Animates —_ Methanosarcing ‘ Fungi Proteobacteria \ PUN? | atethanobacterium | Haldfitos Plantes , Methanococcus | |.” x Cianobacteria Sera Giliophora \ ~ Planctomyct roteus Z Flagelados ~\ — Bacteroides Cytophaga Tricomonadas Microsporidias Thermotoga SP Yo Diplomonadas Figura 3.3. De los estudios efectuados por Carl Woese se concluye la descripcién de los tres grandes Dominios universales que se encuentran por sobre la categoria de Reino y constituyen el arbol filogenético de la vida. Obtenido y modificado de: Woese C. R. 2000. Interpreting the universal phylogenetic tree. Proc Natl Acad Sci. USA. 97 (15) 8392-8396. Aquifex 36 | Microbiologia FundamentalTabla 3.1. Principales caracteristicas diferenciales entre los tres grandes dominios de la vida Caracteristicas Bacteria Archaea Eucarya Estructura celular procariata si si No AON circular si si No Nacleo rodeado de membrana No No si ated celular Mureina No mureina No mureina LUpidos de membrana Ester eter Ester Acids grasos de membrana Lineal Ramificados neal Ribosomas 705, 708, 805 y 705 Iniciador ARNE Formil Metionina Metionina ‘Metionina Intrones en genes de ARNt No si si Operones st si No Plasmidios sh si Raro Sensibilidad a: cloranfenicolyestreptomicina sh No No Metanogénesis No si No Nitvficacisn si No No 3.3. Taxonomia bacteriana La ciencia taxonémica se refiere a la clasificacion biolgica y comprende tres sub- lasificacién, nomenciatura e identificaci6n. La clasificacion es la organizacion estructurada de los seres vivos en grupos también llamados taxones o rangos. Lo anterior en relacién con sus semejanzas o parentesco evolutivo. La nomenclatura se refiere al otorgamiento de los nombres oficiales a grupos o individuos en concordancia con la normativa oficial y aceptada por la comunidad cientifica. Lo anterior, se encuentra particularmente regulado por el International Committee on Systematic and Evolutionary Bacteriology, mediante el International Code on Nomenclature of Bacteria. Las aprobaciones de denominaciones bacterianas son publicadas y actualizadas en el International Journal of Systematic Bacteriology. La identificacién da cuenta del aspecto practico del proceso taxonémico y consiste en la asignacion de un microorganismo a un grupo o taxén, mediante el uso de diferentes metodologias de laboratorio. Es comtin emplear el término sistematica en reemplazo de taxonomia, peroeste es un término mas amplio que involucra el estudio cientifico de los organismos, cuyo objetivo final es caracterizarlos y agruparlos en forma ordenada. Desde sus inicios la taxonomia bacteriana clésica ha utilizado aspectos morfolégicos con énfasis en la forma, agrupacién de las células bacterianas, tamafio y afinidad tintorial al Gram; movilidad mediante la tincién flagelar, con énfasis en numero y disposicién de los flagelos; aspectos nutritives y fisiolégicos remarcando aspectos de conservacién de energia (fotdtrofo, quimiorganotréfico, quimiolitotrofico), su relacién con el oxigeno (aerobio estricto, anaerobio estricto, facultativo), tolerancia a la sal, y principalmente su capacidad para tolerar 0 metabolizar diferentes fuentes de Ordenamientodebactetas | 37carbono, nitrégeno y azufre. A lo anterior, se le han adicionado otros factores tales como susceptibilidad a los antibacterianos, presencia de pigmentos, capacidad patogénica, entre otros. A este tipo de taxonomia también se le denomina taxonomia fenotipica, la cual ha sido utilizada desde los inicios de la bacteriologia médica, realizando una importante contribucién en la identificacién bacteriana asociada al diagnéstico de enfermedades infecciosas. Las pruebas sefialadas anteriormente presentan diferentes grados de importancia en el proceso de identificacién. Es asf que las propiedades morfolégicas y de agrupacién son pruebas iniciales y provisorias en comparaciona las de fermentacion o actividad enzimatica. De esta forma, las pruebas bioquimicas permiten identificar con alto grado de certeza, bacterias que son clinicamente importantes (Figura 3.4). A estas determinaciones también se les denomina identificacién del biotipo. ee ee Figura 3.4. Identificacién fenotipica de bacterias fundamentada en la utilizacion bioquimica de determinados sustratos (API Test 20). Cada galeria considera el estudio de 20 sustratos diferentes. Los resultados obtenidos de las pruebas bioquimicas son comparados frente a modelos estandarizados que conduciran a la identificacion. La utilizacién de un ntimero importante de pruebas fenotipicas otorga mayores probabilidades para una mejor identificacién bacteriana. La Taxonomia Numérica consiste en una mirada cuantitativa a la ciencia taxonémica, que con la ayuda de computadores ha permitido procesar grandes nimeros de pruebas. El resultado de la clasificacién final se basa en la semejanza de los caracteres fenotipicos estudiados. Una vez finalizada esta tarea se determina para cada uno de los microorganismos estudiados un coeficiente de asociacién que va de 0.0 1.0 (menor a mayor asociacion). Posteriormente, las bacterias se ordenan en una matriz de semejanza. Finalmente, estos resultados se disponen en una figura similar a un 4rbol denominado dendrograma. 38 | Microbiologia FundamentalDendrograma En esta figura se establecen los porcentajes de semejanza que permitiran discernir entre las bacterias que se asocian a nivel de especie, género o familia. Un porcentaje de semejanza sobre 80 % puede significar un parentesco a nivel de especie. EI método de la taxonomia numérica también es util para comparar secuencias de Acidos nucleicos y proteinas de origen bacteriano (Figura 3.5). A B Figura 3.5. A, Gel de agarosa de un RAPD-PCR* con partidores arbitrarios en los cuales se evidencian diferentes polimorfismos genéticos. B, Dendrograma obtenido a partir de los productos de RAPD-PCR y ordenados utilizando el programa Taxotron, software de andlisis numérico que da como resultado la apaticién de dos grupos de bacterias relacionados genéticamente (B1 y B2). *RAPD-PCR: (Random Amplification of Polymorphic DNA). La técnica RAPD-PCR consiste en la amplificacién enzimatica de fragmentos de ADN, utilizando cebadores de secuencia arbitraria que hibridan en loci repartidos aleatoriamente en todo el genoma. Ello revela la existencia de polimorfismos que son utilizables como marcadores genéticos y taxonémicos en todo tipo de organismos. Polimorfismos genéticos: son las variaciones naturales en un gen, secuencia de ADN, 0 cromosoma. 3.4. Herramientas de identificacién bacter Identificaci6n inmunolégica La identificacién inmunoldgica o serolégica es un ensayo que permite distinguir el serotipo. Esta propiedad se fundamenta en que las bacterias poseen diversas estructuras altamente inmunogénicas que se pueden identificar mediante sus correspondientes anticuerpos especificos. Este tipo de identificacion es relevante en bacterias de significancia clinica, las que pueden resultar inertes frente a determinadas Ordenamientodebacteias | 39macromoléculas usadas corrientemente en la identificacién bacteriana (ej. Francisella, Bordetella). También para otras bacterias patégenas dificiles de cultivar (ej. Treponema, Mycoplasma) y ademas en variedades de alguna especie que necesariamente deban ser puestas en evidencia (ej. E. coli enterohemorragica, Shigella flexneri). Una ventaja interesante de la identificacion inmunoldgica es la rapidez con la cual se puede realizar una identificacién al tomar directamente la colonia de la placa como ocurre con Streptococcus pyogenes. La serotipificacion de bacterias presenta una interesante importancia epidemiolégica. Ident icaci6n por fagotipia La fagotipia permite utilizar diferentes bacteriéfagos liticos sobre determinadas bacterias susceptibles. En este caso, se aprovecha la capacidad de reconocimiento que presentan algunos fagos, a receptores bacterianos altamente especificos Los procedimientos se evidencian utilizando siembras en césped de bacterias y posteriormente vertiendo sobre ellas diluciones de los fagos a estudiar mezcladas en un thedio semisolid. La evidencia de la accién litica especifica es la produccién de placas de lisis, que son pequefias zonas transparentes sobre el césped bacteriano (Figura 3.6). Figura 3.6. Placa de Petri con cultivo bacteriano sembrado en césped y con diversas placas de lisis producto de la accién de bacteridfagos. Obtenido de https://www.mun.ca/biology/ scart/4241smc_Ecoli_&_T2_bacteriophage.htm! Identificacién mediante bacteriocinas Las bacteriocinas son sustancias de naturaleza proteica elaboradas por diferentes géneros bacterianos que producen una actividad letal sobre otras bacterias. Presentan diferentes mecanismos de accion y amplitud de espectro antibacteriano, lo que ¢s controversial, considerando que diversos autores proponen un reducido espectro de accion. ‘Actualmente, han sido estudiadas con fines biotecnolégicos como la preservacion de alimentos y control de bacterias patégenas para el ser humano y animales (Figura 3.7). 40 | Microbiologia FundamentalHalo inhibitorio _Césped bacteriano Figura 3.7..Cultivo bacterianode una cepa blanco sembradaen césped e inoculada con 10ildebacteriocinas aisladas de diferentes cepas. Los halos inhibitorios demuestran la accién letal de las bacteriocinas. Identificacién mediante el antibiotipo La susceptibilidad antibacteriana a diferentes antimicrobianos puede constituirse en una interesante herramienta a la hora de identificar cepas de especies bacterianas con fines epidemiolégicos. En este caso, el propdsito no es detectar la sensibilidad o resistencia de la cepa estudiada, sino que averiguar frente a un alto ntimero de antimicrobianos cudl es su perfil de susceptibilidad. Para ello, se utiliza la prueba cualitativa de difusién mediante sensidiscos. Mientras mayor el numero de antimicrobianos analizados, mayores posibilidades de determinar el perfil de susceptibilidad, el que se utiliza para realizar las comparaciones entre las cepas las cuales pueden ser obtenidas, por ejemplo, desde algun brote epidémico infeccioso. Identificacién genotipica La identificacion bacteriana mediante la taxonomia molecular utiliza diferentes métodos que permiten una caracterizacién bacteriana mucho mas fiable que la taxonomia fenotipica. A medida que se producen desarrollos metodolégicos con fundamento en biologia molecular, estos han sido paulatinamente utilizados en identificacion bacteriana. Entre los principales ensayos moleculares para la clasificacion e identificacién de bacterias se encuentran: Composicién del porcentaje de G-C. En el mundo bacteriano, el porcentaje de guanina-citosina (G-C) varia entre un 25 y 75 %. Se considera un cardcter taxonémico que Por si mismo no contribuye a la identificacién ni a la clasificacién, ya que en general se produce una sobreposicién de estos valores en diferentes especies bacterianas. Asimismo, dos cepas con el mismo contenido G-C no tienen por qué ser de la misma especie. Hibridacién de dcidos nucleicos. Considera la posibilidad de que cadenas sencillas de ADN se asocien para formar duplex. En este caso, se mide la cantidad de ADN que finalmente es capaz de reconacerse y formar una doble hebra estable. Se estima que para que dos cepas tengan relacién de parentesco deben asociar su ADN en mas del 70 %. Secuenciacién de dcidos nucleicos. Esta metodologia presenta un valor importante en la clasificacién, pero no en la identificacién. Este método es el mas exacto porque se puede analizar el genoma completo de una bacteria y compararlo con el de otro microorganismo. Crdenamientodebacteras | 41