Capitulo 4 Contenido citoplasmatico bacteriano Olga Lobos GilabertCapitulo 4 CONTENIDO CITOPLASMATICO BACTERIANO Olga Lobos Gilabert 4.1, Citoplasma bacteriano El citoplasma bacteriano es una compleja mezcla de sustancias y estructuras que se encuentran disueltas en agua o en suspensidn. Es un sistema coloidal que posee una alta viscosidad, la cual resulta ser superior a la del citoplasma eucaridtico. En él se encuentran soluciones verdaderas, coloidales y material en suspension representado por diversas sales minerales. El citoplasma bacteriano se encuentra compartamentalizado por la membrana citoplasmatica y en su interior se sitéa el nucleoide junto a plasmidos, ribosomas, inclusiones y excepcionalmente organulos (Figura 4.1). A) 2 B) Avcleoide AN embries Plano AGN Figura 4.1. Aspecto de la célula bacteriana con sus estructuras y contenido citoplasmatico. A, esquema. 8, fotografia obtenida por microscopia electronica. La observacién del citoplasma bajo microscopia electronica permite evidenciar su cardcter granulado, el que es aportado por una gran cantidad de ribosomas (Figura 4.2). Contenido ctoplasmstio bacterano | 49Escherichia cot Figura 4.2. Caracter granulado del citoplasma bacteriano otorgado por la presencia de 15.000 a 20.000 ribosomas por célula. Actualmente, existe una concepcién diferente del citoplasma_ bacteriano, enfatizindose la idea de un citoplasma procaridtico més estructurado, gil y organizado. El desarrollo de nuevas técnicas e instrumentos ha permitido evidenciar una clara separacion espacial y funcional entre la zona del nucleoide y la zona periférica del citoplasma, en la cual se encuentra la mayor cantidad de ribosomas. También, en esta drea, se podria localizar una estructura llamada replisoma, la que permaneceria unida a la membrana citoplasmatica. El replisoma participaria en la replicacién del cromosoma bacteriano. La morfologia celular, es otorgada por una estructura denominada peptidoglican junto a una proteina similar a actina, denominada MreB, que al polimerizarse forma hélices que van atravesando el citoplasma desde un polo celular al otro. En este contexto, se han descubierto algunas proteinas que podrian estar implicadas en la regulacién del ciclo celular, las cuales fluctdan continuamente de un extremo a otro de la célula atravesando el sistema coloidal Las bacterias poseen una gran presién osmotica interna. Asi,en bacterias grampositivo esta alcanza las 20 atmésferas, mientras que en las gramnegativo es mucho menor, considerando que presentan solo 5 atmésferas de presién interna, la cual aun resulta ser bastante alta. Se piensa que esta diferencia se debe al mayor grosor del peptidoglican. Contenido en el citoplasma se encuentra el material genético cromosomal y extracromosomal (ADN), los ribosomas, inclusiones y organulos citoplasmaticos y en algunas especies bacterianas la presencia de una endospora. 4.2. Cromosoma bacteriano y nucleoside El ADN es el material genético de los seres vivos y particularmente en las células procatiotas este dcido nucleico forma parte del nucleoide. EI nucleoide bacteriano esta conformado por un 60 % de ADN, 30 % de ARN y 10 % de proteinas. El ADN sigue el modelo tradicional de Watson y Crick. En la mayor parte de las bacterias, se presenta 50 | Microbiologia Fundamentalcomo un cromosoma circular y cerrado covalentemente (ADN c.c.c). Excepcionalmente, algunas bacterias como Borrelia burgdorferi (productora de Enfermedad de Lyme), portan un cromosoma lineal y otras muestran mas de un cromosoma. En rigor, las bacterias son organismos haploides, ya que presentan un unico cromosoma, pero cuando estas células se encuentran en crecimiento activo, cada individuo puede albergar mas de uno. Los rangos de tamario de los cromosomas bacterianos varian entre las 700 kilobases (kb) como en Mycoplasma genitalium y las 12000 kb de algunas cianobacterias. Escherichia coli, la bacteria mas ampliamente estudiada, posee un cromosoma con 4700 kb. Si el cromosoma de E. coli se tornara lineal mediria 1mm, esto es mas de 1000 veces la longitud de la bacteria. El cromosoma de esta bacteria es compactado a través de un proceso denominado “supercoiling” o superenrollamiento. La doble hebra de ADN se encuentra superenrollada negativamente sobre si misma. La relajacién de las hebras también es un proceso necesario, ya que de otra forma la replicacién no se Ilevaria a cabo. Las enzimas que colaboran en estos procesos son las enzimas ADN-girasa y Topoisomerasa-I. La ADN-girasa introduce el superenrollamiento negativo a la hebra, mientras que Topoisomerasa-| relaja el ADN, cortando una de las hebras de la hélice y volviendoa sellar posteriormente el enlace fosfodiéster alterado. Adicionalmente, el ADN bacteriano se relaciona con proteinas estructurales, formando ambos la cromatina. El rol biolégico del ARN en el nucleoide no ha sido completamente dilucidado, sin embargo su funcién puede estar relacionada con la mantencién estable de los dominios superenrollados del ADN. Replicacién del cromosoma bacteriano Watsony Crick (1953) presentaron un modelo molecular de la estructura de ladoble hélice de ADN. Esta estructura propone que el proceso de replicacién es dependiente de la complementariedad de las bases nitrogenadas y semiconservativo. La replicacion semiconservativa implica que los cromosomas replicados poseen una hebra parental y una hebra nueva recién sintetizada. John Cairns (1963) revelé la primera evidencia visual de que el cromosoma de E. coli era de doble hebra, circular y que la replicacién del ADN comienza en un punto fijo llamado origen de replicacién (ori). Posteriormente, otros experimentos realizados demostraron que la replicacién del cromosoma de E. coli es bidireccional y que se inicia en oriC y los sitios de terminacién de la replicacion (ter) se localizan en sectores opuestos sobre el cromosoma. El cromosoma de E. coli puede ser replicado entre 40 0 20 minutos dependiendo de las condiciones nutricionales éptimas. La maquinaria celular implicada en el proceso de replicacién basicamente esta dada por las enzimas polimerasas de las cuales ya se ha mencionado a ADN-girasa y Topoisomerasa-!. De las enzimas polimerasas, la mas importante en la replicacion es la ADN polimerasa-IIl (ADN pol-lll), aun cuando también se encuentran presentes las enzimas ADN pol-l y ADN poll. ADN pol Ill consta de variadas subunidades (a, 8, B, «, 0’, y, x, y ¥) pudiendo ademas asociarse a otras proteinas llamadas proteinas accesorias de la ADN polimerasa. ADN pol-l!l posee ademas actividad exonucleasa correctora (Tabla 4.1). Contenido ctoplasmaticobacteriana | 51Tabla 4.1. Actividad enzimitica de los tres tipos de polimerasa bacteriana Estructura ADN Poll ADN Pol Il ADN Pol Itt PM (Dalton) 109.000 90.000 900.000 Constitucion Monémero Monémero Multimero N° polimerasas/célula 400 Desconocido 10-20 Actividad / Funcién Polimerasa 5~-3’/elongacién SI si st Exonucleasa 3”-5'/correctora st si st Exonucleasa 5’-3’/reparacién st NO NO 43. Los plasmidos son elementos genéticos que existen separados del cromosoma 0 integrados a él (episomas). Ellos contienen un origen de replicacién, mediante el cual se generan independientemente del cromosoma, siguiendo el modelo de replicacion en @ (theta) o del circulo rodante o replicacién a (sigma). Los plasmidos estén conformados por ADN de cadena doble y en general, son circulares, covalentemente cerrados (c.c.c.) y superenrollados. Algunos pueden ser pequefos, conteniendo solo unos cientos de pares de bases, y en pocos casos pueden fer tan grandes como un tercio © Ia mitad del tamafio del cromosoma bacteriano (megaplasmidos). Cada tipo de plasmido posee un ntimero promedio de copias por Célula. En general, los plasmidos pequefios presentan un numero mayor a 10 copias por célula (plasmidos de control relajado), mientras que aquellos de mayor tamano suelen portar una o dos copias (plasmidos con control estricto de la replicacién) (Tabla 4.2). tabla 4.2. Clases moteculares de plasmidos Pequefios No conjugantes 1-10 Mda Gran numero 1-15 proteinas de tamafio mediano Constituyen menos del 0.5% del nucleoide Grandes Normatmente conjugativos 25-300 Mda Una o pocas copias/nucleoide Podrian codificar 50-500 proteinas de tamafio mediano Normalmente constituyen un 1-10% del tamaio de nucleoide '52 | Microbiologia FundamentatEl nucleoide de E. coli tiene un tamaiio de 2500 Mda lo que puede codificar unas 3750 proteinas de tamario medio. La eliminacién de los plasmidos se denomina curacién y puede ser espontanea o provocada por agentes mutagénicos (acridina, luz ultravioleta 0 radiacién ionizante, entre otras) 0 por el cultivo de la bacteria portadora a temperaturas de crecimiento no optimas. Algunos plasmidos poseen la cualidad de transferirse de una célula a otra por medio de contactos intercelulares, proceso denominado conjugacién. Dependiendo de esta caracteristica se pueden distinguir los plismidos conjugativos y los no conjugativos. Los plasmidos conjugativos son autotransmisibles mientras que los no conjugativos carecen de esta propiedad. Existen diferentes fenotipos y funciones determinadas por plasmidos, destacandose los plésmidos de resistencia a antibidticos y metales pesados; plasmidos de virulencia; productores de bacteriocinas y sideréforos; de utilizacion de azticares e hidrocarburos; de induccién de tumores en las plantas; y aquellos que pueden generar interacciones simbiéticas y fijacién de nitrégeno, entre otros (Tabla 4.3). Tabia 4.3. Algunos tipos de plasmidos bacterianos Tipo - Tamafio Microorganismo plésmido — SemPlos copy Copias ortador Conjugativo Factor F 95-100 13 E.coli Conjugacién Pilus Sexual Resistencia RP4 54 13 Paaeruginosa —_Conjugacién Pilus Sexual Resistencia antibacteriana Col Cole 9 10-30 E.coli Produccién de colicina E1 Virulencia Ent (P307) 83 E.coli Produccién de enterotoxina Ti 200 Agrobacterium — Induccién de tumefaciens. tumores en plantas, Metabélico Tol 75 P putida Degradacién de tolueno Contenido ctoplasmaticobactetano | 534.4. Elementos genéticos transponibles Las bacterias, virus y eucariotas, contienen fragmentos de ADN que pueden desplazarse por el genoma, fendémeno denominado transposicién. Estos segmentos de Acido nucleico, contienen los genes necesarios para autotransportarse desde un sector del ADN a otro, lo cual implica una serie de reorganizaciones en los genomas. Estas estructuras son llamadas elementos transponibles o transposones y se comportan de manera similar a los profagos (fagos integrados al cromosoma). Los transposones se coriginan en un lugar del cromosoma y se desplazan dentro del mismo, no poseen ciclos vitales como los virus. Son incapaces de reproducirse a si mismos como los plasmidos y no pueden existir independientemente del cromosoma Seguin su contenido, los elementos transponibles mas basicos son las secuencias de insercién (SI), las cuales varian entre las 750 y 1600 pares de bases (pb), poseen dos genes que codifican la enzima de transposicién transposasa y secuencias inversamente repetidas de 15 a 25 pb. Otro grupo lo conforman los denominados transposones compuestos, que contienen una secuencia de insercién en cada flanco, las que pueden ser de orden directo o inverso (Figura 4.3). Ademas, constan de una region central que suele contener genes codificantes de algtin otro tipo de proteina (Figura 4.3). Por ejemplo, algunos de ellos poseen en su regién central genes que codifican proteinas conducentes ala resistencia frente a antibidticos como cloranfenicol, kanamicina y tetraciclina, entre otros. Las bacterias que poseen este tipo de informacion tienen una ventaja selectiva frente a otras carentes de estos elementos. En general, los elementos genéticos méviles, confieren a las cepas portadoras mecanismos eficaces de cambio evolutivo permitiendo que los genomas procariéticos sean relativamente flexibles. a ‘Transposén simple (SI) —ea 7 i el cai Transposass Repeticiones terminates Tnvertidas ‘Transposén compuesto (Tn) Genes estructurales Side orden directo o invertido Figura 4.3, Constitucion de los elementos genéticos méviles segiin su contenido. A, secuen insercién (SI) y B, transposén compuesto. '54 | Microbiologia Fundamental4.5. Ribosoma bacteriano Un ribosomaes una estructura dentro dela célula, responsable dela sintesis proteica Durante la biosintesis de proteinas existen desde 15000 a 20000 ribosomas por célula. Mediante microscopia electronica pueden evidenciarse por la apariencia granulada de! citoplasma o débilmente adheridos a la membrana citoplasmatica. Un ribosoma consta de dos subunidades compuestas principalmente de ARN ribosomal (ARNr) y proteinas. Los ribosomas y sus subunidades se identifican por su velocidad de sedimentacién. La tasa de sedimentacién es la velocidad a la que los ribosomas son atraidos hacia la parte inferior de un tubo de ensayo, cuando son centrifugados. Esta tasa se expresa en unidades Svedberg (S). Una velocidad de sedimentacién refleja la masa, el tamaio y la forma de un ribosoma y sus subunidades. Es por esta razon que las tasas de sedimentacion de las subunidades de un ribosoma no se suman ala velocidad de sedimentacién del ribosoma Los ribosomas procariotas son relativamente mas pequefios y menos densos que los ribosomas de otros microorganismos. Asi, los ribosomas bacterianos tienen una tasa de sedimentacién de 70S en comparacién con la velocidad de sedimentacién 80S de un ribosoma eucariota (Tabla 4.4). Paralelamente, cada ribosoma procaridtico se sedimenta en dos subunidades de distinto tamano, teniendo la subunidad menor un coeficiente de sedimentacion de 30S y la mayor 50S (Figura 4.4). La subunidad 30S esta formada por ARN. 16S y aproximadamente 21 proteinas, mientras que la subunidad mayor consta de ARN 235 y 5S, junto a 34 proteinas aproximadamente. Ribosoma 70S Subunidad Subunidad menor 30S surveleotiées Figura 4.4. Morfologia y sub estructuras del ribosoma procariota. La funcién del ribosoma es sintetizar las proteinas necesarias para que ocurra el metabolismo bacteriano. A este proceso se le denomina traduccién y consta de cuatro etapas llamadas iniciacién, elongacién, terminacién y reciclaje. Contenido ctoplasmatico bacteiano | 55Tabla 4.4. Comparacién estructural del ribosoma procariota y eucariota Propiedad Procariota Eucariota Tamafio 70S 80S Sub unidad menor 305 40S Ne de proteinas -21 ~33 Tama del ARNr (n° bases) 165 (1542) 185 (2300) Sub unidad mayor 50s 60S Ne de proteinas ~34 ~49 Tamaio del ARNr (n° bases) 235 (2904) 285 (4200) 55 (120) 5.85 (160) 55 (120) 4.6. Inclusiones citoplasmaticas de reserva Son granulos de material organico o inorganico, que pueden estar rodeados de una envoltura proteica y que se originan en el citoplasma bacteriano bajo determinadas condiciones de crecimiento. Constituyen reservas de C 0 N (inclusiones organicas) 0 de Po S (inclusions inorganicas). Las inclusiones organicas pueden ser polisacaridas (glucégeno 0 almidén), granulos de B-polihidroxibutirato, inclusiones de hidratos de carbono y granulos de cianoficina. Las inclusiones inorganicas se presentan como granulos de polifosfato o glébulos de azufre. Adicionalmente, se pueden encontrar inclusiones de sales minerales como calcio y ficobilisomas. Estos ultimos se consideran las estructuras recolectoras de luz en algas rojas y cianobacterias. Poseen forma de cilindros y contienen los pigmentos solubles en agua que hacen posible la captacion de la luz solar en ambientes menos luminosos, como aquellos en que estos organismos frecuentemente se desarrollan. 4.7. Organulos procariéticos Por regla general, en procariotas no existen organulos citoplasmaticos rodeados por una membrana. Particularmente, en las oxifotobacterias (cianobacterias), se pueden localizar estructuras llamadas tilacoides, que son las encargadas de contener la maquinaria biosintética para la fotosintesis procariética que realiza este tipo de microorganismos. Este organulo se encuentra conformado por una serie de sacos aplanados o vesiculas originadas por invaginaciones de la membrana citoplasmatica con la cual permanecen en estrecho contacto (Figura 4.5). 56 | Microbiologia Fundamental,eontsoma creel Pepridognesn Aibosomas Tuscoides Citopissme —Capamucoss ——=«Vacuoladegas —Membrana——_Faeabuisomas Figura 4.5. Cianobacteria con sus organulos caracteristicos. Se pueden observar tilacoides, rodeades por una membrana en bicapa; carboxisomas, envueltos en una estructura proteinica; y ficobilisomas cilindricos, captadores de luz solar a 550, 620 y 660 nm. Magnetosomas Otros organulos celulares bacterianos son los llamados magnetosomas, los que se encuentran en algunos tipos de bacterias acuaticas, sin embargo estas estructuras no son exclusivas de las bacterias, ya que han sido encontradas en aves, peces, tortugas € incluso en el ser humano. Las bacterias que poseen magnetosomas son denor jadas_ bacterias magnetotacticas y son propias deambientes microaeréfilos, es decir, zonas de transicion 6xica-anéxica, en las que se propicia su desarrollo. Dos ejemplos de especies bacterianas magnetotacticas son Magnetospirillum magnetotacticum y M. gryphiswaldense, algunas de sus caracteristicas pueden observarse en la Tabla 4.5. Los magnetosomas bacterianos estan compuestos por un cristal de un mineral magnéticocomo magnetita (Fe, O,)ogreigita (Fe,S,).Cadacristaldemagnetitaestarodeado por una bicapa lipidica y proteinas transmembrana solubles y especificas. Investigaciones recientes han demostrado que son invaginaciones de la membrana citoplasmatica y no vesiculas independientes, como se crefa anteriormente. Presentan forma cubo-octaédrica, hexagonal prismatica alargada y en punta de flecha, se ubican en filas paralelas al eje longitudinal de la célula (Figura 4.6). Su rol es permitir la migracién de las bacterias a lo largo de las lineas del campo geomagnético en busqueda de las condiciones que favorezcan el metabolismo celular. Esta habilidad bacteriana basada en el movimiento a través de las lineas del campo magnético ha sido denominada magnetotaxia. Los cristales de magnetita de bacterias magnetotécticas se han utilizado con fines stecnolégicos. Asi, se han empleado en la inmovilizacién de enzimas; la formacion de anticuerpos magnéticos, y la cuantificacién de IgG; la deteccién y eliminacién de células de Escherichia coli con un anticuerpo conjugado y la introduccién de genes en Contenido citoplasmstio bacteiano | 57células receptoras. En este tiltimo caso, los magnetosomas se recubren con ADN que contiene un gen especifico y luego son disparados hacia la célula blanco utilizando una pistola de particulas. Este tipo de transformacién bacteriana se realiza cuando las células transformantes presentan un muy bajo rendimiento. ——— Proteinas tansmembrana Cristal de — magnetita Membiana lipidica jon grafica de un magnetosoma cubo-octaédrico comin en bacterias Figura 4.6. Representaci fal de magnetita. magnetotacticas. Notese la membrana lipidica y proteinica que envuelve al crist Tabla 4.5. Caracteristicas de especies del género Magnetospirillum (bacterias magnetoracticas) Bacteria Morfologia. Habitat Mineral © Forma del Fisiologia magnético cristal Magretospirilum Espirilo. Aguadulce —-Magnetita ——_cubo-octaédrcoQuimioorganoheterstrofo, ‘magnetotacicumt mmicroaerafilo estricto Magnetospiitum Espirito Aquadulee —-Magnetita-—_cubo-octaédricoDesconocida aryphiswaldense ‘Asi como se ha demostrado la existencia de algunos organulos procaridticos rodeados de una membrana, también se ha dilucidado la existencia de otras estructuras envueltas en una capa proteinica, las cuales también constituiran organulos celulares procariéticos. En relacion con lo anterior, se puede destacar la existencia de algunos géneros bacterianos que presentan estructuras Como carboxisomas, vacuolas de gas y clorosomas, las cuales desempenan una funcién celular especifica. 58 | Microbiologia FundamentalCarboxisomas Son cuerpos poliédricos rodeados por una monocapa de proteina, en cuyo interior se encuentran importantes cantidades de la enzima ribulosa-bifosfato-carboxilasa (RuBisCo), participe de la asimilacién de CO, en el ciclo de Calvin. Son propios de bacterias fotoautdtrofas como las oxifotobacterias y algunas bacterias purpureas (Figura 4.7). Carboxisoma Enzimas y proteinas de cubierta e Hoxamen Confguracion de los hexameros y pontameras en el carboxisoma Pentameros Figura 4,7. La figura representa la estructura y morfologia de un carboxisoma. Se puede apreciar su forma poliédrica compuesta por hexameros y pentémeros de proteina. Al interior se observa la presencia de grandes cantidades de enzima RuBisCo, por lo que se cree que estos organulos cumplen una funcién de almacenaje de fa enzima Vacuolas de gas Las vacuolas de gas son organulos habitualmente presentes en bacterias fotosintéticas purptireas 0 verdes y en cianobacterias. Ademas, pueden encontrarse en algunos miembros del dominio Archaea. Su funcién es mantener la capacidad de flotabilidad optima en ambientes acudticos. Son responsables de que la bacteria pueda lograr la profundidad requerida para realizar su ciclo biolégico normal, ya que en este ambiente el microorganismo podra contar con la intensidad de luz apropiada y una concentracién éptima de oxigeno o nutrientes. Estan conformadas por dos tipos de proteina, una de ellas otorga la hidrofobicidad y rigidez a la vacuola, mientras la otra fortalece la estructura ante las grandes presiones ambientales en las que se encuentra el microorganismo. Contenido ctoplasmiticobacteiano | 59Clorosomas Los clorosomas son estructuras presentes en las bacterias fotosintéticas, cuya funcién es capturar la energia luminica y suministrarla con rapidez a los sistemas dependientes de ella. Se han reconocido como las antenas recolectoras de luz mas grandes y eficientes de la naturaleza. Los clorosomas son vesiculas rodeadas por una monocapa galactolipida con diez proteinas diferentes unidas a ella. Presentan forma eliptica u oblonga y pueden medir entre 100-150 nm de largo y 50 nm de ancho. En su interior, contienen hasta 250,000 moléculas de clorofila bacteriana (bacterioclorofila) y pequefias cantidades de carotenoides y quinonas. Espacialmente, se ubican por debajo de la membrana citoplasmatica y pueden encontrarse conectados a ella por un apéndice de naturaleza no lipidica (Figura 4.8). Actualmente, los clorosomas han alcanzado cierto nivel de importancia, puesto que a partir de ellos se podria desarrollar sistemas fotosintéticos artificiales que conviertan la energia solar en electricidad. Placa basal Complejo citocrame & ‘entro de reaccion Figura 4.8. Sistema fotosintético de las bacterias verdes representado por una antena colectora de luz llamada clorosoma y de un centro de reaccién productor de ATP. La energia dela luz que los. pigmentos absorben es transferida al centro de reaccidn a través de un complejo de pigmentos y proteinas que forman la placa basal del clorosoma. En la Tabla 4.6 se presenta un resumen de las caracteristicas de los organulos procariéticos conocidos en la actualidad. 660 | Microbologa FundamentalTabla 4.5. Organ Organulo Tilacoides Magnetosomas Carboxisomas Vacuolas de gas Clorosomas Tipos de microorganismos Cianobacterias, oxifotobacterias Bacterias magnetotacticas Bacterias autotréficas, oxifotobacterias Bacterias acusticas, especialmente bacterias fotosintéticas verdes o purptreas y cianobacterias, algunos miembros del dominio Archaea Bacterias verdes Invaginaciones de la membrana citoplasmatica formando sacos aplanados o vesiculas Cristal de un mineral magnético como magnetita (Fe,0,) 0 greigita (Fe,S,) Envoltura proteinica poliédrica compuesta por hexémeros y pentémeros, en cuyo interior se encuentra la enzima RuBisCo Dos tipos de proteina: una otorga la hidrofobicidad yrigidez ala vacuola, mientras la otra fortalece la estructura ante fas grandes presiones ambientales Monocapa galactolipida con diez proteinas diferentes unidas a ellay en su interior bacterioclorofila s procaridticos, tipos de microorganismos en fos que se encuentran, composicise y funcién celular Funcién celular Contener la maquinaria biosintética para la fotosintesis procaristica Permitir la migracién de las bacterias alo largo de las lineas del campo geomagnético para favorecer la nutricién celular Almacenaje de la enzima RuBisCo, necesaria para la fijacién autotréfica de co, Sitio de fjacién de CO, Son responsables de que la bacteria pueda lograr la profundidad requerida para realizar su ciclo biolégico normal Capturar la energia luminica y suministrarla con rapidez a los sistemas dependientes de ella, Actdan como antena colectora de luz Es importante destacar que el desarrollo de nuevas tecnologias ha permitido cambiar la concepcién original existente y categérica que presentaba a los seres procariéticos como carentes de organulos (organelos), dando la exclusividad de su posesiona los organismos eucariéticos. Hoy se avanza cada vez mas en el reconocimiento de las bacterias como seres complejos y comunicados, quedando lejos la idea de que son los seres vivos mds simples de la naturaleza. Contenido coplasmaveobacteriana | 614.8. Endospora bacteriana Algunos géneros bacterianos como Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces, poseen una importante estrategia adaptativa cuando se encuentran sometidos a un ambiente con privacién de nutrientes. Asi, los niveles de C, N o P, son limitados y caen, se envia una sefal a la célula bacteriana que indica que se avecina un largo periodo de carencia de nutrientes. En este momento, en la célula comienzan una serie de cambios genéticos, metabdlicos y estructurales, conducentes a la diferenciacion de una célula durmiente en el interior de la célula vegetativa original (célula madre), Hamada endospora. El proceso que promueve estos cambios internos y da origen a la endospora bacteriana es la esporulacién (esporogénesis). Las endosporas son formas de reposo que se caracterizan por su estructura particularmente diferenciada respecto de las células vegetativas, por un estado metabélico basal (casi nulo) y por su elevada resistencia a las condiciones ambientales desfavorables (Tabla 4.7) Tabla 4.7. Diferencias entre células vegetativas y endosporas bacterianas Caracteristicas Célula vegetativa Edospora bacteriana Estructura Grampositivo tipico, Cortex grueso, (pocas gramnegativo) Cubierta, exosporio ‘Apariencia microscépica No refractl Refractil Contenido de calcio Bajo Alto Acido dipicolinico Ausente Presente Actividad enzimatica Elevada Baja Metabolismo Elevado Bajo o ausente Sintesis macromolecular _—Presente Ausente ARN,, Presente Bajo o ausente Resistencia al calor Baja Elevada Resistencia a radiacion Baja Elevada Resistencia a quimicos Baja Elevada Tincién Colorantes basicos Tincién especial Accién de lisozima Sensible Resistente Contenido de agua Elevado Bajo Pequefias proteinas Ausentes Presentes solubles en acido (SASPs) PH citoplasma 70 55+ 6.0 . 62 | Microbiologia FundamentalLas endosporas bacterianas pueden ser observadas al microscopio dptico y se manifiestan como estructuras esféricas, ovoides o cilindricas y refringentes. Pueden encontrarse libres o contenidas dentro de la célula madre. El esporangio est constituido por la célula madre mas la endospora. Algunas endosporas pueden o no deformar el cuerpo de la célula madre y su localizacién dentro del esporangio puede ser terminal, central, subterminal o lateral (Figura 4.9). lospora central 2,3 6:Endospora terminal 4: Endospore lateral Figura 4.9. Esquema de la ubicacién de las endosporas bacterianas al interior dela célula madre, En la figura 2 se observa el cuerpo parasporal (azul) que es posible evidenciarlo en cepas de Bacillus thuringiensis. Las endosporas bacterianas estén formadas por el protoplasto 0 nticleo (core, rodeado por la membrana citoplasmatica), una pared, la corteza o cértex, cubiertas y exosporio (las esporas de algunas especies carecen de él) (Figura 4.10). Pared Mambrana citoplasmatice Uxtennie aly retrarana ele e's corpleios y Vicos. ese enzirespretecltieary Protoplaste nucleo ee Cubierta Fevmada 20° ratins nleina yanwresetlos hrloues. Alta frecuencia de pusntes ula, Cortez eptadoalicsn Ineo pera procs (Gruinarapasusclaisen Figura 4.10. Estructura de la endospora bacteriana. Contenido ctoplasmaicobacteiano | 63En el protoplasto (core), el citoplasma se muestra muy deshidratado y sus componentes se encuentran inmersos en una matriz de quelatos de jones Ca++ y Scido dipicolinico. Ambos componentes forman el dipicolinato calcico, el cual Zumplira un importante rol en la deshidratacién del protoplasto y durante el proceso de germinacién en el que la espora da paso a una nueva célula vegetativa. El core contiene gi cromosoma completo y condensado de la célula durmiente, ademés de todos los Componentes necesarios para iniciar la germinacién, junto a una pequefia cantidad de ribosomas y los elementos primordiales de la sintesis de proteinas La pared de la espora estd compuesta por un peptidoglican (PG) similar al de la célula vegetativa, mientras que la corteza est constituida por un PG especial, el cual difiere en el nivel de entrecruzamientos, en la constitucién del tetrapéptido y en que Sdemas, contiene un dcido murdmico modificado llamado lactama muramico. Dadas estas condiciones, la corteza se presenta como una estructura mas laxa y flexible que el PG normal, lo cual promovera su répida autolisis durante la germinacion de la espora. Lacubiertaesta formadaporunaovarias proteinas tipo queratinaconaminoacidos hidréfobos y cisteinas. Es insoluble e impermeable lo cual impide la entrada de muchos agentes quimicos antimicrobianos. Ademés, es compacta y quimicamente estable dada la abundancia de enlaces disulfuro (S-S). El exosporio es una estructura que se encuentra presente en algunas esporas bacterianas, Esta formado por una estructura membranosa y transparente que envuelve a la espora, Sus constituyentes son proteinas, polisacaridos complejos y algunos lipides. Su roles de proteccién, otorgando resistencia ante enzimas proteoliticas. La esporulacién bacteriana es un proceso biolégico que tarda varias horas en producirse. Cuenta con 8 estadios que han sido bien definidos a partir de algunos hitos sobresalientes en cada uno de ellos: (Figura 4.11) Estadio 1: La célula que se encuentra al final de la fase exponencial de crecimiento, forma un nuevo cromosoma bacteriano. Estadio 2: El ADN celular se hace mas denso y ocupa el centro de la célula formandose el filamento axial. Comienza un importante recambio intracelular de proteinas. Estadio 3: Se produce un plegamiento interno de la membrana celular (invaginacion) para englobar uno de los cromosomas y producir el septo de la preespora. En esta etapa el proceso se hace irreversible. Estadio 4: La membrana citoplasmatica continua creciendo y engloba la espora inmadura (preespora) con una segunda membrana. El citoplasma de la preespora queda delimitado por dos membranas debido al crecimiento de la membrana citoplasmatica alrededor del protoplasto. Al ADN de la célula madre es degradado. 64 | Microblologla Fundamental,Estadio 5: Sobre la membrana interna de la preespora se genera el peptidoglican y comienzaa formarse la corteza. Se inicia la sintesis de 4cido dipicolinico y la acumulacion de calcio. Estadio 6: Se comienza a formar la cubierta y aparece el exosporio. La membrana exterior se transforma en la capa cortical por la incorporacién de proteinas ricas en cisteina. La endospora adquiere la resistencia frente a los agentes agentes fisicos y quimicos. Estadi Se produce la maduracién de la endospora. Su citoplasma se vuelve homogéneo y electrodenso. La capa cortical y la cubierta se completan. Aumenta la resistencia al calor y a los agentes quimicos. Estadio 8: Las enzimas liticas liberan la endospora desde la célula madre. Paved ealelar 1-ADN es reaieade —— ttembrana stop asmanca e 2 AON se olines ae nse de 52:13, Re hwaginacin dela nembanecrog!acmatica pana fnerae 1 mF Ge act danvoranacopasmsnes cee y sala a a eespona — Jdonarde ane snqunds smovann EI AGI Sela cua seth Sieretegnce 9. Ung conces xe een apicalnats sesleeos cence : . +5 Lacabions cela esponse tormaa rededorde a endospore 4 7- wieuurecior dein endosinors,termiaauinn de leu ert ve Ssporae tciomento dln eastern arcalor# ur ess edionte = peers membrana recces pace contador . ‘Segunda membrana 8 Laerdospora és liberads da a cella mache $ conees Culert esporat Cabra octercaCapors bat “spor! 6 7 8 Figura 4.11. Ciclo celular de la esporogénesis. Se representan los 8 estadios de la célula con sus eventos més relevantes. Contenido coplasmsticabacteriana | 65Regulacién génica de la esporulacién bacteriana Bacillus subtilis es la bacteria que por excelencia ha sido estudiada como modelo de esporulacién. El inicio de este proceso debe estar estrictamente regulado puesto que es irreversible y tarda al menos 7 horas en producirse. Las sefiales que inducen la esporogénesis provienen de un regulador maestro de la transcripcién (regulén) denominado SpoOA, el que inicialmente es fosforilado. Los distintos grados de fosforilacién de Spo0A implican los diferentes roles que esta proteina pueda presentar. Spo0A regula directamente la transcripcién de 121 genes, siendo aproximadamente un tercio de ellos activados y los restantes reprimidos. SpoOA activado gatilla un tipo de division asimétrica en la célula, ademds de la transcripcin del loci spollA, spollE y spollG, encargado de codificar importantes reguladores del desarrollo del ciclo de la esporogénesis. La division asimétrica hace que tanto en la célula madre como en la preespora se produzca la activacién de la expresion génica mediada por ARN polimerasas especificas de la esporulacién denominadas Factores Sigma (6) La activacién de Spo0A pasa por varias etapas, iniciéndose esta al final de la fase de crecimiento exponencial de la célula. La célula sera dirigida hacia un estado de transicién que requiere ademas del factor 5%, Este nuevo estado se asocia a situaciones inhabituales, en el género Bacillus, como son la produccién de proteasas, movilidad, adquisicion de un estado de competencia para la transformacién, formacion de biopeliculas, ademés de la induccién al canibalismo. Luego de la formacion de la preespora, la actividad Spo0A aumenta en la célula madre, mientras que disminuye en la preespora. Las células que presentan Spo0A activado, es decir, fosforilado, producen un factor de muerte extracelular que elimina a aquellas células en que Spo0A no es activo. Este mecanismo permitiria que las células en esporulacién se alimenten de las células muertas y que el desarrollo de la siguiente generacién de la poblacién sea retrasado. La fosforilacién es un evento crucial para desencadenar la esporulacién. Son cinco las enzimas histidina-quinasas sensoras que intervienen fosforilando en primera instancia a SpoOF. Estas enzimas son KinA, KinB, KinC, KinD y KinE. La quinasa Kina tiene el rol mas importante en el inicio de la formacion de esporas. KinA es regulada por la proteina Sda. Al unirse ambas forman un heterotetramero donde Sda cumple una funcién de barrera para la autofosforilacin de KinA. La expresion de Sda es inducida cuando la replicacién o la integridad del ADN se ve comprometida, asi Sda previene la activacion de Spo0A por fosforilacién. Sin embargo, KinA es solamente una de las ‘enzimas que intervienen en la fosforilacin. Otras proteinas como Rap A, By E, acttian desfosforilando Spo0F-P. Esta accién puede ser inhibida por pentapéptidos afines, que pueden funcionar como sefiales de la densidad celular. Los pentapéptidos que regulan las proteinas Rap A, By E provienen de la transformacién de los productos exportados por los genes phrA, phrC y phrE, respectivamente. La transcripcién de phrA y phre puede ser reprimida por CodY que actta como sensor de los niveles de nucledtidos de guanina. Una fuerte caida en la concentracién de GTP y GDP es fundamental para la iniciacién de la esporulaci6n (Figura 4.12). 666 | Microbiologia FundamentalLa expresion génica durante el proceso de esporulaci6n es compartamentalizada. Uno de los primeros eventos que ocurre durante la morfogénesis de la espora es la activacion de Spo0A y 5". Luego de la division asimétrica y antes de que el cromosoma se haya dividido completamente, al interior de la preespora se activa 6", mientras tanto en la célula madre se activa 8. Un grupo de proteinas presentes en la célula madre degradan el septo asimétrico y promueven la migracién de la membrana alrededor de la preespora, proceso denominado inmersién. En este punto, la membrana de la preespora se ha unido al polo de la célula para ser luego liberada como un protoplasto al interior de la célula madre. En este momento, un segundo grupo de factores 6 son activados. Asi, 5¢ se activa en la preespora y 6* en la célula madre. Estos dos ultimos factores activan la transcripcion de genes encargados de los componentes estructurales que otorgan la resistencia a la espora (Figura 4.13). Sefializacién replicacién del ADN ADN danado \ ~ N Energia potencial Estado redox 4 ee —— King KinA Kin Kind Kin NI hea CE a —+ Spoor | Densidad celular spoo8 spooA Esporulacion Figura 4.12. Activacién de la esporulaci6n. Las cinco histidinas-quinasas (KinA-E) fosforilan SpoOF. Spo0F fosforilado (SpoOF-PO,) transfiere el fosfato a SpoOB y este a su vez a SpoOA, el que activaré la transcripcién de genes vitales para la esporulacidn. La densidad celular es medida por los péptidos Phr que ademas cumplen la funcién de inhibir las proteinas Rap que causan la desfosforilacién de SpoOF-PO, La transcripcién de kinB y de variados genes phr es reprimida por Cod en presencia de GTP. Spo0A puede ser desfosforilado por Spo0E, Visl y ¥nzD. Contenidacitoplasmaticobacteriano | 67ura 4.13. Formacién y regulacion genética de la espora. Finalmente, Spo0A, 5", 8, 5, 6°y 6" son los factores més importantes que regulan la expresion génica de la esporulacién. El modelo de formacién de esporas en B. subtilis, proporciona conocimiento respecto de como la célula bacteriana es capaz de coordinar efectiva y dindmicamente su metabolismo, la separacién del cromosoma, la expresin génica y la morfogénesis de la espora durante el ciclo de la esporulacion. sin embargo, actualmente queda mucho por descubrir en torno a este intrincado proceso de generacion de un nuevo tipo de célula al interior de una célula madre ya existente. Germinacién de la espora bacteriana La conversion de la espora bacteriana en una nueva célula vegetativa se denomina germinacién. La germinacién requiere de una activaci6n inicial desencadenada por Una fractura en la cubierta esporal, o de modo experimental por la aplicacion de un shock térmico subletal (80 °C por 10 minutos). La activacién propiciars la entrada de nutrientes y agua hacia el protoplasto. Este complejo evento se relaciona con la presencia de nutrientes denominados germinantes y de otros agentes no nutritivos como las condiciones ambientales. Los getminantes pueden ser aminodcidos, azticares 0 nucledsidos de purinas. En algunas especies bacterianas como Bacillus subtilis, la mezcla de asparagina, glucosa y K+ puede actuar como germinante. Una vez que las esporas se han puesto en contacto con los germinantes, la germinacién sera inducida solo en breves segundos, € inevitablemente ‘ocurrird, aun cuando los germinantes sean eliminados. La germinacion de la espora es un proceso que cuenta con 2 etapas, més la fase de crecimiento. (Figura 4.14) Etapal 1. Liberacién de H', cationes monovalentes y Zn’* desde el protoplasto (nticleo) de la espora. La liberaciénde H’, elevard el pH del nucleo e inducird su hidrataci6n lo que conducira hacia la actividad enzimatica en este compartimento. 2. Expulsion de grandes cantidades del dcido dipicolinico (ADP) que se encuentra almacenado en el nticleo, junto a cationes divalentes asociados (Ca*"). Sustitucién de ADP por agua, lo que causa una disminuci6n de la resistencia al calor htimedo. Este aumento inicial en la hidratacién del nticleo no es suficiente para la movilidad de proteinas o enzimas. 68 | Microbiologia FundamentalEtapa 1. Hidrdlisis de la corteza de la espora. 2. Aumento de volumen del nticleo debido a una mayor absorcién de agua y la expansion de la pared celular. 3. Pérdida de la resistencia y del estado de dormancia Crecimiento 1. Aumento del metabolismo y degradacién de las pequefias proteinas solubles en dcido. 2. Sintesis de macromoléculas. 3. Liberacién de la célula vegetativa. Cubieta Paved Pamanenias cos Figura 4.14. Germinacion de fa espora bacteriana. En la imagen se destacan los hitos mas importantes del proceso. ADP: Acido dipicolinico; PPSA: Pequefias Proteinas Solubles en Acido. Contenid ctoplasmaticobactenano | 69