HOA ƯỢC - ĐẠI HỌC Y ƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN VI Ý SINH
NGUYÊN TẮC
n thuận n hịch củ một nhóm chức năn trên pr tein
ới một nhóm chức năn củ ph tĩnh c ký. Như ậy chỉ có pr tein
TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC Ý ÁI LỰC đích m n nhóm chức năn đặc hiệu mới n ph tĩnh, còn các
pr tein khác thi đi r khỏi cột. Pr tein đích u đó được thôi r bằn
một chất cạnh tr nh ới nó.
Đây l kỹ thuật c ký đơn iản hiệu quả nhất để tinh chế pr tein.
Tuy nhiên, nó có nhược điểm l đòi hỏi pr tein đích phải có một
nhóm chức năn n đó, m khôn phải lúc n cũn có được.
N y n y ới kỹ thuật tái tổ hợp, n ười t có thể thêm đ ạn en
đích một đ ạn cid nucleic mã hó ch đ ạn peptid m n chức
năn n y để u đó có thể tách chiết pr tein đích, đ ạn peptid u
đó có thể được l ại bỏ bằn một pept e.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 2

NGUYÊN TẮC BỐ TRÍ THỰC HÀNH

IMAC (i n met l ffinity chr m t r phy- c ký ái l c i n Mỗi nhóm th c hiện các thí n hiệm the thứ t u:
kim l ại): Nh c ký (re in) được n các i n kim l ại
Nhóm lẻ 1,3,5,7 tiến h nh tinh chế enzym bằn c ký ái
(hó trị II như Cu, Ni, …). Các i n n y có ái l c ới đ ạn
l c.
peptid có nhiều hi tidine (p lyHi tidine), đặc biệt l 6-10
hi tidine. Chất dùn để thôi pr tein l imid z le nồn độ Tiến h nh chuẩn bị cột bước 5-7, mục 9.4.2.
> 100 mM.
Tiến h nh tinh chế hi -t pr tein bước 1-5, mục 9.4.4.
GST: Nh có ái l c ới enzyme Glut thi ne-S-
Xác định h m lượn pr tein củ các phân đ ạn mục
Tr n fer e. Pr tein đích được thôi bằn lut thi ne
9.4.5.
dạn khử có nồn độ >20 mM.
Nộp lại cột ch Bộ môn u khi h n th nh b i th c
h nh.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 3 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 4
Nguyên vật liệu C uẩn bị ột
Đệm ạy H 8X (Binding Buffer) Mở cột ch chạy hết dun dịch bả quản cột, tránh để
40 mM Imid z le 4 M N Cl 160 mM Tri -HCl pH 7.9 cột bị khô.
Đệm t ôi H 4X (Eluti n Buffer) Rử cột lần lượt ới các đệm u: (1 thể tích cột l 0,5
400 mM imid z le 2 M N Cl 80 mM Tri -HCl pH 7.9 ml)
Đệm i n 8X (C rge Buffer) 3 thể tích nước cất ô trùn
400 mM NiSO4
5 thể tích Đệm i n 1X
Đệm rử H 8X (W s Buffer)
3 thể tích Đệm chạy H 1 X
400 mM Imid z le 4 M N Cl 160 mM Tri -HCl pH 7.9
Đệm xả H 4X (Strip Buffer) Khó cột.
400 mM E TA 2 M N Cl 80 mM Tri -HCl pH 7.9
Đệm bả quản ột: 24% eth n l.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 5 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 6

P á tế bà Tin ế is-t g pr tein

Ly tâm 15 ml môi trườn nuôi cấy E. c li, đổ bỏ phần Nạp kh ản 1 ml ịch A. Mở ch cột chạy, hứn dịch chảy r
nước. = ịch B.

Phân tán tế b tr n 2 ml Đệm chạy H 1X. Để trên đá. Rử cột ới 5 thể tích Đệm chạy H 1X, hứn dịch chảy r , hi
nhãn ịch B1.
Tán iêu âm mẫu đến khi thu được dịch đồn nhất
Rử cột ới từn thể tích Đệm rử H 1X, hứn dịch chảy r ,
khôn bị nhớt.
hi nhãn ịch C1-Cn. Kiểm tr hiện diện củ pr tein tr n
Chuyển dịch u tán iêu âm eppend rf 1,5ml. từn dịch Ci u mỗi thể tích rử tiếp tục rử đến khi ạch
pr tein. Gộp các dịch C1-Cn th nh ịch C. Xác định thể tích
Ly tâm 14.000 rpm/5 min, thu phần nước nổi. Được dịch A. ịch C.
Thôi pr tein bằn cách thêm từn thể tích Đệm thôi H 1X (0,5
ml) hứn dịch chảy r , hi nhãn 1- n. Kiểm tr các phân
đ ạn thôi để đảm bả pr tein được thôi hết.
Tái cân bằn cột bằn 5 thể tích Đệm chạy H.
Bả quản cột tr n 24% eth n l.
T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 7 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 8
Tin ế is-t g pr tein Cá p ân đ ạn pr tein
Nạp dịch A lên Rử cột ới Thôi pr tein ịch A: tất cả pr tein nội b củ
Rử cột cột, rử cột ới đệm rử ới đệm thôi
đệm chạy Pr tein tạp, pr tein tạp có đuôi Hi -t củ
Pr tein đích (hi -t pr tein)
ịch B, B1: pr tein tạp khôn n lên cột
ịch C: pr tein tạp có đuôi Hi -t củ
ịch : Pr tein đích (hi -t pr tein)

Cân bằn cột Thu B, B1 Thu C, kiểm tr Thu pr tein tr n

hết pr tein tr n C ( 1- n)
T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 9 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 10

Xá địn àm l ng pr tein
Xác định h m lượn pr tein tr n ịch A, dịch B, dịch
B1, dịch C dịch 1- n the phươn pháp Br df rd
ch iá trị O đ được nằm tr n kh ản đườn
chuẩn:
50 l mẫu + 1000 l Br df rd 1X.
ịch A, B ph l ãn 10 lần ới đệm chạy trước khi xác
định h m lượn pr tein.
ịch B1, C, khôn ph l ãn .

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 11