HOA ƯỢC - ĐẠI HỌC Y ƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN VI Ý SINH
NGUYÊN TẮC
Mỗi dun dịch pr tein tùy the pH ẽ được tích điện khác nh u

TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG Mỗi pr tein có một iá trị pH m tại đó tổn điện tích âm dươn
củ nó bằn nh u, h y nói cách khác l có điện tích bằn 0, pH n y
SẮC Ý TRAO ĐỔI ION được ọi l pI (điểm đẳn điện). Khi pH củ dun dịch lớn hơn pI
pr tein ẽ tích điện âm n ược lại
+
─
─ ─
+
+
+
+ ─
+
─ +
─
Gắn vào nhựa hoảng ổn định
trao đổi cation

Gắn vào nhựa

+ trao đổi anion
–
+ – +
–
– –
–
+ +
+
–

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 13

NGUYÊN TẮC NGUYÊN TẮC

Nh c ký tr đổi i n ồm một chất nền r n khôn
t n được n các nhóm m n điện tích bằn liên kết
cộn hó trị, các nhóm m n điện tích n y ẽ liên kết ới Li nd IEX
các đối i n có điện tích trái dấu một cách thuận n hịch
Các i n liên kết lên bề mặt nh các
nhờ tươn tác tĩnh điện. i n khôn liên kết tr n dd đệm
S c ký tr đổi i n d tr đổi thuận n hịch củ
các điện tích trên pr tein ới các điện tích trái dấu củ Các pr tein liên kết

ph tĩnh c ký, tùy the cân bằn i n pH tr n dun

dịch m pr tein ẽ được n nh h y bị đẩy r khỏi Các pr tein khôn liên kết

nh .

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 14 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 15
N ự sắ ký tr đổi i n BỐ TRÍ THỰC HÀNH
Nhóm chẵn 2,4,6,8 tiến h nh tinh chế ly zym bằn c
Nh tr đổi ni n Nhóm m n điện tích Cườn độ ký tr đổi i n.
iethyl min ethyl ( EAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2 Yếu
Tiến h nh chuẩn bị cột: bước 5-7, mục 10.4.2.
Qu tern ry min ethyl -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH 3 Mạnh
(QAE) Tiến h nh tinh chế ly zym từ lòn tr n trứn : bước 1-
Qu tern ry mm nium (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2- Mạnh 4, mục 10.4.3.
N+(CH3)3
Xác định h m lượn pr tein củ các phân đ ạn mục
Nh tr đổi c ti n Nhóm m n điện tích Cườn độ
Yếu
10.4.4.
C rb xymethyl (CM) -O-CH2-COO-
Sulph pr pyl (SP)
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH 2- Mạnh Nộp lại cột ch Bộ môn u khi h n th nh b i th c
CH2SO3 -
-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH- Mạnh
h nh.
Methyl ulph n te (S) CH2SO3 -

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 16 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 17

Nguyên tắ tin ế lys zym từ lòng trắng trứng Vật liệu

N uyên t c tinh chế: d khác biệt ề pI củ Đệm chạy (Bindin Buffer)
ly zym (pI = 10) ới các pr tein khác tr n lòn 50 mM Tri -HCl pH 8
tr n trứn (pI 6), cột tr đổi c ti n Đệm thôi (Eluti n Buffer)
pH 8: ly zym tích điện dươn bị iữ lại tr n cột 2 M N Cl
Pr tein khác có pI < pH: tích điện âm khôn tr đổi 50 mM Tri -HCl pH 8
được ới cột d đó đi r n i. Đệm bả quản cột: 24% eth n l.
Ly zym tr n cột u đó có thể được thôi r : Nh tr đổi i n SP Seph r e FF
Nân pH lên 10 ịch lòn tr n trứn
Tăn nồn độ i n tr n dun dịch lên để cạnh tr nh đẩy
ly zym r .

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 18 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 19
C uẩn bị ột Tin ế lys zym
Mở cột ch chạy hết dun dịch bả quản cột, tránh để Nạp 1 ml dịch lòn tr n trứn (dịch A) lên cột, n ẹ n àng, trán
cột bị khô. làm tung sep r se lên. Ch cột chạy. Hứng t àn bộ dị ảy
r = ị B.
Rử cột lần lượt ới các đệm u: (Vcột=0,5 ml) Rử cột ới 5 thể tích . Hứn t n bộ dịch chảy r , hi
3 thể tích nước cất ô trùn nhãn ị C1. Tiếp tụ rử cột ới từng t ể tí Đệm chạy L 1X,
hứn dịch chảy r , hi nhãn ị C2-Cn. Kiểm tr hiện diện củ
5 thể tích Đệm chạy 1X pr tein tr n từn dịch từ C2 trở đi u mỗi thể tích rử tiếp tục
rử đến khi ạch pr tein. Gộp các dị C1-Cn th nh ị C. Xác
Khó cột.
định thể tích ịch C.
Thôi ly zym r khỏi cột bằn cách ch từn thể tích i.
Hứng dị ảy r và á ống eppend rf, đán số 1 đến n.
Kiểm tr các phân đ ạn thôi để đảm bả pr tein được thôi hết.
Tái cân bằn cột bằn 5 thể tích .
Bả quản cột tr n 24% eth n l.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 20 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 21

Tin ế lys zym Cá p ân đ ạn pr tein

Chuẩn bị Nạp dịch A Rử cột ới Thôi pr tein ịch A: tất cả pr tein củ lòn tr n trứn
cột lên cột đệm chạy ới đệm thôi
Pr tein tạp
Ly zym
ịch B: pr tein tạp khôn n lên cột
ịch C: pr tein tạp khôn n lên cột
ịch : Pr tein đích (Ly zyme)

Cân bằn cột Thu B Thu C, kiểm tr Thu pr tein tr n

hết pr tein tr n C ( 1- n)
T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 22 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 23
Xá địn àm l ng pr tein Bảng g i kết quả
Xác định h m lượn pr tein tr n ịch A, dịch B, dịch,
dịch C dịch 1- n the phươn pháp Br df rd Mẫu A B C Mẫu gộp
ch iá trị O đ được nằm tr n kh ản đườn chuẩn: A
50 l mẫu + 1000 l Br df rd 1X. T ể
tí
ịch A, B ph l ãn 10 lần ới đệm chạy trước khi xác L ng
định h m lượn pr tein. Hiệu
HS= (Mẫu gộp )/Mẫu A (%)
suất
ịch C ph l ãn 5 lần ới đệm chạy trước khi xác định
h m lượn pr tein.
khôn ph l ãn .

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 24 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 25

HÁI QUÁT
ĐIỆN I GEL POLYACRYLAMI E (PAGE) P ly cryl mide l một p lymer ới các m n mer l cryl mide. Khi
cryl mide trùn hợp dưới xúc tác củ các chất tạ ốc t d
như APS TME ẽ tạ r ợi p lymer d i kết tủ khỏi dun
dịch, tuy nhiên, nếu tr n hỗn hợp m n mer b n đầu có mặt củ
Bi cryl mide thì khi trùn hợp ẽ tạ r phân nhánh củ ợi
p lymer d đó tạ th nh một hệ el có cấu trúc lưới 3 chiều có
thể ử dụn để phân tích điện di như el r e.
P ly cryl mide được chạy ở cấu hình đứn , khác ới r e el
chạy the cấu hình n n h y nhún chìm.
PAGE có thể dùn để phân tích pr tein h y A N có thể được
chạy ở chế độ biến tính (chất cần phân tích bị l m mất cấu trúc bậc
3 4) h ặc chế độ khôn biến tính. Hệ đệm ử dụn có thể l liên
tục h ặc khôn liên tục.
Tr n phần th c h nh n y ẽ th c hiện the kỹ thuật PAGE biến
tính (S S-PAGE) tr n hệ đệm khôn liên tục củ L emmli.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 27
Nội dung ông việ C uẩn bị k uôn đổ gel
Đổ el p ly cryl mide Đặt tấm kính n n lên tấm
kính có dãi đệm ( p cer) để
Phân tích pr tein củ b i c ký ái l c tr đổi i n
tạ th nh k u n gel.
bằn điện di trên PAGE
Phân tích kết quả điện di

Chèn k u n gel k u n
kẹp, iữ tấm kính n n qu y
r n i. Điều chỉnh để phần
đáy củ h i tấm kính nằm
trên cùn một mặt phẳn
(dùn mặt b n h y iá đỡ
khuôn l m chuẩn).

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 28 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 29

C uẩn bị k uôn đổ gel C uẩn bị k uôn đổ gel

Khó kẹp trên k u n kẹp để Khó kẹp trên k u n kẹp để
cố định h i tấm kính cố định h i tấm kính

G i k u n kẹp giá đỡ G i k u n kẹp giá đỡ

k u n. Đảm bả phần đáy k u n. Đảm bả phần đáy
củ h i tấm kính nằm trên củ h i tấm kính nằm trên
miến c u xám khuôn miến c u xám khuôn
kẹp phải ở ị trí thẳn đứn . kẹp phải ở ị trí thẳn đứn .

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 30 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 31
Đổ gel Đổ gel
Tr n S S-PAGE ới hệ đệm khôn liên tục, el được chi th nh 2 lớp: Gel m
el tách el m, mỗi el có hệ đệm khác nh u.
Thể tích mỗi el l 2 ml ch mini- el, nồn độ el l 4,5%.
Gel tách:
N y u khi ch TME , đậy n p ốn F lc n, lật úp-n ử 3 lần để
Chuẩn bị hỗn hợp el p ly cryl mide 12% tr n ch i thủy tinh 20 ml
trộn đều.
N y u khi ch TME , dùn pipet hút Nh nh chón hút lấy kh ản 2 ml hỗn hợp bơm khe iữ h i
lên, hút xuốn 3 lần để trộn đều (lưu ý tấm kính ch đến khi hơi tr r khỏi miện .
tránh tạ bọt khi hút-xả). 12%
Re ent C m lược ị trí để yên ch el đôn lại tr n kh ản 30 -
Nh nh chón hút lấy kh ản 4,5 ml hỗn 5 ml 10 ml
Nước khử kh án (ml) 1.75 3.5
60 phút.
hợp bơm khe iữ h i tấm kính ch Đệm el tách (ml) 1.25 2.5
đến khi còn cách miện 1,5 cm. Re ent 2 ml 4 ml
30% Acryl mide 2.0 4.0
S S 20% (μl) 25 50 W ter 1.2 2.4 ml
Nh nh chón ch từ từ 200 µl nước dọc St ckin Gel Buffer 0.5 ml 1.0 ml
10% AMPS (μl) 25 50
the cạnh khuôn lên mặt củ lớp el TEME (μl) 2.5 5 30 % Acryl mide 0.3 ml 0.6 ml
Để yên ch el đôn lại tr n kh ản 30 S S 20% 10 ml 20 ml
- 60 phút. 10 % AMPS 10 ml 20 µl
TEME 4 ml 8 µl
S u khi el đôn , đổ bỏ lớp nước trên
mặt dùn iấy lọc thấm ch khô.
T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 32 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 33

Lắp ráp gel để ạy Lắp ráp gel để ạy

Lấy khuôn el r khỏi khuôn Đặt đi n ự đã n k u n gel
kẹp. Chú ý khôn l m xê dịch k ung ặp.
các tấm kính củ khuôn el. ùn n ón t y trỏ ấn nhẹ để
iữ đi n ự tr n khi dùn n ón t y
cái khó k ung ặp. T n bộ hệ thốn
lúc n y được ọi l Buồng đi n di.
Đặt Buồng đi n di
Đặt k u n gel đi n ự , Bể điện di.
ch miến kính n n qu y Rót Đệm chạy 1X buồn điện tr n
tr n . Chú ý khôn l m xê ch đến khi n ập qu tấm kính n n
dịch các tấm kính củ khuôn kh ản > 0,5 cm.
el. Rót Đệm chạy 1X bể điện di ch
đến khi n ập qu chân el 0,5 cm.

T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 34 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 35
Nạp mẫu - ạy gel Đọ kết quả - p ân tí
Ch 1/3 thể tích đệm mẫu 4X các ốn chứ mẫu Nhấc buồn điện di r khỏi bể điện di
pr tein cần phân tích, trộn đều. Mở khun cặp lấy điện c c r , chú ý iữ các khun el
Đun mẫu ở 95 C tr n 5 phút, ly tâm tr n 2 phút. Gỡ một tr n h i tấm kính, cẩn thận khôn l m ỡ kính, el ẽ nằm
trên tấm kính còn lại. C t bỏ phần el m.
Giến đầu tiên nạp th n pr tein chuẩn, các iến còn
Nếu chạy h i h y nhiều el cùn lúc, phải đánh dấu ố thứ t củ
lại nạp mẫu. el. Đánh dấu bằn cách c t các óc el.
ùn pipet trộn đều đệm tải hút 20 µl nạp iến . Úp tấm kính có el kh y chứ thuốc nhuộm C m ie Blue,
phí có el qu y nước, để el rơi nước. Để nhuộm tr n 1
Ghi lại ơ đồ nạp mẫu. iờ trên máy l c phiến.
Chạy el ở điện thế hằn định 200 V lt kh ản 45 phút, Chuyển el qu dun dịch tẩy m u, tẩy qu đêm.
ch đến khi phẩm m u x nh (br m phen l blue) chạy r Lấy el đặt lên hộp đèn, có phủ một ít nước để tránh khô.
khỏi el.
Chụp hình điện di đồ, căn cứ ơ đồ nạp mẫu để biết ị trí củ
các mẫu.
Căn cứ điện di đồ để phân tích kết quả
T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 36 T ự àn Công ng ệ sin ọ Đại ọ Y TP. HCM 37