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    Patologia molecular Técnicas de hibridacion, clonacién y secuenciacion de acidos nucleicos en el diagnostico anatomopatoldgico ME. Lleonart, R. Sanchez, P. Martin-Duque y S. Ramén y Cajal Departamento de Anatomia Patolégica, Clinica Puerta de Hierro, Madrid. TECNICAS DE HIBRIDACION MOLECULAR Las téenicas de hibridacién molecular se basan en el estu- dio de secuencias especificas del DNA o RNA, tanto para su identificacién como, para su eventual cuantificacién, Para realizarlas se parte de sondas que son secuencias de DNA 0 de RNA, complementarias a aquellas que se quie- ren detectar. La hibridacién o acoplamiento de la secuencia ‘génica diana y la sonda complementaria se puede recono- cer con métodos radiactivos y colorimétricos, En general se utilizan sondas previamente marcadas con sustancias radiactivas o fluorescentes, Las téenicas més utilizadas son la hibridacién por diso- lucid, la hibridacién por filtracién y Ia hibridacién in situ y sus variantes. Existen otras técnicas nuevas de hibridacién, como la hibridaciéa genémica comparativa, que en un futu- +0 pueden servir para la posible caracterizacién de secuen: cias desconocidas implicadas en diferentes patologias, ~ La hibridacién por disolucién se utiliza para evaluar 1a asociacién de una molécula de un écido mucleico en Ia formacién de dobles cadenas de DNA, DNA-RNA 0 do. ble RNA. Esta técnica es muy sensible, pero slo sirve para ccuantificar el contenido de un dcido nucleico especifico. ~ La hibridacién por filtracién consiste en la desnaturaliza- ciéa del DNA o RNA, inmovilizéndolo en un soporte inerte como la nitrocelulosa, para hibridirlo posterior ‘mente con una sonda marcada y asf facilitar su deteccién. Estas técnicas se conoven con los nombres de Southern blot y Norther blot, y sven para analizar las cadenas de DNA y RNA, respectivamente, ~ La técnica de hibridacién in si consiste en utilizar una sonda marcada de DNA o RNA y unisla al DNA o al RNA de una preparaci6n citolégica 0 histol6gics. Recientemente se ha optimizado la técnica de hibridacién in ina usando fluorescencia, lo que permite detectaralte- raciones puntuales y anomalfas cromosémicas tanto en. interfase como en metafase, tras hacer erecer previamen- te las células in vitro, Con la caracterizacién del carioti- po y los rasgos morfol6gicos de los eromosomas se pu: den detectar anomaltas en los mismos y numerosas trans. locaciones (1, 2) (Tablas 1 y 2). Hibridacién in situ (HIS) La hibridacién in situ es un método clisico y bésico que combina las técnicas de biologia molecular con los andlisis MEE, Lisa, R. Shocker, P. Mastin-Dugue y S. Rama y Ci Tabla 1. Ventajas y desventajas de las técnicas de hibridacion. ‘Vetajas LLocalizacin de la sonde en la elu 0 en el tejido HISIFISH REV ESP PATOL ee ae ee ae ee i Uso de marcado radiactivo 0 con digoxigenina EI FISH como técnica de inmunofluorescencia no | tanto amplificaciones como deleciones i Los resultados de las imigenes oon andl histol6gicos y citol6gicos. La hibridacisn in situ o citol6gi- ‘ca consiste en desnaturalizar el DNA cromos6inico por calor (95 °C) y posteriormente afiadir una solucién que contienc la sonda con el DNA o RNA marcado, que hibri- dard con sus secuencias complementarias, El mareado de Jas sondas se puede hacer por radiactividad con B®, S* 0 1 y posteriormente detectarse por autorradiografia. El ‘marcado por biotina o digoxigenina se visualiza mediante tuna reaccién colorimétrica, Con esta técnica se pueden Ver al microscopio los fragmentos de DNA o de RNA dentro del contexto histol6xico (3,4). Esta técnica puede mejorar los resultados de métodos «lésicos de patologia, por ejemplo en infecciones por papi- Jomaviras humano (HPV). En estos casos, el DNA viral ‘std presente en aproximadamente unas 20 copias por eélu- Ja, pero con escasa proteina de la cépside, que es lo que detecta la inmunohistoquimica. Sin embargo, la, hibrida- ‘idn in situ da una seal mucho mayor a la que se detecta ccon el uso de anticuerpos. La hibridaci6n in situ se utiliza en patologta tumoral y en el estudio de infecciones (5), por ejemplo en neoplasias| ‘endocrinas, en neuroblastomas con sobreexpresién de N-mye, bel-2 en linfomas foliculares, erb-2 en cancer de Tabla 2. Aplicacién de las técnicas de hibridacién. Pas FISH ‘Neoplasias endoerinas Deteccisn de virus Deteceién de virus prenatales | studio de alteraciones | oncogénicas translocaciones, et) is digital rmuestran una elevada precisién en la idenificacin Deteecién de anomalias de mvestras Alteraciones oncogsnicas (aneuploid, de las lesiones No es aplicable a RNA ‘mama, o presencia de virus o genomas virales como HPV, EBV (virus de Epstein-Barr), citomegalovirus, etc. (5) (Fig. Hibridacién in situ con fluorescencia (FISH) En la hibridacisn in situ con fluorescencia se utilizan son- das especificas para determinados cromosomas 0 secuen- cis de ellos. Al igual que en el caso anterior, a técnica cconsiste en desnaturalizar el DNA con calor, incubar las :muestras con formamida y tampon salino para mantener las| cadenas desnaturalizadas e hibridarlas posteriormente con sondas especificas de determinados fragmentos de DNA. ‘que se quieren estudiar. Sila sonda no estaba marcada con fluorescencia se afiade un intermediario que haga de puen- te, marcado con una sustancia fluorescente que a su vez reconozca ala sonda (2). La FISH pone de manifiesto as alteraciones genéticas, aa ver que permite ta visualizacién de las células en el contexto histolégico. Este métods se puede utilizar tanto para cromosomas en metafase como en interfase. Si se ‘Comparacién de moestrasnormales y tumorales Andlisis comparativo de diferentes variantes en Ia poblacién i Monitorizacién de tejidos procedentes de trasplames 19975 Vo. 30, 83 -— | Deenatutaeseén del DNA, Hibridacién in situ Sei oy oe | eanatraade Digestion con protests = pas exroner 8! DNA infec tl Figura 1. Esquema representative del mecanismo molecular de la hiridacion in situ: se desnaturaliza Hipidsetén eon sonds val < Teenleas de Mbridacén, clonacin ysecuenciacin de ded mclecos ene dlogrésico enatomopatlépico ae | wat dorttcacin de a sacuenca DNA de la seccion tlsuar a ‘analzar y se niorida con una sonda especfca, en este caso fronts a un DNA vial, La sonda se Une a un sistema de detaccién (méto- y 2 dos colorimétricos 0 autorraciogratia) para ebservar a localizacion de vrus en la seccicn tisuar analizada (esquema tomado del bro Anatomia patolégica de FJ. Pardo). desean estudiar pequetias translocaciones cromosémicas, on sondas completas de un determinado cromosoma, la técnica tiene que efectuarse a partir de células en metafase donde los cromosomas estin separados. De este modo es posible hacer un carotigo e identificar el punto de la trans- locacién, La FISH tiene muchas aplicaciones: en carcinomas (6), en Ia leucemia micloide (9:22), en tumores s6lidos como Jos de ovario (altraciones en el eromosoma 12). También se pueden detectar amplificaciones de oncogenes, como el rnew en el céncer de mama o de préstata (7). Bs importante su aplicaciGn en las muestras prenatales para la identificacién de anomalies cromosémicas, como la del sindrome de Down. Las limitaciones de la FISH vienen dadas por las con- diciones de Ia hibridacién y las derivadas de la preserva- iG del tejido (6-8). ‘Asimismo, para la detecciGn en metafase es preciso cul- tivar las eélulas en placas, lo que dificulta bastante el pro- eso impide su tipificacién en muchas ocasiones. Hibridacién genémica comparativa (HGC) La finalidad de esta técnica radica en la evaluacién del riimero total de aberraciones del genoma de la muestra a 25 analizar (9), Se introdujo para obtener informacién grose- ra, sobre ganancias (amplificaciones) y pérdidas (delecio- nes) de DNA de tumores sélidos. Esta basada en la capaci dad del DNA para hibridar con secuencias homélogas. El ‘método radica en una hibridacién diferencial entre el DNA. normal y el tumoral sobre eélulas normales. Se utiliza en el estudio del edncer de mama y de pulmén, ademés de exten- derse en la actualidad a diversos tipos de tumores (10), Con la HGC se detectan diferencias cuantitativas del srado de hibridacidn de cada DNA empleado. Dado que las células diana de la hibridacién y el DNA control son nor- males, todas las diferencias al comparar Ia hibridacién con- trol con la de Ja muestra tumoral se deben a anomalias pre- sentes en el DNA del tumor, Como el andlsis final dc estas muestras es cuantitativo, es necesario valorarlo con un andlisis digital de imagenes. Uno de los grandes retos actuales es discemir entre las pe- quefias diferencias visibles, practicamente inexistentes de- bdo a la precisin del software. Southern blot Esta técnica se basa en tratar el DNA con enzimas de res- triceién y separar los fragmentos con electroforesis en un zzel de agarose, Para su realizacién se parte de DNA aisla- MG, Lisonart, R Sache, P Martin-Dique y 8. Raméa y Call do del tejido en las mejores condiciones posible. EI DNA, tras cortarlo con enzimas de restricci6n, se desnaturaliza para obtener fragmentos de cadena sencilla que se tansfie- ren del gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa sobre el cual quedan inmovilizados. Esta transferencia es necesiia para que pueda realizarse Ia reaccién de hibridacién. El DNA queda atrapado en Ia nittocelulosa y es entonces ‘euando se puede hibridar con la sonda radiactiva o colo- riméitica, Cada secuencia complementara da lugar & una banda marcada que adquiere una posicién determinada por ¢ltamafio del fragmento del DNA. La reaccién se puede deveetar por autorradiografi, ya que las sondas se pueden ‘marvar radiactivamente (11) (Figs. 2 y 3). Southern Blotting Fragmentos de DNA ay | Electroforesis Se — ee yes si it m rt m0 mM unt rn ‘vw ic Rotor de Nitroceluiosa hibridacion Bandas tras e! Figura 2. Esquema representatvo cel mecanismo molecular col Southern biot (0 blotting) Los tragmentas de ONA conados por lenzimas de cesticolén se separan por electotoresisy se tans- fieren a un papel de fitro que posteriormente se somete a una solucién de hibridacién con la sonda marcaga,E! resultado de la ‘ransterencia on la itrocoiosa eo Impresiona en una pelfoula {e rayos X (esquema tomado da! libro Anatomia patolégica de Fu. Pardo). a2 Figura 3. imagen rosultante de un Southern bot. La banda mas intonsa corraspande al reordenamianto del gen da las inmuno. slobulinas con la sora JH, Esta técnica se utiliza en reordenamientos de procesos linfoproliferativos para determinar clonalidad a partir de Jos genes de las inmunoglobulinas en los linfomas B o delos receptores T en los linfomas T. Northern blot La técnica descrita para el Southern blot aplicada a RNA se

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