Professional Documents
Culture Documents
3
BIOTECHNOLOGICKÉ KULTIVACE MIKROORGANISMŮ
Bioreaktor
Bioreaktor je zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze
substrátu na jeden či více produktů. V moderním a širším slova smyslu není vždy nutné,
aby se procesu zúčastnily buňky, i např. Enzymové biotransformační reaktory můžeme
nazvat bioreaktory.
Bioreaktory můžeme klasifikovat podle různých hledisek, ale výše zmíněná
třepaná baňka zůstává prototypem transportních procesů, které jsou pro bioproces
nezbytné (Obr. 3.1).
4
Klasifikace typů bioreaktorů
Bioreaktory rozdělujeme podle různých hledisek, základní dělení je podle fáze:
Submerzní – nositelé bioprocesu (buňky, enzymy, agregáty, imobilizáty) se volně
vznášejí v kapalné fázi živného média,
Na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a nositelé bioprocesu
tvoří povlak čí nárůst; i tady se zpravidla tvoří mezistrukturní vrstvičky kapaliny,
Imobilizované – nositelé procesu jsou nějakým způsobem ukotveni v pevné struktuře.
5
Jiné dělení může být podle objemu procesu:
Měřítko:
• Laboratorní (do 30 l)
• Čtvrtprovozní (do 100 l)
• Poloprovozní (do 5000 l)
• Provozní (nad 5000 l)
Charakter pohybu média i nositelů procesů zakládá dělení podle operačního módu:
• Vsádkový (batch) - všechny živiny jsou vloženy do procesu již na počátku,
metabolity se hromadí (vyjma plynů), nejjednodušší typ procesu,
• Přítokovaný (fed-batch) – k základnímu objemu v bioreaktoru přitéká další médium s
novými živinami, metabolity se opět hromadí,
• Kontinuální – existuje přítok i odtok, nositelé procesu jsou zadržováni, nebo odtékají.
Neméně důležité dělení je podle konstrukce bioreaktorů, pro ilustraci Obr. 3.2:
• Míchání
▪ Mechanické, pneumatické nebo hydraulické
• Fluidní vrstva
• Náplňové
• Speciální
• Membránové, fotobioreaktory, reaktory pro kultivace na pevném substrátu, atd.
6
! Gradient živin
� U SSC přístup k povrchu buňky je omezen, živiny v bezprostředním okolí jsou
vyčerpávány a další musí k buňkám difundovat. SLC – v ideálně míchaném
reaktoru gradient neexistuje.
! Vrstva substrátu
� SSC - pro omezený transport ve vlhkém, ale pevném prostředí nemá smysl
používat silnou vrstvu substrátu. Kapalného média bývá přebytek.
! Limitace transportu tepla a živin
� SSC - je dána omezenou difuzí, u SLC je přístup k buňkám dokonalý (pokud se
jedná o volné buňky) a je dána transportními procesy přes buněčné stěny a
membrány.
! Fáze
� SSC - třífázový systém pevná – kapalina – plyn, SLC – pouze dvoufázová systém
kapalina – plyn.
! Dodávka kyslíku
� SSC - kyslík je dodáván hlavně z plynné fáze, což je problematičtější, SLC –
rozpuštěný kyslík z kapaliny a zároveň mezifázový přechod kyslíku z plynu do
kapaliny.
! Teplo
� SSC – teplo se odvádí plynou fází, SLC – kapalina je chlazena externím médiem
– nákladnější, ale mnohem účinnější.
! Sledování (monitoring) a řízení procesů
� SSC – velmi obtížné až nemožné, SLC – standardní postupy.
! Charakter růstu
� SSC – povrchový, SLC – submerzní.
! Koncentrace produktu
� Zde významná výhoda SSC – zpravidla vyšší koncentrace produktu ve srovnání
se SLC.
! Zvětšování měřítka procesu (scale-up)
� U SSC špatně definovatelné, u SLC standardní metodika.
Ideální bioreaktor
Ideální bioreaktor má rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,
nízké provozní náklady. Zpravidla se jedná o submerzní bioreaktor, ale to závisí na
7
charakteru nositele procesu a procesu samém.
Bioreaktor je proto nutné vybírat, případně konstruovat, s přihlédnutím k těmto
parametrům procesu:
• Přestup kyslíku
• Přestup tepla
• Přestup hmoty
• Požadavky na míchání
• Nároky na energie
• Citlivost kultury ke střižným silám
• Reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné
síly)
• Minimalizace odparu kapaliny
• Tlaková odolnost
• Sterilita operace
• Čištění bioreaktoru
• Bezpečnost
• Účelová flexibilita a kompatibilita
• Cena zařízení a jeho provozu
• Přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up
Speciální bioreaktory
Mezi speciální bioreaktory řadíme například fotobioreaktory, zařízení různé
konstrukce umožňující přístup světla k rostoucím fotosyntetizujícím kulturám, např.
Jednobuněčným řasám, cyanobakteriím.
Další velkou skupinou jsou bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi, o které bylo
stručně pojednáno výše. Konstrukce jsou opět různé, podle charakteru organismu a jeho
růstu. K těmto reaktorům se řadí i zařízení pro povrchový nárůst na kapalných médiích.
Bioreaktory pro kultivaci živočišných či rostlinných buněk – tkáňových kultur
8
přesahují rovněž rozsah tohoto textu.
Míchání bioreaktorů
Nejčastějšími způsoby míchání bioreaktorů jsou pneumatické, s fluidním ložem a
zejména mechanické.
9
a) bublaná kolona, b) air-lift reaktor s cirkulační trubkou.
1 - nádoba bioreaktoru
2 - plášť
3,4 - izolace
5 – přívod inokula
6 – porty pro pH elektrody
7 - míchadlo
8 – aerační věnec
9 – ucpávka
10 - převodovka
11 – motor
12 – vypouštěcí otvor
13 – chlazení pláště
14 – vzorkovací otvor s připojením páry
15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)
16 – přívod roztoků na úpravu pH a
odpěňovadla
17 – vstup vzduchu
18 – víko
19 – přívod média
20 – odvod vzduchu
21 – porty pro senzory
22 – rozbíječ pěny
23 – přívod páry
24 – tryska
11
míchacími narážkami, což jsou podélné obdélníkové vestavby, zpravidla umístěné
pravidelných vzdálenostech po vnitřním obvodu nádoby. Narážky (zarážky) pro
optimální promíchávání se umisťují v počtu 4-8, d (šířka narážky) asi 0.1 dT.
Typická konstrukce aerovaného míchaného bioreaktoru (CSTR – continuous stirred tank
reactor) je na Obr. 3.4.
12
CSTR standardního tvaru je vybaven obvykle více míchadly na společném hřídeli,
což výrazně zlepšuje homogenizace tanku, vzdálenost míchadel 1-1.5 D (průměr
nádoby), nejčastější počet je tři. Rychlost míchání je často omezena pouze konstrukčním
a materiálovým provedením bioreaktoru, avšak maximalizace otáček není efektivní ani
pro homogenizaci a provzdušnění.
Velikost míchadla se volí D/DT = 0.4-0.5 (průměr míchadla/průměr tanku), počet
narážek je čtyři a jejich šíře 0.1 DT. Vzdušnění (aerace) podporuje míchání a snižuje
míchací příkon. Poměr mezi příkonem aerovaného tanku (PG) a neaerovaného tanku (P)
vyjadřuje vztah:
Přestup tepla
V aerobních míchaných bioreaktorech vzniká teplo exotermickou činností
mikroorganismů nebo exotermickými reakcemi, dále třením při míchání a aeraci.
Množství uvolněného tepla u aerobních procesů je proporcionální spotřebovanému
kyslíku,
Q (kj/m3.s) = 0.12 . Ocr (mmol o2/m3.s)
kde Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol
utilizovaného O2. U submerzních kultur to bývá 3-15 kJ/m3.s.
Odvod tepla je realizován prostřednictvím aktivního chlazení přes externí plášť či
interní vestavby. Při zvětšování měřítka (scale-up) si přestup kyslíku a tepla zaslouží
zvláštní pozornost - větší objem znamená menší chladicí plochu.
13
Aerace a přestup kyslíku
Aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace vyváří
relativně velké mezifázové rozhraní. Hodnotí se pomocí tzv. Stupně dispergace a:
14
Kultivační půdy – média
Kultivační média jsou nezbytná pro kultivaci - růst a metabolismus
mikroorganismů. Dále tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje fyziologii a chování
mikroorganismů a tím ovlivňují výtěžnost, rychlost tvorby produktu a složení produktu.
Živiny obsažené v médiu jsou potřebné pro růst buněk, získávání energie pro syntézu
produktů a zachování buněčné integrity.
Pro technologické účely dělíme média na KOMPLEXNÍ a DEFINOVANÁ.
Komplexní média obsahují zpravidla všechny potřebné živiny v ne zcela přesně
definovaném složení, což je dáno jejich původem. Bývá to organický zdroj živin, např.
Hydrolyzáty proteinů (peptony), extrakty masa, kvasnic, mléka, různé směsi rostlinných
živin apod. Definovaná média mají přesně známé složení, obvykle roztoky minerálních
solí, čisté esenciální živných komponent a jeden nebo více zdrojů uhlíku a energie.
Médium představuje zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu
nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy, dále zdroj
energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě
energie (jako donory nebo akceptory elektronů). Elementární složení všech mikrobiálních
buněk je relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků mikroorganismů na
živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P).
Při návrhu složení média je nutno znát biochemii kultivace, jeho případný vliv na
metabolismus a fyziologii buněčné populace, dále účel kultivace a průběh DSP. Cena
média tvoří přes 50% ceny konečného produktu, je tedy třeba ji zohlednit. Důležitá je
také stálost jeho složení.
Formulace média je vždy kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a
dostupností složek. Elementární chemické složení média se určí ze složení biomasy a
produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů.
Uhlíkatý substrát - část je oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané
energie je na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace). Poměr asimilované a
disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje. Maximální výtěžnost substrátu -
čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí
se to v YX/S.
Hlavní elementární složky médií jsou obvyklé biogenní prvky. Dalšími složkami
jsou stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu, růstové faktory - esenciální org. sloučeniny,
které si buňka neumí sama syntetizovat, vitamíny – často kofaktory enzymů, L-
aminokyseliny – především glutamová, puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových
kyselin, VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná, odpěňovadla – povrchové napětí,
oleje, polyglykoly polymery (PPG).
Při přípravě médií je nutno dbát na pH a iontovou rovnováhu. Ke stabilizaci pH se
15
užívají pufry (organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES). Regulace pH se
provádí během kultivací, většinou pomocí NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4. Iontová síla i
redox potenciál také ovlivňují růst, produkci a produkty.
Příprava inokula
Průmyslové kultivační procesy začínají stejně jako laboratorní, z čisté kultury
produkčního kmene. Kmeny se uchovávají standardním způsobem, lyofilizované,
hluboko zmrazené, nebo klasicky přeočkováváním na pevných, mnohdy selektivních
půdách. Revitalizace se obvykle provádí v kapalném médiu.
Abychom dosáhli potřebného kultivačního objemu, je zpravidla zapotřebí
několika stupňů. Všem stupňům před produkčním se říká inokulační, objemový poměr
pro převod je 1:10 až 1:20, může však být i mnohem vyšší; pak je třeba počítat s delší lag
fází.
V inokulačních stupních je důraz na růst, nikoli produkci, často se používají
komplexní média. Stupňů by mělo být co nejméně, mohou způsobit změnu chování nebo
charakteru kultury.
Sterilizace u bioreaktorů
Řada produkčních procesů je aseptických. Sterilita znamená nepřítomnost živých
organismů, tedy vyjma těch produkčních. Kultivačnímu procesu tedy předchází
odstranění veškerých živých mikroorganismů ze zařízení a je nutné zabránit vstupu
kontaminace po sterilaci. Provádí se tedy sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího
zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací
zařízení, senzory atd.).
Hodnocení sterility
Používá se tzv. D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10, která závisí na
odolnosti mikroorganismu.
Inokulace
Inokulace je aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně. Je
vhodné ji provádět pomocí sterilizovatelného potrubního spojení tanků a čerpat tlakem
sterilního vzduchu. Také se používají sterilní inokulační jehly a septa v aperturách ve
víku bioreaktoru. V tom případě se používají sterilní hadice a čerpání peristaltickými
čerpadly - inokulum tak nepřichází do styku s čerpadlem.
17
Základní typy kultivačních procesů
! Vsádková (batch)
� Uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani odvod metabolitů
! Přítokovaná (fed-batch)
� Přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantní
! Kontinuální (continuous cultivation)
� Otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru
�
19
Přítokovaná kultivace (fed-batch)
Jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt
zůstává v bioreaktoru, Vr není konstantní. Řízením rychlosti přítokování limitujícího
substrátu lze ovlivnit rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a
metabolismu. Výhodou je, že řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek
nebo produktivitu. Živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem
bioreaktoru roste.
Kontinuální kultivace
Kontinuální kultivace je otevřený systém, kde dochází k plynulému
(nepřetržitému) dodávání živin (média) a zároveň k plynulému odběru média
pozměněného metabolickou činností mikroorganismů i s částí biomasy. Rychlost přítoku
je rovna rychlosti odtoku, objem bioreaktoru je konstantní. K rozmnožování
20
mikroorganismů dochází za podmínek blížících se optimu.
Základním a nejméně náročným typem kontinuální kultivace je chemostat:
Optimalizace bioprocesu
Hlavní faktory, které určují kvalitativní i kvantitativní výsledky bioprocesů jsou:
• Konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene
• Optimalizace složení média
• Výběr typu kultivace
• Podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií
• Optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
Monitoring a automatizace
Prvky zajišťující monitoring a automatizační hardware a software jsou v dnešní
době již konstrukčními součástmi bioreaktorů. Reaktory jsou vybaveny senzory a
zařízeními pro měření základních stavových veličin, jako jsou pH, teplota, do, redox,
dco2, odplyny, x, s, p a pro měření a řízení základních procesních parametrů, jako jsou
otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky. Ještě v nedávné době to bylo realizováno
prostřednictvím analogových měřících a řídících jednotek, dnes je standardem ddc (direct
digital control) realizované plc (procesními počítači. S nimi spolupracují nadřazené
monitorovací, archivační a řídící systémy.
22
(hmotová spektrometrie) měření
� Tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP (set-point, žádaná
hodnota)
! Přítokování -
� Tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji vážením reaktoru nebo
zásobníku.
Použité zdroje
! Kultivační techniky, sylabus ÚKCHB VŠCHT
� http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
! Bioinženýrství kvasných procesů (Mojmír Rychtera a Jan Páca, VŠCHT Praha 1987)
! Fyziologie bakterií (František Kaprálek, SPN 1986)
! Bioinženýrství (František Kaštánek, Academia 2001)
Doporučená literatura
Goering R.V.., H.M.Dockrel., M.Zuckerman., D.Wakelin., I.M.Roit.,
C.Mims., P.L. Chiodini. (2008) Medical Microbiology (4th Edition).
Elsevier . USA.
Internetové zdroje
http://www.vscht.cz/kch/kestazeni/sylaby/kultivtech.pdf
25