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  • Parte 2 Manual Hematología - PDF Versión 1

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    160 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD Fraceién VW + Facilta la agregacién de los trombocitos. Contribuye ala adhesion de las plaquetas en el endotelo vascular + Mantiene los niveles de Vill. Los pacientes que presentan alteraciones de la fraccién Vill - C presentaran hemofilia, los que presenten alteraciones de la fraccién Vill - VW presentaran la enfermedad de Von Willebrand. 2.8. Factor IX También conocido como factor de Christmas o antihemofilico B es una glucoproteina que podemos encontrar en el plasma y el suero y que se sintetiza en el higado siendo vitamina K dependiente. Puede ser activado por ambas vias de la coagulacién: = Viaintvinseca: factores Xla, Cary fp3. ~ Via extrinseca: factores Vila, Cat* yTH. Una vez activado interviene en la via intrinseca de la coagulacién activando al factor X. Laencargada de su inhibicién es la ATH, Los pacientes que presentan un deficit de este factor presentan hemofilia b o enfermedad de Christmas. 2.9. FactorX También conocido como factor de Stuart-Prower es una glucoproteina que podemos en- contrar en el suero 0 en el plasma sanguineo. Esta glucoproteina se sintetiza en el higado y es vitamina k dependiente. La encargada de su inhibicién es la ATII yla a, antiplasmina Este factor puede ser activado por ambas vias de la coagulacién: = Via intrinseca: factores IXa, Vill ~Ca, Ca*y fp, ~ Via extrinseca: factores Vila, Ca" y TH. Una vez activado colabora en la activacién de la protrombina, 2.10. Factor XI También conocido como antecedente plasmstico de la tromboplastina es una glucopro- teina que podemos encontrar tanto en el plasma como en el suero de los pacientes. Se sinteti- zaenel higado y los encargados de su inhibicién son la ATII a, ~ antitripsina y el C1 inhibidor. Elfactor Xila es el encargado de su activacién y una vez activado pi seca de la coagulacién activando al factor IX. ipa ena via intrin- MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN 2.11. Factor XII También conocido como factor de Hageman es una glucoproteina que podemos encon- trar en el suero yel plasma, Los encargados de su inhibicién son Ia ATI y el C1 inhibider. Se desconoce dénde se sintetiza y se activa por la accién de enzimas proteoliticas sobre él © por contacto directo con superficies negativas. Una vez activado se encarga de activar al factor Xly ala precalicreina 2.12. Factor XIII También conocido coma factor estabilizante de la fibrina es una glucoproteina que pode- mos encontrar en el plasma. En el suero también aparece pero en cantidades infimas. La parte que es plasmatica se sintetiza en el higado, pero existe un porcentaje que se loca- liza en las plaquetas y que se sintetiza en los megacariocitos. Se activa por la trombina y su funcién consiste en estabilizar el coagulo de fibrina 2.13. Factor de Fitzgerald También conocido como quininégeno de alto peso molecular es una glucoproteina que podemos encontrar en el plasma y en el higado. Se sintetiza en el higado y es un cofactor de la activacién de la precalicreina y el factor XI 2.14, Factor de Fletcher También conocido como precalicreina (PK) es una glucoproteina que podemos encontrar cenel plasma y en el suero. Los encargados de su inhibicién son la a2 macroglobulina, a2 anti- plasmina y C1 inhibidor. Se sintetiza en el higado y se activa por el quininégeno y el factor Xila convirtiéndose en calicreina activando a su vez al factor Xl Factor | __ Nombre om] Concentcion | ermaciin | caraceristics | [roe 3anom | romani | Hote | Petes Premade Ta 1 | rents roo | sons tigaso | Retina ve ae pendent un far te Trombopatn tr aoe ne ae ene [Sarco No ae degra w coz ee ees alin oh von mao | 5-10 wigaso [cade eI probs 7 161 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD “ EK dependene vt |rocanverina soo | 035060 Hose [factor ce vis me- samen Toad, cs Anthemefia ; No ana ensma, vm] Arshe aocoo | oro2 | enanasy [NO sume megacoots Thematic Boar : vx [Anihemet somo | as Hondo | veKaependene fainador deta | sua Power somo | a7 wosso | poems ve K Sependete Tshenatcot 5 : va [foshenaticn vwaow | 36 tigado | ylobuna nat [Hagenan ome [sas aoa balobna, pod vm |esaaadordestnn | sioc00 | 0 | Mesnaoctony | Ct ersamenta eligado: de la fibrina Frage ocnndgeno lb tegen ci ranom | 7050 2 Gobuina FcherpPeabeena | 90000 | 050 tigado [blob ~ LosfactoresK dependientes en ausencia de esta vtamina se sitetzan,perono se pue- den active. ~ Ademés de los presents en a tabla actdan en fa coagulacién el Ca factor sur y el factor plaquetari 3 (FP3), encargados de aumentarlaconcentraién delos atero- resen el lugar de a lesién Nombre | _Quiénto acta _Quién lo inhibe Funeién Fbindgeno | Tombina Formacin del coigula Widrolaar a molcla de Five Factores Xa, Va e iones | Antitrombinas y el Fibri- | M6EN® 2 la protrombina, Ac~ rrovorbira | factors x Aativombinsy Fb | Proc etre WV peti Formacién de prostaglandinas y Nberocén de AD plogutara rear Acai dl actor iKy 1X Factor [Tomb Prteina ¢ Cofactor vena Wombia por elf Actvain dl factor Xy de Procnverina | FOr Proteins C Acta wie Tomine Catacr yaaacon docork ‘ombina Agregacén a os womb, vu vw Trombit la adhesin de las plaquetas Factor de [Poeores Xe, ys ‘Christmas Factores Vila, Ca* y TH a Activando al factor x Facor de saan [Factores a, VIC, Show facar |" y BD At la antismina | Actvain dela tombeplastina nea) [aechestmas [Factores in, ca yTH MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN 1 . Al, 2, —antitipinay Factor factor Xa ATI ani Activa factor Enaimas protectins ractorde | soo lo or contacto Activa al factor Xly ala Hageman directo con superficies ne- AIITy el C1 inhipidor. precalicreina savas Factor xit___|Trombina Estobilize lcosgulo Factor de Cofactor dea activa dela ftegerald precalirina yl factor. Factor de | Quinindgenoy el factor | A2 macroslabutna, a, an- Fletcher. xia tiplasmina y C1 inhibidor. | ACt¥acion del factor XIl, 3. Factores inhibidores de la coagulacién Como cualquier otra funcién fisiolégica del cuerpo humano, la coagulacién debe ser re- gulada por diversos factores que impidan que esta se realice sin control y provoque daos irreversibles en el organismo. Han sido muchos los estudios que se han realizado de la hemostasia y parece claro que tuna vez que se inicia la secuencia de coagulacién, esta no se puede detener, es decir, una vez que los procoagulantes son activados la coagulacién llegara a término sin que podamos hacer nada para impeditlo. Los factores de la coagulacién presentan una vida media en sangre muy corta, silos com- paramos con otras proteinas plasmaticas, pero este no parece ser un factor muy importante, Existen varios factores de inhibicién que se encargan de vigilar que todo funcione correc- tamente de forma fisiolégica; en casos patolégicos debemos administrar un tratamiento es- pecifico para que la coagulacién se normalice lo maximo posible. Estos mecanismos fisiol6gicos son los que siguen: ~ Fluje sanguineo: el continuo movimiento de la sangre por el torrente sanguineo nos sirve para diluir las concentraciones de los procoagulantes presentes en el medio, asi como para arrastrar a pequefias fracciones de trombos de fibrina formados en las paredes, Como es evidente, los factores ajenos al sistema sanguineo, como el factor tisular, estén ‘mucho menos influidos por este factor inhibidor. reticuloendotelial ~ Factores bioquimices: son varios los inhibidores bioquimicos que estan presentes en el plasma; estas sustancias estén destinadas a inactivar algtin factor determinado, cor- tando as! la cascada de la coagulacién acién de la circulacién de los factores activades: diversos estudios apuntan a la eliminacién de los factores de la coagulacién activados por medio de diversos M riemo De TaomsoPLAsTINa ») TIEMPO DE PROTROMBINA PARCIAL ACTIVADA x (@ TEMPO DE QUICK) Via comin " Y ~ TIEMPO DE TROMBINA Y ' 176 MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN Cuando los niveles de los factores explorados son inferiores al 25-40% o la concentracién de fibrindgeno es menor de 50-80 mg/dl sus valores aumentarén, ya que tardaré més en rea- lizarse la coagulaci6n del plasma, De igual forma estaré elevado con la administracion de an- ticoagulantes orales. La téenica es como sigue: La muestra utilizada suele ser PPP. 2. Calentar 100 pl del plasma problema durante 2 minutos a37 °C y ahadir 200 pl de trom- boplastina calcica a la misma temperatura, Cronometrar el tiempo de coagulacién, los valores normales oscilan entre 10 y 15 segundos. 4, Debemos realizar varias medidas y establecer la media, Para dar valores representativos debemos realizar un calibrado de cada lote de trombo- plastina que nos llegue, formando la curva de calibracién de ese lote. Los resultados los pon- dremos como porcentajes de los valores de la curva de calibracién, Para obtener esta curva realizaremos diluciones de un plasma de control, que podemos comprar o formar nosotros mismos a partir de la mezcla de, al menos, 7 plasmas frescos de personas sanas, y comprobando el TP en estas diluciones. Debemos realizar varias mediciones ‘con cada dilucién y sacar la media, os resultados se pasarén a una hoja de papel milimetrado para realizar la curva, Diluelon a [ie [ia [14 [1 Plasma ml 2 | oz | oz | oz | o2 Tampéndituyentemt | — | 02 | o4 | 06 | 1a ‘Actividad % roo | 50 | 33 | 25 | 125 Los resultados obtenidos en el plasma problema serdn dados finalmente en relacién con la curva realizada para cada lote,y se pueden dar como un porcentaje del plasma problema respecto alplasma control, ocomo una relacién entre eITP del plasma problema y el TP del plasma control suero problema /TP suere control Silo expresamos en porcentajes los valores normales oscilaran entre e170 y el 100%, y silo expresamos como razén serén los comprendidos entre 0,9 y 1,2 Podemos dar los resultados en segundos pero debemos anadirla marca de la tromboplas- tina utilizada dado la gran variabilidad de las mismas. En estudios de los tratamientos con anticoagulantes orales los resultados se expresarén en INR (ratio normalizada internacional), que es la razén entre si se hubiere realizado con la primera tromboplastina de referencia humana de la OMS, INR = (TP problema /TP control)" donde el ISI es el indice de sensibilidad internacional 8.7. Tiempo de Stypven Existe un variante del TP denominado tiempo de Stypven, donde aftadimos veneno de la ser- piente Russel en vez dela tromboplastina,y nos sirve para conocer el funcionamiento del factor VI Los valores de normalidad oscilan entre las 20-25 segundos. 7 178 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD 8.8. Tiempo de trombina (TT) Esta es una prueba que determina el tiempo que tarda un PPP en coagularse tras la admi- nistracion en bajas cantidades de trombina, La trombina que se utiliza se proporciona por diferentes laboratorios y es de origen bovi- no;esta viene lioflizada y hay que reconstituitla para poder utilzarla Latéeniea es como sigue: Colocar 200 ul del PPP problema en un tubo ¢ incubar durante 2 minutos a 37 °. 2. Afiadir 100 pl de trombina reconstitulda y conectar el cronémetro. 3. Contabilizar el tiempo necesatio para la coagulacién Como siempre deberemos realizarla prueba a la vez con un plasma control. El resultado de la prueba se dara como un cociente entre ambos resultados. Los valores de normalidad oscilan entre 15-20 segundos. 8.9. Tiempo de reptilase/a Es una variante de la prueba anterior que utiliza veneno de la vibora del género Bothrops cen vez de trombina. Este veneno no se ve influenciado por Ia presencia de tratamientos con heparina, siendo muy util para realizar diagnésticos de comprobacién. La téenica es como sigue: Colocar 200 ji! del PPP problema en un tubo e incubar durante 2 minutos @ 37°C, 2. Aftadir 100 pl del veneno de la serpiente y conectar el cronémetro, 3. Contabilizar el tiempo necesario para la coagulacién Como siempre deberemos realizarla prueba a la vez con un plasma control. El resultado de la prueba se dara como un cociente entre ambos resultados. Los valores de normalidad oscilan entre 15-20 segundos. 8.10. Dosificacién del fibrinégeno Realizaremos esta determinacién cuando los valores de TP oTTPA se encuentren elevados, asicomo ante la sospecha de un CID (coagulacién intravascular diserninada). Los valores normales de fibrinégeno en sangre oscilan entre 150y 450 mg/dl, aunque pue- den verse afectados por diversos estados de inflamacién aguda, por esta razén lo ideal es realizar varias determinaciones seriadas y no una sola determinacién puntual. Aunque existen muchas formas diferentes de realizar la determinacisn la mas precisa es la de Claus, que va a determinar el fibrindgeno funcional. También se puede determinar este fibrindgeno por métodos inmunolégicos ya comercializados. La téenica es como sigue: Realizar una solucién de plasma con tampén veronal al 1/10. 2, Calentar 200 ul del plasma a 37 °C durante 2 minutos. MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN 3. Afiadir 100 pil de trombina a temperatura ambiente al plasma, 4, Cronomettar el tiempo de coagulacién desde que ahiadimos la trombina, 5. Esaconsejable realizar varias determinaciones y obtener la media, Debemos determinar una recta de calibrado para cada lote de trombina, esto lo realizare- mos con un plasma control que podemos comprar o realizar nosotros mismos, pero del que debemos conocer la cantidad de fibrinégeno presente Una vez obtenido el plasma control iremos haciendo diluciones y determinando el tiempo de coagulacién, realizaremos la medida al menos 3 veces en cada dilucién y sacaremos la me- dia, los datos obtenidos se pasaran a una grsfica, determinando asi la recta de calibrado para ese lote de trombina 8.11. Prueba de mezclas La causa dela distesis hemorragica puede no ser el déficit de alguno de sus factores dela coagulacién, sino la presencia de inhibidores de los mismos, para determinar esta posibilidad realizamos la prueba de mezclas. Los resultados de las diferentes pruebas de coagulacién dardn resultados normales si el porcentaje de los factores de coagulacién es de, al menos, el 50% o, dicho de otra forma, si los valores de los factores de coagulacién presentes en la sangre ascienden a niveles iguales 0 superiores al 50%. Esta prueba de mezclas se basa en este fundamento, Realizaremos una mezcla al 50% del suero problema con un suero normal, asi aseguramos la presencia de la cantidad minima de factores de a coagulacién necesarios para quelos resul tados sean los correctos, y volvemos a realizar las pruebas con este nuevo plasma. La mezcla puede ser entre el plasma problema con plasma normal, plasma problema con suero normal o plasma problema con plasma normal adsorbido. Silos valores siguen siendo erréneos, los tiempos de coagulacién son elevados, podemos decir que el plasma problema presenta inhibidores de los factores de coagulacién, que no dejan actuar a los diferentes factores presentes en el plasma, Si por el contrario los valores se normalizan podemos decir que el plasma problema presenta niveles bajos de algin factor, por esto al afiadirle mas cantidad del mismo factor se normalizan las pruebas. 9. Pruebas independientes de los factores de la coagulacién En la actualidad existen preparados comerciales que vienen ya preparados sin un factor determinado, estos preparados se utilizarén en las pruebas normales de coagulacién. Si el paciente presenta el factor buscado los tiempos no se verdn alterados, si faltan los tiempos ‘obtenidos aparecerin alargados correborando la falta del factor buscado, 9.1, Determinacién de los factores Il, V, Vil yX Estos son los factores que intervienen en el tiempo de protrombina; para realizar la prue- ba mezclaremos al 50% el plasma problema con un plasma carente del factor especifico que vayamos a buscar. 179 180 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD Antes de inicia la prueba deberemos realizar una recta de calibracién que nos servira pos- teriormente para expresar los resultados. Los datos de normalidad se expresan en la siguiente tabla: Fecor [Niels denormataea | i 20 Ua Tv 0a it sonouar | x conoua | 9.2. Determinacién de los factores VIII, IX, Xl y XII Estos son los factores que intervienen en la TTPA; al igual que en el caso anterior mezcla- Femos el suero problema con un preparado que carezca del factor que queremos medir y realizaremos la determinacién. También es necesarla la fabricacién de una recta de calibra cién para poder expresar los resultados. En la siguiente tabla podemos observar los niveles de normalidad, Factor | Niveles de normalidad vu s0-1s0U/d « 20-120U/al x! 20-120U/a xi 20-120 9.3. Determinacién del factor XIII Este factor se utiliza de forma fisiol6gica en muy bajas concentraciones; para su determina- cién procederemos de la siguiente técnica: Colocar 400 ul del suero problema en un tube de hemélisis. 2. Afiadir 100 pil de CaCl, 0,1 mol/L, 3. Incubar durante 30 minutos a 37 °C, 4, Una vez terminada la coagulacién ahadiremos 3 ml de acido monocloroacético. 5. Mezclar. 6. Cronometrar a disolucién del codgulo, puede aparecer en las siguientes 24 horas. Siel suero problema presenta el factor Xillel codgulo permanecers insoluble, sila ausencia del factor es completa la disolucién aparecera en 10 minutos, en ausencia relativa, aparecera enun tiempo determinado. MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN 10. Estudio de la presencia de anticoagulantes circulantes Existen pacientes que presentan anticuerpos que anulan algunos de los sistemas de coa- gulacién por atacar a diferentes factores. Suelen aparecer en el transcurso de enfermedades autoinmunes como el lupus, de donde cogen su nombre. Su presencia se pone de manifiesto mediante pruebas que utllicen una concentracién baja de fosfolipidos; as principales son las siguientes: 10.1. Tiempo de caolin La prueba ha de realizarse con el plasma problema, el plasma control y con una mezcla a partes iguales de ambos para comparar los resultados. La téeniea es la que sigue: Colocar 100 ul del plasma problema en un tubo. 2. Afadir 100 ul de suspension de caolin, 3. Incubar durante 3 minutos a 37 °C. 4, Nadir 100 pl de cloruro calcico y conectar el cronémetro. 5. Medir el tiempo que tarda en coagular la solucién Los niveles de normalidad aparecen siempre que el tiempo sea inferior a 120 segundos. 10.2. Tiempo de veneno de Russell En este caso utilizaremos el veneno de la vibora de Russell diluido en un tampén de vero- nal acetato para realizar la prueba. Al igual que la anterior deberemos realizar la prueba con el plasma problema, el plasma control y con una mezcla de ambos para comparar los resultados. La téenlea es como sigue: Colocar en un tubo de hemélisis 100 pl del plasma problema, 2. Afiadir 100 yl de cefalina diluida en el tampén veronal al 1/8 e incubar durante 90 se- gundos a 37°C. Afiadir 100 ul del veneno e incubar 30 segundos mas. 4, Ahadir 100 pil de cloruro célcico y conectar el cronémetro. Contabilizar el tiempo que tarda en aparecer la coagulacién 11. Estudio de los inhibidores de la coagulacién Como hemos comentado en apartados anteriores el organismo humano cuenta con una se- vie deinhibidores de a coagulaciénfsioldgicos que permiten un control adecuado dela misma. En ocasiones estos inhibidores no funcionan como debe ser y aparecen trastornos severos de la coagulacién por no cesar el proceso y formarse trombos de forma incontrolada, 181 182 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD Lo mas normal es estudiar la funcionalidad de estos inhibidores, ya que es posible que su cconcentracién sea la adecuada pero su funcidn esté alterada, De igual forma si su concentra~ cién es baja la funcién se encontraré igualmente alterada, 11.1. Estudio de la ATII Siafadimos heparina y trombina en exceso a una muestra de plasma problema, la ATI, se formarin complejos amarillos que podremos medir. La técnica es la que sigue: Colocar en un tubo 50 ul de plasma problema y afadir 3 mI de tampon A. 2. Mezclary separar 400 pi 3. Incubar estos 400 pl durante 4 minutos a 37 °C, 4, Afiadir 100 pl de trombina, 5. Incubar durante 30 segundos mas, 6. Afiadir 300 pl del sustrato (sustrato cromogénico $-2238%) calentada previamente a 37 °C. 7. Mezclar e incubar durante 30 segundos mas, 8. Aftadir 300 pl de dcido acético. 9. Medir la absorcién y traspasar el dato ala recta de calibracin, AT +heparina + AT—heparina. AT- heparina + trombina > ATIll-heparina-trombina + trombina residual. Sustrato + trombina residual ——» péptido + pNA (amarillo) 11.2. Estudio de la prot La téeniea es como sigue: Colocar en un tubo 25 ul del plasma problema, ‘fadir 200 il de activador de la proteina C a C por método amidolitico Mezclar eincubar durante 5 minutos 237 °C Afadir 200 il de sustrato 5-2366. Mezclar eincubar durante 5 minutos a37 °C. Afar 200 il de acido acético. Transferira una cubeta y leer la absorcién. 11.3. Estudio de la proteina S Al ser un cofactor de la proteina C no recomendamos la determinacién de la funcionalidad de esta proteina, ya que puede verse alterada si la proteina C presenta alguin tipo de resisten- ciaa la actividad por parte del paciente, Elmétodo més recomendado es la determinaci6n inmunolégica de ambas partes, la parte que circula libre y la que circula unida al sistema complement. MAD FIiLociay MoRFOLOIADELAOAGULACIN El método de eleccién es el ELISA y existen preparados comerciales para determinar la totalidad de esta proteina o para su divisién por separado. Los niveles de normalidad oscilan entre 60-140 U/dl 12. Estudio de la fibrindlisis 12.1. Estudio del tiempo de destruccidn del coagulo de sangre total Este es un estudio global de la fibrindlisis y consiste en determinar el tiempo total que tarda un coagulo de sangre total en destruirse in vitro. Latéeniea es como sigue: Colocar sangre total en un tubo y dejar que se coagule. 2. Colocar el tubo en un bao maria a 37 *C y conectar el cronémetto. 3. Determinar el tiempo de lisis del coégulo, Eltiempo considerado normal es igual o superior a 72 horas. 12.2. Estudio del tiempo de destruccidn del coagulo de euglobinas Este estudio es también de cardcter global, Las euglobinas son un grupo de proteinas plas- méticas insolubles en agua y que precipitan si acidficamos esta. El fibrindgeno y el plasminé- geno son algunas de ellas. Para su estudio utilizamos el métede de Von Kaulla que es el que sigue: Realizar una solucién con 500 pl del plasma problema y agua destilada al 1/20. Afiadir 90 pil de dcido acético al 1%. Mezclar y dejar en la nevera durante 30 minutos. Centrifugar 2 2.000 rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante, ‘Afiadir 500 il de veronal-- acetato para reconstituir el precipitado. Colocar en un bafio maria a 37°C Afiadir 100 ul de trombina y remover. Conectar el cronémetro y determinar el tiempo de lisis del coagulo, Los niveles normales oscilan alrededor de las 2 horas y es una prueba mucho més sensible que la anterior. 12.3. Estudio de la determinacién de la 2 antiplasmina Es un método colorimétrico basado en la plasmina que queda activa en el plasma, La tée- nica es la que sigue: Colocar en un tubo de plastico 100 pil del suero problema, 2. Afiadir 3 ml de tampén tris 0,05 mol/| y mezclar. 3 184 ACTUALIZN NDE ConacHMETOS EX HEMATOLOIACLNCA MAD Colocar 600 pil de la solucién anterior en otro tubo e incubar durante 4 minutos a 37°C. - ‘Afiadir 200 il de plasmina, mezclar e incubar 20 segundos més, Afiadir 200 ul de sustrato cromogénico $-2251” con una concentracién de 35 mmol/l e incubar 2 minutos mas, 6. Afiadir 100 pil de dcido acético transferir a una cubeta y medir la absorcién. Los niveles de normalidad oscilan entre 80-120 U/dl 12.4. Determinacion de los monémeros de fibrina Si tomamos una muestra de PPP y a ponemos en contacto con etanol en un medio aleali- no los monémeros de fibrina formaran un gel que se puede determiner. La técnica es como sigue: Colocar en un tubo 450 pl del plasma problema Afadir 50 ul de NaOH, Afadir 150 il de etanol dluide, Mezclar todo y dejar incubando en la nevera durante 10 minutos. vp en Observar la gelificacién de la muestra 12.5. Determinacion del fibrindégeno por inmunodifusién radial La determinacién se realizaré en una placa que contenga como medio semisdlido gel de agar 0 agarosa, normalmente tefidos de alguin color para poder visualizar mejor los anillos formados. Gel con el Ac Pocito x G\(& Preparacién del gel Incorporacén Difusién —__Precipitacién de los delAg del Ag Inmunocomplejos El gel que ponemos en la placa puede tener cualquiera de los dos reactivos inmunes de forma homogénea por toda la base; en este gel realizaremos diferentes pocillos donde pon- dremos el otro reactivo, lo mas normal es que el gel presente anticuerpos y que en el pocillo coloquemos antigenos. El precipitado formado por los anticuerpos presentes en la muestra que colocamos en esta placa aparecerd en forma de anillo alrededor del pocillo central Inmunologia y serologia Inmunopatologia Sistema del complemento Sistema mayor de histocompatibilidad 186 ACTUALEACIONDE CONOCIMIENTOSE HEMATOLOGIA CLEA MAD 1. Inmunologia y serologia 1.1. Generalidades sobre la inmunologia Elsistema inmunitario (S}) puede dividirse desde el punto de vista funcional en dos niveles: a) Inmunidad innata: primera linea de defensa frente a agentes infecciosos; la mayoria de los agentes patégenos pueden controlarse antes de que se produzca una infeccién declarada. b) Inmunidad adaptativa: entra en accién cuando falla la inmunidad innata. labora una respuesta especifica para cada agente infeccioso y guarda memoria de él (puede impe- dirla reinfeccién), Otra divisién de la respuesta inmune: a) Inmunidad hum la sangre (Ad), al: es la inmunidad que se transfiere mediante el plasma o suero de b) Inmunidad celular: es la inmunidad que se transfiere mediante células de la sangre, timo, bazo, ganglios linféticos, etc. 1.1.1. Inmunidad innata 1.1. Limite exterior del organismo Elimite exterior de nuestro cuerpo suele ser una barrera efectiva para detener los micro- organismos patégenos. Esta barrera est compuesta por: a) Piel esta queratinizada y contiene microorganismos comensales que impiden el creci- imiento de patégenos. Ademas, las olindulas sebaceas secretan Ag que tienen accién bactericida. b) Lisozima (de la mayoria de las secreciones externas): hidroliza la pared celu- lar de las bacterias Gram+, rompiendo la unién entre el N-acetilmurdmico y la N-acetilglucosamina del peptidoglicano. ©) Meco de los epitelios de recubrimiento externo: que bloquea el paso de microorganismos d) Tapizado ciliar de la traquea: que arrastra alos microorganismos. ©) PH dcide del estémago, piel y vagina f) Espermicida del semen, 9) Gérmenes comensales del intestino, piel y vagina: que ocupan un nicho ecolégico, Los quemados pierden la barrera de proteccién, por lo que aumenta el riesgo de infecciones. MAD wnmuno.06i ceuLAR ANTIGEN ANTCUERPO 1.1.1.2. Fagocitos. Macréfagos y neutréfilos Son la primera barrera de defensa y sufuncién es fagocitary destruir particulas patégenas. Estén compuestos por: a) Células del sistema mononuclear fagocitico: = Macréfagos de los alvéolos, bazo, recirculantes y residentes de ganglios linfaticos. = Monocitos sanguineos. = Células A ~ Células de Kupffer del higado. = Células microgliales del SNC. = Macréfagos esplénicos, = Histiocitos: macréfagos de los telidos. = Osteaclastos del hueso, b) Glanulecites (PMN): neutréfilos, eosinéfilos. 1.1.13. Natural Killer (NK) Las NK son leucocitos que pueden reconocer los cambios de la superficie que se producen en algunas células infectadas por virus y ciertas células tumorales. Las NK se unen a estas cé- lulas diana y las destruyen (reaccién citot6xica) 1.1.1.4. Proteinas de fase aguda La concentracién sérica de las proteinas de fase aguda aumenta répidamente durante la infeccién y permanece elevada mientras ésta se encuentre presente. Por ejemplo: a) La proteina C reactiva (PCR): que reconoce y se une, por un mecanismo dependien- te del calcio, a los grupos moleculares existentes en una gran variedad de bacterias y hongos. En particular, se une ala mitad fosforicolina de la pared del neumococo y acta como opsonina, activando el complemento. b) Elsistema del complemento: es un grupo de 20 proteinas séricas cuya funcién global 5 controlar la inflamacién. Se activan por una cascada de reacciones enzimaticas que conducen a: = Opsonizacién de microorganismos. = Quimiotaxis y fagocitos. - Aumer 110 de flujo sanguineo e increment de la permeabilidad de la zona. = Lesién de la membrana plasmatica de virus, bacterias y células que hayan inducido la activacién. ©) Les interferones: son un grupo de proteinas importantes en la infeccién vitica 187 ACTUALEACIONDE CONOCIMIENTOSE HEMATOLOGIA CLEA MAD 1.1.1.5. Inflamacion Es la repuesta tipica de la inmunidad natural frente a los agentes agresores. Se producen tres acontecimientos: a) Aumento del riege sanguineo. b) Aumento de la permeabilidad capilar y formacién del exudade inflamatorio: por retraccién de las células endoteliales que permite la salida de elementos del S| hacia el lugar de la infeccién. 2) Quimiotaxis de leucocitos: hacia el lugar de la infeccién. Los fagocitos responden a un gradiente de concentracién de ciertas moléculas como CSa y C32, Los pasos son: ~ Pavimentacién del endotelio capilar. = Diapedesis o paso del endotelio capilar por seudépodos. = Movimiento ameboide por el tejido intersticia ~ Aumento de la fagocitosis inespecifica mediada por opsoninas como C3b. Tras la inflamacién aguda puede ocurrir lo siguiente: = Resolucién con retorno a una estructura y funcién normales. = Supuracién con formacién de abscesos. = Hinchazén con regeneracién de tejido especializado o fibrosos formando una cica- triz ~ Persistencia del agente causante, haciendo el proceso crénico. 1.1.2. nmunidad adaptativa o especiica Lainmunidad especifica se caracteriza por dos hechos esenciales: = Hay una memoria de cada encuentro con el antigeno, lo que hace que cada contacto posterior amplifique la respuesta, Esta es la base de la vacunacién, en la que se dan dosis repetidas de antigeno para educar al sistema inmune. = Amplifica los mecanismos protectores de la inmunidad natural, haciendo que los antigenos sean localizados en su lugar de entrada y eliminados mas facilmente, 1.1.2.1. Tipos de inmunidad espectfica La inmunidad se puede conseguir por dos mecanismos a) Inmunidad activa: introduccién de un antigeno que induce a una respuesta por el sistema inmunitario especfico, b) Inmunidad pasiva: transferencia de componentes de un organismo a otro que no est inmunizado. Este sistema se usa para bloquear un antigeno urgentemente. En estas ‘ocasiones se transfieren Ac producidos en otro individuo para neutralizar el veneno. 138 MAD wnmuno.06i ceuLAR ANTIGEN ANTCUERPO 1.1.22. Antigen Son sustancias extrafias al organismo capaz de producir respuesta inmunitaria, es deci, ‘capaz de provocar la aparicién de anticuerpos o de células que acttian sobre ella En la superficie del antigeno existen unas estructuras 0 fragmentos moleculares, que son los que verdaderamente van a reaccionar con el anticuerpo y con las células que las van a atacar. Estas estructuras se denominan determinantes antigénicos 0 epitopos. Un antigeno es més inmunogénico cuanto mis niimero de determinantes antigénicos posea Puede haber en un Ag varios determinantes antigénicos del mismo tipo o diferentes. Puedeen reaccionar todos con el anticuerpo 0 anticuerpos 0 no, El numero de determinantes antigénicos presentes en un Ag es la valencia total del antigeno. La composicién quimica del Ag puede ser variada, generalmente proteinas, pero también pueden ser lipidos 0 glicidos, siendo de menor poder antigénico, Son factores que afectan a la antigenicidad: ~ Naturaleza quimica: dependiendo de si son proteinas, glicidos o lipides, son mas 0 ‘menos antigénicos. = Complejidad: cuanto mas complejo sea el antigeno mayor poder inmunogénico, A mayor ntimero de aminoacidos mas inmunogénico. = Complejidad: cuanto mas complejo sea el antigeno mayor poder inmunogénico. = Conformacién: la configuracién espacial, es decir, la estructura terciaria de las protet- nas influyen en su antigenicidad. Algunos antigenos que quimicamente son iguales tienen diferente poder antigénico cuando varia la situacion espacial de algunos deter- minantes antigénicos. ~ Accesibilidad: cuanto més solubles es un Ag, mas poder antigénico tendré, ya que seré ‘mas accesible a todas las partes del organismo. ~ Concepto de extraio: generalmente las sustancias extrafias son las que provocan res- puesta inmunitaria, Serén mas inmunogenicas, las sustancias més distantes, evolutiva- mente hablando, entre el antigeno y el huésped. = Genética: la respuesta inmunitaria se encuentra bajo control genético. ~ Modo de administracién del antigeno: el hecho de que un antigeno induzca una respuesta inmunitaria depende de la dosis y de la forma de administracién. Antigeno: sustancia inmunégena con especifcidad antigénica: es toda molécula capaz de generar una respuesta del SI cuando penetra en el organismo y de reaccionar especificamente con los productos desarrollados en dicha respuesta. Son proteinas o polisacaridos de pesomo- lecular superior a 5.000 daltons. Existen varios tipos de antigenos dependiendo de su origen: ~ Heteroantigenos (xenoantigenos): cuando son extraiios ala especie a la que per rece el organismo (como los presentes en la superficie de las bacterias) = Isoantigenes (aloantigenos): propios de la especie, pero extrarios al individuo (como los grupos sanguineos) ~ Autoantigenos: pertenecen al propio individuo (situacién patolégica) 189 ACTUALEACIONDE CONOCIMIENTOSE HEMATOLOGIA CLEA MAD 1.1.23. Hapteno ‘Sustancia no inmunégena con especificidad antigénica: moléculas de bajo peso molecular (menos de 1000 daltons) capaces de reaccionar con un Ac determinado, pero incapaces de desencadenar por si mismas su produccién. Son determinantes antigénicos aislados. Puede hacerse inmunégena uniéndose a proteinas transportadoras (carrier) 1.1.24. Determinante antigénicoo epitopo Zona del antigeno en la que reside la antigenicidad: conformacién molecular de la superficie del Ag capaz de combinarse especificamente con una zona complementaria que existe en el Ac. Los Ac son especiicos para un Ag, pero un Ag puede tener varios Ac especificos. Cada Ac se acopla a una zona del Ag llamada determinante antigénico 0 epitopo; son formas moleculares reconacidas por los Acy las células del Sladaptativo especifico. Un Ag puede tener varios epitopos diferentes 0 idénticos. Los Ac son especificos para los epitopos y no para el Ag en su conjunto, 1.1.25. Adyuvante Sustancia que intensifica inespecificamente la respuest inmunitaria frente a un Ag, 1.1.2.6. Selecci6n clonal La especificidad del Sistema Inmunoldgico se basa en la especificidad de los Acyylos linfoci- 105, La cantidad de Ag que pueden ser reconacidos es alta porque hay linfocitos reconocedores de cualquier Ag en un porcentaje muy bajo. Cuando estas células reconocen el Ag, se induce una proliferacién hasta conseguir células suficientes para desarrollar una respuesta adecuada, ELAg selecciona los clones celulares capaces de fijarlo especificamente: a) Las eélulas B: estan preparadas para producir un solo tipo de Ac especifico de un Ag, que se sitda en la superficie celular como el Re (receptor) del Ag. EIAg se une al Rc apro- piado y provoca la proliferacién de las células B para producir = Célula plasméticas productoras de Ac. = Células de memoria de larga vida que no producen Ac ) Los linfocites T: estan involucrados en el reconocimiento de las células infectadas por virus, células cancerosas y reconocimiento de aloinjertos. El Ag se un al Rc adecuado y provoca la proliferacién de LT para producir LT activados y células de memoria, El sistema inmune produce Ac que pueden reconacer Ag antes de ponerse en contacto con él, Se producen tantos Ac que a mayoria no son reclamados nunca; pero este mecanismo se mantiene porque los microorganismos mutan continuamente sus Ag, Asi pues, el sistema inmune se earacteriza por: = Reconocer lo propio de lo extraiio, discriminando entre distintos tipos de Ag, = Sumovilidad, sus células y componentes pueden trasladarse a cualquier zona del cuer- 190 pe q MAD wnmuno.06i ceuLAR ANTIGEN ANTCUERPO ~ Las células que han reconocido a un Ag se reproducen répidamente aumentando la capacidad defensiva de este sistema, = Pose células que acttian como memoria, ya que son capaces de reconocer a Ag que previamente han estado en contacto con el organismo, Estas, a su vez, estan prepara- das para producir una respuesta mas répida, 1.2. Sistema linfoide 1.2.1. Organos linfoides El érgano hematopoyético es el productor de las células sanguineas, mientras que el 6r- gano linfoide es el érgano de produccién y diferenclacién de los linfocitos. El sistema linfoide std integrado por los érganos linfoides: = Primatios: timo y médula ésea = Secundaris: bazo, ganglios linféticos, amigdalas, apéndice vermiforme, placas de Peyer, adenoides, La médula 6sea es el Unico érgano hematopoyético y linfoide ala vez. 1.2.2. Funcién del tejido linfoide primario y secundario 1. Organos linfoides primarios o centrales Son érganos linfopoyéticos en los que se diferencian los linfocitos, desde células pri- mordiales, hasta células efectoras funcionales, a través de un proceso de proliferacin y ‘maduracién. En mamiferos son el timo, higado fetal y médula ésea adulta Aqui los linfocitos adquieren Rc antigénicos especificos para defenderse de los micro- ‘organismos y distingue lo propio de lo no propio. 2. Organos linfoides secundarios Son ganglios linfaticos, bazo y tejido linfoide asociado a mucosas. Son lugares donde se crea el ambiente necesario pare que los linfocitos puedan interaccionar entre si,con los Ag y las células productoras de anticuerpos, para dar una respuesta inmunitaria apropiada. También disemina la respuesta inmunitaria, 1.2.2.1. Organos linfoides primarios 1.Timo Se desarrolla a partir de la bolsa faringea. Se sitda en el t6rax, sobre el coraz6n y las arterias mayores. Es un érgano bilobulado; cada lébulo se organiza en lobulllos ofoliculos separados por trabéculas de tejido conjuntivo. Dentro de cada lobulllo se distinguen dos zonas = Corteza:es la zona donde el timo recibe las células linfoides primordiales, procedentes del higado fetal y la médula dsea. Estas células son CD7+, CD2+, CDS+, CD3c+, TDT+, y se instalan en la regién subcapsular. A la corteza Hlegan los precursores timicos (preti- a 192 ACTUALEACIONDE CONOCIMIENTOSE HEMATOLOGIA CLEA MAD ‘mocitos),y se instalan como protimocitos (10%) y timocitos comunes (80%); segtin van madurando, van pasando ala zona medular (timocitos maduros) que son CD4+ (RC de. 4c. hialurénico). De los timocitos, tan sélo un 5% son viables. La corteza es muy densa y contiene un alto porcentaje de timocitos inmaduros. = Médula: hay timocitos ya maduros que emigran hacia éreas T-dependientes de los 6r-

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