Professional Documents
Culture Documents
1 SM
1 SM
ABSTRACT
Algae is one of the primary producers in marine ecosystem whose existence in Indonesia is
quite abundant. Algae is the living place of various microorganisms that are symbiotic with it,
included bacteria. Endophytic symbiont bacteria of algae has potential as a candidate of antibiotic
producing agent, because it is able to produce bioactive metabolite that can inhibit the growth of
pathogenic bacteria. The objective of this study is to isolate and test the antibacterial activity of
endophytic symbiont bacteria of Halimeda opuntia, and to carry out molecular identification using
16S rRNA gene to identify the endophytic bacteria isolate that showing the greatest antibacterial
power. A total of 3 isolates of endophytic symbiont bacteria were obtained through the purification
process. The results of antibacterial activity test showed that all the supernatants of endophytic
simbiont bacteria isolates had inhibitory activity against the growth of pathogenic bacteria. The
mean diameter of the inhibitory zone against Escherichia coli were: Ho-B1 (6.86 mm) and Ho-B2
(8.53 mm) classified as intermediet, and Ho-B3 (4.36 mm) classified as weak. While the antibacterial
activity against Staphylococcus aureus bacteria were: Ho-B1 (6,15 mm) and Ho-B2 (6,84 mm)
classified as intermediet, and Ho-B3 (3,84 mm) classified as weak. The Ho-B2 isolate which had the
highest inhibitory index in the antibacterial activity test was identified molecularly as Bacillus sp.
ABSTRAK
Alga merupakan salah satu produsen primer di ekosistem perairan laut yang keberadaannya
di Indonesia cukup melimpah. Alga merupakan tempat hidup berbagai mikroorganisme yang
bersimbiosis dengannya, salah satunya ialah bakteri. Bakteri simbion endofit alga berpotensi sebagai
kandidat agensia penghasil antibiotik, karena mampu menghasilkan metabolit bioaktif yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan
melakukan pengujian aktivitas antibakteri dari bakteri simbion endofit alga Halimeda opuntia, serta
melakukan identifikasi secara molekuler menggunakan gen 16S rRNA terhadap isolat bakteri
simbion yang menunjukkan daya antibakteri terbesar. Sebanyak 3 isolat bakteri simbion endofit
berhasil diperoleh melalui tahap purifikasi. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa
supernatan ketiga isolat bakteri simbion endofit memiliki aktivitas penghambatan terhadap
pertumbuhan bakteri uji. Diameter rata-rata zona hambat terhadap bakteri Escherichia coli yaitu: Ho-
B1 (6,86 mm) dan Ho-B2 (8,53 mm) tergolong kategori sedang, dan Ho-B3 (4,36 mm) tergolong
kategori lemah. Sedangkan daya antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus yaitu: Ho-B1
(6,15 mm) dan Ho-B2 (6,84 mm) tergolong kategori sedang, dan Ho-B3 (3,84 mm) tergolong
kategori lemah. Isolat Ho-B2 yang memiliki indeks penghambatan tertinggi dalam pengujian
aktivitas antibakteri teridentifikasi secara molekuler sebagai Bacillus sp.
53
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
PENDAHULUAN
Alga/rumput laut merupakan endofit mirip dengan inangnya dan
sejenis tumbuhan tingkat rendah yang diduga sebagai hasil koevolusi atau
keberadaannya di Indonesia cukup transfer genetik dari inang (Tan dan
melimpah. Pemanfaatan alga dalam Zou, 2001).
bidang farmasi selama ini masih Pencarian bakteri endofit yang
terbatas, sedangkan potensi alga laut di banyak terdapat pada tumbuhan
Indonesia lebih khusus di Sulawesi dilakukan untuk menambah atau
Utara sangat besar. Potensi alga laut memperkaya koleksi mikroba.
Indonesia sangat besar untuk Selanjutnya mikroba tersebut perlu
dikembangkan sebagai bahan baku obat diidentifikasi untuk mengetahui sifat
karena mengandung senyawa bioaktif pertumbuhan dan jenisnya, sehingga
yang memiliki banyak manfaat. Salah lebih lanjut dapat dimanfaatkan di
satu contoh alga laut ialah Halimeda bidang kesehatan (Noverita et al.,
opuntia (Purnama et al., 2011; 2009). Dengan berkembangnya
Widiastuti, 2003). identifikasi mikroorganisme, maka saat
Mikroba memiliki jumlah yang ini identifikasi bakteri dapat dilakukan
sangat banyak dibandingkan dengan dengan metode berbasis molekuler
jumlah makhluk hidup lain di bumi. dengan menggunakan gen 16S rRNA.
Pertumbuhan mikroba, khususnya Penelitian ini dilakukan dengan
bakteri, banyak dijumpai dengan cara tujuan untuk mengetahui aktivitas
hidup berasosiasi dengan berbagai antibakteri dari mikroba endofit yang
organisme laut, salah satunya ialah alga diisolasi dari alga Halimeda opuntia.
(Wantania et al., 2016). Untuk Untuk mengetahui jenis bakteri endofit
mengambil senyawa bioaktif secara yang memiliki daya antibakteri terbesar,
langsung dari tanamannya dibutuhkan maka dilakukan analisis secara
sangat banyak biomassa atau bagian molekuler terhadap gen 16S rRNA.
dari tanaman tersebut. Untuk
mengefisienkan cara memperoleh METODE PENELITIAN
senyawa bioaktif tersebut, maka
Alat
digunakan mikroba endofit spesifik
yang diperoleh dari bagian dalam Masker, sarung tangan, snorkel,
tanaman yang diharapkan mampu fins, cooling box, zipper bag,
menghasilkan sejumlah senyawa erlenmeyer (Iwaki ST Pyrex), gelas ukur
bioaktif yang dibutuhkan tanpa harus mL (Iwaki ST Pyrex), tabung reaksi, rak
mengekstrak dari tanamannya. Mikroba tabung reaksi, pipet tetes, timbangan
endofit adalah organisme hidup yang analitik (ADAM), lumpang dan alu,
berukuran mikroskopis yang hidup di pisau, cawan petri (Iwaki ST Pyrex),
dalam jaringan tanaman (xilem dan jarum ose, pinset, rotary shaker
floem), daun, akar, buah, dan batang. incubator (Infors HT), bunsen, lemari
Senyawa yang dihasilkan oleh mikroba pendingin, cetakan sumur diameter 7
54
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
mm, laminar air flow (Biotek), autoklaf mikroorganisme epifit lain yang dapat
(ALP), mikropipet (Ecopipette), tip, L- mengontaminasi.
Glass, jangka sorong, kertas label,
Isolasi dan Purifikasi Bakteri
plastik wrap, aluminium foil, tisu,
Simbion Endofit
kapas, kasa, mikroskop cahaya, kaca
objek, seperangkat alat PCR (Biometra Penanaman bakteri endofit yang
T-Personal) dan elektroforesis bersimbiosis dengan alga dilakukan
(Biometra T-Personal), alat fotografi. dengan metode sebaran menurut
Madigan (2012). 1 gram sampel alga
Bahan
yang telah disterilisasi permukaannya
Sampel alga Halimeda opuntia, dihancurkan dengan cara digerus
bakteri uji Escherichia coli (ATCC dengan lumpang dan alu sampai halus.
25922) dan Staphylococcus aureus Selanjutnya, 1 gram sampel yang telah
(ATCC 25923), aquades, etanol 70%, halus tersebut dimasukkan ke dalam 9
etanol 95%, NaCl 0.9%, Natrium mL aquades steril sehingga diperoleh
Hipoklorit (NaOCl) 5,25%, media pengenceran sampel sebesar 10-1.
Nutrient Agar, media Nutrient Broth, Pengenceran bertingkat selanjutnya
antibiotik amoksisilin 0,1 mg/mL, dilakukan untuk seri 10-2, 10-3, 10-4, 10-
5
kristal violet, lugol, larutan safranin, kit , 10-6, dan 10-7. Dari masing-masing
isolasi DNA bakteri (Geneaid), primer seri kemudian diambil 100 µL dan
set (untuk bakteri), Master Mix untuk disebarkan ke dalam cawan petri steril
amplifikasi DNA (Bioline), ddH2O, gel yang berisi media NA dan diinkubasi
agarosa, TBE buffer 0.5x, dan etidium dalam inkubator pada suhu 27-29ºC
bromida. selama 1x24 jam. Koloni bakteri endofit
yang tumbuh diamati warna, bentuk,
Pengambilan dan Penyiapan Sampel
elevasi, tepian dan ukurannya. Koloni-
Sampel alga Halimeda opuntia koloni bakteri dipisahkan dengan jarum
diambil dari perairan pantai Malalayang ose berdasarkan perbedaan karakteristik
menggunakan alat bantu (masker, makroskopik dan mikroskopiknya pada
snorkel dan fins). Sampel dimasukkan media NA baru dalam cawan petri dan
ke dalam zipper bag dan disimpan diinkubasi pada suhu 27-29°C selama
dalam cooling box berisi es batu untuk 24 jam. Isolat yang telah murni
dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi kemudian dipindahkan dan disimpan
Program Studi Farmasi Fakultas pada media NA miring.
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Pengujian Aktivitas Antibakteri
Alam Universitas Sam Ratulangi.
Sampel diidentifikasi (secara morfologi) Bakteri simbion endofit
kemudian dibersihkan dengan air disiapkan dengan cara satu ose isolat
mengalir untuk menghilangkan kotoran bakteri endofit alga diinokulasilan ke
yang menempel dan dilakukan dalam 5 mL media cair NB dan
sterilisasi permukaan untuk diinkubasi selama 24 jam dalam rotary
menghilangkan pengotor maupun shaker dengan suhu 27-29ºC. Masing-
55
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
masing koloni bakteri simbion endofit Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan
dalam media cair kemudian PCR
dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge
Amplifikasi dilakukan dengan
dan disentrifugasi dengan kecepatan
menggunakan mesin PCR combi block
3000 rpm selama 30 menit. Supernatan
(whatman biometra Germany). Primer
yang terbentuk diambil.
yang digunakan untuk proses PCR yaitu
Pengujian dilakukan dengan
pasangan primer BKXF (forward) dan
metode difusi sumuran, yaitu dengan
BKXR (reverse). Cetakan yang
menuangkan 20 mL media NA ke
digunakan untuk amplifikasi gen 16S
dalam cawan petri steril dan dibiarkan
rRNA yaitu DNA genomik bakteri yang
memadat. Pada permukaan lapisan
telah diisolasi. Amplifikasi dengan
media pertama tersebut kemudian
teknik PCR dilakukan dengan variasi
diletakkan cetakan sumur secara aseptis,
komposisi reagen dan kondisi reaksi
kemudian dituangkan 20 mL media NA
PCR yang telah dimodifikasi.
yang telah dicampurkan dengan
suspensi bakteri uji ke atas permukaan Elektroforesis Gel Agarosa dan
lapisan media pertama dan didiamkan Visualisasi
hingga memadat. Selanjutnya, cetakan
DNA yang telah diamplifikasi
sumur diangkat dan ke dalam tiap
kemudian diseparasi dengan
sumur dimasukkan supernatan bakteri
elektroforesis gel agarosa 1%. Gel
simbion endofit, kontrol positif, dan
direndam dalam campuran larutan Tris-
kontrol negatif masing-masing
Borat-EDTA buffer dan etidium
sebanyak 50 µL. Pengamatan dilakukan
bromida. Visualisasi dilakukan dengan
terhadap zona bening yang tebentuk di
sinar UV pada UV-transiluminator.
sekitar sumuran setelah diinkubasi pada
Hasil deteksi didokumentasikan.
suhu 37ºC selama 1x24 jam dan diukur
menggunakan jangka sorong dengan Sekuensing Gen 16S rRNA
ketelitian 0.05 mm (Ortez, 2005).
Sekuensing dilakukan untuk
Diameter zona hambat yang terukur
menentukan urutan nukleotida pada
kemudian dikategorikan kekuatan daya
fragmen DNA yang terdeteksi dari hasil
antibakterinya berdasarkan
visualisasi DNA yang teramplifikasi
penggolongan kekuatan daya antibakteri
dalam proses PCR menggunakan mesin
menurut Davis dan Stout (1971).
autosequencing. Proses sekuensing
Identifikasi Bakteri Endofit Secara dilakukan dengan mengirim sampel ke
Molekuler First Base Pte. Malaysia.
Isolasi dan Pemurnian DNA Pengolahan Data Sekuens DNA
Isolasi DNA Genomik dari
Kromatogram DNA hasil
kultur bakteri dilakukan dengan
sekuensing disunting menggunakan
Genomic DNA Mini Kit (Geneaid) yang
perangkat lunak Geneious. Hasil
telah dimodifikasi.
sekuensing DNA kemudian dianalisis
56
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
57
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
15,00
(mm)
10,00
5,00
0,00
Ho-B1 Ho-B2 Ho-B3 Kontrol + Kontrol -
+ + +
+
- -
- -
Pengulangan 1 Pengulangan 1 Pengulangan 2 Pengulangan 2
+
+
-
-
Pengulangan 3 Pengulangan 3
Ket.: 1 = Isolat Ho-B1 + = Kontrol positif
2 = Isolat Ho-B2 Gambar 2. Hasil Pengujian Aktivitas Antibakteri
= Kontrol negatif
3 = Isolat Ho-B3
58
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
59
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
KESIMPULAN
1. Terdapat 3 (tiga) jenis bakteri endofit
yang berhasil diisolasi dari alga
Halimeda opuntia. Masing-masing
isolat diberi kode Ho-B1, Ho-B2,
dan Ho-B3.
2. Ketiga isolat bakteri simbion endofit
dari alga Halimeda opuntia
menunjukkan adanya kemampuan
aktivitas antibakteri terhadap bakteri
uji. Diameter rata-rata zona hambat
terhadap bakteri Escherichia coli
Gambar 3. Hasil Elektroforesis
yaitu: Ho-B1 (6,86 mm), Ho-B2
Produk PCR
(8,53 mm), dan Ho-B3 (4,36 mm).
Proses sekuensing dilakukan Sedangkan daya antibakteri terhadap
dengan mengirim produk PCR DNA ke bakteri Staphylococcus aureus yaitu:
First Base Pte. Malaysia. Data hasil Ho-B1 (6,15 mm), Ho-B2 (6,84
sekuensing yang diperoleh selanjutnya mm), dan Ho-B3 (3,84 mm).
dibuka dan disunting dengan 3. Bakteri endofit yang memiliki daya
menggunakan perangkat lunak antibakteri terbesar ialah isolat Ho-
Geneious. Berdasarkan hasil visualisasi B2 yang berdasarkan analisis secara
dalam perangkat lunak Geneious, molekuler dengan menggunakan gen
dipilihlah segmen DNA dengan kualitas 16S rRNA teridentifikasi sebagai
pembacaan terbaik. Urutan nukleotida Bacillus sp.
tersebut (sekuens query) kemudian
disalin untuk dianalisis menggunakan SARAN
program BLAST (Basic Local Perlu dilakukan penelitian lebih
Alignment Search Tool) yang diakses lanjut untuk identifikasi dan purifikasi
secara online melalui website NCBI senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). bakteri simbion endofit alga Halimeda
Hasil analisis BLAST menunjukkan opuntia, serta pengujian aktivitas
nama bakteri dan tingkat kesamaan antibakteri dengan menggunakan
urutan nukleotida dari DNA isolat bakteri uji yang berbeda.
dengan urutan nukleotida dari spesies
bakteri yang sesuai dalam database DAFTAR PUSTAKA
GeneBank. Berdasarkan hasil analisis Davis, W. W. dan Stout, T. R. 1971.
BLAST yang diperoleh dari sekuens Disc Plate Methods of
DNA isolat Ho-B2, diketahui bahwa Microbiological Antibiotic
isolat Ho-B2 dengan nilai score 725, Assay. Microbiology. 22(4):
659-665.
query coverage 100%, maximum
identity 97%, dan e-value 0.0 Kolondam, B. J. Primer BKXF dan
merupakan bakteri Bacillus sp. BKXR, (siap terbit).
60
PHARMACONJurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT Vol. 7 No. 2 MEI 2018 ISSN 2302 - 2493
61