Oo Promega Nota Técnica PCR Rapida em Menos de 1h com GoTaq® Rapid PCR Master MixNota Técnica GoTaq® Rapid PCR Master Mix 1. Resumo A PCR endpoint é essencial para a amplificagao de genes, e seu uso pelo mundo continua a crescer, junto com outras variedades populares de PCR (qPCR, ddPCR, etc.). A velocidade para chegar aos resultados tem se tornado cada vez mais importante nos estudos de screening de grande escala. Avangos recentes na tecnologia dos equipamentos j4 possibilitaram um tempo total de corrida mais curto, mas limitagdes na capacidade e velocidade dos reagentes ainda permaneciam um obstéculo. Atualmente, o proceso de PCR convencional pode levar mais de 90 minutos, e um programa “rapido” do equipamento pode melhorar esse tempo para, quando mais rapido, de 30 a 40 minutos. Demonstraremos uma master mix recentemente otimizada que 6 capaz de reduzir os tempos de reagao para menos de 15 minutos para amplicons menores ou iguais a 1kb. A especificidade permanece intacta, enquanto a velocidade da nova master mix permite que se realize o dobro de reagées no mesmo intervalo de tempo. Os resultados em comparacao com as master mixes “répidas” existentes mostrardio maior rendimento e amplicons mais longos. Assim, os usudrios podem diminuir significativamente o tempo de resposta para reacdes de PCR endpoint, sem comprometer a sensibilidade ou especificidade. 2. Escolha do Termociclador Pesquisadores que realizam endpoint PCR podem utilizar termocicladores de diferentes marcas e modelos. De forma geral, quanto mais alta a taxa de rampagem de temperatura do instrument, mais répida a reagdo. A nova GoTaq® Rapid Master Mix foi desenvolvida e otimizada para uma taxa de rampagem de 10°C/s, mas jé foi testada e validada em 5 dos termocicladores mais comuns do mercado, cada um com uma taxa de rampagem diferente, e conseguiu acelerar os resultados em todos eles. Marca/Modelo Taxa de ‘Tempo total de corrida* doTermociclador © Rampagem ——3-stepwasterixcConvencionl —»«3-Stop GoTaq Rapid ——-2-StepGoTaq Rapid © PROMEGA BRASIL - RUA 83. Procedimento de Amplificagao Rapida 50 ng de Total Human DNA (Promega #G3041) foram usados como modelo para a amplificag&o de mUitiplos fragmentos de microglobulina Beta 2 humana (B2M), de E. coli 16S ribossémico (Zeptometrix) e de genes C. albicans KER1 (ATCC), usando GoTaq® Rapid Master Mix. A GoTaq® Rapid Master Mix foi preparada em tubos de polietileno Fast PCR (Eppendorf #0030124928) e amplificada usando um Eppendorf Mastercycler® X50s, nas condigdes de ciclagem abaixo. A amplificagéo também foi realizada usando GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix (Promega #M7433) e Thermo Fisher ProFlex Descrigao Ciclos Tempo Temp. Ativagao. 1 1 min 94°C Desnaturagéo 2seg 95°C 35 Hibridagdo / Extensao 6 seg 65°C Alongamento 1 1 min 72°C BRASIL - RUA Promega "i pronegs.comar4. Faixas de Gel de Alta Clareza em Diferentes Amostras DNA genémico humano foi amplificado 2x GoTaq Rapid Hot Start 2X GoTag G2 Hot Start usando a GoTaq® G2 Hot Start Colorless Colorless Master Mix Colorless Master Mix Master Mix ja existente no mercado e a nova GoTaq® Rapid Master Mix. O Thermo Fisher PROFLEX PCR System amplificou ambas as re: gées usando um programa rapido e um procedimento de ciclo modificado, ao longo de 35 ciclos. Os produtos de PCR foram detectados por eletroforese em gel de agarose 2% usando brometo de etidio visualizados usando 0 BioRad GelDoc XR + A GoTag Rapid exibiu clareza de banda vivida 0 prdutos da amplticaco do DNA gondiea cumparaoe van GTag® apd (equ una Master Mid para produtos de amplificagéo duas vezes — Sistentem mercado GaTaq® 62 Ht Sat nel (det), usando mais longos do que aqueles produzidos pela °F: Gag fepd sun hme she FRO EFET Syst. GoTaq® G2 Hot Start Colorless Master Mix ° A seguir, a GoTaq Rapid amplificou amostras de trés genes de modelo de organismo usando © Eppendorf X50s e seu programa Fast com nosso procedimento de ciclagem modificado, novamente ao longo de 35 ciclos. Os produtos de PCR foram submetides aos mesmos métodos de eletroforese em gel acima. A especificidade foi mantida em todas as amostras testadas, apesar da complexidade varidvel do organismo. Organismos com complexidade decrescent xibiram uma relagdio inversa com a amplificagéo do comprimento do par de bases quando fornecido o mesmo tempo de amplificagao total. Mais notavelmente, o produto de E. coli exibiu bandas proeminentes no limite da faixa testada ((b), abaixo; aproximadamente 1.600 bp) e pode se aproximar de 2 kb com um aumento modesto no tempo de extensdo, reer Oe Imagens de gel de produtos de amplificaco completos usando GoTaq ® Rapid Master Mix com Eppendorf Mastercycler As amostras incluiram (a) Microglobulina Beta 2 humana (B2M), (b) genes ribossémicos 16S de E. coli ¢ (c) genes KER1 de C. albicans, 0 tempo total de amplficago usando Eppendorf X50s foi de aprox. 13 minutos.5. Menos Tempo até o Resultado Enquanto algumas reagdes de PCR endpoint podem demorar de 90 a 120 minutos para completar 35 ciclos de amplificagdo, GoTaq Rapid pode concluir o mesmo procedimento em 15 minutos ou menos ao usar um termociclador com uma taxa de rampagem de temperatura alta. Enquanto isso, um termociclador com configuragao de programa “Fast"v e rampagem de 3°C/s amplificaré o mesmo ntimero de ciclos em aproximadamente 45-60 minutos. Considerando que o tempo de amplificagao tipico necessério para um amplicon com menos de 2 kb de comprimento é em torno de 90-120 minutos, a implementagao do GoTaq Rapid em qualquer um dos cendrios apresenta economia de tempo significativa para o pesquisador, sem afetar a especificidade da amostra. © comprimento do amplicon de saida foi comparado ao tempo total de ciclagem usando Human B2M e o Eppendorf X50s. Para fragmentos menores (<1kb), 0 tempo total de ciclagem necessério pode ser reduzido para 12 minutos ou menos ao se diminuir o tempo de ciclagem da etapa de extensdo. A mesma ldgica de tempo se aplica a outras amostras de menor complexidade. Para fragmentos maiores (12kb), embora eles exijam um tempo de extensdo um pouco mais longo, o impacto no tempo total é relativamente pequeno. Tempo de Tempo de Ciclagem Total 2 seg Extensao (seg) para 35 ciclos (min) 4seg 2 1 4 12 6 seg 5 3 8 14 Beg 10 15 Mudar 0 tempo reservado para a etapa de extensio permite visualize 0 tempo necessério para amplificar 0 amplicon alvo usando a GoTaq® Rapid M: Comparagao do tempo de extensdo relative necessario para produzir bandas do amplicon alvo em gel de agarose a 2%, 0 tempo € os ccomprimentos do amplicon s ‘amplificagdo de B2M humano. ster Mix com Mastercycler ® X50 da Eppendort 10 sec © rrowes!6. O Futuro da PCR Raj A Promega continua testando a GoTaq® Rapid Master Mix com diferentes amostras e instrumentos com taxas de rampagem mais baixas. Anova master mix diminui significativamente © tempo necessario para termocicladores que possuam programas “Fast”, mas a maior economia de tempo ocorre em instrumentos com taxas de rampagem de temperatura mais altas. Acreditamos que a recém-desenvolvida velocidade da GoTaq Rapid tera um impacto duradouro em rotinas de escala high-throughput, especialmente em periodos excepcionais como o do SARS-CoV-2, reduzindo o tempo necessério para a andlis ompleta de amostras. 7. Referéncias Gerke, N., & Phang, A (2017). Eppendorf AG, Hamburg, Germany. Comparative Run Time Evaluations of PCR Thermal Cyclers.htps:/Wwww. eppendorl.com/product-media/doc/en/4926%Eppendort PCR Application Note 274 MC pro S MC nexus MC-X50 Evaluating speed PCR thermal cyclers, pdf UO (Research Use Oniy). Promega, a logomarca Promega, © GoTaq séo matcas regisradas da Promega Corp., USA. Eppendort®, 0 design da marca Eppendor, Mastrcycer @ e Eppendor twin tec @ so marcas registrades da Eppendort AG, Germany. Thermo Fisher e PROFLEX so marcas regstradas da Thermo Fisher Scientific, USA fon rE = GoTaq® Rapid PCR Master Mix 1.000 ensalos _CS3083A01 GoTag@ Rapid PCR Master Mix too ensalos —_-OS3088A02 ‘Componentes do kit CS3083A01 Volume Nucleaso-Free Water 1x19 GoTaq® Rapid POR Mastor Mic 2x 10m Componentes do kit CSa08A02 Volume Nuclease-Free Water 11,25 ml GoTaq® Rapid POR Master Mx 2xim Pega uma cotagao: cotacao.brasil@promega.com > /A BRASIL + RUA GARAO DO TRIUNFO, 8¢ + CJ. 1402 + 04002-000 + SAO PAULO, SP + +55 Promega — Hn pTimep.cn. =a ercryan © SAT aCRTO- TOK BORER RCS ESRC TS