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    yr vill. LA TECNOLOGIA DEL ADN cartTuLo 1s HERRAMIENTAS DISPONIBLES | ADN engloba una serie de procedimientos para extraer, Cor Laver ae identifica, amplificar y secuenciar al ADN. Estas téc- as simak My grlladas a To largo de un década (1985-1995) ries hoya conjunc de etramiens re adas de rutina en los l- pontoros generalmente ¢ sistemas automatizados disefiados ad hoc para cfecuar rapidamente Un ntimero altisimo de operaciones. LAEXTRACCION DEL ADN to relativamente simple. De modo branas libera el contenido celular, antes de separar el ADN; que pre rata de diversas Laextraccin del ADN es un procedimien gener, la rupeura de las paredes y mem del cual se eliminan el ARN y las proteinas pita con alcohol. Una ver extraido y purifcado, el ADN set maneras. Hay por lo menos una treintena de empresas que comercializan diferen- tes tipos de kts para la extraccién de dcidos nucleicos, protocolostradicionales por sistemas més féciles de automacizar reemplazando a los LAS NUCLEASAS Y LAS ENZIMAS DE RESTRICCION are co enzimas utilizadas diariamente en los laboratorios, las ey atencién especial. Estas enzimas rompen las uniones ttemos, eee | una cadena de ADN; algunas comienzan por los ex- car dine ane pea cares otras cortan a la molécula por adentro. A peer (endonue easas) pertenecen las “enzimas de restriccién’, Notmalmente, las nar an en sitios espectficos. ; ee eee restriccién son producidas p fensa conta el ataque de virus (bacteridfagos). ya que al cor- yor bacterias, Co- 137 Biotecnologia ‘ar al ADN viral impiden su multplicacién. El ADN bacteiano no ¢s por sus propias enzimas, ya sea porque no posee las secuencias corres, tes 0 porque ls secuencias estin camufladas ginando dos fagmentos de exremos que sobressen (protruyentes)y 4 sGAATIC » at ee . ‘ 5 sores S OrTAR 1 separa los fragmentos obtenidos al cortar el ADN con enzi- icin, Las muestras fos negativament, los fragme al encontrar menos resi El poder de separacién v: orte (gel de agarosa o de poliacri- lamida), cuya concentra cl tamafio del poro. También varia on las caracteristicas del campo eléctrico aplicado. Los fragmentos de restrccién forman bandas que pueden observarse ala luz Uulaviolea, después de la tincidn con una sustancia fluorescente. Al mismo ‘empo, s siembra en el gel una mezcla de fragmentos de tamafio conocido que sirve como patrén de comparacién, Como una “regla molecular, estos fragmen- ‘os permiten la estimaci6n del tamatio de las bandas de tamafio desconocido. ras aplicaciones de la electroforcsis de los fragmet estudio de los polimorfismos. Un cambio cn dl sitio de restriccién de una molécula de ADN (como por ejemplo, de psoas 1 Hsiao aero ‘spo Frac de Le bandas por mpcién ©) Migacin de dents reed Deeg fens de recon ove pl st \ a —— SO BOSS Se ras -- = Lg yee _— | GAATTC a GAACTO) origina fragmentos de tamafio diferente, denomins- dos RFLP (del inglés, 3 fragment length polymorphisms). Los RFLP son marcadores que pueden ser estudiados como cualquier gen asociado a un ‘aricter visible o una modificacién bioquimica (Figura 2). Hibridizacién y sondas génicas Cuando el ADN se coloca en determinadas condic snes de temperatus H © concentracién salina, las cadenas de la doble hélice se separan. La separa~ «dn se debe a que los puentes de hidrégeno entte las bases complementaras 139 Biotecnologia FIGURA 2. Polimonfsmas de resticcisn ‘Una mutacin puede generar dos allo diferentes; tun sitio de restiein. En la lectroforsis l ADS tuna banda el de ATA2 como tes bandas y el de A2A2 como dos nr dria fags Diep Sti deride 56S == cmt cet cas Wf dem decent tein N tL s > SS > cmt cand cas erocigos Momecigaa Homecigts f€ rompen. Pero si se vuelve alas condiciones iniciales, esos enlaces se rees- tablecen y las eader ARN de diferente origen y tamat complementarias. En funcién de simple cadena de ADN 0 ARN de secuencia cono generalmente marca- dos radiactivamente. Estos fragmentos se usan como sondas para reconocet 4a presencia de una secuencia complementaria en un cromosoma o en un segmento de ADN (Figura 3). 40 La técnica de Southern En 1975, E. M. Southern describié un método para analizarfragmentos de restricci6n usand de ADN. Una vex separados por elecuroforesis, los se transfieren a una membrana de nylon o de nitroceluloss. La in de una sonda radioactiva con su secuencia blanco se registra en tuna placa o film apropiado (Figura 4). EI método, denominado Southern blovrng, ha sido utlzado para el diagnéstico de enfermedades genéticas, algunas de las cuales son causadas pot mutaciones que al eliminar 0 crear un sitio de restticcién, modifican el pan de bandas. Luego se disefiaron métodos andlogos para estudios de ARN (Northern bloring)y de proteinas (Western blotting). En el primer caso la sonda es un fragmento de cido nucleico, en el segundo, un anticuespo especiico, La técnica de fingerprint Deserta por A. Jeffrcys en 1985, la técnica es una varinte del método de Souther, focalizada en las regiones del genoma que no se expresan, acumt- lando mutaciones que le confieren a cada individu una secuencatnica (ex- ‘eptuando a los gemelos). Muchas de ellas son secuencias epetidas que estin dispersas alo largo del genoma. femeae: Fewominan Vere (dl inglés, variable number of . tandem repeats) puede varar entre cromosomas homélogos correspondien- tes tendrén un sis (Figura 5). ; Al aumentar el ntimero de sondas para el reconocimiento de otros tipos “ Caploulo VIM. La tecnologia del aD Biotecnologia —— FIGURA 4. El método de Southern AGURA 5. Ls polimorfismos de vcr 1. Preparci ds gmc de icin ea 2 Suen elf erica ee 08 Dine arb ides fms al gc FS A [armcinndeaon bee Cl [| Cl waaay \ Mwai 1 23 Eames | ‘ooo coo 7 RD | eam ein | ; ‘ (| —oo0- cot a, >| - Se span os agents ‘ deren por decors ‘aun! Cos 3 ; ; | 2] +f @ 33 erence de VNTR, se obtiene un perfil de bandas individual, parecido al cédigo de ba- Fras que se usa en el comercio. Ast como las impresiones digitales identfican a las personas, as sondas revelan la i LASINTESIS ¥ AMPLIFICACION DEL ADN Sintesis de oligonuclestidos \ FET spt de tat par clininar co q t ean cloca sare Ianesnbrant ‘na plies enile a laren de bases (Figura 6) oligonucledtidos pueden ser usarse como sondas 0 como primers (cebadores) para la PCR (véa- 8 un poco mis adelante). 142 13 _ ll Biotecnologia is de olgonvelestidos Bae? ase? ° e Sef! pene Beaded fo Sintesis de ADNe ay una enzima de origen viral que transcribe la informacién en el sentido ARN —* ADN, Esta enzima, denominada t virus con un genoma de ARN (como el HIV, por ejemplo) multiplicarse en el hhospedax ‘ARNm de la protefna de 10 de seda. la seda 0 fibroina se fabricacién de hebras de ADN complementarias (ADNc) a cualq la de ARN (Figura 7). Cabe destacar, que a diferencia del gen original, no ha- bf intrones en el ADNc construido a partir del ARN. La reaccién en cadena de la polimerasa La reaccién en cadena de la polime 5 un método que permite obtener (polymerase chain reaction, o PCR) nes de copias de ADN en pocas ho- 44 cs Cadena dete de AD or) Stes de una rsevs cadena de ADN Degrndaci del ARS Sites del ADN complemencasio — “Teamcsipas reves ae ara eso se requiere el ADN que contiene la secuencia que se car, de los cuatro tipos de desoxinucleétidos (dATP, dTTP, dCTP rasa y de los primers (cebadores) correspondien- mers son pequefios fragmentos sintéticos de ADN, complementa- extremos de la secuencia blanco e indispensables para que la polimerasa comience a sintetizar a la cadena de ADN.. ‘La clave del proceso es la ADN-polimerasa. Se usa la de la bacteria Ther- ‘mus aquaticus que al ser estable aaltas temperaturas, le permite a la bacteria o ‘en aguas termales. Actualmente, esta enzima se produce por inge- nierfa genética, de tio deo que comprende varios cambios de temperatura as ademas ___Una de las grandes ventajas de la PCR es que no es necesario aislar pre- viamente el fragmento a amplificar, alcanza con conocer los extremos de la Secuencia a amplificar y el ‘mers adecuados. El procedimiento, que * reaiza de forma total izada, admite miltiples variantes. 45 ee Biotecnologia FIGURA 8, La reccidn en cadena del polimerasa Un apaato de Pox puede elisa 25 cds en menos de una hora, ‘ces el fragmento de ADN seat Mes dem mccain indo a cadena y permiendo dele ADNpolimerss Lr ambi de Itt Moléals Denisa Apaeamiento egal dcledoblecaena delved Posconis Gas) HHH Dos copie oe Car pias I-AA Cas copia i Ocho coat, 46 Capitulo VO a i te de la compré a sa inventor, K. Mullis Ta pares cremdoxcla al poco tiempo a Hi fmann-LaRoche emo se tata hoy de una técnica corriente En logla molecular, es probable que ‘Mas tarde, en 1993, K. Mullis rec dela PCR mpleada con diversos ‘ura, la medicina, la veterinat iy la medicina forense. Entre sus muchas ‘antropoldgicos y evolutivos, tales como la “ic momias egipcias, de animales extinguidos como el ebm) 0 de insectos atrapados en el Ambar 40.000.000 be ci cexsraccion de ADN aquagga (un tipo de deafios atrés. LASECUENCIACION DEL ADN Desarrllado por F. Sanger en 1977, la secuenciacin de un fragmento de [ADN es también un procedimiento de tipo iterativo que puede llevarse a c3- {os automatizados capaces de realizar répidamente el trabajo Bristen hoy secuenciadores capilares auromatizados donde un brazo ro- bot coloca el gel en los caplares y agrega el ADN, efecruando la limpieza des- pués dela electoforesis. En el afio 2000 extos secuenciadores permit el tratamiento de una centena de muestras en cuatto horas, sin exgir més de 15 minutos diarios de atencién humana, ‘Una vez determinada la secuencia de varias mucstras, se ensambla la in~ formacién almacenada en los bancos de datos, Esta etapa se realiza en super computadoras, y exige un tratamiento matemético para ordenar as seevenchs, complet ls “laguna” y vesifiar los ats Se calculaba que en slauge del escuio del genoma humano, una empress relacionada con Cele- "2 (Bayes Applied) manteni sus computador funcionando dia y no- llegando a gastar en electricidad USS 1.000.000 mensuales. 47 4a ncn ushers Biotecnologla FIGURA 9. Secuenciacién de un fragmento de ADS’ EL sinema automatizado permite identificar en la corvida elecroforética a los cuato didesxinuclestidos,generando directamente la secuencis del one secuenciado He fagments 1. Pepa numero opin dl agent erdir elgacriesacas (Gamat spied 500g) 9 a ; Sree Tierenteerery 2. Iai a ppc com molec pr lines ppt daesincbdon mara por orocenn con semen ee LELE + ADNptmens +, Dessinucetides 4 Algunosdidesoxinuclete HL + 8 hace aoe SE cm *alseteaiatt 3. Iara sss de as adena complementarins,que see Mogueda,

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