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BASES DA MEDICINA CELULAR E MOLECULAR

ROTEIROS AULAS PRÁTICAS

BACTERIOLOGIA

2011
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Docentes:

Beatriz E. Cabilio Guth: bec.guth@unifesp.br

Rosa Maria Silva: rmsilva01@unifesp.br

Sylvia C. Leão: sylvia.leao@unifesp.br Coordenadora

Tânia A. Tardelli Gomes do Amaral: tatg.amaral@unifesp.br

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REGRAS DE CONDUTA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas práticas de bacteriologia foram planejadas para mostrar a você, estudante

de Medicina, os princípios e os métodos clássicos utilizados em laboratórios de diagnóstico
microbiológico. Nessas aulas, você trabalhará com uma variedade de bactérias, algumas
patogênicas para o homem. É, portanto, essencial que você siga as regras de segurança
estabelecidas para um laboratório de microbiologia, a fim de evitar contaminações do grupo
ou de funcionários.

1. Desinfete sua bancada no início e ao término de cada aula prática. Com isso, estará
destruindo os microrganismos que poderão contaminar suas culturas e os que tenham
contaminado a área de trabalho.

2. Não coma nem fume no laboratório. Se a bancada ou o equipamento tiver sido

contaminado acidentalmente com qualquer microrganismo, comer ou fumar é um meio
eficiente para uma autocontaminação.

3. Use sempre o avental. Se ele acidentalmente ficar contaminado, não deve ser utilizado
fora do laboratório.

4. Lave as mãos ao sair do laboratório.

5. Avise o professor em caso de contaminação acidental.

6. Não coloque materiais contaminados (pipetas, lâminas, etc…) sobre o balcão.

Sempre haverá um recipiente próprio para colocá-los.
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1ª Aula: CULTIVO. MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS

COLORAÇÃO DE GRAM

Esta coleção de experimentos práticos será desenvolvida em três dias, tendo como
objetivo introduzir o aluno às técnicas de cultivo, isolamento e identificação presuntiva
de diferentes espécies bacterianas.
Nossa proposta é que as espécies bacterianas contidas em uma mesma cultura
sejam isoladas e identificadas por meio de provas bioquímicas, a exemplo do que ocorre na
identificação de patógenos bacterianos presentes em material clínico proveniente de sítios
contendo uma microbiota normal.

1º dia: 26/04/2011

• CULTIVO BACTERIANO
As bactérias podem ser cultivadas em meios líquidos ou meios sólidos. Os meios
de cultura podem ser seletivos quando contêm uma substância que inibe o crescimento de
um determinado grupo de bactérias, mas permite o crescimento de outras. Alguns meios
sólidos são chamados diferenciais quando permitem diferenciar colônias que apresentam
propriedades distintas.

Exercício 1:
Compare as culturas A, B, C e D semeadas anteriormente em meio líquido, entre si e
com o conteúdo de um tubo contendo o mesmo meio de cultura não inoculado.
Você consegue identificar em qual delas houve crescimento bacteriano? Por quê?

É possível identificar se estas culturas bacterianas são culturas puras?

Exercício 2:
a. Homogeneíze as culturas crescidas em meio líquido e semeie cada uma delas em
placas de Petri contendo Ágar nutriente, Ágar sangue e Ágar MacConkey, para
a obtenção de colônias isoladas, de acordo com as instruções do professor e a
descrição do esquema a seguir.

b. Identifique as placas com os números do laboratório e da turma e entregue-as ao

monitor para que sejam incubadas até o dia seguinte, em estufa a 37ºC.
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chemistrydaily.com

2o dia: 27/04/2011

Observe cada uma das culturas A, B, C e D, semeadas nas placas contendo meios
sólidos. É possível agora verificar se alguma delas é uma cultura bacteriana pura? Por quê?

Exercício 3:
Observe novamente as placas semeadas e responda:
1. Ágar nutriente:
a. Houve crescimento de colônias?
b. Que coloração apresentam as colônias crescidas?

2. Agar sangue:
a. Houve crescimento de colônias?
b. Que alterações você observa no meio?
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3. Agar MacConkey:
a. Houve crescimento de colônias?
b. Que coloração apresentam as colônias crescidas?
c. Houve fermentação da lactose? Em quais colônias?

Exercício 4:
a. Realize um esfregaço de uma colônia crescida em MacConkey e de uma colônia
hemolítica crescida em Ágar sangue, de acordo com as instruções do professor e as
orientações abaixo.
b. Repita o procedimento para fazer um esfregaço de material colhido de mucosa
oral, com cotonete.
c. Realize a coloração de Gram, conforme as instruções.

• COLORAÇÃO DE GRAM
http://www.youtube.com/watch?v=YvZHHNZ8cdo&NR=1
http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm
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A coloração de Gram (Hans Christian Gram, 1884) diferencia bactérias em Gram-

positivas e Gram-negativas. Organismos Gram-positivos e Gram-negativos se diferenciam
drasticamente na organização das estruturas externas à membrana plasmática.

PREPARO DO ESFREGAÇO

1. Coloque uma gota de solução salina sobre uma lâmina de

microscopia.
2. Com palito esterilizado, toque uma colônia isolada e suspenda-
a na salina.
3. Homogeneíze a suspensão e espalhe-a sobre a lâmina, de
forma a obter uma camada homogênea e pouco densa
(esfregaço).
4. Seque o material ao ar e fixe levemente passando rapidamente
sobre a chama do bico de Bunsen.
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COLORAÇÃO

1. Cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta.

2. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia.
3. Cobrir a lâmina com lugol (KI + I2).
4. Aguardar 1 minuto e desprezar o corante na pia.
5. Inclinar a lâmina e gotejar álcool etílico a 95% até que não haja desprendimento de
corante.
6. Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.
7. Cobrir com fucsina de Gram.
8. Aguardar 30 segundos.
9. Lavar a lâmina e secar com papel (sem esfregar).

3º Dia: 28/04/2011

Exercício 5: Exame ao Microscópio

Inicialmente, focalize com as objetivas de menor aumento e depois coloque uma gota
de óleo de cedro sobre o esfregaço e focalize em imersão (o objeto é aumentado 1000x).
Observe o tipo de coloração (Gram + ou Gram -), a forma e o tipo de arranjo das bactérias
fornecidas.

Ao término da observação, limpe a objetiva de imersão com papel absorvente.

RESPONDA
- Como se explica a diferença de coloração das bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas?

- O que aconteceria com uma bactéria Gram-positiva tratada com lisozima (hidrolisa as
ligações entre açúcares da camada de peptideoglicano, desestabilizando-a)?

- Qual a utilidade prática da coloração de Gram para o médico?

- Que outros elementos você pôde observar no esfregaço de mucosa oral?

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2ª Aula: EXPERIMENTOS DE GENÉTICA BACTERIANA

1º dia: 04/05/2011
Os experimentos delineados a seguir demonstram a ocorrência de alteração genética em
uma das bactérias utilizadas. O objetivo é determinar qual bactéria foi modificada e qual(is)
evento(s) genético(s) poderia(m) explicar o resultado obtido.

Amostras bacterianas utilizadas e suas características relevantes

Marcas de Resistência*
Amostra Fermentação de
lactose
A [E.coli J53 (pR1)] lac + EST, CLO, AMP
B [E. coli C600] lac _ NAL

* EST = estreptomicina, CLO = cloranfenicol, AMP = ampicilina, NAL = ácido nalidíxico

Experimento 1:
As duas culturas bacterianas serão colocadas em contato, de acordo com as
condições abaixo:

I- Em um tubo de ensaio adicione:

- 1 ml de cultura em caldo TSB da amostra A
- 1 ml de cultura em caldo TSB da amostra B
- 1 ml de caldo TSB
II - Incube essa mistura (M) bem como as culturas parentais (A e B) a 37oC,
durante 1 hora pelo menos.

Experimento 2:
Utilizando alças estéreis, semeie as
amostras A, B e a mistura M em placas contendo
meio seletivo MacConkey (NAL 50 μg/mL + AMP 50 μg/mL), A
de acordo com o esquema abaixo.
M
Para controle de viabilidade, semeie as mesmas
culturas no meio de MacConkey sem drogas.
B
o
Incube as placas a 37 C por 16-18 h.
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2º dia: 05/05/2011

Leitura do experimento 1

I - Registre os resultados obtidos

Bactéria crescimento em meio crescimento em meio Fermentação
sem droga com droga de lactose
A
B
M

II - Compare as características das colônias crescidas e responda:

- Quem é a bactéria crescida na placa com droga?

- Neste momento, quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido?

Experimento 3:
Determine a resistência das amostras A, B e M (resultante da mistura semeada em
meio seletivo) para as drogas Ácido Nalidíxico (NAL), Estreptomicina (EST), Cloranfenicol
(CLO) e Ampicilina (AMP), utilizando o seguinte protocolo:

• com palito estéril, pegue algumas colônias crescidas na placa com droga
(M) e semeie em placas de MacConkey contendo cada droga isoladamente, nas
concentrações de: NAL = 50 µg/ml, AMP = 50 µg/ml, CLO = 30 µg/ml, EST = 20 µg/ml.
• faça o mesmo com as amostras A e B.
• Incube as placas a 37ºC por 16-18h.
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3º dia: 06/05/2011
I - Faça a leitura do teste de resistência, observando presença ou ausência de
crescimento bacteriano nas placas com droga. Observe também a capacidade de
fermentação da lactose. Preencha a tabela abaixo:

Crescimento na presença de
Bactéria NAL EST CLO AMP Padrão de Fermentação
Resistência de lactose
A
B
M

- Em vista dos resultados obtidos, qual das hipóteses que você considerou
anteriormente seria a mais viável para explicar o ocorrido? Por quê?

- Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos moleculares?

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3ª Aula: ANTISSÉPTICOS E HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

Como exemplos de processos de antissepsia serão utilizados antissépticos comerciais de

uso corrente.

1º dia: 04/05/2011
Experimento 1:

A. ANTISSÉPTICO PARA ENXAGUE BUCAL

Dividir uma placa de ágar sangue em três partes, marcando t0, t1 e t2.

t0 t1

t2

Friccionar um cotonete estéril na mucosa da bochecha e semear em t0, em zigue-zague.

Bochechar com parte da solução fornecida por 1 min. Aguardar 3 min e repetir a coleta de
material, semeando em t1.

Bochechar novamente por 1 min, aguardar 3 min e semear em t2.

As placas serão incubadas a 37o.C.

Experimento 2:

B. HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

Abrir a placa com o meio voltado para baixo e colocar dois dedos na superfície do meio no
quadrante b, com cuidado para não romper o agar. Esperar 15 segundos e fechar a placa
sem virar.
a b

c d

Lavar as mãos com água e sabão líquido, secar com papel absorvente e colocar os mesmos
dois dedos no quadrante c, com cuidado para não romper o agar. Esperar 15 segundos e
fechar a placa sem virar.

A seguir, colocar álcool 70% na outra mão em concha e submergir os mesmos dois dedos
por 1 min no álcool. Esperar que os dedos sequem sem usar papel absorvente. Colocar os
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mesmos dois dedos no quadrante d, com cuidado para não romper o agar. Esperar 15
segundos e fechar a placa sem virar.

As placas serão incubadas a 37ºC.

2º dia: 05/05/2011

LEITURA DOS EXPERIMENTOS

Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento em cruzes (+ a ++++).

Crescimento

Antisséptico bucal t0 t1 t2

Higienização das mãos b c d

Como você interpreta os resultados observados com antisséptico bucal?

Como você interpreta os resultados observados com o experimento da lavagem das mãos?
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4ª Aula: ANTIBIOGRAMA

O antibiograma é o método utilizado em laboratório de análises clínicas para avaliar

o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de bactérias isoladas de processos
infecciosos.
Após processamento microbiológico do material clínico colhido do paciente (p/ex.
urina, secreções diversas - de orofaringe, vaginal, uretral, etc., aspirado brônquico, entre
outros), a(s) bactéria(s) suspeita(s) isolada(s) freqüentemente deve(m) ser submetida(s) à
análise de seu perfil de susceptibilidade para que o médico possa ter uma orientação sobre
o tratamento antimicrobiano mais adequado.
A metodologia para realização do antibiograma é padronizada e deve ser executada
com rigor. No teste de difusão Kirby-Bauer, discos de papel filtro impregnados com
antimicrobianos são depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou uma
suspensão padronizada do organismo a ser testado. O antimicrobiano se difunde no meio e,
caso a bactéria apresente alguma susceptibilidade a este antimicrobiano, seu crescimento
será inibido ao redor do disco. A medida do diâmetro da zona de inibição do crescimento é
usada para determinar a susceptibilidade ou resistência a determinado antimicrobiano, por
comparação com tabelas padronizadas. O meio sólido Muller-Hinton é recomendado para
realização de antibiograma da maioria das bactérias isoladas de espécimes clínicos.
O experimento que será realizado em classe tem como objetivo realizar e discutir a
técnica; tanto os antimicrobianos como as bactérias que serão testadas foram escolhidos de
modo a ilustrar os diferentes resultados que podem ser obtidos com esta técnica. É
importante salientar que, na rotina de um laboratório clínico, existem parâmetros para a
escolha dos discos de antimicrobianos, dependendo da espécie de bactéria que foi isolada,
do perfil de resistência apresentado por esta espécie na região e do tipo de infecção,
especialmente no caso de infecções adquiridas no hospital.
Muitas variáveis podem influir na qualidade e confiabilidade do teste e serão
discutidas em classe.
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1º dia: 12/05/2011

- Com auxílio de uma pipeta, retirar UMA GOTA da cultura bacteriana fornecida e inocular
em solução salina. ATENÇÂO: observar a turvação da suspensão que deve ser
semelhante ao padrão fornecido (∼108 bactérias/mL)
- Mergulhar um suabe estéril na suspensão preparada, retirar
o excesso de líquido comprimindo-o contra a parede interna
do tubo e semear em toda a superfície da placa de Muller-
Hinton, de forma homogênea em três direções.
- Deixar a placa secar e, com auxílio de uma pinça, aplicar os
discos de antibióticos sobre a superfície semeada, de forma
equidistante e mantendo uma distância de ~2 cm das bordas. É
conveniente marcar com a caneta, na base da placa de Petri, os
locais onde os discos serão colocados. Pressioná-los levemente,
com a pinça, após a aplicação.
- Incubar as placas por 16-18 h.

2º dia: 13/05/2011

Leitura do Antibiograma

Realizar a leitura do antibiograma, medindo os diâmetros dos halos de inibição de

crescimento em mm e determinando o perfil de resistência com o auxílio da Tabela padrão
abaixo.

halo

disco

mm
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Tabela: Diâmetro de halos com diferentes agentes antimicrobianos

Agente quantidade
observações Diâmetro mais próximo (mm)
antimicrobiano no disco
Resistente Intermediário Suscetível
AMINOGLICOSÍDEOS
Amicacina 30 µg ≤14 15-16 ≥17
Gentamicina 10 µg ≤12 13-14 ≥15
Canamicina 30 µg ≤13 14-17 ≥18
Netilmicina 30 µg ≤12 13-14 ≥15
Estreptomicina 10 µg ≤11 12-14 ≥15
Tobramicina 10 µg ≤12 13-14 ≥15
QUINOLONAS
Ciprofloxacina 5 µg ≤15 16-20 ≥21
Enoxacina 10 µg ≤14 15-17 ≥18
Lomefloxacina 10 µg ≤18 19-21 ≥22
Ácido Nalidíxico 30 µg ≤13 14-18 ≥19
Norfloxacina 10 µg ≤12 13-15 ≥16
Ofloxacina 5 µg ≤12 13-15 ≥16
OUTROS
Ampicilina Enterobactérias 10 µg ≤ 13 14-16 ≥17
Staphylococcus ≤ 28 - ≥29
Cloranfenicol 30 µg ≤12 13-17 ≥18
Clindamicina 2 µg ≤14 15-20 ≥21
Cefotaxima Enterobactérias 30 µg ≤22 23-25 ≥26
Nitrofurantoina 300 µg ≤14 15-16 ≥17
Rifampim 5 µg ≤16 17-19 ≥20
Amoxacilina Enterobactérias 30 µg ≤ 13 14-16 ≥17
Sulfonamidas 300 µg ≤12 13-16 ≥17
Trimetoprim 5 µg ≤10 11-15 ≥16
Trimetoprim/ 1.25/ ≤10 11-15 ≥16
sulfametoxazol 23.75 µg
Vancomicina Staphylococcus 30 µg - - ≥15

Preencher o quadro abaixo com os resultados obtidos:

Bactéria Padrão de Resistência
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5ª Aula: IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

Nesta aula, serão discutidos alguns métodos empregados na identificação de

bactérias patogênicas para o hospedeiro humano.

1º dia: 16/06/2011

Experimento 1:
Você recebeu duas placas de Agar MacConkey e duas placas de Agar sangue, cada uma
delas contendo uma mistura de bactérias distintas (misturas A e B). Para identificar as
bactérias contidas nessas misturas:

1. Observe as placas semeadas com a mistura A e responda:

- Houve crescimento na placa de MacConkey? Qual o significado desse achado?

- Houve crescimento na placa de Agar Sangue? Quais as características das colônias

crescidas nessa placa?

2. Observe as placas semeadas com a mistura B e responda:

- Houve crescimento na placa de MacConkey? Que alterações você observa nas
colônias crescidas neste meio? Qual o significado desse achado? Anote os resultados
na tabela da Página 27.

- Houve crescimento na placa de Agar Sangue? Que alterações você observa nas
colônias crescidas neste meio?
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Experimento 2:
Selecione uma colônia de cada tipo da placa de Agar Sangue da mistura A e faça o ensaio
de catalase conforme descrito a seguir.

PROVA DA CATALASE

1. Com o auxílio de palito esterilizado, toque uma colônia e

misture-a a uma gota de H2O2 10 V, na superfície de uma lâmina
de microscópio.
Obs.: Quando a colônia é obtida de uma placa de Agar Sangue,
é essencial que o meio de cultura não seja removido da
superfície, pois hemácias contêm catalase.
2. A produção de bolhas de gás é indicativa de teste positivo.

A catalase catalisa a seguinte reação: 2 H2O2 → 2 H2O + O2

Anote os resultados na tabela da Página 19.

Experimento 3:
Para as colônias que apresentarem resultado positivo na prova de catalase, realizar a prova
da coagulase.

PROVA DA COAGULASE
Selecione duas colônias da placa de Agar Sangue, que tenham dado resultado positivo na
prova da catalase. Com auxílio de palitos esterilizados, homogeneíze as duas colônias em
um mesmo tubo contendo 0,5 ml de plasma de coelho. Incline suavemente o tubo, girando-o
sem agitar. Identifique-o e entregue-o ao professor, que irá incubá-lo a 37°C até o dia
seguinte (ou, no mínimo, por 4 horas). Um tubo não inoculado servirá como um controle
negativo da prova de coagulase.

Experimento 4:
Com o auxílio do fio esterilizado, selecione uma colônia de cada tipo da placa de
MacConkey semeada com a mistura B e inocule cada uma delas nos meios EPM e MiLi,
conforme a explicação do professor, para a realização de provas bioquímicas. Os tubos
serão incubados a 37ºC por 24 horas.
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2º dia: 17/06/2011

Leitura do Experimento 3 (PROVA DA COAGULASE)

Proceda à leitura inclinando o tubo para os lados, procurando detectar a formação de um
coágulo. Anote os resultados observados na tabela abaixo e consulte o esquema de
identificação (Página 20) para determinar o gênero e a espécie bacterianos.

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS A PARTIR DE ÁGAR SANGUE

SEMEADAS COM A MISTURA A

Colônia Tipo de Hemólise Catalase Coagulase Identificação

1
2

Leitura do Experimento 4 (PROVAS BIOQUÍMICAS)

Para identificar as amostras bacterianas Gram-negativas contidas na placa de MacConkey,
proceda à leitura dos ensaios bioquímicos realizados, de acordo com a tabela anexa
(Página 21). Registre os resultados na tabela abaixo. Conclua sua identificação e compare
com os resultados de outras bactérias fornecidas e com os meios de EPM e MiLi não
inoculados.

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS A PARTIR DE ÁGAR

MACCONKEY SEMEADO COM A MISTURA B
Mac EPM MiLi
Conkey Identificação
Colônia presuntiva
Ferm. Lac. Gás H2S Urease LTD Mot. Indol Lisina
1
2
3
4
5
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Esquema para identificação de algumas bactérias patogênicas e não-patogênicas

Bacilos Gram -

Provas
Bioquímicas
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