Professional Documents
Culture Documents
392-Breforgen Web Verze
392-Breforgen Web Verze
Halina Šimková
Tribun EU
2012
Breviář forenzní genetiky
Forenzní DNA analýza v otázkách a odpovědích
Halina Šimková
recenzovali:
ISBN
Obsah
Seznam ilustrací...........................................................................................7
Předmluva .................................................................................................. 11
Forenzní genetika jako obor ................................................................ 13
Biologické stopy a biologický materiál ............................................ 18
Obecné pojmy .................................................................................................... 18
Tkáňový původ, druhový původ a původce biologického
materiálu ............................................................................................................. 19
Využitelnost biologického materiálu pro forenzně genetickou
analýzu ................................................................................................................. 25
Nakládání s biologickými stopami ............................................................ 29
Vlastnosti a chování biologického materiálu ve stopách................. 37
Důkazní potenciál stopy ................................................................................ 46
Seznámení s genetikou ........................................................................... 50
Základní fakta o DNA ...................................................................................... 50
Základní principy fungování dědičné informace ................................ 58
Forenzní potenciál genetické analýzy .............................................. 69
Individualita a identifikace .......................................................................... 69
Určení příbuznosti ........................................................................................... 80
Predikce biogeografického původu a fenotypových znaků osoby
................................................................................................................................. 95
Obecné principy forenzně genetické analýzy ................................ 99
Principy identifikace....................................................................................... 99
Principy určení příbuznosti ...................................................................... 117
Principy predikce biogeografického původu a fenotypových
znaků osoby..................................................................................................... 122
Technologie forenzně genetické analýzy ..................................... 127
Základní kroky forenzně genetické analýzy ...................................... 127
Izolace (extrakce) DNA ............................................................................... 129
Kvantifikace (a případná charakterizace) DNA ................................ 140
Amplifikace DNA ........................................................................................... 146
Elektroforéza DNA........................................................................................ 153
5
Analýza STR lokusů ...................................................................................... 158
Analýza HVR mt DNA ................................................................................... 161
Analýza SNP lokusů ...................................................................................... 164
Nakládání se stopami obsahujícími degradovanou DNA
a/nebo malá množství DNA ...................................................................... 166
Interpretace forenzně genetických dat ......................................... 175
Obecné kroky a pravidla interpretace dat .......................................... 175
Spolehlivost dat – technická kvalita dat............................................... 176
Kvalita v laboratoři ....................................................................................... 179
Vypovídací hodnota dat .............................................................................. 182
Zdroje chyb ve forenzně genetické expertíze .................................... 185
Uchovávání zdrojů genetických informací ................................... 190
Banky (archivy, depozity) biologického materiálu ......................... 190
Banky izolátů DNA ........................................................................................ 191
DNA databáze.................................................................................................. 192
„Non–human“ forenzní analýza živočišné, rostlinné a
mikrobiální DNA .................................................................................... 196
Forenzní analýza živočišné DNA ............................................................. 196
Forenzní analýza rostlinné DNA ............................................................. 198
Forenzní analýza mikrobiální DNA ........................................................ 199
Doslov ........................................................................................................ 201
O autorce................................................................................................... 202
Doporučená literatura a informační zdroje ................................. 203
Rejstřík ...................................................................................................... 204
6
Seznam ilustrací
Obrázek 1 – Charakteristiky biologické stopy .........................................................20
Obrázek 2 – Degradace DNA – příčiny .........................................................................32
Obrázek 3 – Odběr biologického materiálu ...............................................................34
Obrázek 4 – Kontaminace stopy .....................................................................................36
Obrázek 5 – Primární a sekundární přenos biologického materiálu .............44
Obrázek 6 – Struktura jednořetězcové DNA ............................................................51
Obrázek 7 – Struktura dvouřetězcové DNA .............................................................52
Obrázek 8 – Karyotyp..........................................................................................................53
Obrázek 9 – Genetický kód ...............................................................................................55
Obrázek 10 – DNA v lidské buňce ..................................................................................57
Obrázek 11 – Variabilita lokusů v DNA ......................................................................60
Obrázek 12 – Meióza (redukční dělení) .....................................................................62
Obrázek 13 – Oplození .......................................................................................................63
Obrázek 14 – Dědičnost autozomálních lokusů .....................................................64
Obrázek 15 – Dědičnost Y–chromozomálních lokusů .........................................66
Obrázek 16 – Dědičnost X–chromozomálních lokusů . ........................................67
Obrázek 17 – Dědičnost mitochondriální DNA .......................................................68
Obrázek 18 – Genetický profil osoby ..........................................................................71
Obrázek 19 – Genetická informace jednovaječných dvojčat ............................74
Obrázek 20 – Genetická informace dvouvaječných dvojčat .............................76
Obrázek 21 – Genetická informace chimérického jedince .................................78
Obrázek 22 – Rodokmen – stupeň příbuznosti ......................................................87
Obrázek 23 – Rodokmen – dědičnost autozomálních lokusů ..........................88
Obrázek 24 – Rodokmen – dědičnost X–chromozomálních lokusů ...............89
Obrázek 25 – Rodokmen – dědičnost Y–chromozomálních lokusů ...............90
Obrázek 26 – Rodokmen – dědičnost mitochondriální DNA ............................91
Obrázek 27 – Rodokmen – konsangvinita a incest ...............................................93
Obrázek 28 – Rodokmen – mnohotný incest ...........................................................94
Obrázek 29 – Struktura krátké tandemové repetice (STR) . .......................... 101
Obrázek 30 – Alely STR lokusu – standardní a mikrovariantní. ................... 103
Obrázek 31 – Srovnání genotypu stopy a osoby .................................................. 106
Obrázek 32 – Struktura jednonukleotidového polymorfismu (SNP). ........ 109
Obrázek 33 – Struktura mitochondriální DNA (mtDNA) ................................ 113
Obrázek 34 – Určení pohlaví ........................................................................................ 123
7
Obrázek 35 – Základní kroky technologického zpracování stopy................ 128
Obrázek 36 – Princip organické extrakce DNA. .................................................... 133
Obrázek 37 – Princip vyvázání enzymatických kofaktorů .............................. 134
Obrázek 38 – FTA karty ................................................................................................. 135
Obrázek 39 – Vazba DNA na siliku ............................................................................ 137
Obrázek 40 – Diferenciální lýza .................................................................................. 138
Obrázek 41 – Laserová mikrodisekce (LCM) ......................................................... 139
Obrázek 42 – Spektrofotometrická kvantifikace ................................................. 142
Obrázek 43 – Fluorimetrická kvantifikace ............................................................. 143
Obrázek 44 – Specifická kvantifikace – princip .................................................... 144
Obrázek 45 – Specifická kvantifikace – slot blot hybridizace ........................ 145
Obrázek 46 – Složení PCR směsi a denaturační fáze PCR ............................... 148
Obrázek 47 – Anelační a elongační fáze PCR ........................................................ 149
Obrázek 48 – Princip elektroforézy DNA ............................................................... 154
Obrázek 49 – Princip kapilární elektroforézy ....................................................... 157
Obrázek 50 – Monoplexová a multiplexová analýza STR lokusů . ............... 159
Obrázek 51 – Sekvenace asymetrickou PCR ......................................................... 163
Obrázek 52 – Monoplexová a multiplexová analýza SNP lokusů ................ 165
Obrázek 53 – Mechanismy degradace DNA .......................................................... 166
Obrázek 54 – Klasická a miniSTR analýza ............................................................. 169
Obrázek 55 – Stochastické jevy ................................................................................... 173
Obrázek 56 – Základní kroky procesu práce s daty. ........................................... 175
Obrázek 57 – Možné formy uchovávání zdrojů genetických informací .... 190
8
9
Motto:
10
Předmluva,
která by neměla zůstat nepřečtena
11
přičemž tipy na některé z nich najde čtenář v závěrečné Doporučené
literatuře.
autorka
12
Forenzní genetika jako obor
Co je to genetika?
Co je to forenzní?
Co je to forenzní genetika?
15
zadržen podezřelý – již dříve pro sexuální napadení trestaný Milan
Lubas. Průlomový znalecký posudek, který jasně ztotožnil krevní
kapky z místa činu s tímto podezřelým a naopak – krevní stopy
z jeho oděvu se zavražděnou, zpracoval Doc. RNDr. Vladimír
Ferák, CSc., vedoucí katedry genetiky a molekulární chemie
Přírodovědecké fakulty Univerzity Komenského v Bratislavě. První
expert Kriminalistického ústavu Praha a rovněž velmi významný
průkopník oboru, RNDr. Jaroslav Brouček, CSc., začal na
kriminálních případech pracovat roku 1992, kdy byl také vyškolen
u FBI.
16
určitých tělesných charakteristik osob ze stop na místě činu).
Pozornost oboru se též obrací k metodám umožňujícím určovat a
tkáňový původ stopy molekulárně genetickými metodami a též
určovat stáří stopy.
17
Biologické stopy a biologický materiál
Obecné pojmy
Co je to biologický materiál?
Co je to biologická stopa?
18
forenzně genetickou analýzou dohledat přesný původ takového
podezřelého masa.
19
Obrázek 1 – Charakteristiky, které zpravidla chceme znát u biologické
stopy: tkáňový původ, druhový původ a původce.
20
Jaký je rozdíl mezi orientační a specifickou zkouškou
tkáňového původu biologického materiálu?
21
Zatímco v některých případech je typ biologického materiálu
irelevantní, jindy může zásadně změnit pohled na hodnotu DNA
profilování a důkazu jako takového.
Dříve tyto testy mohly najít své opodstatnění jako jakési “síto“
k oddělení stop nepoužitelných pro genetické zkoumání (kupříkladu
u zmíněných nedopalků nepřítomnost slin a lidské bílkoviny
indikovala nemožnost stanovit genetický profil). V dnešní době je už
tento přístup ale překonán, neboť jednak forenzní genetika
disponuje mnohem přesnějšími metodami posouzení obsahu
využitelného biologického materiálu ve stopě, jednak i z nedopalků
s negativním výsledkem testu na přítomnost slin lze někdy stanovit
relevantní genetický profil.
26
demonstrovat, jak neostré jsou hranice mezi zdravotnickými a
forenzními aplikacemi.
27
kožní seškraby; děje se tak například při genetických výzkumech
lidských přírodních populací, u nichž by se odběr jiného typu
vzorku nesetkal s porozuměním.
29
Jak se vyhledávají stopy?
30
Latentní stopy, tvořící čtvrtou kategorii, nemohou být detekovány
ani okem, a prozatím ani pomocí screeningových testů. Typickým
příkladem takové stopy jsou povrchové kožní buňky ulpivší na
telefonním sluchátku. Tyto stopy se tudíž zajišťují „naslepo“: jsou
odebírány v místech, kde výskyt biologického materiálu
předpokládáme. Úspěšnost při jejich zajišťování tak závisí
především na dobrém odhadu a zkušenostech toho, kdo je zajišťuje.
31
1. nedošlo k degradaci stopy (zničení biologického
materiálu)
2. bylo odebráno co možná největší množství biologického
materiálu (toto neplatí jen u rozsáhlých stop, jako jsou
například krevní tratoliště)
3. nedošlo ke kontaminaci stopy (vnesení cizorodého
biologického materiálu).
32
Blíže se o tom zmíníme později, zde pouze stručně: rozkladné
procesy jsou urychlovány vysokou teplotou a vlhkem, jež podporují
rychlý růst bakterií; nevratné chemické změny v dvoušroubovici
DNA způsobuje UV záření – tedy např. přímo dopadající sluneční
paprsky, stejně jako působení některých chemikálií. Degradaci DNA
lze zabránit pouze vytvořením správných předpisů týkajících se
zajišťování stop a následným dodržením v nich uvedených postupů.
33
Obrázek 3 – Užitím speciálních odběrových pomůcek pro forenzní účely
můžeme zajistit z biologické stopy významně větší množství biologického
materiálu (a tedy izolovat více DNA) než při užití běžného zdravotnického
tampónu.
Obrázek 4 – Možnými zdroji kontaminace mohou být jak jiné stopy, tak i
odběrové pomůcky či osoby manipulující se stopami. Proti těmto všem
zdrojům je třeba se účinně bránit.
36
4. Srovnávací vzorky osob je naprosto nezbytné zajišťovat
odděleně od ohledání místa činu, nejlépe jinde a s časovým
odstupem.
37
1. přirozeně odcházející tělní tekutiny, sekrety a exkrementy
– menstruační krev, moč, stolice, pot, slzy, nosní sekret, sperma,
sliny, zvratky
2. přirozeně odcházející buňky kůže a kožní deriváty – vlasy,
chlupy, nehty, odumřelé kožní epitelie (povrchové buňky)
3. přirozeně odcházející buňky sliznice – poševní epitelie
(např. při pohlavním styku), povrchové epitelie pohlavního údu
(při pohlavním styku či jiné manipulaci s ním), epitelie dutiny
ústní a krku (při ústní hygieně, jídle, líbání, orálním styku
apod.), epitelie trávicího traktu (např. sliznice střeva
uvolňovaná do stolice), epitelie dýchacích cest (při kašli,
smrkání, kýchání, dýchání, řeči), epitelie močových cest (při
zánětu uvolňované do moči) atd.
4. materiály uvolňované nepřirozeně, a to v důsledku
nemoci, zranění, lékařského zákroku – krev, kůže jako celek,
svalová tkáň, tuková tkáň, při velmi hrubém poranění (včetně
chirurgického úkonu) i jakékoli další tkáně (mozková tkáň,
kost, tkáně orgánů dutiny břišní atd.).
40
3. biologickými činiteli – bakteriemi, plísněmi, ale i enzymatickou
sebedegradací (autolýzou)
41
Moderní forenzně genetická laboratoř ovšem již disponuje jednak
metodami na zjištění přítomnosti inhibitorů ve vzorku, jednak
izolačními postupy schopnými ve většině případů tyto inhibitory
účinně odstranit.
42
ani jinými metodami; je to však předmětem zájmu forenzně
genetického výzkumu.
45
muže A, ale ten s ní ve skutečnosti vůbec nepřišel do
kontaktu);
na místě činu se vyskytuje biologický materiál osoby,
která tam nikdy nebyla (v hotelu na pokoji č. 27 komár
nasaje krev spícího hosta A, poté vyletí oknem a vletí do
pokoje č. 59, kde je bdícím hostem B zabit, následně je
ovšem neznámým pachatelem zabit host B – na stěně je
nalezena krev a stanoven profil hosta A, ale ten na pokoji č.
59 nikdy nebyl).
47
Co je očekávaná rozdílnost výsledku příslušného
znaleckého zkoumání za platnosti jednotlivých
zvažovaných hypotéz?
48
Byl oznámen případ znásilnění mezi manželi, kdy žena tvrdila, že
manžel ji znásilnil, ten tvrdil, že mezi nimi došlo k dobrovolnému
pohlavnímu styku. Ke zkoumání byl předložen poševní stěr poškozené.
Zkoumání je v tomto případě irelevantní, neboť u obou hypotéz lze
očekávat zjištění přítomnosti manželova spermatu v poševním stěru
manželky.
49
Seznámení s genetikou
Základní fakta o DNA
Co je to DNA?
50
Sled nukleotidů ve vlákně – tzv. sekvence nukleotidů – vytváří
jednoduchý lineární kód o čtyřech znacích. (Obdobně například
naše písmo – latinka – je lineární kód, užívající ovšem podstatně
více znaků – v anglické abecedě 26, v té české dokonce 37 – a to
počítáme pouze písmena, nikoli interpunkční a jiná znaménka!).
ACCAGTGAGATCCCAATATAGTACACACACTGCTGCTACTTCTAGAGG
CAAACTTAGT
51
které jsou navzájem propojeny pomocí vazeb mezi bázemi. Tento
komplex je prostorově svinutý do tvaru známé dvoušroubovice.
AGGTAC
||||||
TCCATG
V běžné tělní lidské buňce je DNA o celkové délce cca 6,6 miliardy
nukleotidů, což de facto představuje dvoušroubovici o délce zhruba
2 metry. Velikost lidské buňky je však dramaticky menší – například
52
bílé krvinky mají průměr řádově pouhých 0,00001 metru. Jedinou
možností, jak vtěsnat něco tak dlouhého do něčeho tak malého, je
mnohonásobně to smotat.
Co jsou chromozómy?
53
Biologické druhy mají různý počet chromozómů – např. člověk má
23 párů chromozómů, kočka 18 párů chromozómů, damašská růže
28 chromozómů atd. Vyšší počet chromozómů však neznamená, že
daný druh má delší DNA: pouze ukazuje, do kolika „svazků“ je tato
DNA rozdělena.
55
sama někdy zneužívána, a pro potřeby této publikace zcela postačí
zjednodušující tvrzení, že v extragenové DNA kódující oblasti
nejsou.)
56
jím myslet celý gen i jednotlivý nukleotid naprosto kdekoli,
v genové i extragenové oblasti lidského genomu.
58
Naproti tomu existují znaky, kde hraje prostředí významnou roli a
daný znak jím může být silně ovlivněn; genetická informace se
u nich uplatňuje pouze jako jakýsi velmi tvárný základ, nebo
chceme–li, dispozice. Říkáme, že tyto znaky jsou slabě geneticky
determinované. Typickým příkladem budiž tělesná hmotnost.
Co je polymorfismus?
59
1. lokusy nepolymorfní, tedy zcela minimálně variabilní (říkáme
jim též vysoce konzervativní sekvence); obvykle jsou to nějaké
zásadní funkční úseky, bez nichž se buňka neobejde a které
musejí mít určitou přesnou sekvenci, jinak svou funkci ztratí;
2. lokusy nízce až středně polymorfní, vyskytující se v populaci
v několika variantách; sem spadají především geny;
3. lokusy vysoce polymorfní (multialelické), vyskytující se
typicky v mnoha variantách, jejichž počet může jít i do mnoha
desítek; najdeme je především v určitých oblastech nekódující
(extragenové) DNA;
Co jsou mutace?
Co je to heterozygot a homozygot?
63
matky, druhou od otce. Pokud jsou obě kopie identické (jsou to dvě
stejné alely), říkáme, že daný lokus je v homozygotním stavu a
daný člověk je v tomto lokusu homozygot (homozygotní). Naproti
tomu pokud je na každém párovém chromozómu v daném lokusu
jiná alela, říkáme, že daný lokus je v heterozygotním stavu a daný
člověk je v tomto lokusu heterozygot (heterozygotní).
64
Prosím povšimněte si, že homozygozita či heterozygozita je
vlastností konkrétního lokusu na nepohlavních chromozómech,
nikoli genetické informace jako celku! Tedy: každý z nás je v řadě
svých lokusů heterozygotem a v řadě homozygotem.
65
Obrázek 15 – Dědičnost Y–chromozomálních lokusů. Dědičná informace
syna pochází pouze od otce.
Co je to hemizygot?
68
Forenzní potenciál genetické analýzy
Z forenzního hlediska lze genetickou analýzou získat informace,
které nám
Individualita a identifikace
Co je to identifikace?
69
Co je to genetický profil osoby?
Co je to genetické individuum?
Co je to fyzické individuum?
70
Obrázek 18 – Typický genetický profil osoby: set genotypů autozomálních
STR lokusů a amelogeninu (bližší vysvětlení, o jaké lokusy se jedná a proč
je testujeme, najdete v dalších částech knihy).
71
Jaký je vzájemný vztah genety a ramety?
72
Může u člověka existovat i jiný vzájemný vztah genety a
ramety?
74
by dokázaly k rozlišení identických dvojčat využít těch změn v DNA,
k nimž dochází až po vzniku samostatných embryí v jejich tělních
buňkách. Přestože některé postupy se jeví jako nadějné, dosud
nebyla nalezena a v odborných časopisech publikována žádná
validní metoda, kterou by bylo možno s velkou spolehlivostí použít
jako důkazní nástroj.
75
nazývá heteropaternální superfekundace a, jak dokládá báje
o dvojčatech Héraklovi a Ífiklovi, jeho existence je lidstvu známa již
nejméně od dob starého Řecka.
Co je to chimérismus?
76
Co je to vrozený tetragametický chimérismus?
77
Obrázek 21 – Genetická informace chimérického jedince vzniklého
splynutím zárodků je dvojího typu; takový jedinec je vlastně spojením
dvou sourozenců do jediného těla.
79
v tkáňových antigenech. Ty nemají nic společného s genetickým
profilem užívaným k forenzně genetické identifikaci, a dárce a
příjemce se tak genetickým profilem liší.
Určení příbuznosti
Co je to biologická příbuznost?
Co je to stupeň příbuznosti?
80
První stupeň příbuznosti představuje stav, kdy polovina, tj. 50 %
autozomální genetické informace je shodného původu. V prvním
stupni příbuznosti jsou dvojice rodič–dítě a úplné sourozenecké
dvojice.
Jak je vidět, každá z těchto čtyř skupin lokusů se dědí podle jiných
pravidel. Vhodné lokusy pro testování vybíráme tedy na základě
toho, jaký příbuzenský vztah chceme ověřit či vyvrátit.
81
Jak lze předpokládaný biologický vztah ověřit?
Někdy nemáme o příbuzenství dvou osob jen jednu, ale hned dvě či
více alternativních hypotéz. Například: paní Novákové se narodil
syn Adam, jehož otcem může být manžel paní Novákové Jiří Novák
nebo jeho bratr Jindřich Novák nebo soused Novákových pan Josef
Svoboda. O dvojici Adam Novák – Jiří Novák tedy můžeme říci, že
mohou být a) otec a syn, b) strýc a synovec nebo c) nepříbuzné
osoby. V takovém případě opět posoudíme, jak zjištěná míra shody
odpovídá míře očekávané u jednotlivých hypotéz.
82
matka – dcera
50 % autozomální DNA je shodné původem
obě mají po dvou X chromozómech, z toho jeden je shodný
původem
mitotyp je shodný původem
matka – syn
50 % autozomální DNA je shodné původem
matka má dva X chromozómy, syn jeden, a to shodný původem
s jedním z matčiných X chromozómů
mitotyp je shodný původem
otec – dcera
50 % autozomální DNA je shodné původem
dcera má dva X chromozómy, otec jeden, a to shodný původem
s jedním z dceřiných X chromozómů
mitotyp není shodný původem
otec – syn
50 % autozomální DNA je shodné původem
otec i syn mají po jednom X chromozómu, tyto nejsou shodné
původem
otec i syn mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné
původem
mitotyp není shodný původem
sestra – sestra
v průměru 50 % autozomální DNA je shodné původem
obě mají po dvou X chromozómech, jeden nebo oba jsou
shodné původem
mitotyp je shodný původem
83
sestra – bratr
v průměru 50 % autozomální DNA je shodné původem
sestra má dva X chromozómy, bratr jeden, tento může a nemusí
být shodný původem s jedním ze sestřiných X chromozómů
mitotyp je shodný původem
bratr – bratr
50 % autozomální DNA je shodné původem
oba mají po jednom X chromozómu, tyto mohou a nemusí být
shodné původem
oba mají po jednom Y chromozómu, tyto jsou shodné původem
mitotyp je shodný původem
84
oba mají po jednom X chromozómu, tyto mohou a nemusí být
shodné původem
oba mají po jednom Y chromozómu, tyto nejsou shodné
původem
mitotyp není shodný původem
86
Obrázek 22 – Rodokmen ilustrující stupeň příbuznosti běžných
biologických příbuzenských vztahů. Osobu, k níž se porovnání vztahuje,
označujeme běžně termínem proband (tak použito i v dalších obrázcích).
87
Obrázek 23 – Rodokmen zachycující dědičnost autozomálních lokusů.
Každá osoba nese dvě kopie daného lokusu, přičemž se může jednat od
stejné nebo různé alely.
88
Obrázek 24 – Rodokmen zachycující dědičnost X–chromozomálních
lokusů. Osoby ženského pohlaví nesou vždy dvě kopie téhož lokusu, osoby
mužského pohlaví pouze jednu.
89
Obrázek 25 – Rodokmen zachycující dědičnost Y–chromozomálních
lokusů. Osoby ženského pohlaví nenesou žádnou kopii téhož lokusu, osoby
mužského pohlaví nesou kopii jednu.
90
Obrázek 26 – Rodokmen zachycující dědičnost mitochondriální DNA.
Každá osoba nese určitý mitotyp (vyjma osob s tzv. heteroplazmíí, o nichž
bude pojednáno později).
91
Existují nějaké situace, kde výše uváděné míry shody
neplatí?
Ano. Námi popsané míry shody jsou platné jen tehdy, když daná
dvojice osob je právě a pouze v uvedeném vztahu a tyto osoby
nejsou zároveň příbuzné ještě jinak. Co máme na mysli?
92
Obrázek 27 – Rodokmen ilustrující zvýšený stupeň příbuznosti osob
v rodině, kde došlo jak ke konsangvinnímu sňatku bratrance a sestřenice
(značen modrou úsečkou), tak k nechtěně incestnímu sňatku probanda
s nevlastní sestrou (značen červenou úsečkou).
93
Byl posuzován případ možného incestního vztahu, kdy ze zjištěných
údajů vyplývalo, že muž (68) měl se svojí sestřenicí dceru, s touto
dcerou měl další dceru (tedy zároveň vnučku) a s touto dcerou–
vnučkou zplodil syna (tedy zároveň vnuka a pravnuka). Pomineme–li
trestně právní a sociální rozměr případu, je tato kauza z hlediska
stanovení správných očekávání genetické shody velmi zajímavá.
Co je fenotypový znak?
97
Co tedy lze v současnosti z biologické stopy s relativně
velkou spolehlivostí predikovat?
98
Obecné principy forenzně genetické
analýzy
Principy identifikace
Na základě analýzy jakých lokusů v DNA lze osobu
identifikovat?
99
identifikaci zdaleka nejužívanějšími lokusy tzv. krátké tandemové
repetice, označované jako STR (angl. Short Tandem Repeats) neboli
mikrosatelity.
100
délkou, nicméně celková délka repetice je u STR výrazně kratší než
u VNTR.
101
lidského genomu, nicméně zdaleka ne všechny tyto mikrosatelity
jsou variabilní.
Jak již bylo řečeno výše, mikrosatelity mohou mít délku základního
motivu 2–9 nukleotidů, a právě podle ní klasifikujeme jednotlivé
mikrosatelity na di–, tri–, tetra–, penta–, hexa–, hepta–, okta– a
nonanukleotidové. Pro forenzní analýzy lidí jsou využívány
prakticky výhradně STR lokusy tetra– nebo pentanukleotidové,
tedy ty se základním motivem dlouhým 4 nebo 5 nukleotidů.
U repetic s kratším motivem (2 či 3 nukleotidy) může při analýze
docházet ve velké míře k těžko odstranitelnému nežádoucímu jevu,
zvanému stuttering (prokluz polymerázy, jev je podrobněji popsán
v kapitolách pojednávajících o technologii forenzně genetické
analýzy), repetice s delším motivem (6–9 nukleotidů) jsou již zase
celkově dosti dlouhé (čtyřnukleotidová repetice s 20 opakováními
motivu měří 80 nukleotidů, zatímco osminukleotidová repetice se
stejným počtem opakování měří 160 nukleotidů), což může vést
k problémům s jejich analýzou u vzorků s degradovanou DNA.
105
Obrázek 31 – Možné varianty srovnání genotypu stopy a osoby: neshoda,
náhodná shoda nebo zákonitá shoda genotypu.
107
Jak probíhá identifikace (určení shody) pomocí
analýzy Y–chromozomálních STR lokusů?
108
hypervariabilních oblastí mitochondriální DNA, označovaných
jako HVR mtDNA (angl. Hypervariable Region of mitochondrial
DNA).
109
SNP se vyskytují po celém lidském genomu s četností cca 1 na 1000
nukleotidů – u každého z nás lze tedy nalézt miliony takovýchto
polymorfismů.
111
proveditelná na zařízeních používaných pro STR analýzu, celá
řada SNP aplikací je však založena na odlišných technologiích)
2. Nekompatibilita dat (pokud jsou v databázích uloženy STR
profily, pak SNP profil není s nimi porovnatelný, jedná se o jiný
identifikační údaj)
3. Problematičtější použitelnost pro analýzu směsí biologických
materiálů
4. Souvislost mnohých SNP s dědičnými chorobami.
112
V lidské mtDNA rozlišujeme dvě hlavní hypervariabilní oblasti
(HV1 a HV2) a jednu vedlejší (HV3):
113
Jak vypadá HVR mtDNA konkrétního jedince, jak
popisujeme jednotlivé alely HVR mtDNA?
114
3. U inzercí uvedeme poslední standardní pozici, tečku, pořadí
inzertovaného nukleotidu a typ nukleotidu, tedy kupříkladu
211.1A (=“u vyšetřované osoby je za standardní pozicí 211
navíc začleněn nukleotid A“).
115
všechny osoby v této linii mají – nedojde–li k mutaci – sekvence
mtDNA identické. Analýzou tedy nelze rozlišit např. mezi sourozenci
(pokud mají společnou matku), mezi matkou a jejími dětmi, mezi
vnukem a babičkou z matčiny strany atd.
116
Principy určení příbuznosti
Na základě analýzy jakých lokusů v DNA lze
posuzovat biologickou příbuznost osob?
117
2. O tom, která z obou rodičových alel bude předána, rozhoduje
náhoda.
3. S určitou velmi malou pravděpodobností může „v době
předávání“ (tj. při vzniku vajíčka či spermie, z něhož posléze
dítě vznikne) dojít k mutaci, která předávanou alelu pozmění
(např. z alely 11 se stane alela 12).
Dvě osoby (bez ohledu na to, zda jsou příbuzné či nikoliv) mohou
nést tutéž alelu určitého lokusu – např. jedna osoba má genotyp
11/12, druhá osoba je 12/14 – shodně mají tedy obě alelu 12. Této
alele pak říkáme alela shodná stavem.
118
i původem. Marie má také alelu 8, ovšem tu s jistotou Davidovi
nepředala (neboť mu předala alelu 14), a můžeme tedy konstatovat,
že alela 8 je u Davida a Marie shodná stavem, nikoli však
původem.
119
babičky a dědečka dítěte), dalších biologických dětí nařčeného (tj.
potenciálních sourozenců dítěte) apod. Vypovídací hodnota
zkoumání pak výrazně závisí na příbuznosti a počtu takto
dostupných „nepřímých“ vzorků. Existuje zde ovšem riziko, že
dostupné osoby nejsou ve skutečnosti v předpokládaném
biologickém vztahu k nařčenému – tj. například že jeho otec (tedy
potenciální dědeček dítěte) není ve skutečnosti jeho biologickým
otcem.
Jak již bylo popsáno dříve, ženy mají ženy dva chromozómy X,
zatímco muži mají jeden chromozóm X a jeden Y.
120
2. průkaz otcovství dcery, kdy není k dispozici vzorek otce, ale
pouze jeho matky (tj. analýza páru babička z otcovy strany–
vnučka)
3. průkaz mateřství u páru matka–syn či matka–dcera, kdy není
k dispozici vzorek otce
4. průkaz polovičního sourozenectví sester, které mají společného
otce
5. některé incestní situace; analýza X–STR například může pomoci
rozhodnout, zda dítě zplodil otec nebo bratr jeho matky.
121
její děti (dcery i syny), tj. po přeslici. Jediným mechanismem změny
mtDNA lokusů jsou mutace.
122
Obrázek 34 – Určení pohlaví pomocí analýzy krátkého úseku DNA v genu
pro amelogenin, který se nachází na X i na Y chromozómu. U muže
detekujeme dva rozdílně dlouhé fragmenty, u ženy fragment jediný.
123
Jak se pomocí analýzy DNA určuje biogeografický
původ osoby?
124
s velkou pravděpodobností z Evropy, avšak už nedokážeme určit, ze
kterého státu.
126
Technologie forenzně genetické analýzy
Základní kroky forenzně genetické analýzy
Jaké technologické postupy jsou využívány při
forenzní analýze DNA?
127
Po extrakci může, ale nemusí následovat kvantifikace DNA, tedy
určení množství DNA ve vzorku, často spojené s její charakterizací,
tedy určením specifity (ve smyslu určení původu – lidská,
bakteriální apod.) a kvality (ve smyslu určení stupně degradace).
Kvantifikace je často vynechávána u vzorků do značné míry
standardních, jakými jsou například srovnávací vzorky (bukální
stěr, krev). Naopak u vzorků velmi „nejistých“, což mohou být
například plošné stěry, vzorky z těl ve vyšším stupni rozkladu apod.,
je kvantifikace zásadním krokem, který může podstatně ovlivnit
finální úspěch analýzy.
128
Jak dlouho trvá provedení forenzně genetické analýzy?
129
má co nejvyšší výtěžnost, tj. získá z materiálu pokud možno
veškerou přítomnou DNA; tato podmínka je důležitá především
u vzorků s malým množstvím využitelného materiálu. Naopak,
u vzorků bohatých na DNA často dáváme přednost takovému
izolačnímu postupu, který nám izoluje DNA v určitém
standardním množství (tj. víme, že na konci izolace budeme mít
k dispozici roztok DNA o určité standardní koncentraci).
převede DNA do stabilního stavu – do roztoku či na pevnou
fázi (nosič), které jsou bez problémů použitelné pro následující
analýzy.
Co je izolát?
Co jsou inhibitory?
Co je purifikace DNA?
131
Co je zkoncentrování izolátu DNA?
132
Jak fungují postupy založené na oddělení polárních a
nepolárních látek?
133
Jak fungují postupy založené na inaktivaci
enzymatických kofaktorů?
135
Následná izolace se provádí tak, že z karty je mechanicky vyražen
malý terčík, ten se vloží do zkumavky a jsou k němu přidány izolační
reagencie; dojde k odstranění nežádoucích látek (např. vymytí
inhibitorů), přičemž DNA stále zůstává fixována na papírovém
terčíku.
136
Obrázek 39 – Vazba DNA na siliku v magnetosilikových partikulích
umožňuje manipulovat DNA v roztoku pomocí magnetického pole.
138
Laserová mikrodisekce (LCM) (laser capture microdissection) je
vysoce pokročilou technologií mikromanipulace, užívanou
v nejrůznějších oborech pracujících s biologickým materiálem.
Podstatou je vyhledání příslušných objektů (např. buněk)
v mikroskopu, jejich oddělení od ostatního materiálu pomocí
laserového paprsku a přenesení světelným pulzem do čisté
zkumavky. V rámci forenzní analýzy mohou být takto odebrány
např. jednotlivé spermie z poševního stěru, embryonální buňky
z potratu apod.
139
Kvantifikace (a případná charakterizace) DNA
Co je to kvantifikace DNA a jak vyjadřujeme
množství DNA?
140
DNA – příliš malá, ale především příliš velká vstupní množství DNA
mohou vést ke zhoršenému průběhu reakce nebo k její úplné
inhibici. Kupříkladu je–li optimální vstupní množství DNA do určité
PCR reakce 1 ng, pak vstupní množství 10 ng DNA způsobí
částečnou inhibici reakce a PCR proběhne velmi problematicky.
Kvantifikace je tak nesmírně důležitá zejména u vzorků s těžko
odhadnutelným obsahem DNA (plošné stěry, tkáně v rozkladu
apod.)
143
řečeno „pasují“) pouze k určitému místu v DNA daného druhu či
skupiny blízce příbuzných druhů (např. primátů) a u ostatních
druhů komplementární nejsou, „nepasují“).
145
řetězové reakci (viz níže) – tzv. kvantitativní PCR (qPCR).
Technicky může mít qPCR mnoho konceptů, jejichž popis a
vysvětlení by šly nad rámec této knihy. Koncepty užívané ve
forenzní analýze jsou nejčastěji založeny na v zásadě jednoduchém
principu: je prováděna PCR, tj. cyklické kopírování vybraného
malého úseku DNA, a současně je průběžně měřeno množství těchto
nakopírovaných DNA fragmentů ve vzorku. Z toho, jakým způsobem
během PCR toto množství rostlo, lze zpětně dovodit původní
vstupní množství DNA ve vzorku (opět se kalibruje pomocí vzorků
známé koncentrace). Metoda kvantitativní PCR nám ze všech
kvantifikačních metod přináší nejvíce informací: je vysoce přesná,
vysoce citlivá (zobrazí i velmi malá množství DNA), přísně
specifická (poskytuje pozitivní výsledek prakticky pouze u daného
druhu respektive velmi blízce příbuzných druhů) a detekuje i
případnou přítomnost PCR inhibitorů a rozsah DNA
fragmentace.
Amplifikace DNA
Co je to amplifikace DNA?
1. PCR pufr, tj. vodu obsahující ionty a další látky potřebné pro
správný průběh reakce (Mg2+, případně K+, NH4+ apod.)
2. volné nukleotidy, označované jako dNTPs, což jsou stavební
kameny DNA, z nichž budou tvořeny nově vznikající řetězce
DNA; až na výjimky je pro PCR užívána vyvážená směs 4
základních dNTP – dATP, dCTP, dGTP a dTTP.
3. primery – krátké úseky DNA o délce cca 20–30 nukleotidů,
které slouží k nalezení specifického místa v DNA, jež má být
kopírováno, a od nichž toto kopírování začíná; primery jsou
navrženy tak, aby bezchybně párovaly právě pouze na začátek a
konec zájmového úseku na každém z obou DNA vláken;
(primery v páru pak označujeme jako F – forward a R– reverse.
4. DNA polymerázu – enzym, který provádí vlastní kopírování;
jsou užívány tzv. termostabilní polymerázy, které dobře snášejí
vysoké teploty, kterým jsou během PCR vystaveny.
147
5. templátovou DNA neboli matriční DNA, což je vlastní
předloha, podle níž má kopírování probíhat; nejčastěji se jedná
o DNA izolovanou z nějakého biologického materiálu (stopy
nebo srovnávacího vzorku).
148
2. fázi hybridizační (anelační), při níž se teplota sníží
(konkrétní teplota závisí na sekvenci a délce užitých primerů,
pohybuje se nejčastěji kolem 50–65°C) a dojde k nasednutí
primerů na oba volné řetězce DNA v místech, kam bezchybně
párují (tj. na začátek a konec úseku, který chceme kopírovat);
tato fáze rovněž trvá několik desítek vteřin.
150
reakce a mohou se při něm snáze uplatnit některé náhodné
(stochastické) efekty, jako je drop–out, o nichž bude pojednáno
v kapitole o interpretaci dat (nicméně – PCR může zdárně
proběhnout i pokud je ve vstupní reakci přítomna jedna jediná
nepoškozená kopie cílového úseku DNA). Zcela fatální důsledky pro
PCR však má příliš vysoké vstupní množství DNA, které může vést
až k úplné inhibici reakce.
151
o monoplexové PCR. Amplifikujeme–li lokusů více, pak zpravidla
používáme termín vystihující počet amplifikovaných lokusů –
duplexová PCR (= 2 lokusy), triplexová PCR (= 3 lokusy) atd.,
u většího počtu lokusů můžeme použít též obecný pojem
multiplexová PCR (= mnoho lokusů).
152
Elektroforéza DNA
Co je elektroforéza?
155
fluorescenčního scanneru; v rámci molekulárně genetických technik
je však tento přístroj vytěsňován genetickými analyzátory
založenými na principu kapilární elektroforézy.
156
Obrázek 49 – Princip kapilární elektroforézy fluorescenčně značených
fragmentů DNA.
157
Analýza STR lokusů
Jakými metodami jsou analyzovány STR lokusy?
158
injikován do kapiláry, na kterou je následně vloženo napětí. Při
průchodu DNA fragmentu okénkem kapiláry excituje laser
fluorescenční barvičku, která je na fragmentu vázána, a ta následně
emituje silné záření v určité oblasti spektra, což se projeví
v elektroforetogramu (časovém záznamu elektroforézy)
charakteristickým píkem určité barvy.
160
procesu zapojuje jednak jako kontrolní entita (zda vše probíhá
podle plánu), jednak jako ten, kdo vyhodnocuje nejednoznačné
nebo komplikované výsledky – lze ho tedy přirovnat k pilotovi
dopravního letounu, který sice ve standardních situacích hojně
využívá autopilota, avšak pro kontrolu průběhu letu a řešení
situací nestandardních je jeho přítomnost absolutně klíčová.
Dlužno podotknout, že stopy jsou zřídkakdy povahy
standardního vzorku.
161
Při sekvenační reakci je v reakční směsi přítomen pouze jeden
z páru primerů (F nebo R), a nové fragmenty tak vznikají pouze
podle jednoho z obou komplementárních řetězců sekvenovaného
fragmentu. Reakční směs dále obsahuje kromě „obyčejných“
deoxyribonukleotidů (dNTP), jež slouží jako stavební kameny nově
vznikajících řetězců, též fluorescenčně značené
dideoxyribonukleotidy (ddNTP), nazývané pro svou úlohu v reakci
terminátory: pokud je totiž do nově vznikajícího řetězce zařazen
ddNTP namísto standardního dNTP, nemůže polymeráza na něj již
připojit další stavební kámen, a syntéza řetězce tak končí. Je–li
poměr dNTP a ddNTP cca 100:1, dosáhneme stavu, kdy výsledný
produkt této asymetrické PCR sestává z fragmentů různých délek,
přičemž každý fragment má na konci fluorescenčně značený
terminátor. Stejně jako dNTP, jsou i ddNTP v reakci přítomny 4
druhy (ddATP, ddCTP, ddGTP a ddTTP), každý značený jinou
fluorescenční barvou.
162
templátové DNA nebo problematická sekvence, přes kterou
polymeráza jen obtížně postupuje dále – typické jsou úseky
v mitochondriální DNA označované jako cytozinový pás (angl. C–
stretch), kde je v sekvenci zařazeno několik C za sebou (např.
ATTGACCCCCCCATCCT).
163
úsecích této HVR jako celku. Vybrány pro testování jsou úseky
zahrnující nejpolymorfnější nukleotidy. Analýza pomocí SSO se
uplatňuje především jako screeningová metoda při vyšetřování
většího množství stop či osob.
164
Po úvodní amplifikaci následuje krok označovaný jako prodloužení
primeru: do reakce je přidán tzv. extenzní primer nasedající zcela
těsně před testovaný SNP, a směs čtyř různou barvou fluorescenčně
značených ddNTP neboli terminátorů (týchž, jaké byly popsány
v části věnované technologii sekvenování mtDNA). Polymeráza poté
na základě komplementarity s naším SNP připojí k primeru jediný
ddNTP (odtud název minisekvenování). Vzniklý fluorescenčně
značený produkt je poté analyzován pomocí kapilární elektroforézy:
barva detekovaného píku odpovídá typu terminátoru, který byl na
základě komplementarity s testovaným SNP do fragmentu zařazen.
165
používáno nejčastěji připojení různě dlouhých poly–T řetězců (úsek
tvořený pouze nukleotidy T) k extenzním primerům, což změní
výslednou pozici jednotlivých píků v elektroforetogramu.
167
Může být degradovaná DNA před analýzou nějak
reparována?
169
Co je LCN?
Jako LCN (angl. Low–Copy Number, „malý počet kopií“) neboli LT–
DNA (angl. Low–Template DNA) jsou souhrnně označovány vzorky
s malým až velmi malým obsahem DNA využitelné pro analýzu.
171
Jako nerovnováhu píků u heterozygota označujeme stav, kdy oba
píky reprezentující dvě alely heterozygotního lokusu nejsou stejně
vysoké (tak, jak by u vzorku jediné osoby měly být), ale svou výškou
se významně liší; pokud se výška jednoho z obou píků sníží až k nule
(tj. pík není de facto přítomen), mluvíme o ztrátě alely neboli
alelickém drop–outu. Dojde–li ke ztrátě obou alel lokusu (tj. žádný
pík daného lokusu není de facto přítomen), mluvíme o ztrátě lokusu
neboli lokusovém drop–outu.
172
Obrázek 55 – Stochastické jevy, k nimž dochází při analýze degradované
DNA a/nebo LT–DNA.
173
Jaká hlavní rizika přináší užití vzorků s degradovanou
DNA a/nebo LCN vzorků ve forenzní praxi?
Jak již bylo naznačeno výše, analýza tohoto typu vzorků s sebou
vždy přináší snížení spolehlivosti získaných dat: uplatňují se snáze
stochastické efekty a roste riziko, že se projeví kontaminující DNA.
Přes tato negativa mohou být degradované a LCN vzorky
principiálně pro forenzní analýzu užity, pokud je s nimi správným
způsobem nakládáno a z nich získaná data jsou správně a obezřetně
interpretována. Na druhou stranu – data velmi sporné kvality a
původu již by neměla být referována jako relevantní a neměla by
být pro jakékoli forenzní interpretace užívána.
174
Interpretace forenzně genetických dat
Obecné kroky a pravidla interpretace dat
Co si představit pod pojmem interpretace dat?
175
jak jsou získaná data technicky kvalitní, a jaká je tedy
spolehlivost vlastního odečtu dat
jak v principu spolehlivé jsou námi použité metody
analýzy a jak je z hlediska možného ovlivnění výsledků
bezpečný a vůči chybě odolný celý laboratorní proces
jak logicky konzistentní jsou jednotlivá dílčí zjištění
v procesu forenzně genetické analýzy navzájem (tj. zda si
např. dva dílčí výsledky zkoumání téhož vzorku neodporují)
jak dobře data odpovídají empirii (tj. zda jsou data
v souladu se zkušeností znalce a uživatele dat – soudce, či
naopak zda z ní vybočují).
176
Co rozumíme pod pojmem technická kvalita
laboratorních dat?
Prvním krokem by vždy měla být snaha kvalitu dat zvýšit; v praxi
tak často po první analýze vzorku následuje i několik dalších
opakování s různými modifikacemi (změna vstupního množství
DNA do PCR, změna parametrů PCR, změna parametrů kapilární
elektroforézy atd.) Cílem je optimalizovat průběh celé analýzy
tak, aby výsledná data byla co nejčitelnější. Na tomto místě
zdůrazňuji, že se v žádném případě nejedná o snahu tak dlouho
zkoušet analýzu, až konečně dostanu výsledek, jaký potřebuji; jde
o snahu „vyladit“ celou analýzu tak, aby poskytla co nejúplnější a co
nejspolehlivější data.
177
V případě práce se silně degradovanou DNA a/nebo LCN vzorky,
kde se silně uplatňují již dříve popsané stochastické jevy (alelický
drop–out, nevyváženost píků atd.), se můžeme setkat se
sestavováním tzv. konsenzuálních profilů. Podstatou je
opakovaná analýza téhož vzorku s pomocí několika nezávislých PCR
a následné pomyslné spojení odečtených dat ze všech těchto analýz;
tím lze do značné míry eliminovat právě stochastické jevy, které se
objevují náhodně a pouze v některých PCR téhož vzorku.
178
Kvalita v laboratoři
Proč laboratoře zavádějí systémy řízení kvality?
179
Akreditací rozumíme dobrozdání akreditačního orgánu, že buď
a) daný certifikační orgán je po stránce odborné i jiné (nezávislost,
nestrannost atd.) způsobilý k certifikacím, nebo že b) daný subjekt
je odborně i jinak způsobilý k provádění určité činnosti.
182
Jak vidíme v našem příkladu, inferenční logika je založena na
úpravě našich očekávání na základě získání nových dat
(informací).
183
smíšené stopy pro přítomnost biologického materiálu konkrétní
osoby. Ve třetím případě nás zajímá, jak silně pro hypotézu či proti
hypotéze o určitém příbuzenském vztahu svědčí zjištěné genotypy
(genetické profily) obou osob.
185
Kde v procesu forenzně genetické analýzy se chyby
objevují?
186
běžný lidský omyl (přestože to mnozí neradi slyší, je
chybovost bez znaků nedbalosti integrální vlastností lidského
mozku – např. přepsání se v čísle, napipetování vzorku do
nesprávné zkumavky, překouknutí atd.)
technická chyba z očekávatelných příčin (počítačový virus,
závada na přístroji, nekvalitní chemikálie pro analýzu atd.)
technická chyba z neočekávatelných příčin (neodhalený
negativně působící fyzikální, chemický či biologický faktor –
v minulosti byly takto dodatečně „odhaleny“ např. pudrová
tvářenka laborantky či pylová zrna jasanu ve dvoře objektu,
které oboje velmi účinně blokovaly PCR).
187
mechanismy jako v předchozím případě; účinnost opatření
bude u cizí osoby zcela jistě mnohem větší (osoba se nemůže
v laboratoři pohybovat „nenápadně“, není tak dobře
obeznámena s chodem laboratoře atd). Obecně je tendence
zcela minimalizovat přístup cizích osob do laboratorních
prostor (i proto, že tyto osoby mohou být zdrojem
kontaminující DNA).
nedbalostní jednání (ať už vědomé, či nevědomé) lze
nejlépe eliminovat zavedením přesných pravidel práce
v laboratoři a průběžnou kontrolou jejich dodržování
jednotlivými pracovníky; dobrým pomocníkem v tomto směru
může být software monitorující procesy v laboratoři, který umí
indikovat problematický faktor mnohem dříve, než by si jej
všiml člověk (např. identifikuje provázanost mezi častějšími
špatnými výsledky a určitým konkrétním pracovníkem).
je někdy snaha eliminovat běžný lidský omyl hrozbou trestu;
to je ovšem opatření zcela neúčinné, ba co víc –
kontraproduktivní. Člověk nemůže přestat přirozeně chybovat
jen proto, že mu hrozí trest; naopak – často hrozba trestu
způsobí, že osoby, která svůj omyl zjistí, se snaží na něj
neupozorňovat, případně jej i zastřít. Jedinými účinnými
opatřeními proti běžným chybám jsou zavedení kontrolních
mechanismů (např. data odečítají nezávisle na sobě dva experti
a musejí se shodnout, při pipetování jedna osoba kontroluje
druhou atd.) a především automatizace procesů, která vyloučí
lidský faktor ze hry (např. automatická izolace a amplifikace,
kdy vše provádí robot a vzorky jsou v procesu značeny a
identifikovány pomocí čárového či QR kódu)
technické chyby jsou do značné míry eliminovatelné
zavedením managementu kvality (zmíněné ISO17025), jehož
součástí jsou standardní operační postupy, které zahrnují i
pravidelné údržby, kalibrace a kontroly funkčnosti přístrojů,
188
kontroly kvality používaných chemikálií a laboratorního
materiálu atd.
189
Uchovávání zdrojů genetických informací
DNA databáze
Co jsou DNA databáze?
192
Setkáme se s nimi ve všech oblastech, v nichž se uplatňuje genetická
analýza – v klinické diagnostice, výzkumu i forenzní oblasti.
193
Jaká porovnávání umožňuje DNA databáze?
Naproti tomu pokud máme profil z dat nižší technické kvality, kde je
nejistota ohledně přesného stanovení genotypů větší, lze nastavit vyšší
toleranci odchylek – např. maximálně 6 alel.
194
Na jakém software stojí česká kriminalistická DNA
databáze?
195
„Non–human“ forenzní analýza živočišné,
rostlinné a mikrobiální DNA
Forenzní analýza živočišné DNA
Jaké forenzní analýzy lze u živočichů provádět?
196
Jak je prováděna identifikační analýza u koček a psů?
198
v některých případech však neposkytují tak spolehlivé výsledky
jako u živočichů.
199
Jaké metody zkoumání se ve forenzní analýze
mikrobiální DNA užívají?
200
Doslov
Forenzně genetická analýza je pilířem kriminalistické práce při
vyšetřování závažných trestních činů, ale podílí se i na vyšetřování
méně závažných přestupků proti trestnímu i občanskému právu.
Z laického pohledu televizního diváka ovlivněného sledováním
seriálů typu CSI se jedná o bezchybnou a nezpochybnitelnou
metodu usvědčování zločinců. Z pohledu jiného genetického laika,
bojovníka za občanské soukromí, se jedná o potenciální hrozbu
úniku zneužitelných osobních údajů z kriminalistické DNA databáze.
Oba pohledy jsou pokřivené neznalostí. Pro pochopení výhod a
nevýhod použití DNA profilování a databázování kriminálníků je
nutné nejprve pochopit biologii genetických markerů, technologii
sběru stop, amplifikace DNA a detekce amplikonů a zásady
inferenční logiky.
201
Kniha může sloužit jako odrazové prkno pro všechny právníky, kteří
se chystají skočit do bazénu forenzně genetických analýz, i pro laiky,
kteří se cítí ohroženi existencí kriminalistické DNA databáze.
Ilustrativní obrázky svou přehledností a výpovědní hodnotou
nemají konkurenci na trhu českých genetických učebnic a
monografií.
O autorce
Mgr. Halina Šimková vystudovala odbornou biologii se specializací
na genetiku člověka a antropologii na Přírodovědecké fakultě
Univerzity Karlovy v Praze. Už v době studia působila dva roky jako
civilní stážistka na Kriminalistickém ústavu Praha Policie ČR, od
roku 2002 zde pracuje jako DNA expertka na oddělení genetických
expertíz. V roce 2005 se jako DNA specialistka účastnila mise
Interpolu při identifikacích obětí tsunami v Thajsku. Po ukončení
studií v r. 2002 spoluzaložila a přednáší předmět Forenzní genetika
na PřF UK. Velkou prioritou pro ni vždy byla a je didaktika oboru –
kromě odborných přednášek na univerzitě se věnuje přípravě
budoucích expertů, specializačnímu dalšímu vzdělávání stávajících
znalců a expertů, odbornému vzdělávání kriminalistů, přednáší pro
soudce a státní zástupce, ale nesmírně ráda také přibližuje obor
naprostým laikům při přednáškách pro veřejnost. Je zakládající
členkou Československé společnosti pro forenzní genetiku, od roku
2007 je její místopředsedkyní.
202
Doporučená literatura a informační zdroje
V českém jazyce pohříchu existuje jen velmi málo aktuální literatury
k tématu forenzně genetické analýzy (což byl ostatně jeden
z hlavních důvodů, proč vznikl tento breviář). Odborné informace
k oboru existují (jak už tomu u přírodních věd bývá) především
v jazyce anglickém. Zde odkazuji zejména na novější publikace, jako
například:
203
Rejstřík
fluorescenční ................................... 142
1 biodegradace ................................. 40, 166
biologická stopa ......................................18
12S rRNA gen ........................................ 197 autolýza.................................................41
degradace.............................................32
důkazní potenciál .............................46
A důkazní potenciál nízký, nulový48
kontaminace .......................................34
adenin .......................................................... 50 latentní ..................................................31
AIMs ........................................................... 125 mechanismus vzniku ......................38
akreditace ............................................... 179 původce.................................................25
akreditační orgán ................................ 180 uchovávání ..........................................37
alela....................................................... 59, 62 určení doby vzniku ..........................42
mikrovariantní . viz mikrovarianta vyhledávání.........................................30
shodná původem ........................... 118 biologický materiál ................................18
shodná stavem ............................... 118 druhový původ ..................................23
alelově–specifická sonda ................. 161 odběr ......................................................33
AluQuant Human DNA Quantitation primární přenos................................44
System ................................................ 145 průkaz lidského původu ...............23
AMC............................... viz amniocentéza sekundární přenos ..........................44
amelogenin ...................................122, 160 sekundární přenos nepravý ........46
amniocentéza ........................................... 28 sekundární přenos vektorem .....45
amplifikace DNA ........................146, 152 tkáňový původ ...................................20
analyzátor genetický ...............156, 157 určení množství ................................39
Ancestry Informative Markers ....... viz za nehty.................................................39
AIMs zdroje .....................................................37
archeogenetika ........................................ 14 bovinní sérový albumin ................... 131
autozómy...................... viz chromozómy BSA ........... viz bovinní sérový albumin
nepohlavní bukální stěr ...............................................26
buňky
pohlavní ..................... viz gametocyty
B
banka
C
biologického materiálu .............. 190
izolátů DNA ...................................... 191 Cambridge Reference Sequence... 114
barvivo CE viz elektroforéza DNA kapilární
204
certifikace ............................................... 179 báze ........................................................ 50
CODIS STR Loci ..................................... 104 degradovaná ......................... 166, 168
COI gen ..................................................... 197 dvouřetězcová .................................. 51
CVS................................. viz choriocentéza extragenová........................................ 54
cytochrom B gen .................................. 197 jaderná.................................................. 57
cytozin .........................................................50 jednořetězcová ................................. 50
cytozinový pás ...................................... 163 mikrobiální ............................ 196, 199
mitochondriální ............................... 57
rostlinná.................................. 196, 198
Č struktura .............................................. 50
templátová ............................. 148, 150
červené krvinky ............. viz erytrocyty živočišná ............................................196
činidlo DNA databáze ........................................192
chelatační .......................................... 134 obsah ...................................................193
porovnávání .......................... 194, 195
software .............................................195
D DNA fingerprinting ............................... 15
DNA polymeráza ..................................147
ddNTP .................. viz dideoxynukleotid DNA profil .............. viz genetický profil
dědičnost DNA profil osoby. viz genetický profil
mendelovská ......................................62 osoby
mitochondriální DNA .....................68 drop–in
na nepohlavních chromozómech alelický................................................172
.............................................................62 drop–out
na pohlavních chromozómech...65 alelický................................................171
degradace DNA ...................32, 166, 171 lokusový .............................................171
stupeň ................................................. 167 druh
degradovaná DNA ............................... 173 rostlinný - identifikace................198
dělení redukční...................... viz meióza živočišný ............................................196
deoxyribonukleová kyselina . viz DNA živočišný - identifikace ...............197
deoxyribóza ..............................................50 důkaz
detekční činidlo vypovídací hodnota ......................184
FastBlue ................................................30 dvojčata
Luminol .................................................30 dizygotní viz dvojčata dvojvaječná
dideoxyribonukleotid........................ 162 dvojvaječná .................................75, 77
diferenciální lýza ......................... viz lýza fraternální ....................... viz dvojčata
diferenciální dvojvaječná
Differex ..................................................... 138 identická .......................... viz dvojčata
D–klička ................................................... 112 jednovaječná
DNA ...............................................................50 jednovaječná ...................................... 73
205
monozygotní .................. viz dvojčata gen .................................................................56
jednovaječná geneta....................................70, 72, 73, 77
genetická data
spolehlivost ...................................... 175
E technická kvalita............................ 176
uchovávání ....................................... 190
elektroforetická vana ........................ 155 vypovídací hodnota........... 175, 176
elektroforetogram ....................159, 162 genetický kód
elektroforéza DNA .............................. 153 univerzální ..........................................54
gelová........................................154, 155 genetický profil ............................... 70, 71
kapilární ............................................ 156 genetický profil konsenzuální ...... 173,
endonukleáza ........................................ 134 178
epigenetické rozdíly ............................. 59 genetický profil osoby..........................70
erytrocyty .................................................. 58 genetika.......................................................13
ethidiumbromid................................... 142 forenzní .................................................13
etnicita......................... viz původ etnický identifikační ........................................14
etnikum ....................................................... 95 kriminalistická...................................13
European Standard Set..................... 104 lékařská.................................................14
extrakce DNA ............... viz izolace DNA genom ..........................................................57
geny...............................................................54
gonozómy. viz chromozómy pohlavní
F guanin ..........................................................50
206
homozygozita ...........................................65 identifikace
huminové kyseliny.............................. 131 principy ................................................ 99
HV1 ............................................................. 113 identifikace
HV2 ............................................................. 113 individuální ......................................108
HV3 ............................................................. 113 identifikace
HVR mtDNA................................. 109, 124 individuální ......................................116
alely...................................................... 114 identifikace
analýza ............................................... 161 rostlinných drog ............................198
Identifiler.................................................160
Identifiler Plus ......................................160
Ch Identifiler® Plus Kit ...........................129
inbreeding ................................................. 92
charakterizace DNA ........................... 128 incest ........................................................... 92
Chelex–100 ............................................. 134 individuální identifikace ....................viz
chimérismus .............................................76 identifikace individuální
posttransplantační .................. 73, 79 individuum
tetragametický .......................... 73, 77 fyzické .................................. viz rameta
chloroplasty ..............................................58 genetické ............................. viz geneta
choriocentéza ...........................................28 inference ..................................................182
chromatinové vlákno............................53 pravděpodobnostních jevů .......176
chromozóm inferenční logika hodnocení dat...182
X 54, 105, 120 inhibitory .............................. 41, 130, 146
Y 54, 65, 66, 105, 120, 121 Interpol DNA Gateway ......................195
Y - určení biogeografického Interpretace forenzně genetických
původu ......................................... 125 dat .........................................................175
chromozómy .............................................53 izolace DNA ................................. 127, 129
nepohlavní ...........................................54 fenol-chloroformová ....................133
pohlavní ........................................ 54, 65 chelexová ...........................................134
chybovost ................................................ 185 na FTA papíru..................................135
zdroje chyb ....................................... 186 vazbou na pevnou fázi ................136
izolát
DNA ......................................................130
I genový (genetický) .......................130
identifikace
individuální .........................................25 J
identifikace ................................................69
identifikace jádro
individuální .........................................69 buněčné ................................................ 57
identifikace ................................................70 jedinec
207
fyzický .................................. viz rameta nízce a středně polymorfní..........60
genetický .............................. viz geneta vysoce polymorfní ........ 60, 99, 117
Jeffreys, Alec John .................................. 15 Low–Copy Number..................... viz LCN
Low–Template DNA ........... viz LT-DNA
LR viz věrohodnostní poměr
K LT–DNA .................................................... 170
luminometr ............................................ 145
karyotyp ..................................................... 53 lýza
kolonka buněk .................................................. 132
silikátová ........................................... 136 diferenciální..................................... 137
koncentrace DNA lyzát
hmotnostní ....................................... 140 buněčný .................................. 132, 134
konsangvinita........................................... 92
kontrolní oblast... viz oblast kontrolní
krevní destičky ............. viz trombocyty M
křížení
příbuzenské ...............viz inbreeding marker .........................................................57
kvalita v laboratoři ............................. 179 matroklinita ..............................................68
kvantifikace DNA.......................128, 140 meióza .........................................................63
luminometrická ............................. 145 melanin .................................................... 131
nespecifická ..................................... 141 mikrodisekce
specifická ................................141, 143 laserová..................................... viz LCM
spektrofotometrická.................... 141 mikrochimérismus
fetální ............................................. 73, 79
maternální ................................... 73, 79
L mikrokoncentrátor ............................. 132
mikrosatelity ................................. viz STR
laserová mikrodisekce............. viz LCM mikrovarianta ....................................... 103
LCM ..................................................137, 139 mikrovariantní alela ............................ viz
LCN ............................................................. 170 mikrovarianta
Likelihood Ratio.....viz věrohodnostní minHt . viz haplotyp Y-STR minimální
poměr MiniFiler .................................................. 160
lokus ............................................................. 56 minisatelity ................................ viz VNTR
mitochondriální ............................. 121 minisekvenování ................................. 164
X-chromozomální ......................... 120 miniSTRs ................................................. 168
Y-chromozomální ......................... 121 mitochondriální DNA ...... 57, 112, 124
lokusy sekvenace.......................................... 161
multialelické ....... viz lokusy vysoce určení biogeografického původu
polymorfní .......................................................... 124
nepolymorfní ..................................... 60 mitom ...........................................................57
208
mitotyp ........................................................68
O
mobilita
elektroforetická ............................. 153
oblast
motiv
hypervariabilní .... viz HVR mtDNA,
sekvenční .............................................99
viz HVR mtDNA
mtDNA
kontrolní ............................................112
viz mitochondriální DNA ..............57
pseudoautozomální ........................ 65
mutace .........................................................61
okružní testy ..........................................181
gametické .............................................61
OligoGreen ..............................................142
indukované..........................................61
oocyty ..........................................viz vajíčka
somatické .............................................61
oplození ...................................................... 70
spontánní .............................................61
organismy
modulární............................................ 72
N unitární................................................. 72
ori H ...........................................................112
otcovství...................................................119
národ .................................................... 95, 96
narušení struktury DNA ................... 167
násilný kontakt
P
důkaz ......................................................40
nDNA ...............................viz jaderná DNA
partikule
nehty ..................................................... 27, 39
magnetosilikové .............................136
nerovnováha píků ............................... 171
PCR ........................................131, 140, 146
non–human analýza ........................... 196
asymetrická ......................................152
norma
fáze denaturační ............................148
ISO 17020
fáze hybridizační (anelační) .....149
1998............................................... 180
fáze plató ...........................................150
ISO 17025
fáze prodlužovací (elongační,
2005............................................... 180
extenzní) ......................................149
nucleus ....................... viz jádro buněčné
kvantitativní.......................... viz qPCR
nukleom ......................................................57
monoplex...........................................151
nukleotid ....................................................50
multiplex............................................151
nukleotidová sekvence .. viz sekvence
negativní vlivy.................................150
nukleotidů
nested..................................................170
nukleotidy
reakční směs ....................................147
volné .................................................... 147
sekvenační ........................................162
symetrická ........................................152
PicoGreen ................................................142
pigment
indigový .............................................131
209
vlasový a kožní ............................... 131 pryskyřice
pík iontoměničová ................................ 134
koktavý ......................... 151, 171, 172 příbuznost
plastidom ................................................... 58 biologická ..................................... 14, 80
plastidy,....................................................... 58 pokrevní ............... viz konsangvinita
plodová voda ............................................ 28 principy určení ............................... 117
plodový materiál .................................... 28 stupeň ....................................................80
pohlaví osoby půdní vzorky.......................................... 199
určení ........................................122, 160 purifikace DNA ..................................... 131
polymeráza původ
prokluz .....................................151, 172 biogeografický ........................ 95, 124
s korektorskou funkcí ................. 151 etnický ...................................................95
polymerázová řetězová reakce ...... viz
PCR
polymorfismus ........................................ 59 Q
bodový........................................ viz SNP
jednonukleotidový ............... viz SNP qPCR ............................................... 146, 167
poly–T řetězec ...................................... 166 QuantiBlot Human DNA Quantitation
pomůcky Kit ......................................................... 145
DNA-free............................................... 34
ochranné .............................................. 35
sterilní ................................................... 34 R
PowerPlex 16 ........................................ 160
PowerPlex 18D Kit ............................. 129 rameta...................................70, 72, 73, 77
PowerPlex 21 ........................................ 160 rasa ................................................................95
PowerPlex Y ........................................... 160 rCRS .............. viz Cambridge Reference
PowerPlex Y23 ..................................... 160 Sequence
pravidlo komplementarityviz princip reparace DNA ........................................ 168
komplementarity repetice ..........viz sekvence repetitivní
predikce rozptýlená............................................99
biogeografického původu ............ 95 tandemová ...........................................99
fenotypu ............................................... 97 tandemové dlouhé ............ viz VNTR
Prep–n–GoTM Buffer ........................... 130 tandemové krátké ................. viz STR
primer .............................................147, 152 ribonukleová kyselina.............. viz RNA
prodloužení...................................... 165 RNA ...............................................................55
princip komplementarity ................... 52 rozptýlená repetice ........... viz repetice
proband ...................................................... 87 rozptýlená
proficienční testy ................................ 181
proteosyntéza .......................................... 55
Prümská úmluva.................................. 195
210
klasifikace .........................................102
Ř
lokusy doporučené sety .............104
X-chromozomální ............... 105, 107
řídící oblast............viz oblast kontrolní
Y-chromozomální ............... 105, 108
základní motiv ..................... 100, 102
STR lokus
S analýza................................................158
stutter peak ....................viz pík koktavý
sekvenace ................................................ 197
superfekundace
sekvenátor .............................................. 157
heteropaternální.............................. 76
sekvence
SwabSolution Kit .................................130
nukleotidů ...........................................51
syntéza bílkoviny... viz proteosyntéza
repetitivní ............................................99
silika........................................................... 136
slot blot hybridizace .......................... 144 T
SNaPshot ................................................. 164
SNP .................................................. 108, 109
tandemová repetice........... viz repetice
alely...................................................... 110
tandemová
analýza ............................................... 164
terminátor .................................... 162, 165
autozomální ..................................... 110
termocyklér ................ viz thermocycler
identifikace....................................... 111
thermocycler .........................................147
určení biogeografického původu
transkripce ............................................... 55
.......................................................... 125
transplantace ........................................... 79
X-chromozomální .......................... 110
kostní dřeně ....................................... 80
Y-chromozomální .......................... 111
trifosfát ....................................................... 50
spermie ............................................... 58, 70
trombocyty ............................................... 58
srovnávací vzorky
tymin............................................................ 50
mrtvá osoba ........................................29
pohřešovaná osoba .........................29
srovnávací vzorky U
typy .........................................................26
SRY ............................................................. 123
U.S. Core Loci .........................................104
SSO................................................... 161, 163
účinnost
SSR ...................................................... viz STR
separační ...........................................129
starodávná DNA ......................................14
stochastické efekty ............................. 171
STR .................................................. 100, 197
V
alely...................................................... 102
analýza ............................................... 168
vajíčka ......................................................... 58
autozomální ................ 105, 106, 117
vajíčko ......................................................... 70
genotyp .............................................. 105
211
validace .................................................... 181
Z
verifikace................................................. 181
věrohodnostní poměr ....................... 184
zkoncentrování izolátu DNA .......... 132
vícerčata
zkouška
jednovaječná .................. viz dvojčata
orientační .............................................21
jednovaječná
specifická..............................................21
vícevaječná ...................... viz dvojčata
znak
dvojvaječná
fenotypový................................ 96, 126
VNTR ................................................. 99, 100
ztráta alely ............................ viz drop-out
výtěžnost
zygota ................................................... 63, 70
izolace ................................................. 130
Y
Y–filer........................................................ 160
212