Oksidacijska dekarboksilacija piruvata

Ciklus limunske kiseline (CLK): regulacija,

inhibitori

Kristina Mlinac Jerković

kristina.mlinac.jerkovic@mef.hr
- Većina molekula ATP koja nastaje u metabolizmu dobiva
se aerobnom razgradnjom

- Proces započinje potpunom oksidacijom do ugljikovog

dioksida

- Oksidacija se zbiva u seriji reakcija koje čine ciklus

limunske kiseline (CLK; citratni ciklus), poznat i pod
nazivom ciklus trikarboksilne kiseline (TCA) tj. Krebsov
ciklus

- CLK je završni zajednički put oksidacije molekula goriva –

ugljikohidrata, masnih kiselina i aminokiselina

- Većina molekula goriva ulazi u ciklus u obliku acetil-

koenzima A
 Acetil-koenzim A (acetil-CoA)

- Hidroliza tioestera termodinamički je povoljnija od hidrolize kisikova estera (jer elektroni veze C=O ne mogu stvarati
rezonancijske strukture s vezom C-S koja je stabilna, kao što mogu s vezom C-O)

- Posljedica toga je visoki potencijal prijenosa acetilnih skupina koijm se odlikuje acetil-CoA (dakle, acetil-CoA je aktivirani
prenositelj acetilnih skupina, baš kao što je ATP prenositelj aktiviranih fosforilnih skupina)
 CLK prikuplja elektrone visoke energije

- CLK središnje je metaboličko čvorište stanice

- Važan izvor preteča za gradivne blokove mnogih drugih molekula (npr. aminokiselina, nukleotidnih baza, porfirina)

- Funkcija CLK je prikupljanje visokoenergijskih elektrona iz ugljikovih spojeva koji služe kao gorivo

- Sam CLK ne stvara velike količine ATP-a niti uključuje kisik kao reaktant

- Umjesto toga CLK uklanja elektrone s acetil-CoA i koristi te elektrone za stvaranje NADH i FADH2
 Piruvat-dehidrogenaza povezuje glikolizu s CLK

- U mitohondrijskom se matriksu piruvat oksidacijski dekarboksilira pri

čemu nastaje acetil-CoA

- Reakciju katalizira kompleks piruvat-dehidrogenaze (PDH)

- Posebni proteinski nosač prenosi piruvat iz citosola u mitohondrijski matriks u simportu s H+

- NADH se reoksidira u respiracijskom lancu

- Ova je IREVERZIBILNA REAKCIJA veza između glikolize i CLK

- Kompleks PDH je veliki složeni kompleks triju vrsta enzima

Kompleks PDH (E. coli)

Prostetička
Enzim Kratica Broj lanaca Katalizirana reakcija
skupina
Piruvat-dehidrogenaza Oksidacijska dekarboksilacija
E1 24 TPP
(komponenta) piruvata
Prijenos acetilne skupine na
Dihidrolipoil-transacetilaza E2 24 lipoamid
CoA
Obnavljanje oksidiranog oblika
Dihidrolipoil-dehidrogenaza E3 12 FAD
lipoamida
 Za sintezu acetil-CoA iz piruvata potrebna su 3 enzima i 5 koenzima

- Koenzimi tiamin-pirofosfat (TPP),

lipoična kiselina i FAD služe kao
katalitički kofaktori, a CoA i NAD+ su
stehiometrijski kofaktori

- Lipoična kiselina je amidnom vezom -

lipoamid - povezana s Lys ostatkom u
E2 podjedinici PDH
Tiamin-pirofosfat (TPP)
- Prevođenje piruvata u acetil-CoA sastoji se od 3 koraka: dekarboksilacija, oksidacija i prijenos nastale acetilne
skupine na CoA
1. Dekarboksilacija (PDH, E1)

- Piruvat se spaja s TPP-om i tada dekarboksilacijom nastaje hidroksietil-TPP

2. Oksidacija (PDH, E1)

- Hidroksietilna skupina vezana na TPP se oksidira te nastaje acetilna skupina koja se istodobno prenosi na lipoamid

- Taj prijenos rezultira stvaranjem energijom bogate tioesterske veze

- Oksidans je disulfidna skupina lipoamida koja se reducira u disulfhidrilni oblik

3. Stvaranje acetil-CoA (PDH, E2)

- Acetilna se skupina s lipoamida prenosi na CoA i stvara acetil-CoA

- Kompleks PDH ne može završiti drugi katalitički ciklus dok se dihidrolipoamid ne oksidira u lipoamid

- U četvrtom se koraku oksidirani lipoamid obnavlja dihidrolipoil-dehidrogenazom (E3)

- 2 se elektrona prenose na enzimsku prostetičku skupinu FAD, a potom na NAD+

- Prijenos elektrona s FAD na NAD+ je neobičan jer je uobičajena uloga FAD primanje elektrona s NADH

- Ovo je primjer u kojem FAD povećava potencijal prijenosa elektrona zbog vezanosti na enzim što mu omogućuje
prijenos elektrona na NAD+

- Proteini s čvrsto vezanim FAD ili FMN zovu se flavoproteini


- Fleksibilna veza
omogućuje lipoamidu
kretanje između
različitih aktivnih
mjesta
PRIJENOS ELEKTRONA I
PROTONA NA NAD+ ČIME SE
ZAVRŠAVA REAKCIJSKI CIKLUS
ANIMACIJA:
https://www.wiley.com/legacy/colle
ge/boyer/0470003790/animations/
pdc/pdc.htm
Reakcije kompleksa piruvat-dehidrogenaze
PIRUVAT SE
NEMODIFICIRANI DEKARBOKSILIRA I NASTAJE
ENZIM SPREMAN ZA HIDROSKIETIL-TPP
KATALITIČKI CIKLUS
E3 KATALIZIRA OKSIDACIJU
DIHIDROLIPOAMIDNE
KISELINE
LIPOAMIDNA “RUKA” E3
POMIČE SE U AKTIVNO
MJESTO E1
E1 KATALIZIRA PRIJENOS
JEDINICE S 2 C ATOMA NA
LIPOAMIDNU SKUPINU I
NASTAJE KOMPLEKS
ACETIL-LIPOAMID
E2 KATALIZIRA PRIJENOS ACETILNE JEDINICE NA CoA PRI ČEMU
NASTAJE PRODUKT ACETIL-CoA; DIHIDROLIPOAMIDNA “RUKA”
POTOM SE PREBACUJE U AKTIVNO MJESTO E3
 Regulacija aktivnosti PDH

- S obzirom da je stvaranje acetil-CoA iz piruvata ireverzibilni korak i u skladu s činjenicom da su često regulirani
upravo enzimi na ključnim mjestima grananja u metabolizmu , tako se i aktivnost kompleksa PDH mora precizno
regulirati

- Kompleks PDH kontroliran je alosterički i reverzibilnom fosforilacijom

 Poremećaji vezani uz deficijenciju kompleksa PDH

- Mutacije u genu za PDH

- Hipovitaminoza tiamina (beri-beri)

- Trovanje arsenitom (ASO33-) zbog inaktivacije enzima koji sadrže lipoamid kao prostetsku skupinu
(arsenit općenito kovalentno veže sulfhidrilne skupine, osobito sulfhidrilne skupine koje su u
neposrednoj blizini (susjedne) kao što je slučaj s lipoamidom gdje onda nastaju bidentatni adukti)

zeleni pigment CuHAsO4

- Postoje spojevi koji sprečavaju inhibiciju PDH arsenitom jer stvaraju kompleks s arsenitom koji se može
izlučiti (2,3-dimerkaptopropanol ili BAL-British anti-lewisite)
 CLK

- CLK oksidira jedinice od 2 C

atoma

- Slijed reakcija oksidacije,

hidratacije i ponovne
oksidacije (6,7,8) je analogan
reakcijama oksidacije masnih
kiselina

- Metabolon: enzimi CLK su

vjerojatno međusobno
povezani – povećana
efikasnost katalitičkog
djelovanja (kanalno vođenje
supstrata)
1. Kondenzacija - stvaranje citrata

- Ciklus započinje spajanjem oksaloacetata (jedinice s 4 C atoma) s acetilom acetil-CoA (jedinice s 2 C atoma)

- Ovu reakciju aldolne kondenzacije nakon koje slijedi hidroliza katalizira citrat-sintaza; reakcija je IREVERZIBILNA

- Oksaloacetat se najprije kondenzira s acetil-CoA i stvara citril-CoA, energijom bogatu molekulu koja sadržava
tioestersku vezu

- Hidroliza tioestera citril-coA u citrate i CoA jako pomiče ravnotežu ukupne reakcije u smjeru nastajanja citrata
 2. Izomerizacija - stvaranje izocitrata

- Reakciju izomerizacije katalizira enzim akonitaza; intermedijerni spoj je cis-akonitat

- Akonitaza je protein s nehemskim željezom; sadrži Fe-S središte koje sudjeluje u

vezanju supstrata za aktivno mjesto i reverzibilnim reakcijama dehidratacije i
hidratacije
 3. Oksidacijska dekarboksilacija izocitrata

- Enzim izocitrat-dehidrogenaza katalizira reakciju oksidacijske dekarboksilacije izocitrata u kojoj nastaje α–

ketoglutarat; brzina stvaranja α–ketoglutarata važna je za određivanje brzine cjelokupnog ciklusa

- Tom oksidacijom nastaje prvi prenositelj s visokim potencijalom prijenosa elektrona, NADH

- U reakciji nastaje intermedijerni spoj oksalosukcinat (nestabilna keto-kiselina)

- Postoje 2 izoenzima koji koriste ili NAD+ ili NADP + kao akceptore elektrona (izoenzim koji koristi NADP+ nalazi se i u
mitohondriju i u citosolu, za razliku od izoenzima ovisnog o NAD+ koji je izražen samo u mitohondriju)
 4. Oksidacijska dekarboksilacija α-ketoglutarata

- Reakciju oksidacijske dekarboksilacije α-ketoglutarata katalizira enzimski kompleks α–ketoglutarat-dehidrogenaza čije

djelovanje se može usporediti s enzimskim kompleksom PDH: čine ga 3 enzima homologna E1, E2 i E3 i za aktivnost su mu
potrebni prostetske skupine i koenzimi TPP, lipoična kiselina, FAD, NAD+ i CoA

- Reakcija je egzergona, ireverzibilna

 5. Fosforilacija na razini supstrata – stvaranje sukcinata

- Sukcinil-CoA je energijom bogat tioesterski spoj (ΔG°’ hidrolize usporediv je s vrijednošću za ATP!)

- Energija potrebna za sintezu anhidridne veze u GTP/ATP oslobađa se hidrolizom tioestera (sukcinil-CoA)

- Reakciju katalizira sukcinil-CoA-sintetaza (sukcinil-tiokinaza)

- 2 izoenzima s različitom specifičnošću za ADP ili GDP

- Reverzibilnu izmjenu GTP/ATP katalizira nukleozid-difosfat-kinaza

 6. Dehidrogenacija sukcinata

- Oksidaciju sukcinata katalizira flavoprotein sukcinat-dehidrogenaza, jedini enzim citratnog

ciklusa koji je vezan za unutrašnju mitohondrijsku membranu

- Elektroni se s FADH2 izravno prenose na koenzim Q respiracijskog lanca

7. Hidratacija fumarata

- Reverzibilnu hidrataciju
fumarata do L-malata katalizira
fumaraza

- Fumaraza je visokospecifičan
enzim i prepoznaje isključivo
trans konfiguraciju dvostruke
veze u strukturi fumarata
- Fumaraza pokazuje visoku specifičnost za supstrate fumarat i L-malat
 8. Oksidacija malata

- Reverzibilnu oksidaciju malata do oksaloacetata katalizira L-malat-dehidrogenaza

- Oksaloacetat se troši u sljedećoj vrlo egzergonoj reakciji sinteze citrata; stanična koncentracija
oksaloacetata je vrlo mala!
 Sumarna (neto) reakcija CLK:

Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H20 →

CoA-SH + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 CO2 + 3H+
U citratnom ciklusu je vrlo efikasno sačuvana energija reakcija oksidacije

1 NADH (2 e-):
2,5 ATP u oksidacijskoj fosforilaciji

1 FADH2 (2 e-):
1,5 ATP u oksidacijskoj fosforilaciji

Koliko molekula ATP

nastaje potpunom
oksidacijom 1 molekule
acetil-CoA?
(10)

Koliko molekula ATP

nastaje potpunom
oksidacijom 1 molekule
piruvata?
(12,5)
 Regulacija CLK

- Kontrola CLK provodi se

modulacijom aktivnosti enzima
kao dostupnošću supstrata

- Primarne su su kontrolne točke

alosterički enzimi izocitrat-
dehidrogenaza i α-ketoglutarat-
dehidrogenaza, prva 2 enzima
koji u ciklusu stvaraju
visokoenergijske elektrone
 Inhibitori CLK

FLUOROACETAT

MALONAT

ARSENIT
 CLK je amfibolički ciklus

- Osim što je CLK glavni razgradni put za stvaranje

molekula ATP, također osigurava i međuprodukte za
biosintezu

- Međuprodukti CLK moraju se nadomjestiti ako se

troše za biosinteze

- Npr., ako se oksaloacetat pretvara u aminokiseline

potrebne za sintezu proteina a istodobno se poveća
stanična potreba za energijom: ukoliko se
oksaloacetat ne stvori de novo, CLK će slabije
funkcionirati jer acetil-CoA ne može ući u ciklus (jer
se ne može kondenzirati s oksaloacetatom)

- Iako se oksaloacetat reciklira, minimalna je količina

uvijek potrebna za funkcioniranje ciklusa

- Oksaloacetat se stvara karboksilacijom piruvata

- Sinteza oksaloacetata karboksilacijom piruvata primjer je ANAPLEROTSKE REAKCIJE (grč. ispuniti), koja
vodi k neto sintezi ili nadomještanju jedne komponente reakcijskog puta
https://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/tca/tca.htm
https://www.wiley.com/college/fob/anim/#chap16
Literatura korištena za pripremu prezentacije:

1. J.M. Berg, J.L. Tymoczko i L. Stryer: Biokemija, 1. izdanje (hrvatsko; prijevod 6. engleskog izdanja), Školska knjiga, Zagreb, 2013.

2. J.M. Berg, J.L. Tymoczko i L. Stryer: Biochemistry, 7th edition, W.H. Freeman and Company, USA, 2012.

3. D.L. Nelson i M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 6th edition, W.H. Freeman and Company, USA, 2013.

4. D. Voet i J.G. Voet: Biochemistry, 4th edition, John Wiley & Sons Inc., USA, 2010.

Animacije i online izvori:

https://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/pdc/pdc.htm

https://www.wiley.com/college/fob/anim/#chap16

The Arsenic Dress: How Poisonous Green Pigments Terrorized Victorian Fashion (https://pictorial.jezebel.com/the-arsenic-dress-
how-poisonous-green-pigments-terrori-1738374597)

Copy protected with Online-PDF-No-Copy.com