TIEU CHUAN VIET NAM — a < 2 TCVN 4992 : 2005 ISO 7932 : 2004 Xuat ban lén 2 VI SINH VAT TRONG THUC PHAM VA THUC AN CHAN NUOI — PHUONG PHAP DINH LUGNG BACILLUS CEREUS GIA BINH TREN DIA THACH - KY THUAT DEM KHUAN LAC G 30°C Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus — Colony-count technique at 30°CTCVN 4992 : 2005 Léi gidi thigu 0.1 Do tinh da dang cila thuc pham va thie an chan nudi nén phuong phap nay cé thé khéng thich hap dén ting chi tiét cho timg san phdm cy thé. Trong trutng hop nay, cé thé si’ dung cac phuung phap khac dc trung cho tung sn phdm, néu hoan toan chi vi ly do kj thuat. Tuy nhién, cdn cé gang 4p dung phuong phap nay khi cé thé. Khi tigu chudin nay dude soat xét tiép thi can phai tinh d&n moi théng tin lién quan dén pham vi ma phuong phap dém dia nay phai tudn theo va cae nguyén nhan gay sai lech so véi phuong phap trong truéng hop cac san phdm cu thé. Vic hai hoa cac phuong phap this cé thé khéng thuc hién duge ngay va déi véi mét vai ahém san pdm C6 thé tén tai cdc tiéu chudn quéc té va/hoac tiéu chudn quéc gia ma khéng pha hgp vdi tiéu chudn nay. Trong trudng hgp cé sn tiéu chudn quéc té cho san phdm can thi nghiém thi phai tan theo tiéu chudn d6. Hy vong rang khi cac tiéu chudin nhu thé duge soat xét, thi chung phai duge sita déi dé pho. hop véi tiéu chudn nay, ‘a0 cho cudi ciing cht cin cdc sai léch véi phudng phap dém dia nay ia cc ly do ky thuat duoc thita nhian: 0.2. Khi ¢6 nhiéu bao tir xuat hin, nhumg néu khéng phai t&t ¢8 thi cling phai dling cc chiing B cereus moe sn trén bé mat méi trudng cAy duoc ding dé dinh ivong. Trong phan [én cae truéng hgp duéng nhu khéng can xt ly séc nhiét dé kich thich moc. B4i khi cn phai séc nhiét, vi dy nhu 48 dém cac bao tt hoac dé ute ché phat trién cac té bao vi khudn sinh dung. Trong cdc trutng hop nay, nén xi ly & 80 °C trong 10 phiTIEU CHUAN VIET NAM TCVN 4992 : 2005 Xuat ban lan 2 Vi sinh vat trong thuc pham va thife an chan nudi - Phuong phap dinh luong Bacillus cereus gia dinh trén dia thach — Ky thuat dém khuan lac 6 30 °C Microbiology of food and animal feeding stuffts - Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus - Colony-count technique at 30°C 1 Pham vi 4p dung Tiéu chugn nay qui dinh phuong php dinh luong Bacillus cereus gia dinh cé kha nang moc duce trén dia thach bang ky thuat dém khudn lac 30°C. Tiéu chudn nay 66 thé ap dung cho: ac san phdm ding cho con nguéi va thie n chan nudi, va cac mau méi truéng trong khu vue san xuat va xi ly thy phdm. CHU THICH: 88 cho phuong phap this mang tinh thuc tién thi giai doan khiing dinh da gidi han vé thir dién hinh tren thach MYP va thir héng cau. Do dé, thuat ngif “gid dinh’ 44 duoc dua vio 4€ céng nhan thyc té la giai doan kning inh khéng thé phan biét duge B.cereus véi céc loai Bacillus khdc cé lién quan mat thiét, nhung thutng it gap phéi nhu: B.anthracis, B.thuringiensis, B.welthenstephanensis, B.mycoides. Mét phép thi tinh di déng bé sting co thé gidp 48 phan biét B.cereus véi B.anthracis khi nghi ng cé mat B.anthracis. 2 Tai ligu vién dan Cac tai liu vién dan sau Ia rat can thi&t cho viée 4p dung tiéu chun. Béi véi cdc tai liu vién dan ghi nam ban hanh thi 4p dung phién ban dude néu. D6i véi cdc tai liu vién dn khdng ghi nam ban hanh thi ap dung phién ban mdi nhét, bao gém ca cac sita déi. TCVN 6507-1 : 2005 (ISO 6887-1 : 1999), Vi sinh vat trong thye phdm va thite an chan nudi - Chudn bj mau tht, huyén phi ban dau va cac dung dich pha lodng thap phan dé kiém tra vi sinh vat. Phan 1 & chudin bi huyén phbi ban déu va cae dung dich pha long thap phan.TCVN 4992 : 2005 \SO 7218 : 1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examinations and Amd.1 : 2001 (Vi sinh vat trong thuc phadm va trong thife an chan nudi - Nguyén tac chung vé kiém tra vi sinh vat). ISO/TS 11133-2 : 2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vat trong thuc phdm va thie an chan nudi - Huéng dan chudn bi va tao méi trudng cay ~ Phan 2: Cac hung thue hanh vé thi tinh nang cla méi truéng cay). 3. Thuat ngi va dinh nghia Trong tiéu chun nay suv dung thuat ngi va dinh nghia sau day: 341 Bacillus cereus gia dinh (presumptive Bacillus cereus) vi sinh vat hinh thanh céc khudin lac dign hinh trén bé mat cde mai trudng ey chon loc va cho phan Ung khang inh ducng tinh duéi cdc diéu kign duge qui dinh trong tiéu chudin nay. CHU THICH;: Xem Chi thich trong diéu 1 4 Nguyén tac 4.1 Cay mét lueng mau thd qui dinh néu san phém ban dau & dang léng, hoac mét lugng huyén phu ban 84u qui dinh néu cac san phdm & dang hac, lén bé mat méi truéng cdy dae chon loc dung trong cac dia Petri Chuan bi cac dia khac trong cling mét diéu kién, si dung cac dung dich pha ioang thap phan cla mau thir heac cla huyén phd ban dau. 4.2. U trong cae diéu kin hidu khi cac dia 6 30°C ty 19h dén 48h 4.3 Tinh sé lung 8. cereus trong mét mililit hoc trong mot gam mau ti’ sé lugng Khudn lac khang dinn thu duce trén cdc dia 4 c&c 46 pha long da chon sao cho két qua c6 y nghia va dug khang dinh theo phép thir qui dinh. 5 Dich pha loang, mdi trudng cay va thuéc thir él véi thue hanh trong phong thir nghiém, xem TCVN 6404 (SO 72735.1. Dich pha loang Xem TCVN 8507-1 (SO 6887~1) va tiéu chudin rigng lién quan dén san pham can phan tich. 5.2. M@i trudng thach (xem [1]) 5.2.4. Méi tring co ban 5.2.1.1 Thanh phan | Cao thit bo- 1,09 Pepton tir casein 10.09 | p-mannitol 100g Natri clorua (NaCl) 10,0g Phenol 46 0,025 | Thach 12g dén tag" | Nude 900 mi [a Tay mupe ie ang ale ech 5.2.1.2. Chuan bj Hoa tan cac thanh phan hoac méi trudng hoan chinh khé trong nude, dun néng néu cén. Chinh pH sao cho sau khi khi/trling, pH cia méi truing hoan chinh (5.2.4) dat 7,2 + 0,26 25 °C, néu can. Phan ohéi cdc lueng 90 ml mdi truting vao cac binh cu dung tich thich hop. Khu tring 15 phut trong ndi hap ap ive (6.1) 6 121 °C. 5.2.2 Dung dich Polymyxin B “6.2.2.1. Thanh phan Poiymyxin B sunfat 10°" | 100 mi |TCVN 4992 : 2005 §.2.2.2 Chuan bi Hoa tan Polymyxin B sunfat trong nude. Loc dé khif tring. 5.2.3. Dung dich nhii tuong long dé tring Si dung cac qua trimg ga cén nguyén ven. Ding ban chai, rifa trétng trong dung dich tay rita. Trang sach dué: déng nude chay. ngém trong etanol 95 % (theo thé tich) trong 30 gidy rdi dé khd. Bang ky thuat v6 tring, dap vé tling qua trimg va tach riéng long dé bang cach chuyén long dé tir nita vo qua nay sang nua vd qua con lai. Cho cac long dé sang 6ng dong vé tring va thém bén phan theo thé tich nue v6 tring, Chuyén mét cach vd tring sang binh cdu vé tring va khuay manh. Bun nang hén hgp 2 h trong ndi cach thuy (6.4) dé d 44 °C dén 47 °C. Sau dé dé yén 18h dén 24he 85°C = 3°C dé tao két tla Bang cach v6 tring thu lay nha tung phia trén Dung dich nhi tung nay o6 thé bao quan dén 7235 °C + 3°C, 5.2.4 Méi trurdng hoan chinh (thach MYP) §.2.4.1. Thanh phén Méi trudng co ban (5.2.7) Dung dich polymyxin B (5.2.2) Dung dich nha tuang long dé tring (8.2.3) 10,0 mi 5.2.4.2, Chuan bi Lam tan chay méi truéng co ban va lam ngudi trong néi cach thuy (6.4) dé d 44 °C dén 47 °C Cho cac dung dich con lai vao, trén kj sau méi lén thém. Lam nguéi méi truéng hear chinh trong néi cach thuy (6.4) dé 3 44 °C dén 47 °C 5.2.5 Chuan bi cac dia thach Rot cae phan tir 1§ ml dén 20 mi mdi trudng hoan chinh (5.2.4) sang cac dia Petri v6 tring (6.6) va dé cho dong dacTCVN 4992 : 2005 Ngay truéc khi sii dung, lam khé cae dia, t6t nhat thao bé nap ra va up bé mat thach xuéng, dat trong th + sy hoac tl dm (6.2) dé 6 37 °C dén 55 °C cho dén khi bé mat thach khd. _ 5.2.6 Kiem tra tinh nang Xem ISO/TS 11133-2 : 2003, phu luc B. 5.3. Thach huyét ciu 5.3.1. Mei truéng co ban: Thach huyét No.2 5.3.1.1 Thanh phan Pepton proteoza noac pepton tuong duong 159 ‘$n phdm thuy phan gan 259 Cao nam men sa| Natri clorua (NaCl) 5g) Thach tw 12g dén 18.9” Nu6e 1.000 mi a) Tuy thude vao sife d6ng aa thach. §.3.1.2 Chuan bi Hoa tan cac thanh phan hoac mai trudng hoan chinh khé trong nuéc bang cach dun séi. Ghinh pH sao cho sau khi khif triing la 7,0 + 0,2 6 25 °C, néu can. Phan phéi vao cac binh cau va khirtrung 15 phut trong néi hap ap luc 6 121 °C. 5.3.2 Huyét ciu da khir soi huyét 5.3.2.1. Méi trvéng hoan chinh 5.3.2.1.1 Thanh phan Méi trudng co ban (5.3.1) 100 mi 1 mi! sun JA ent soi quvet 5 mi dén 7 mi |TCVN 4992 : 20u5 §.3.2.1.2 Chuan bi Sau khi lam ngudi dén nhiét dé tir 44 °C dén 47 °C, bé sung huyét ciu da khif sai huyét vao mi truong co ban (6.3.1), Tron dau. Rét cac phdn it nhdt 12 ml méi trudng hoan chinh sang cdc dia Petri (6.6) va dé cho déng dc, 6 Thiét bi va dung cu thuy tinh CHU THICH: Co thé cling dung cu thuy tinh str dung mdt in thay thé cho c&e dung cu thuf tinh sit dung nhiéu lan néu ching c6 cae dae tinh thich hop. Str dung cae thiét bi cla phong tht nghiém vi sinh thang thudng va cu thé I& 6.1 Thiét bj dé khir tring khé (1d say) hoac dé khit tring ust (néi hap ap luc) Xem TCVN 6404 (ISO 7218), 6.2 Tu say hodc tl dm, duge théng gid di luni, dé lam khé cde dia thach, 66 kha nang hoat déng & 37°C 21°C va 55°C = 1°C. 6.3. TU dm, co thé lam viée 6 30°C + 1 °C. 6.4 N@i cach thily, cé thé duy tri nhist do 4 44 °C én 47 °C. 6.5 pH met, co 46 cninh xac » 0.1 dan vi pH 6 25 °C, 6.6 Dia Petri, bang thiiy tinh noge chat déo 66 dudng kinh tu 90 mm Gén 100 mm, neac 140 mm néu can. h danh dinh 10 mi va 6.7 Pipet chia vach, dudc hiéu (ml. duoc chia vach 0.5 ml va 0.1 mi tuong tng va co Id xa ver dung kinh danh dinh tir2 mm dén 3mm n chi dé ding cho vi khudn hoe. 66 dung 6.8 Dung cy dan mau (dang que gat), que bang thu tinh hoae dang chat deo ce duéng kinh Kraang 3.5 mm va dai 20 om. met dau duge uén thanh gac vuéng véi doan dai khodng 3 cm: cdc du duve lam nhan bang nhvet ong la Phong the: nghiém rhan duce d dao ua trinh van chuvén hode bao cudTCVN 4992 : 2005 Viée lay m&u khéng qui dinh trong tiéu chudn nay. Xem tiéu chudn riéng vé lay mau cho san pham | tueng Ung, Néu chua c6 tiéu chudn riéng thi cdc bén lién quan ty thoa thuan véi nhau vé vn dé nay. «8 Chuan bj mau thir \Viée chuan bi mau thif theo tiéu chun riéng phi hgp vdi cdc san pham tuong tng. Néu chua o6 tigu chudn riéng, thi cac bén cé lién quan ty thea thuan vé van dé nay. 9 Cach tién hanh 9.1. Phan mau thi, huyén phi ban dau va cdc dung dich pha loang Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) va tiéu chudn riéng lién quan téi san phdm, 9.2 Cay vad 9. phdm 6 dang ldng hoac hayén phi ban déu néu cac san phdm 6 dang khdc. Lap Iai qui trinh vdi cac 4 Lay hai dia thach (5.2.5), ding pipet vd trling (6.7) cho vao mdi dia 0,1 ml mau tht néu san dung dich pha loang thap phan tiép theo, néu can. 9.2.2 Ddi voi mot sé sn phdm nhat dinh, tét nhat dé uéc tinh B.cereus vai sé luong nhé, la tang cac gidi han phat hién lén 10 én bang cach kiém tra 1,0 ml mau thoy néu san phdm ban dau 4 dang lng, hoac 7.0 ml huyén phi ban dau néu san phdm 4 dang khac. Phan phdi 1 mi dich cay lén bé mat cla dia Petri dn (140 mm) hodc lén khdp bé mat cla ba dia nhé (90 mm) str dung dung cu dan mau vo tring (6.8). Trong ca hai truéng hop, chuan bi cho phép xéc dinh kép si dung hai dia lén hoac sau dia nhé 9.2.3 Can than diing que dan mau (6.8) dan déu dich cdy trén khap bé mat dia thach cang nhanh cding t6t ma khéng cham vo cac mép dia. Si dung mdt que dan mau vo tring cho méi dia, BE cac dia 6 day nap khoang 15 phut nhiét d6 phong dé chat cdy bam vao thach. 9.2.4 Lat up cac dfa 48 chudn bi (9.2.3) va dé 18 h dén 24 h trong tl 4m (6.3) 30 °C. NBu khong thé rnin thay 1 cac khudn iac thi U cde dia thém 24 h truée khi dém. 9.3. 8ém khuan lac Sau giai doan o (9.2.4), chon cae dia, t6t nhat la & hai 46 pha loang lién tiép, 26 tt han 150 khudin 'ge s gia dinh trén méi dia. Cac khudn lac gia dinh la cac knudn lac én, mau cae khudn lac 8, 4 thich 1} v2 thung dude bac quanh dd mét ving Ket i thee shénh tech trén thang fog.s\logectuig) | ona i 0.28 theo ty 86 trén thang danh dink (ofu/g) |Bang B.3 — Cac két qua phan tich sé ligu thu duge vdi cac mau phomat tuci Cac théng so TeVN 4yyz . cuuD (mite nhiém ban) Phomat tuoi Phomattwei | Phomattusi | (mic thép) | (mic trung bin) | (mtie cao) | sé lugng mau 2 | 2 2 $6 Ivong phong thit nghiém cén lai sau khi tris 12 | 12 12 goal 16 | | SS ugng phorg this nghi8m ngoailé o o | Oo 86 twang mu due ena nnan [a 23 [se Gia tr tung binh 2a (logwctule) 3a] at | 1 lech chun lap fas, (logctula) 0,05 | 0.08 os 6 Iéch chuan twang d6i lap lei (%) | 1,50 | 1,87 1,95 1 + Gi6i han lap lair | | theo chénh i8ch trénthang loge (log wefula) | 0.14 0,18 0,33 theo ty 86 trén thang danh dinh (cfu/g) | 14 18 22 | Dé léch chudn tai lap Sz (log,cefu/g) | 0,08 0,10 017 | 6 léch chun twang di tai |p (%) | 2.28 2,38 2,78 Gidi han tai lap | : thao chénh igen trén thang log, ('o9.,cfu/g) 022 027 048 theo ty $6 tran thang danh dinh (cfulg) 18 45 30TOVis 5392 : 2005 Bang B.4 - Cac két qua phan tich so ligu thu dugc vi vat liu chuan Cac thang so Vat ligu chuan SSé twang mau 2 1 $6 Iuong phong thi nghiém cén lai sau khi tri ngoai Ie | 18 | 6 luong phéng thu nghi@m ngoai Ie | 0 $6 lueng mu duce chp nhan 36 | | Gia trang binh Za (logy fuvién nang) | 38 | Bo léch chun lap lal, (logis cfulvién nang) | 0.04 | 6 léch chuéin tuong déi lap lai (%) 4.12 | Gigi han lap fair | theo chénh léch trén thang log,o(logy ofu/vién nang) | 0,12 | | theo ty sé trén thang danh dinh (efulvién nang) 13 | | 86 léch chudhn tdi lap Sp (log,_ cfulvién nang) | 0,08 | 186 lach chun tuong dé tai lap (9%) i 2.16 | " Gidihan tai ap theo chénh léch trénthang 1099 (log,, cfulvign nang) | 0.23 theo 8 s6 trén thang danh dinh (cfulvién nang) wwThu muc tai ligu tham khao [1] MOSSEL, D.AA., KOOPMAN, M.J and JONGERIUS, E. Appl. Microbiol. , 15, 1967, pp. 650 - 653. [2] ICMSF. Microorganisms in foods, Vol. 1, 2 nd edn. , University of Toronto Press, 1978. [3] COWELL and MORISETTI J. Sci. Fd. Agric. , 20, 1969, p.573, [4] INT VELO, PH. , SOENTORO, P.S.S. and NOTERMANS, S.H.W. |.J. Food Microbiol. , 20, 1993, pp. 23-36 {5} TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994) BO chinh xac (46 dung va 6 chym) cla phuong phap do va két qua do. Phan 1: Nguyén téc va dinh nghia chung. {6} TCVN 6910-2 - 2001 (ISO 5725-2 : 1994) D6 chinh xac (46 diing va 46 chum) cla phudng phap do va két qua do, Phén 2: Phuong phap co ban xéc dinh d6 l&p lei va 46 tai lap cla phutong phép do tiéu chudn. [7] SCHULTEN S.M., BENSCHOP E., NAGELKERKE N.J.D. and MOOLJMAN K.A. Validation of Microbiological methods: Enumeration of Clostridium perfringens arcoding to ISO 7937 (second edition, 1997), Report 286555001, National institue of Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands, 2001. [8] SCHULTEN, S.M., IN'T VELD P.H. , NAGELKERKE, N.J.D. , SCOTTER, S. , DE BUYSER, M.L. . ROLLIER, P. and LAHELLEC, C.i.J. Food Microbiology, 57, 2000, pp. 53 - 67